SE460803B - Saett att immunkemiskt bestaemma klamydia-infektion - Google Patents

Description

v I 3 * ' 460 eos .-2- (Stephens R et al, J Immunol 128 (1982) 1083-89; Stephens R et al, Thesis, Diss Abstracts Int 44 (1984) 3312 B; Caldwell H et al, Inf Immun 44 (1984) 306-14 och EP-A-193431). I det s k MOMP-proteinet (Major Outer Membrane Protein) har genus- och art- såväl som typ- och gruppspecifika antigen påvisats (Stephens R et al, loc cit; Caldwell MD et al, Inf Immun 31 (1981), och Batteiger as et ai, inf immun 52 (1986) sào-3).

Man har under de senaste åren framställt monoklonala anti- kroppar riktade mot dessa antigen och använt dem vid struk- turstudier och diagnos (se de nyss nämnda artiklarna).

Det finns flera tidigare kända metoder för att bestämma infektion av Chlamydia. Vid provtagningen användes vanligen en pinne med absorberande material, s k "swab". Proverna kan härstamma från öga, näsa, mun, hals, uro-genitala organ etc.

Provet kan härstamma från djur tillhörande Mammalia, speciellt människa, eller èvgs. Beroende på att bakterierna har en livscykel som till stor del är intracellulär, är det väsent- ligt att provet innehåller sàväl sekret (slem) som celler fràn provtagningsstället. Detta gör att klamydia-provers I//re sammansättning kan variera betydligt med provtagare, patient, provtagningsställe, tid etc, vilket i sin tur kan försvåra en direkt immunanalys av det ursprungliga patientprovet. Ett vanligt sätt att bestämma eventuell förekomst av bakterier i ett prov är genom odling. Mängden bakterier ökar då vilket gör att man lättare kan påvisa dem. Odling av Chlamydia är speciellt omständlig eftersom deras livscykel till stor del är intracellulär och därför fordrar lämpliga värdceller. För diagnos av klamydia-infektion har det därför varit speciellt angeläget att ta fram metoder med tillräcklig känslighet vilka utföres direkt pá patientprovet.

Pâ marknaden finns f n ett antal testsystem för direktanalys av patientprover. IDEIATM Chlamydia test (Boots-Celltech Diagnostics Limited, Berkshire, Storbritannien) och ChlamydiazymeTM (Abbot Laboratories, North Chicago, Ill., USA) är tvâ s k "solid phase"-metoder. Bada innebär att AL-HB/asw/pb 1987-04-13 * -- asap.- 460 803 l det absorberande materialet med provet förvaras i ett transportmedium till dess att analysen skall ske. I det förstnämnda testsystemet innehåller transportmediet agens som gör att bakterierna lyserar. När analysen sedan skall genomföras får frisatt antigen reagera med en genusspecifik anti-Chlamydia monoklonal som i förväg adsorberats till väggen i en mikrotiterbrunn. Därefter adderas till i brunnen befintligt transportmediet enzymmärkt anti-Chlamydia mono- klonal för att påvisa klamydia-antigen som immunkemiskt bundits till brunnsväggen. För att få upp känsligheten i systemet utnyttjas s k enzymkaskad, d v s produkten som bildas av det antikroppsbundna enzymet får delta i yttere ligare enzymreaktioner för att öka signalens styrka.

ChlamydiazymeTM skiljer sig väsentligt fràn IDEIATM Chlamydia Test. Metodologiskt är det tvâ skilda förfaranden. I IDEIATM Chlamydia Test bindes klamydia-antigen immunkemiskt till den s k fasta fasen (mikrotiterbrunn). Specificiteten i adsorp- tionen gör att nästa steg i reaktíonssekvensen - addering av enzymmärkt anti-Chlamydia monoklonal - kan ske utan före- gående separation och tvättning. Detta är ett mycket vanligt förfarande vid denna typ av tester (sandwich test) (se t ex US-A-4,376,1l0). I ChlamydiazymeTM bindes däremot antigen i lysatet icke-specifikt genom fysikalisk adsorption till den fasta fasen. Denna typ av förfaranden kallas vanligen för "coating" och följes alltid av ett separations- och tvätt- ningsförfarande innan antikropp riktad mot adsorberad antigen tillsättes. Tekniken är den för "coating" gängse.) ,f Förutom dessa viktiga metodologiska olikheter finns ett If antal andra mindre skillnader. För ChlamydiazymeTM gäller sålunda även att i) den fasta fasen är små kulor, ii) den anti-Chlamydia antikroppspreparation som användes för att påvisa adsorptivt bundet antigen är polyklonal och omärkt, och iii) anti-Chlamydia antikroppar bundna immunkemiskt till kulorna påvisas med hgälp av en enzymmärkt polyklonal anti-antikroppspreparation; Kombinationen av tvà antikropps- preparationer i ChlamydiazymeTM innebär, liksom vid all immunkemisk metodik, en ökad känslighet. Den leder till att ett extra reagens och ett extra inkubationssteg behövs.

AL-HB/asw/pb 1987-414-13 * ' 460 sos -4- \ o nu I mot Qcca O 0 gon c lotion c n n nous coon o: I 0 g an. I g n o . n n uno un: I ChlamydiazymeTM har beskrivits i US-A-4,497,899 där man som ' § alternativ till plastkulor även anger kärlväggar och som alternativ till polyklonal anti-Chlamydia trachomatis antikropp ger motsvarande monoklonal. US-A-4,497,899 nämner ingenting om att anti-Chlamydia antikroppen kan vara genus- specifik och riktad mot klamydia-LPS.

Förutom de två nyss nämnda finns det pà marknaden ett antal testsystem som utnyttjar mikroskopiering av provutstryk som behandlats med fluorescensmärkta anti-Chlamydia antikroppar (monoklonaler).

Uppfinningens ändamål är att erbjuda en ny immunkemisk testmetodologi för att i prover av animalt ursprung påvisa eventuell infektion av bakterier tillhörande släktet Chlamydia.

Uppfinningen möjliggör testförfaranden som kan vara snabbare ' och mindre reagenskrävande samtidigt som de kan ha en A känslighet som är minst densamma som för känd teknik.

Uppfinningen är ett immunkemiskt bestämningsförfarande för att påvisa infektion av bakterier tillhörande släktet §hlamydia hos fåglar och däggdjur, främst människa. För- farandet innebär att bakterier av släktet Chlamydia som eventuellt finns i ett prov lyseras i ett lyseringsmedium.

Förfarandet kännetecknas av att klamydia-antigen i lyse- ringsmediet sedan fysikaliskt adsorberas till lämplig fast fas, t ex en plastyta såsom väggen i en mikrotiterbrunn, disperserbara plastpartiklar, större kulor etc, för att sedan på den fasta fasen immunkemiskt påvisas. På den fasta fasen påvisat klamydia-antigen tas som en indikation på att Å kprovet innehåller antigenet, och att därmed även djuret från f vilket provet härstammar är infekterat av bakterier till- 1 hörande släktet Chlamydia. Att påvisa det adsorberade antigenet innebär enligt uppfinningen att man efter adsorp- tionen och utan att separera den fasta fasen från vätske- adderar en monoklonal mediet, i vilket lyseringen skett, anti-Chlamydia antikroppspreparation till mediet, så att AL~HÉ/asw/pb 1987-04-13 * v u» m* n wmírí, ._ .. _* W, n-.vwu 460 eos ¿ anti-Chlamxdia antikroppsaktiva komponenter i antikroppspre- parationen immunkemiskt kan reagera med till den fasta fasen adsorberat klamydia-antigen. Till den fasta fasen immun: kemiskt bunden antikroppsaktiv komponent tas som en indi- É kation på att klamydia-antigen fanns i provet. É Med fast fas avses en i använda reaktionsmedier olöslig fas som har förmåga att fysikaliskt adsorbera antigenen ifråga.

Vanligtvis är den hydrofob. Någon uppfángande antikropp eller annan komponent med biospecifik affinitet för kla- mydiaåantigen används inte.

Möjligheten att med bibehållande eller förbättrad känslighet kunna ta bort separationssteget som normalt alltid följer pà ett adsorptionssteg är klart överraskande. Vid adsorptionen skall betingelserna ge en optimal exponering av hydrofoba strukturer i antigenet under det att denna exponering skall vara minimal i det steg som ger testet dess specificitet (inkubering med antikropp).

Lxseringsmediet Som ovan nämnts tas prover för klinisk diagnostik av infektion av Chlamxdia med en s k "swab", som sedan förvaras tillslutet i lämpligt transportmedium. Efter transport, och i omedelbar anslutning till att analysen skall genomföras, lyseras' bakterierna i provet i lämpligt medium. Att lysera bakterier av släktet Chlamxdia tillhör känd teknik (se t ex US-A-4,497,988) och IDEIATM Chlamydia Test. Med nuvarande kunskaper är det för uppfinningen, liksom för metoden beskriven i US~A-4,497,899, fördelaktigt att använda detergenter såsom salter av deoxykolat eller andra gallsyror etc. Lyseringen sker för att öka känsligheten. Den mest fördelaktiga detergenten för uppfin- ningen anses för närvarande vara chenodeoxykolat. Koncentra- tionen av detergent i lyseringsmediet kan variera beroende .wllwfywwwmv-eflym -VH _. r på vilket klamydia-antigen som skall påvisas. För cheno- deoxykolat i kombination med monoklonala anti-MOMP anti- _ ä »fi-f 1:'- - ^ 1:a.

AL~HB/asw/pb 1987-04-13 * y <3; sark* I v “ 4so ans kroppar bör man välja en detergentkoncentration som är 0,2 - 1 % (w/v). Användes monoklonaler riktade mot LPS är deter- gentkoncentrationen mera kritiskt och för chenodeoxykolat bör den ligga mellan ca 2,0-2,6 mM, t ex 2,3 mM. Eftersom MOMP binds samman via disulfidbryggor är det fördelaktigt att använda reducerande agens som ditiotreitol om MOMP- proteinet är det protein som man avser pàvisa.V Lyseringen genomföres helst vid temperaturen 25-100 OC med föredragen snabb kokning på vattenbad följt av avsvalning. pH varierar beroende på detergent, men för chenodeoxykolat bör pH vara i intervallet 7-12. Lyseringsmediet är som regel buffrat med fosfat eller karbonat, men även andra buffert- system kan givetvis användas om de ej verkar störande pà testet. Generellt gäller att lyseringsbetingelserna skall vara valda så att de på ett optimalt sätt ger största möjliga känslighet och precision. Det är viktigt att komma ihåg att pH och buffertkapacitet skall vara valda så att man lätt kan ställa in det för immunreaktionen nödvändiga pH-värdet.

Anti-Chlamydia antikroppspreparatíon Med uttrycket anti-Chlamvdia antikroppspreparation avses att antikroppspreparationen är riktad mot genus-, art-, grupp- eller typspecifika antigen som främst finns hos släktet Chlamvdia. Antigenen ifråga får alltså inte finnas hos andra bakterier som är frekventa i samband med den typ av diagnostik som en given antikroppspreparation är avsedd att användas för (se t ex Science 220 (1983) 1279-81). Preparationerna är monoklonala och kan bestå av en enda monoklonal, före- trädesvis en genus- eller species-specifik (t ex för C. trachomatis), eller en blandning av ett ändligt antal olika monoklonaler (t ex mindre än 10 sàsom 2, 3, 4 eller Sf som var och en uppvisar specificitet mot en art, en grupp eller en typ av bakterier tillhörande släktet Chlamvdia.

Utgångspunkten för att välja rätt kombination är vad testet AL-HB/asw/pb 1987-04-13 * skall användas till. För humana prov tagna i uro-genitala organ kan man bara förvänta sig C. trachomatis varför sådana tester kan använda en genus- eller trachomatis-specifik mohoklonal även om kombinationer av grupp- och typspecifika monoklonaler kan vara acceptabla. Har man för avsikt att diagnosticera C. psittaci hos burfáglar (ex.vis papegojor såsom undulater) är en monoklonal specifik för C. psittaci det lämpliga valet, även om en genusspecifik monoklonal även skulle gå bra (C. trachomatis finns vad man vet inte hos papegojor).

Att framställa monoklonaler riktade mot genus-, art-, grupp- eller typspecifika klamydia-antigen tillhör känd teknik och har gjorts på ett flertal laboratorier runt om i världen. Se t ex de ovan givna artiklarna. Monoklonalerna finns även tillgängliga kommersiellt.

Preparationens antikroppsaktiva komponenter kan uppvisa en kovalent bunden analytiskt indikerbar grupp som en enzy- 'matiskt aktiv, radioaktiv, kemiluminescent, fluorescent, biotin etc grupp. Om preparationen innehåller märkta kom- ponenter kan dessa, när de immunkemiskt bundits till den fasta fasen, detekteras pà denna. I de fall att komponenterna man använder är omärkta går det att pá gängse sätt påvisa dem med hjälp av s k anti-antikroppar, som då i sin tur kan vara försedda med analytiskt indikerbara grupper. Prepara- tionens antikroppsaktiva komponenter kan_även användas i_ V form av antikroppsaktiva fragment av lämplig monoklonal, t ex Fab-, Fab'- eller F(ab')2-fragment.

Hittills har det visat sig att monoklonaler riktade mot den genusspecifika epitopen som finns i klamydia-LPS ger de bästa resultaten med uppfinningen.

De anti-Chlamydia antikroppsaktiva komponenter som utnyttjas föreligger som,aggregat i vilka flera antikroppsmolekyler och/eller märkgrupper kovalent bindes samman, t ex via AL-HB/asw/pb 1987-04-13 * 460 aus weosos -w- glutaraldehyd- eller disulfidkoppling. Aggregatet bör Å innehålla mer än 3 såsom mer än 6 eller 10 kovalent samman- “ bundna antikroppsmolekyler (intakta eller fragmenterade).

Antalet markörgrupper bör i aggregatet vara minst en perl antikroppsmolekyl. V Immunreaktionerna utföres vid pH och temperatur som är de _ É gängse för immunkemisk bestämningsmetodik, d v s pH bör vara 5 - 8,6 och temperaturen 0 - 40 °C, företrädesvis 4 - 40 °C. Reaktionsmedierna skall vara buffrade med buffert- system som uppvisar hög buffertkapacitet i pH-intervallet ovan, vilket innebär att de skall svara mot syraëbas-par som har ett pKa i intervallet. För att förhindra icke-specifik adsorption av anti-Chlamydia antikroppsaktiva komponenter bör en effektiv mängd av ett agens som blockerar sådan adsorption finnas i reaktionsmediet. Som exempel kan nämnas inerta proteiner. Fackmannen titrerar lätt in den optimala koncentrationen som för proteiner, t ex BSA eller likvärdigt protein, ligger under ca 2 % (w/v) men över 0,2 % (före- trädesvis över 1 %) (w/v).

Uppfinningen definieras av bifogade patentkrav som ingår som en del i beskrivningen och skall nu àskàdliggöras med patentexempel.

Reagenslösningar Lösning för att lysera och adsorbera (belägga, "coata") antigen till mikrotiterbrunnar: chenodeoxykolat 2,3 mM (=1 mg/ml), Nacl so mM,_Po2' 0,1 M, pa 7,1.

Lösning för att adsorbera olyserat material til mikro~ titerbrunnar (s k C03-beläggning): COš_ 50 mM, pH 9,6.

Tvätt1ösning= voi" 15 mm, Nacl 0,15 M, TweenR zø o,os % och pH 7,0 AL-HB/asw/pb l987~04-13 * Substratlösning (ALP): p-nitrofenylfosfat 3,3 mg/ml, I dietanolamin 1,04 M, MgCl2 0,1 mg/ml och pH 9,8 Transportlösning: POâ_ 15 mM, NaCl 200 mM och pH 7,1 Lösning för monoklonal-ALP-konjugat (ALP = alkaliskt fos- fatas): Bovint serumalbumin (BSA) 50 mg/ml, Tris 100 mM, TweenR 20 0,05 %, MgCl2 l mM, ZnCl2 0,1 mM och pH 8,0. f Framställning av ALP-konjugat: Detta skedde genom att monoklonal antikropp och ALP (alkaliskt fosfatas, Sigma, St. Louis, Miss., USA) var och en för sig reagerades med SPDP (N-succinimidyl 3-(2-pyridylditio) propionat, Pharmacia AB, Sverige) för att föra in 2-pyridyldisulfidgrupper. Därefter reducerades pyridyldisulfidgrupperna i ALP-SPDP till fria tiolgrupper, och sålunda tiolerat ALP fick i tiol-disulfid- utbytesreaktion reagera med monoklonal-SPDP-derivatet.

Syntesen utfördes enligt bruksanvisningen för SPDP så när som på att samtliga reaktionssteg utfördes i 20 mM PO:-, 0,15 M NaCl vid pH 7,2. Gelkromatografi av det behàllna konjugatet visade pà en molvikt som var över 106 dalton.

.Konjugatet var alltså ett s'k multikonjugat (US-A-4,232,l19).

Anti-mus-ALP konjugat var fràn Dupont New England Nuclear, Boston, Mass., USA. Substratlösningen för enzymet var P03- 50 mM, BSA 5 mg/ml, NaCl 150 mM,.TweenR 20 0,05 % och 4 pH 7,1.

Europium-kelat~monoklonal~konjugat: Europium-komplex med isotiocyanatfenvl EDTA kopplades till monoklonal anti- Chlamxdia antikropp enligt tidigare känd metod (Lövgren, T. et al.; In: Alternative Immunoassays, Ed. Collins, W.P., .ml-m Wiley s. sons Ltd. (1985) 203-17. i Pepparrotsperoxidas-monoklonal-konjugat: Peroxidas från pepparrot (HRP, Sigma Chemical Co, St. Louis, Miss., USA) kopplades efter aktivering med perjodat enligt tidigare känd metod (Boorsma och Strefkeerk, J Immunol 30 (1979) 245-55).

AL~HB/asw/pb 460 eos “T ..,«,-,. :w;«.~_\«,-v- v- ß., __ ,._-,,, __ _... . , M 4 . 4 4 4 K 460 803 _10¿ Framställning av monklonal antikropp Partiellt renade och intakta Chlamydia trachomatis serovar L2 ("elementary bodies", LZEB), stam 434-Bu (Abo universitet) samt äggodlat material (Lz) (Statens Bakteriologiska Laboratorium, Sverige).

I f f f l è§;¿ss§= S M _ _- I I šse2§i§ssi§s§§shsee= å: n FCA = Freuds Complete Adjuvans. FIA = Freuds Incomplete Adjuvans. 3 - 4 immuniseringar med 3 veckors mellanrum. l:a FCA sub. cut + fotsula. 2:a FIA, sub. cut + ip. 3:e FIA, sub. cut + ip. 50 /ug - 70 /ug protein per sprutning.

Möss: Stam Balb/c, (Statens Bakteriologiska Laboratorium, Sverige) 2 5 veckor gamla.

Mössen tappades och deras sera titrerades på L2-beläggning .H (mikrotiterbrunnar belagda med C. trachomatis L2) 3 dagar efter 2:a och 2 dagar efter 3:e immunisering. ALP-antimus- antikropp användes för att påvisa till brunnarna adsorberade antikroppar. Bästa serum efter 3:e immunisering bestämde i i vilken mus som utvaldes. It ÉEÉÉEÉESÉEÉL-QÉ y En utvald mus avlivades 3 dagar efter 3:e immuniseringen och mjälten togs ut för fusering med myelomcellinjen sp2/O (Flow V Laboratories, Irvine, Cal., USA) enligt de St. Groth et al Å; (Journal of Immunological Methods, 35 (1980) l~21) med “ PEG 4 000 (Merck, Darmstadt, Västtyskland).

Cellinjen reklonerades 2 ggr och har odlats med mellan- liggande frysningar och tiningar under en sammanlagd period av 10 månader utan att titer sjunkit eller IEF (isoelektrisk fokusering) mönster ändrats.

AL-HB/asw/pb (>\ n *w 1 r nu; an» 46Û 803 >-1'1»- Karaktäriseringar av den utvalda monoklonalen 1) 2) 3) 4) 5) 6) Subklass bestämdes med catcher-ELISA-metodik och med isotyp-specifika antisera som infàngande antikropp, IgG1, k. ' Titer bestämdes med ELISA-teknik på C03-beläggning av renade bakterier av olika serotyp. Resultat: 10-3 för odlingssupernatant och 10-6 för ascitesvätska.

Antikroppsproduktion hos de olika klonerna bestämdes med kvantitativ catcher-ELISA på odlingssupernatanter från stationärfaskulturer och pà ascitesvätska som renats med kromatografiska metoder (protein A, jon- byteskromatografi). Resultat: 5 /ug/ml (odlings- supernatant) och 1,5 mg/ml (ascitesvätska).

Bandning Mab in vitro/in vivo med IEF gav pI-värde pH 7,0 - 7,5. i Reaktivitetsbestämning genom indirekt immunofluorescens- mikroskopi på samtliga serotyper av Chlamydia trachomatis.

Resultat: genusreaktivitet.

Western Blot~teknik pà lysat av cellodlade bakterier visade: a) Reaktivitet var mot LPS. b) LPS-determinant som är genusrelaterad. c) Antikroppen hämmas inte av ketodeoxyoctanoic acid i ELISA, även i doser > 20 /ug/ml. d) Renade LPS-fraktioner från Salmonella minnesota Re mutant som helt saknar O-antigen visar ingen reaktion med monoklonalen. LPS från Salmonella tvghimurium ger heller ingen reaktion.

AL-HB/asw/pb 1987-04-13 * “4eo eos -12-_ EXEMPEL Ekempel på testprotokoll för uppfinningen: Kliniska prover tas med s k provtagningspinne och förvaras till dess att analysen skall ske i ett transportrör till- sammans med 0,1 ml transportlösning. Efter transporten till analyslaboratoriet försättes röret med 0,5 ml lyserings- medium, och skakas kraftigt varefter pinnen tas bort. Röret värmes sedan på kokande vattenbad och är efter avsvalning klart för analys. 100 /ul från varje prov får under 30 minuter adsorbera till plastytan i mikrotiterbrunnar. Temperatur 37 °C. Därefter sättes till brunnarna innehållande lyserings- lösningen 50 /ul ALP-monoklonal konjugat och blandningen får inkubera under 45 min vid 37 OC. Därpå tvättas brunnarna 4x med tvättlösning och 100 /ul substratlösning tillsätts.

Efter 60 minuter läses 0D405nm. Värden som ligger över de som erhålles för blankprov (0,05 Abs enligt ovan) positiva för Chlamydia. tas SOITI Ovanstående testprotokoll genomfördes på en konstant halt av klamydia-antigen (protein 30 ng/ml) och jäm- fördes med ett protokoll där tvätt (3x med PBS-Tween) utfördes mellan tillsats av prov och tillsats av _ konjugat (Fig. 1). Resultatet visar att analysen kan göras känsligare då tvättsteget ej används.

AI B. Testprotokollet ovan utfördes med tillsats av isolerat klamydia-antigen i olika mängd (enl proteinbestämning).

Samma tillsatser analyserades i ChlamydiazymeTM och jämförelsen presenteras i Fig. 2. Resultaten visar att uppfinningen kan ge en analytisk känslighet som väl mäter sig med ChlamydiazymeTM.

AL-HB/asw/pb 1987-04-13 * _1j_. 460"803 C. Testprotokollet ovan applicerades sedan på en klinisk situation och resultaten jämfördes med konventionell odlingsmetodik och med ChlamydiazymeTM. Metoderna visade mycket god överensstämmelse med varandra Uppfinningen Resultat: Chlamydiazyme O + - O + - d d l + 34 3 l + 34 4 1 1 n n g - 7 146 g - 7 145 Metodiken enligt uppfinningen bedömdes ha mycket stora praktiska fördelar framför ChlamydiazymeTM därför att den involverade färre reagens och färre inkubationssteg.

D. Antikroppens reaktivitet gentemot C. trachomatis serovar L2 “elementary bodies" (LZEB) och LPS från C. trachomatis jämförda med LPS från Salmonella rough, E. coli och Acinetobacter (den senare kan förekomma i uro-genitala prover och har LPS som liknar klamydia-LPS) àskådliggörs i nedanstående försök. Testprotokoll enligt ovan. Koncentrationerna gäller för blandningen transportlösning/lyseringsmedium.

Efter 60 minuters framkallning med p-nitrofenylfosfat mättes OD 405nm. Resultaten'blev§ _ Antigen Konc.* OD405nm chl-Lzzß 1 ng/ml 0,950 Chl-LPS 1 ng/ml 1,850 Salmonella rough LPS 1 /ug/ml 0,050 Acinetobacter LPS 1 /ug/ml 0,050 E. coli LPS 1 /ug/ml 0,040 -Obelagd - - 0,050 * Protein för L EB och torrvikt för övriga. 2 AL~HB/asw/pb l987~O4~l3 * :oil a 460 so3 -lf- E. Olika markörer (HRP, ALP eller Europium-kelat) bands' till den monoklonala antikroppen och olika mängder av konjugaten testades mot C03-adsorberat antigen (Fig. 3).

Försöket visade att samtliga konjugat var aktiva.

-F. För att få ett direkt mått pà vad den monoklonala antikroppen och borttagande av första tvättsteget i ChlamydiazymeTM betydde genomfördes det senare testet utan tvättsteg. Resultaten tydde på att känsligheten sjönk, d v s att i en klinisk situation skulle antalet falska negativa stiga.

Sammanfattningsvis gäller att försöken visar på att anti- Chlamvdia antikroppar som är monoklonala och riktade mot t ex genusspecifika epitoper i klamydia-LPS ger mycket stora och oväntade fördelar. I Figurer Fig. l redovisar försöket A. ovan. Mätvärden för uppfinningen' representeras med cirklar och för försök där separatione- och tvättsteg införts med trianglar.

Fig. 2 redovisar försöket B. ovan. Uppfinningen representeras med cirklar (OD4o5) och ChlamydiazymeTM med trianglar (°°492)' Fig. 3 redovisar försöket E. Peroxidas redovisas med trianglar (OD492), ALP med cirklar (OD405) och Eu-kelat med kvadrater (eps).

AL-HB/asw/pb 1987-04-13 *

Claims (6)

t"15' - 46o eos PATENTKRAV '

1. Sätt att utan föregående odling immunkemiskt bestämma klamydia-infektion hos däggdjur och fåglar vid vilket i ett prov eventuellt förekommande bakterier av släktet Chlamydia lyseras i ett lyseringsmedium, kvä n n e - t e c k n a t av att 4 i) i lyseringsmediet efter lyseringen förekommande klamydia-antigen adsorberas fysikaliskt till en i lyseringsmediet olöslig fast fas, ii) i samband med lyseringen, företrädesvis efter adsorptionen, till lyseringsmediet sattes en monoklonal anti-Chlamvdia antikroppspreparation som immunkemiskt får reagera med till den fasta fasen adsorberat klamydia-antigen, varefter iii) till den fasta fasen immunkemiskt bunden anti~ kroppsaktiv komponent från antikroppspreparationen på i och för sig känt manér detekteras och tas som V en indikation på att däggdjuret eller fågeln fràn vilket provet härstammar har en klamydia-infektion. och av att den i steg (ii) använda antikroppsprepara- tionens anti-Chlamxdia antikroppsaktiva komponenter föreligger som aggregat vilka består av flera antikropps- molekyler som är kovalent sammanbundna.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n nte t e c k n a t av att antikroppspreparationen är riktad mot en för Chlamvdia unik epitop pà klamydia-LPS. IÉ

3. Sätt enligt krav 2, k ä n nge t e c k n a t av att ;f epitopen är genusspecifik. , V '¿ AL-HB/ësw/pb 1987-04-13 * o n \ ^' -16- _“' 460 803 ~ *

4. Sätt enligt någotflav kraven 1 - 3, k ä n n e t e c k - n a t av att anti-Chlamvdia antikroppspreparationens anti-Chlamvdia antikroppsaktiva komponenter innehåller minst 3 st antikroppsenheter som är kovalent samman- bundna.

S, Sätt enligt något av kraven l - 3, k ä n n e t e c k - n a t av att anti-Chlamydia antikroppspreparationens antikroppsaktiva komponenter är försedda med en ana- lytiskt indikerbar grupp.

6. Sätt enligt något av kraven 1 ~ 4, k ä n n e t e c k - n a t av att provet är av humant ursprung, företrädes- vis uro-genitalt. AL-HB/asw/pp l987-04-l3 *