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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung liegt in dem Gebiet der Diagnostik und betrifft
ein Verfahren und einen Kit zum schnellen Feststellen ganzer Mikroorganismen
auf Rückhaltemembranen
durch Verwendung chaotroper Substanzen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Das
Feststellen von Mikroorganismen in Körperflüssigkeiten, Wasser und Lebensmittelprodukten erlaubt
die Diagnose und Prognose viele Infektionskrankheiten. Zur Herstellung
von Impfstoffen benötigte
Zellen und Mikroorganismen verlangen eine strenge Kontrolle der
Sterilität
der produzierten Medien, was in der Regel durch Kultivieren eines
Aliquots des Mediums, dessen Sterilität kontrolliert werden soll,
in einem wachstumsfördernden
Medium über
mehrere Tage erreicht wird. Das Wachstum und die Identifizierung
von Mikroorganismen sind zeitaufwändig, schwierig und dauern
häufig
zwei bis drei Wochen, bevor Ergebnisse verfügbar sind.
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Es
existiert ein solches Feststellungsverfahren für diagnostische Zwecke, das
auf der Kultur einer Blutprobe oder von Sputum beruht, wenn das Vorhandensein
mykobakterieller Einheiten diagnostiziert werden. Die Zeit, die
erforderlich ist, um zu einer diagnostischen Schlussfolgerung zu
kommen, ist jedoch sehr lang, manchmal bis zu 4 Wochen. Für andere
Mikroorganismen, beispielsweise dem ätiologischen Agens der Malaria
(vor allem Plasmodium falciparum, Leishmaniasis, Gonorrhoe, Syphilis,
Tuberkulose, Malaria, Lyme-Borreliose sowie Meningitis aufgrund
unterschiedlicher Vektoren wie Neisseria, Haemophilus, Streptococcus,
Listeria und Mycobacterium, gibt es kein schnelles diagnostisches
Verfahren, das das gesamte Pathogen feststellt, und es besteht daher
ein Bedarf für
ein solch schnelles Verfahren.
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Schnellverfahren
zum Feststellen von Antigenen und Antikörpern sind derzeit für Antikörper und Protein- und Glykoproteinantigene
in Gebrauch, deren Größe ausreichend
klein ist, damit sie in einem Lateral-Flow-Chromatographie-System
transportiert werden können.
Für größere Einheiten
(beispielsweise ganze Bakterien und eukaryotische Organismen) ist
diese Technik nicht anwendbar, da die Analyten zu groß sind,
um sich mit der Strömung
zu bewegen. Diese Mikroorganismen großer Größe sind auch in der Lage, an
den Haltemembranen zu kondensieren, so dass die Empfindlichkeit
ihrer Feststellung in situ wesentlich erhöht ist.
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Es
wird jedoch auch eine nicht akzeptable Menge an falsch positiven
oder negativen Ergebnissen beobachtet. Das Phänomen einer von Körperflüssigkeiten
hervorgerufenen, immunologischen Dämpfung (Quenching) ist gut
bekannt. Diese Dämpfung
verhindert die Erkennung des ganzen Organismus durch spezifische
Bindungspartner wie Antikörper
und induziert falsch negative Ergebnisse.
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STAND DER
TECHNIK
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Das
Dokument EP-0306206 beschreibt eine diagnostische Vorrichtung umfassend
einen Trichter, der die Flüssigkeit
bei der Analyse auf einen definierten Teil einer Filtermembran leitet,
die den Analyten zurückhält. Der
Trichter wird danach entfernt und die Membran wird weiter mit Signal
erzeugenden Materialien und anderen Reagenzien als Waschflüssigkeiten
behandelt, die gleichzeitig auf den Testbereich und den benachbarten
Bereich der Membran aufgetragen werden. Die gleichzeitige Behandlung
von benachbarten Bereichen soll eine negative Kontrolle bereitstellen,
um das Feststellen unspezifischer Bindung und damit falsch positiver
Ergebnisse zu unterstützen.
In dem Dokument ist die Probe auf einen separaten Bereich des Filters
beschränkt
und der ganze Filter wird dann mit Reagens behandelt, was eine echte
negative Kontrolle ergibt. Dieses Dokument erwähnt Wasser als Flüssigkeit,
die durch die eingeschränkte Öffnung strömt, und
beschreibt nicht die Art der verwendeten Membranen. Eine solche
verbesserte Vorrichtung, die auf der direkten Feststellung des Vorhandenseins
von Pathogenen auf der Membran beruht, ist tatsächlich nur mit Wasser anwendbar.
Geladenere Flüssigkeiten,
wie beispielsweise Serum, die in einem einzelnen, separaten Bereich
des Filters angesammelt sind, neigen dazu, diesen Filter zu verstopfen,
den leichten Durchfluss danach zugegebener Flüssigkeiten (beispielsweise Waschmedium)
zu verhindern und zu bewirken, dass die nachfolgenden Waschflüssigkeiten,
die auf die gesamte Membran aufgetragen werden, um diesen Bereich
herum fließen,
ohne ihn zu durchdringen. Darüber
hinaus ist die Vorrichtung selbst mit Wasser speziell entwickelt
und dafür
bestimmt, falsch positive Fälle
sichtbar zu machen, was anzeigt, dass das Auftreten falsch positiver
Fälle möglich ist,
selbst mit Wasser. Für
Körperflüssigkeiten,
wie beispielsweise Serum, Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Perikardflüssigkeit,
Harn oder andere Körperflüssigkeiten,
ist keine solche Vorrichtung in Gebrauch, um ganze Mikroorganismen
durch direktes Markieren festzustellen.
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Es
wurde die Verwendung einer chaotropen Substanz wie Natriumthiocyanat
für Suspensionen von
Mikroorganismen in Wasser befürwortet,
bevor sie auf einem Membranfilter kondensieren, aber die befürwortete
Konzentration ist 0,04 Molar und nur Wasser ist als eine für die Behandlung
geeignete Flüssigkeit
anerkannt (Dokument JP-05034350). Diese Lehre betrifft das Feststellen
von Mikroorganismen in Wasser, deren Verklumpung mithilfe geringer Konzentrationen
von Desintegrationsmitteln verhindert oder in einzeln suspendierte
Organismen aufgelöst
werden kann.
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Es
wurde der Anstieg der Sensitivität
eines immunchemischen Tests von Kollagen in Anwesenheit einer chaotropen
Substanz behauptet. Weder Harnstoff noch Guanidin werden als geeignet
erwähnt,
sondern Thiocyanat, das in einer Konzentration von 0,1 bis 1,6 molar
in der Reaktionsmischung verwendet wird (Dokument WO92/16846). Diese Lehre
betrifft Kollagen, das in einem ein chaotroper Stoff wie Isocyanat
enthaltenden Testmedium gelöst ist
und das von einem Bindungspartner erkannt wird.
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Desgleichen
wurde eine vor dem Immunassay stattfindende Behandlung einer Probe
mit verschiedenen oberflächenaktiven
Stoffen und einem chaotropen Stoff wie beispielsweise Harnstoff
als auf Blutproben anwendbar erklärt, die durch den Immunassay
auf das Vorhandensein von Viren, beispielsweise Hepatitis-C-Virus,
untersucht werden (Dokument WO99/06836). In diesem Fall wird der
chaotrope Stoff mit verschiedenen oberflächenaktiven Mitteln mit der
unter Analyse stehenden Probe in Kontakt gebracht, nicht als eine
Waschlösung,
und es wird kein Versuch gemacht, die auf der Oberfläche einer
Membran kondensierte pathogene Einheit auf direkte Weise festzustellen,
aber es wird ein Lateral-Flow-Immunassay zum Feststellen des in
der behandelten biologischen Flüssigkeit
vorhandenen Analyten verwendet.
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Das
Dokument US-5714343 beschreibt eine Vorrichtung, bestehend aus Saugkissen,
die von einer Rückhaltemembran
bedeckt sind. Die Flüssigkeit wird
durch die Rückhaltemembran
geführt
und die potenziell auf der Membran zurückgehaltenen Mikroorganismen
werden durch einen chromogenen Stoff sichtbar gemacht, das ein solches
Oxidationspotenzial hat, dass das Reagens durch mikrobielle Dehydrogenase
reduziert werden kann, wodurch ein sichtbar gefärbtes Produkt erhalten wird,
das das Vorhandensein von Mikroorganismen in der Probe anzeigt. Die
Rückhaltemembran
hat Poren (0,75 bis 1,2 μm), die
größer sind
als die De hydrogenase-aktiven Mikroorganismen, die sie zurückhalten
soll, das Festhalten der Bakterien auf solchen Filtern wird durch mechanische
Rückhaltung
erreicht. Der Grund für diese
unlogisch große
Porengröße, die
mit dem Risiko verwendet wird, dass eine große Menge des Analyten durch
den Filter hindurch tritt, ist das mögliche Auftreten von falsch
positiven Fällen
bei kleineren Poren, da andere reduzierende Verbindungen als Bakterien
(z. B. freie Reduktionsenzyme, Ascorbinsäure, Glutathion) zurückgehalten
werden könnten, was
zu falsch positiven Ergebnissen führt. Des Weiteren wird in Beispiel
1 bis 7 nur physiologisches Wasser beschrieben, obgleich die Vorrichtung
für die Wasser-,
Blut- Milch- und Harnanalyse nützlich
sein soll. Der prinzipielle Vorteil dieses Verfahrens ist das Signal
erzeugende Material, bestehend aus einem Chromogen, das nach der
Reaktion mit bakterieller Dehydrogenase einen sichtbaren Niederschlag
von Formozan bildet. Dadurch wird eine Kultur der Bakterien in vitro
für mehrere
Tage nach dem Sammeln auf der Rückhaltemembran
vermieden und viel Zeit gespart. Viele Bakterien und Hefen sowie
Leukozyten besitzen eine Dehydrogenaseaktivität und das Feststellungsverfahren
unterscheidet nicht zwischen ihnen, außer dass eine selektive Zerstörung von
Dehydrogenase stattfindet, die von gram-positiven Bakterien synthetisiert
wird, wobei die Dehydrogenase von gram-negativen Bakterien noch
immer aktiv ist. Diese selektive Zerstörung von Dehydrogenase, die
von gram-positiven Bakterien synthetisiert wird, wird entweder durch
Inkubation der Probe mit Octylglucosid, das die Dehydrogenaseaktivität aller
getesteten, gram-positiven Bakterien unterdrückt, oder ansonsten durch 0,5
M Guanidin erreicht, was die Dehydrogenaseaktivität einiger
grampositiven Bakterien unterdrückt,
während
mindestens ein gram-negatives Bakterium, Pseudomonas, ebenfalls
betroffen ist (nur lebende Bakterien besitzen aktive Dehydrogenase).
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Einer
der Nachteile der Technik ist daher, dass sie kein spezifisches
Feststellen erlaubt, da eine große Anzahl von Mikroorganismen,
die aktive Dehydrogenase und andere Reduktionsenzyme besitzen, festgestellt
und identifiziert wird.
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Die
Dokumente
US 4,695,537 und
US 4,808,518 unterstreichen
die Tatsache, dass hypertone Lösungen
von Substanzen, wie beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumthiocyanat,
Guanidin und andere, in Konzentrationen zwischen 1,0 und 5,0 M, vorzugsweise
zwischen 2,0 und 3,5 M, auf Antigene in Lösung und auf intrazellulär lokalisierte
Antigene angewandt werden können.
Diese Konzentrationen verringern die antigenen Eigenschaften des
Antigens nicht, verbessern aber das Ergebnis.
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Das
Dokument
EP 0 234 941 deutet
an, dass die Behandlung viraler Untereinheiten mit denaturierenden
Konzentrationen von Guanidin (von 5 bis 8 Molar) (nach Reinigung
des Virus und seinem Aufbrechen in Untereinheiten mit oberflächenaktiven Substanzen)
die Reinheit dieser Untereinheiten für die Adsorption von Antikörpern in
einem ELISA verbessert. Es ist bekannt, dass denaturierende Konzentrationen
chaotroper Substanzen Proteinkomplexe in Untereinheiten zerstören, wie
es bei den Alpha- und Betauntereinheiten von humanem Choriongonadotropin
der Fall ist. Manchmal, wie es bei den Untereinheiten von HCG der
Fall ist, wird die Immunogenität
der Untereinheiten nicht von dieser hypertonen Behandlung beeinflusst.
Tuberkelproteine werden durch Behandlung von tuberkulärem Material
mit chaotropen Substanzen (Guanidin, Harnstoff und Phenol) isoliert,
die das Tuberkelpathogen zu immunogenen Tuberkelproteinen reduzieren (FR-2082226).
Diese Dokumente lassen jedoch nicht den Schluss zu, dass das untersuchte
Pathogen ganz und intakt, ohne Reduktion zu Untereinheiten, erhalten
bleibt, so dass es eine Größe beibehält, die ausreichend
ist, damit es mechanisch auf einer Filtermembran zurückgehalten
und danach direkt festgestellt werden kann.
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ZIELE DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung
für das
schnelle Feststellen ganzer Mikroorganismen, welche die möglichen falsch
positiven oder falsch negativen Ergebnisse, die das aus dem Stand
der Technik bekannte Verfahren beeinträchtigen, nicht präsentieren
oder reduzieren.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
gibt derzeit noch kein einfaches Feststellungssystem, das in verschiedenen
Körperflüssigkeiten,
wie Serum, Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit,
Perikardflüssigkeit
etc., die auf einer Rückhaltemembran
kondensiert sind, auf direkte Weise, in einer empfindlichen Weise
und in einer spezifischen Weise das Vorhandensein ganzer Pathogene
zeigen kann, die zu dem Reich der Bakterien gehören, oder ansonsten eukaryotische
Parasiten wie Plasmodium falciparum oder Toxoplasma, obgleich eine
solche Feststellung die schnelle Diagnose mehrerer Pathogene stark verbessern
würde.
Ein solches System muss zwangsläufig
die spezifischen Bindungseigenschaften, die zwischen spezifischen
Bindungspartnern für die
festzustellenden Mikroorganismen bestehen, wie beispielsweise spezifische
Antikörper,
Protein A, Protein G, nutzen.
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Das
Auftreten falsch positiver Ergebnisse ist auf kontaminierende Substanzen,
die in den Körperflüssigkeiten
vorhanden sind, in denen die Mikroorganismen suspendiert sind, und
das von ihnen ausgelöste
Dämpfen
(Quenching) zurückzuführen, welche
an die Oberfläche
dieser Mikroorganismen adsorbieren und deren Erkennung durch spezifische Bindungspartner
verhindern (entweder, wenn diese Organismen in diesen Körperflüssigkeiten
in Suspension sind, oder nachdem diese Mikroorganismen auf der Oberfläche von
Rückhaltemembranen
aus diesen Flüssigkeiten
kondensiert worden sind).
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Die
vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Feststellen eines
Mikroorganismus oder mehrerer Mikroorganismen, die in einer flüssigen Probe,
vorzugsweise einer biologischen, flüssigen Probe, vorhanden sind,
wobei das Verfahren mindestens die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Eventuell Hinzufügen einer Reagenslösung, umfassend
eine chaotrope Substanz mit vorzugsweise einer Konzentration, die
Wasserstoffbindungen aufbrechen kann, zu der flüssigen Probe;
- (b) Filtrieren der flüssigen
Probe durch einen Filter mit einer Porengröße, die klein genug ist, um
den Durchtritt von Mikroorganismen durch den Filter zu verhindern,
aber groß genug
ist, um den Durchtritt des gesamten löslichen Materials, das in der
Probe vorhanden ist, zu gestatten, wobei die Mikroorganismen auf
dem Filter zurückgehalten
werden;
- (c) Eventuell Hindurchführen
der Reagenslösung, umfassend
eine chaotrope Substanz, durch den Filter, auf dem sich die zurückgehaltenen
Mikroorganismen befinden, wobei die Lösung mit dem chaotropen Stoff
vorzugsweise eine Konzentration hat, die Wasserstoffbindungen aufbrechen
(unterdrücken)
kann, und
- (d) Hindurchführen
eines markierten Reagens oder mehrerer markierter Reagenzien durch
den Filter, wobei mindestens eines der Reagenzien für die festzustellenden
Mikroorganismen spezifisch ist.
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Die
Lösung
mit der chaotropen Substanz umfasst Harnstoff, Guanidin, Thioharnstoff,
Isothiocyanat oder einer Mischung davon und die Konzentration der
chaotropen Substanz in der Lösung
ist höher
als 2 M, vorzugsweise zwischen 4 und 8 M (denaturierende Konzentration).
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Die
Mikroorganismen könnten
in jeder biologischen Probe vorhanden sein, vorzugsweise in einer
geladenen biologischen Probe, wie Sputum, Blut, Serum, Plasma, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit oder
Harn, die von einem tierischen Patienten stammen, einschließlich dem
Menschen, und sind vorzugsweise pathogene Bakterien oder eukaryotische Parasiten,
die entweder gleichzeitig oder nacheinander festgestellt werden.
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Kontaminierende
Stoffe von Getränken
und Lebensmitteln, wie Listerien, Hefen und Schimmelpilze, sind
ebenfalls feststellbar. Die Art von Filter, die verwendet wird,
um die untersuchten Analyten zurückzuhalten,
ist in der Regel Cellulose, Papier, Nitrozellulose oder Nylon oder
andere Arten, die von Experten ausgewählt sind.
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Bei
den spezifisch markierten Reagenzien, die für das Feststellen von Mikroorganismen
verwendet werden, handelt es sich vorzugsweise um Antikörper, die
eventuell direkt oder indirekt an einen Marker gekoppelt sind, wie
beispielsweise Goldmizellen, Biotin, Enzyme, Chromophoren, gefärbte Latexkügelchen,
Fluorophoren, radioaktive Verbindungen oder eine Mischung davon.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit, umfassend Mittel
und Medien zum Durchführen des
erfindungsgemäßen Feststellungsverfahrens, wobei
der Kit Filtermembranen von vorbestimmter Porengröße, um spezifische
Mikroorganismen zurückzuhalten,
eine oder mehrere chaotrope Substanzen, ein markiertes Reagens oder
mehrere markierte Reagenzien (Signal erzeugende Reagenzien) umfasst,
wobei eines davon für
die überwachten
Mikroorganismen spezifisch ist.
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Falls
erforderlich, können
das Verfahren und der Kit angepasst werden, um das schnelle Feststellen
von Mikroorganismen in einer Probe zu erlauben, indem ein Automat
und Mittel zum automatischen Durchführen des erfindungsgemäßen, spezifischen Feststellens
verwendet werden.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Das
Vorhandensein von Mikroorganismen wie dem Koch Bazillus (Mycobacterium
tuberculosis), Plasmodium falciparum oder anderen, schwierig zu
diagnostizierenden Bakterien und Parasiten, wie Leishmaniasis, Gonorrhoe,
Syphilis, Lyme-Borreliose sowie Meningitis, die von unterschiedlichen
Vektoren wie Neisseria, Haemophilus, Streptococcus und Listeria
verursacht werden, und von Hefen und Würmern in menschlichem und tierischem
Serum und anderen Körperflüssigkeiten
wird festgestellt, indem die in diesen Flüssigkeiten vorhandenen Mikroorganismen
auf der Oberfläche
einer Membran, welche den Durchtritt der Flüssigkeit erlaubt, die Mikroorganismen
aber auf ihrer Oberfläche
zurückhält, kondensiert
werden. Danach werden durch Waschen der Membran zum Eliminieren
von Verunreinigungen, Behandeln der Membran mit einem chaotropen
Stoff wie Guanidin, Harnstoff, Guanidinisothiocyanat oder einem ähnlichen
Stoff in Konzentrationen, die hoch genug sind, um die Mikroorganismen
von allen dämpfenden
Elementen, die ihre Erkennung durch spezifische Bindungspartner
verhindern, zu reinigen, die Rückhaltemembran
und die auf ihrer Oberfläche kondensierten
Mikroorganismen mit einem für
die Mikroorganismen spezifischen Bindungspartner, wie beispielsweise
Antikörper,
behandelt, danach wird die Membran von überschüssigem Bindungsreagens befreit
und die an den Mikroorganismen gebundenen Antikörper mit einem Bindungspartner
markiert, der spezifisch für
die Klasse von Gammaglobulinen der Tierart ist, in der Antikörper gegen
die Mikroorganismen erzeugt wurden, z. B. Kaninchen, Ziege, Esel, beispielsweise
Antikörper
gegen Gammaglobuline vom Kaninchen oder der Ziege oder dem Esel,
Protein A oder Protein G, wobei der Bindungspartner selbst an einen
Marker gekoppelt ist (d. h. ein Mittel, das die Markierung amplifizieren
kann, wie beispielsweise kolloidales Gold oder ein Endenzym).
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Das
Feststellen von Mikroorganismen mit der Größe von Bakterien oder größer (Spirochäten, Trypanosomen
und Würmer),
die in Körperflüssigkeiten
wie Serum und Urin vorhanden sind und mittels spezifischer Bindungspartner
wie Antikörper,
Protein A oder Protein G erhalten werden, ist nicht einfach.
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Mikroorganismen,
die sich in Lösung
befinden oder auf der Oberfläche
einer Membran kondensiert sind, widerstehen jedoch der aufbrechenden Wirkung
höherer
molarer Konzentrationen von chaotropen Substanzen wie Guanidin,
Harnstoff, Thiocyanat, Thioharnstoff, Isothiocyanat, Perchlorat,
etc., während
sie damit leicht für
spezifische Bindungspartner erkennbar werden. Dieselben Mikroorganismen,
die aus denselben Seren auf denselben Rückhaltemembranen kondensiert
wurden und mit denselben chaotropen Substanzen behandelt wurden, deren
Molarität
zu gering war, um ihre aufbrechende Wirkung auf Proteine zu nutzen
(wie beispielsweise 0,5-molares Guanidin, das verwendet wird, um
die Aktivität
der Deyhdrogenase bei grampositiven Bakterien zu zerstören), werden
nicht von ihren spezifischen Bindungspartnern erkannt. Bei der Durchführung eines
Immunassays ist daher unerwarteterweise eine zehnmal höhere Konzentration
der chaotropen Substanzen vorteilhaft.
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Um
eine Wirkung zu erhalten, sind Molaritäten von Harnstoff und Guanidin
im Bereich von etwa 4 bis 8 erforderlich. Bei anderen chaotropen
Substanzen, wie Thioharnstoff und Isocyanat, sind geringere Konzentrationen
im Bereich zwischen 2 und 5 Molar ausreichend.
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Lange
Zeit sind hohe molare Konzentrationen chaotroper Substanzen wie
Guanidin und Harnstoff angewandt worden, meistens zusammen mit organischen
Lösungsmitteln
wie Phenol und Chloroform, um die Nukleinsäuren DNS und RNS aus eukaryotischen
Zellen, Bakterienzellen wie Escherichia coli und aus Viruseinheiten
freizusetzen. Die Tatsache, dass Nukleinsäure nach Behandlung von Zellen und
Viren mit chaotropen Substanzen erhalten wird, zeigt, dass die Zellmembranen,
die Zellkernmembranen und die Tertiärstrukturen von Proteinen in
Viren durch diese Behandlung zerstört werden. Diese Wirkung schließt jede
offensichtliche Anwendung chaotroper Substanzen in hohen molaren
Konzentrationen für
den Zweck der vorliegenden Erfindung aus.
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Derzeit
werden chaotrope Substanzen wie Harnstoff und Guanidin, die in Konzentrationen
im Bereich zwischen 4 und 8 Molar angewandt werden und aufgrund
der Nutzung ihrer proteindenaturierenden Eigenschaften und ihrer
Fähigkeit
zur Unterdrückung
von Wasserstoffbindungen nützlich
und erforderlich sind, verwendet, um entweder Proteine aus Nukleinsäurezubereitungen
zu entfernen oder ansonsten um Proteinuntereinheiten zu trennen,
die danach durch Auftrennungsverfahren, die auf den unterschiedlichen
physikalisch-chemischen Eigenschaften der getrennten Produkte beruhen,
isoliert werden. Beispielsweise werden die Alpha- und Beta-Untereinheiten von Choriogonadotropin
unter Vorhandensein von 8-molarem Harnstoff bei 40 °C getrennt
und die beiden Untereinheiten danach durch Hindurchführen durch
eine DEAE-Cellulose-Chromatographiesäule isoliert. Gereinigte Tuberkelproteine werden
isoliert, indem das Tuberkelmaterial bei einem sauren pH-Wert einem
Präzipitationsschritt
unterzogen wird, der unter Vorhandensein einer Substanz, wie beispielsweise
Harnstoff, Guanidin, Formamid, Phenol, etc., durchgeführt wird,
die in der Lage ist, Wasserstoffbindungen aufzubrechen. Das ausgefällte Material
wird danach mit einer modifizierten Cellulose in Kontakt gebracht,
die eine basische Gruppe wie beispielsweise DEAE trägt (siehe
Dokument DR-2082226). In diesen Fällen ist die Molarität der chaotropen
Substanz ausreichend hoch, um ihre aufbrechenden Eigenschaften auf
in Lösung
gehaltene Substanzen nutzen zu können
und zwar mit dem Ziel, eine Auftrennung und Solubilisierung der
verschiedenen, in der ursprünglichen
Zubereitung vorhandenen Substanzen zu bewirken.
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Das
Hauptproblem bei der Entwicklung von Assays, die auf das direkte
Feststellen von auf einer Rückhaltemembran
kondensierten Pathogenen abzielen, ist das Dämpfen (Quenching), das von
geladenen, flüssigen
Medien wie Serum ausgelöst
wird, wobei das Dämpfen
(Quenching) solcher Art ist, dass der Mikroorganismus von spezifischen
Bindungspartnern nicht mehr erkannt wird. Viele Seren lösen ein Dämpfen (Quenching)
aus, welches das Signal, das nach der Anwendung Signal produzierender
Elemente festgestellt wird, beträchtlich
verringert. Insbesondere reagiert das aus manchen Seren isolierte
und auf der Oberfläche
der Rückhaltemembran
kondensierte Pathogen nicht mit Antikörpern, die dagegen gerichtet
sind, was die Möglichkeit
der späteren Sichtbarmachung
des Vorhandenseins dieser Antikörper
durch Signal verstärkende
Bindungspartner wie Goldmarkiertes Protein A oder Peroxidase-markierte
und spezielle, Gammaglobuline-bindende Antikörper ausschließt. Während einige
Seren und weniger geladene Flüssigkeiten
wie Harn, Kulturmedium und Wasser in dieser Hinsicht zufrieden stellen
sind, schließt
die Tatsache, dass manche Seren falsch negative Ergebnisse auslösen, die
routinemäßige Verwendung
solcher Verfahren für
das Feststellen des Vorhandenseins von Pathogenen aus.
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Eher
unerwarteterweise wurde entdeckt, dass hohe molare Konzentrationen
chaotroper Substanzen wie Guanidin, Harnstoff, Thioharnstoff, Isocyanat,
die direkt auf die gerade analysierte, flüssige Probe und/oder auf die
Rückhaltemembran
nach dem Kondensieren der Mikroorganismen auf ihrer Oberfläche aufgetragen
werden, die Reaktion spezi fischer Bindungspartner mit den gerade
analysierten Mikroorganismen erheblich erleichtern. Wie in Dokument
US-5714343 beschrieben,
ist derzeit eine Vorrichtung, die aus einer Kartusche besteht, welche
mit einer Rückhaltemembran
bedeckte Saugkissen enthält,
zum Herstellen solcher Assays verfügbar. Die folgenden Versuche,
die als Beispiele dienen sollen, wurden unter Verwendung einer solchen
Vorrichtung durchgeführt.
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Beispiel 1
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500 μl Humanserum,
das mit Tuberkulosebazillus versetzt war, wurde über eine Membran geführt, deren
mittlere Porengröße 0,45
Mikron betrug. Diese Porengröße ist klein
genug, um die große
Mehrzahl der Bazillen zurückzuhalten,
deren mittlere Größe 0,6 × 4 μm beträgt. Nach
dem Hindurchführen
der flüssigen
Probe wurde die Rückhaltemembran
mit 200 μl
Waschmedium gewaschen. Die Membran wurde weiter mit 200 μl einer 6-molaren
Lösung
von Guanidinhydrochlorid bei einem pH-Wert von 8,0 gewaschen. Ein
Waschschritt mit 200 μl
Waschmedium beseitigte das Guanidin und die Membran wurde danach
mit 100 μl
einer verdünnten
Lösung
von Kaninchenantikörpern
gegen Mycobacterium tuberculosis behandelt. Die Antikörper wurden
aus Kaninchen erhalten, die wiederholt mit durch Hitze abgetötetem Mycobacterium
tuberculosis (Difco) angeimpft wurden. Nach einem Waschschritt mit
200 μl wurde
100 μl Gold-markiertes
Protein A in einer Konzentration von A520=0,75
aufgebracht, wobei ein positives Ergebnis aus einem rot-hellroten
Punkt in der Mitte der Membran bestand.
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Die
gleiche Analyse, die in Abwesenheit eines chaotropen Reagens durchgeführt wurde,
ergab stattdessen einen diffusen, kaum gefärbten Punkt.
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Die
gleiche Analyse, die mit einer Guanidinlösung durchgeführt wurde,
deren Konzentration auf etwa 4,5 Mol gesenkt wurde, ergab einen
Punkt, dessen Intensität ähnlich war
wie bei der Positivkontrolle (6-molares Guanidin).
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Die
gleiche Analyse, die mit einer Guanidinlösung durchgeführt wurde,
deren Konzentration auf 7 Mol erhöht wurde, ergab einen Punkt,
dessen Intensität ähnlich war
wie die, die mit einer 6-molaren Guanidinkonzentration erhalten
wurde.
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Beispiel 2
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Mit
einer Lösung,
die 7-molaren Harnstoff enthielt, wurde eine zu der in Beispiel
1 beschriebenen Analyse identische Analyse durchgeführt. Es wurde
das gleiche positive Ergebnis wie in Beispiel 1 erreicht, wohingegen
Konzentrationen unterhalb etwa 4,5 Molar kein zufrieden stellendes
Signal erbrachten. Eine Harnstoffkonzentration über etwa 8 Molar verringerte
das Signal.
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Beispiel 3
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Es
wurde das gleiche Experiment wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei
die Guanidinwaschlösung
mit konzentrierter HCl oder 10-molarer NaOH auf einen pH-Wert von
4, 0, 5, 0, 6, 0, 7, 0, 8, 0, 9, 0, 10, 0, 11, 0, 12, 0 und 13,
0 gebracht wurde. Die Lösungen
der chaotropen Substanz, dessen Säurestärke bei pH 6,0 oder darunter
lag, waren viel weniger zufrieden stellend als die, deren pH-Wert über dem neutralen
Wert lag. Bei einem basischen pH-Wert von 13,0 war das Signal reduziert.
Mit einer Guanidinlösung
mit pH 9,0 wurde ein optimales Signal erreicht.
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Beispiel 4
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Mit
den chaotropen Substanzen 4-molares Kaliumthiocyanat, 2-molares
Thioharnstoff, 6-molares Guanidin enthaltend 2-molaren Thioharnstoff, 3-molarer
Harnstoff gemischt mit 3-molarem Guanidin wurde das gleiche Experiment
wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Löslichkeitsschwierigkeiten
aufgrund des Vorhandenseins verschiedener oberflächenaktiver Substanzen, die
derzeit in Immunassays verwendet werden und dem Experten bekannt
sind, erlaubten keine höheren
Molaritätskonzentrationen
für Thiocyanat
und Thioharnstoff als die hier angewandten. Diese chaotropen Substanzen
waren gegenüber
allein verwendetem Harnstoff oder Guanidin nicht überlegen.
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Beispiel 5
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Diese
Experimente zeigten, dass eine Membran mit einer Porengröße von 0,45 μm eine zufrieden
stellende Rückhalteleistung
erbringt, wenn kein Sputum verwendet wird. Wenn dagegen Sputum verwendet
wird, neigt die Membran mit einer Porengröße von 0,45 μm dazu, leichter
zu verstopfen. Eine Membran mit einer größeren Porengröße ist bevorzugt.
Um den Durchfluss weiter zu begünstigen,
wird ein Glasfaservorfilter benötigt,
der in Sputum enthaltene, ungelöste
Substanzen und visköse
Substanzen zurückhält.
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In
der Abteilung für
Lungenheilkunde des Universitätskrankenhauses
Strasbourg (Frankreich) wurde einem Tuberkulosepatienten Sputum
entnommen. Das Sputum wurde routinemäßig untersucht und die Bazilloskopietechnik
auf der Basis der Ziehl-Nielsen-Färbung ergab, dass das Sputum TB-Bazillen
enthielt. Das Sputum wurde durch Zugabe von 0,25% N-Acetylcystein
und 1% NaOH (Endkonzentration) verflüssigt. Dieses Verflüssigungsverfahren
ist ein Standardverfahren in der Mykobakteriologie für die Behandlung
von Sputum vor dessen Verwendung in Kulturen. Das NaOH wird als
ein Verflüssigungsmedium
zugegeben und außerdem,
um die Probe zu dekontaminieren und alle anderen vorhandenen Bakterien
abzutöten,
bevor die Tuberkelbazillen in Kultur genommen werden. Das NaOH ist für die Verflüssigung
nicht unabdingbar und N-Acetylcystein in Konzentrationen zwischen 0,5%
und 2% und alkalischem pH-Wert kann Sputum innerhalb von zwei Minuten
verflüssigen.
Andere Verflüssigungsverfahren
auf der Basis von Hypochlorit oder Natriumdodecylsulfat arbeiten
genauso gut. In Ländern mit
geringem Einkommen kann insbesondere Bleiche geeignet sein, da sie
billig und vor Ort verfügbar ist
und die Integrität
der Rückhaltemembran
besser erhält
als NaOH. Es wurde eine Veränderung
der aus Nitrozellulose bestehenden Rückhaltemembran beobachtet,
wenn die Probenflüssigkeit
mit 1% NaOH behandelt wurde. Es war eine Neutralisierung der Flüssigkeit
mit HCl erforderlich, bevor sie auf eine Rückhaltemembran aus Nitrozellulose
geleitet wurde. Andere Verflüssigungsmittel
(Bleiche, Dithiothreitol) erwiesen sich als mit den verwendeten
Rückhaltemembranen
kompatibel. Jedes Verflüssigungsmittel,
das die Antigenität
der Bakterien aufrecht erhält und
die Rückhaltemembran
nicht verändert,
ist ausreichend.
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Auf
die Rückhaltemembran
aus Nitrozellulose wurde ein Glasfaservorfilter gelegt, um das in
dem verflüssigten
Sputum verbliebene, ungelöste
Material zurückzuhalten.
200 μl verflüssigtes
Sputum wurde durch den Vorfilter und die 0,8μm-Nitrozellulosemembran geführt, bevor
der Glasfaservorfilter entfernt wurde. Die Rückhaltemembran wurde zweimal mit
100 μl 0,2
M Phosphat pH 7,0 enthaltend 0,2 % Tween 20 gewaschen. Nach dem
Waschen wurde die Membran mit 6 M Guanidin behandelt und dann mit
einem Kaninchenantiserum gegen M. tuberculosis in Kontakt gebracht,
das in phosphatgepufferter Salzlösung
mit einem pH von 7,2 und enthaltend 0,2 5 Tween 20 geeignet auf
1:160 verdünnt
war. Nach einem Waschschritt wurde das auf der Membran vorhandene
Signal mit einem Reagens verstärkt,
das aus mit 30-nm Goldpartikeln sensibilisiertem Kaninchen-Anti-Ziege-IgG
bestand. Die Empfindlichkeit des Systems stellt etwa 3.000 mykobakterielle
Einheiten/ml fest.
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Beispiel 6
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Das
Feststellen von Mykobakterien in Sputum erfolgte wie in Beispiel
5 mit einer Membran, deren Porengröße 0,45 μm betrug. Diese kleine Porengröße erwies
sich als annehmbar, obwohl sie die Durchflussrate verzögerte, aber
ein langsamerer Durchfluss der Reagenzien verstärkte die Empfindlichkeit des
Verfahrens, indem er einen längeren Kontakt
und längere
Reaktionszeiten der Reagenzien mit den Antigenen erlaubte. Kaninchen-Anti-Mykobakterien-Serum
wurde verwendet, um das auf der Membran zurückgehaltene Antigen zu markieren. Der
sekundäre
Partner der Reaktion bestand aus Antikörpern gegen Kaninchen-IgG,
die im Esel hergestellt wurden. Der Verstärker war mit 30-nm-Goldpartikeln
markiertes Protein G, das gut mit Pferdeantikörpern reagiert. Es wurde eine
Empfindlichkeit von etwa 3.000 Einheiten/ml erreicht.
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Beispiel 7
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In
einem Experiment, das wie in Beispiel 5 durchgeführt wurde, wurde eine Membran
mit einer Porengröße von 0,45 μm verwendet,
um die in Sputum suspendierten Mykobakterien zu sammeln. Nach dem
Markieren der auf der Membran vorhandenen Mykobakterien mit spezifischen
Kaninchenantikörpern
wurde ein sekundärer
Bindungspartner, bestehend aus Protein-A-20nm-Kolloidal-Gold (Signal Chemical
Co., St. Louis, MO, USA), aufgetragen. Die Ergebnisse waren ähnlich wie
die in Beispiel 6, als der sekundäre Antikörper Gold-sensibilisiertes
Ziege-Anti-Kaninchen-IgG
war, d. h. 3000 Partikel/ml.
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Beispiel 8
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Durch
Chlamydia trachomatis verursachte Infektionen des Menschen betreffen
die Augen und den Genitaltrakt. Die Morphologie der Chlamydien gliedert
sich auf in Elementarkörperchen
(0,2 bis 0,4 μm),
die durch Immun fluoreszenz oder Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays
festgestellt werden können,
und Retikulärkörperchen,
welche die mikroskopisch selten beobachtete, intrazellulär metabolisch aktive
Form darstellen (0,6 bis 1,0 μm).
Die Labordiagnose beruht auf einer Vielzahl von Verfahren (Komplementfixierung,
Mikroimmunfluoreszenz, Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays, direkte
mikroskopische Untersuchung, Isolierung der Mikroorganismen und
Nukleinsäuretechniken).
Bei Infektionen des Genitaltraktes sind die Präparate für den Assay Abstriche aus der
Harnröhre
und der Zervix sowie Urin, mit dem Ziel, das ätiologische Agens festzustellen.
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Menschlicher
Urin wurde mit abnehmenden Mengen des Pathogens Chlamydia trachomatis-Elementarkörperchen
versetzt. Es wurden in Kaninchen hergestellte Antikörper verwendet,
um das Pathogen zu markieren. Eineinhalb Milliliter des versetzten Urins
wurde durch einen Filter mit einer mittleren Porengröße von 0,2 μm geführt, der
das Pathogen auf seiner Oberfläche
zurückhalten
konnte. Es wurde kein Vorfilter verwendet. Die Aufklärung des
Vorhandenseins des Pathogens erfolgte durch Behandeln der Membran
zunächst
mit 5 M Guanidin bei pH 8,0, danach mit den spezifischen Antikörpern, gefolgt
von Gold-Protein-A, das mit Kaninchen-Gammaglobulinen reagiert.
In einer zweiten Analyse wurden in Ziegen hergestellte Antikörper verwendet.
Gold-markiertes Protein G wurde verwendet, um das Vorhandensein
der Ziegenantikörpern
festzustellen, und schließlich
wurde ein Verstärker,
bestehend aus Goldmarkierten Gammaglobulinen vom Schwein, aufgetragen.
Die Empfindlichkeit dieses Feststellungssystems wurde mit der Empfindlichkeit
verglichen, die im Chlamydienschnelltest, einem kommerziell erhältlichen
diagnostischen Kit (Abbott), erhalten wird. Während ein einziges Verstärkungssystem
(Kaninchenantikörper
und Gold-Protein-A) ähnliche
Ergebnisse lieferte, wurde die Empfindlichkeit durch Verwendung
eines Verstärkers
(Gold-markierte Antikörper
vom Schwein) um das 2-Fache erhöht.
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Beispiel 9
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Toxoplasmose
wird durch Toxoplasma gondii verursacht, ein Sporentierchen, dessen
einzelne Zellen 4 bis 7 μm
lang sind. Die Diagnose beruht im Wesentlichen auf dem Feststellen
spezifischer Antikörper
im Serum, aber die am häufigsten
angegriffen Stellen sind die Lymphknoten, das Gehirn, die Augen und
die Lunge. Direkte Untersuchung des Sputums, vaginaler Exsudate,
der Rückenmark-,
Lungen- und Peritonealflüssigkeit
sind möglich,
werden aber selten durchgeführt.
Es gibt keinen diagnostischen Kit für die direkte Untersuchung
von Sputum und Körperflüssigkeiten.
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Toxoplasma
gondii-Organismen wurden mit Sputum gemischt, das Sputum wurde verflüssigt und 1
ml über
eine mit einem Vorfilter ausgestattete 0,8μm-Membran geführt. Es
wurde dieselbe Vorgehensweise wie in Beispiel 7 befolgt. Die Ergebnisse waren
hervorragend, wobei etwa 200 Pathogeneinheiten in der Probe festgestellt
wurden.
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Beispiel 10
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Für das Feststellen
von Neisseria gonorrhoeae sind wenige diagnostische Kits erhältlich.
Die Labordiagnose einer Gonokokkeninfektion beruht hauptsächlich auf
der Identifizierung des ätiologischen
Agens durch mikroskopische Untersuchung und durch Kultur. Kulturen
aus sterilen Stellen (Gehirn-Rückenmarkflüssigkeit,
Blut, Synovialflüssigkeit) liefern
in der Regel eine definitive Diagnose, aber positive Kulturen aus
nicht-sterilen Stellen sind von unsicherem Wert. Kommerziell ist
noch kein serologischer Test erhältlich.
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Sputum
wurde wie in Beispiel 5 mit bekannten Konzentrationen von Neisseria
gonorrhoeae-Antigen versetzt. Die Porengröße der Rückhaltemembran war 0,45 μm, kompatibel mit
der Größe der Organismen
(0,6 bis 1,0 μm
im Durchmesser). Die Verflüssigung
des Sputums erfolgte mit 0,2% Natriumdodecylsulfat bei pH 9,5, eine
Behandlung, welche die Immunreaktivität des Pathogens nicht verändert. Das Vorhandensein
von N. gonorrhoeae-spezifischem Kaninchen-IgG auf der Oberfläche der
Membran, welches das Vorhandensein des Pathogens anzeigt, wurde
weiter wie in Beispiel 7 verfolgt und ergab ähnliche Ergebnisse.
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Beispiel 11
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Die
mikroskopische Beobachtung der adulten Schizonten von Plasmodium
falciparum in Blutausstrichen stellt die Labordiagnose von Malaria
dar.
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Humanes,
frisches Vollblut wurde mit formalininaktivierten Schizonten versetzt.
Nach dem Versetzen wurde das Blut mit 1 % Nonidet P 40 (Endkonzentration)
hämolysiert
und 500 μl
der Flüssigkeit wurde über einen
Glasvorfilter geleitet und auf einer Rückhaltemembran mit einer Porengröße von 0,8 μm gesammelt.
In dieser Analyse erwies sich Guanidin in einer Konzentration von
4 Molar bei pH 8,0 als zufrieden stellend. Eine hohe Konzentration
von 8-molarem Harnstoff
erwies sich auch als geeignet, aber diese bemerkenswerte Resistenz
der Schizonten könnte
durch ihre Fixierung mit Formalin erhalten worden sein. Die zur
Markierung des Antigens verwendeten Mausantikörper wurden mit Gold-markiertem
Protein G erkannt. Charakteristische rote Punkte auf der Membran
zeigten das Vorhandensein einzelnen Organismen an.
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Es
wurde eine große
Anzahl von Möglichkeiten
untersucht, indem entweder mit Peroxidase oder mit Gold markierte
Antikörper,
mit Peroxidase oder mit Gold markiertes Protein A und Protein G
verwendet wurden, und auch die Nützlichkeit
des sekundären
Verstärkungsschrittes
wurde untersucht. Es stellte sich heraus, dass das in Beispiel 7
beschriebene Verfahren das zuverlässigste und einfachste Verfahren
war: 500 μl
bis 1,5 ml Probe (je nach Proteinladung der verarbeiteten Probe)
wird durch eine Rückhaltemembran
geführt.
Die vermutlich auf der Oberfläche
der Membran konzentrierten Organismen werden dann mit einer Lösung mit
6-molarem Guanidinhydrochlorid bei pH 8,0 behandelt. Nach einem Waschschritt
wird die Membran mit Kaninchenantikörpern gegen den Analyt behandelt
und das Vorhandensein der möglicherweise
an die antigenen Determinanten des Analyten haftenden Antikörper mit Goldmarkiertem
Protein A nachgewiesen.
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Beispiel 12
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Eine
direkte Behandlung der analysierten Probe mit hohen Konzentrationen
einer chaotropen Substanz vor der Konzentration des Analyten auf
der Rückhalteoberfläche einer
Filtermembran, eventuell gefolgt von einem Waschschritt mit dem
chaotropen Stoff, ergab die besten Ergebnisse.
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100 μl Sputum,
das durch mikroskopische Untersuchung positiv auf TB befunden wurde,
wurde mit 100 μl
Verflüssigungslösung bestehend
aus 5 % N-Acetylcystein und 0,5 % Mercaptoethanol in 1 % NaoH, die
auf pH 12,0 gebracht wurde, verflüssigt. Diese Verflüssigungslösung ist
Standardvorgehensweise, aber andere, dem Fachmann bekannte Verflüssigungsverfahren
(z. B. Natriumhyposulfit) eignen sich ebenfalls.
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Nachdem
das Sputum verdaut war (5 Minuten bei Raumtemperatur), wird die
Probe mit 1,3 ml einer Lösung
mit 7-molarem Guanidin bei pH 8,5, enthaltend 0,01 % Tween 20, gemischt
und nach Beispiel 7 verarbeitet.
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Nach
Abschluss des Tests wird in der Mitte ein roter Punkt beobachtet,
der nicht beobachtet wird, wenn negative Proben auf dieselbe Weise
verarbeitet werden.
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Beispiel 13
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100 μl Sputum,
das durch mikroskopische Untersuchung positiv auf TB befunden wurde,
wurde mit 100 μl
einer Lösung
mit 7-molarem Guanidin bei pH 12,0 gemischt. Nach Verflüssigung
des Sputums wurden der Mischung 100 μl NaClO bei 12° zugegeben
und das Sputum wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur verdaut.
Die Probe wurde danach mit 1,3 ml einer Lösung mit 7-molarem Guanidin
bei pH 8,5 gemischt und nach Beispiel 12 verarbeitet.
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Nach
Abschluss des Tests wird in der Mitte ein roter Punkt beobachtet,
der nicht beobachtet wird, wenn negative Proben auf dieselbe Weise
verarbeitet werden.