WO2005042579A1 - 抗ｓａｒｓウイルス抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬 - Google Patents

抗ｓａｒｓウイルス抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2005042579A1
WO2005042579A1 PCT/JP2004/016099 JP2004016099W WO2005042579A1 WO 2005042579 A1 WO2005042579 A1 WO 2005042579A1 JP 2004016099 W JP2004016099 W JP 2004016099W WO 2005042579 A1 WO2005042579 A1 WO 2005042579A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
monoclonal antibody
hybridoma
sars
rsn
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/016099
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshiaki Uchida
Nobuyuki Fujii
Yoshihiro Kurano
Masahisa Okada
Hiroyuki Kogaki
Yasuji Kido
Kazushige Miyake
Original Assignee
Fujirebio Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujirebio Inc. filed Critical Fujirebio Inc.
Priority to US10/577,310 priority Critical patent/US20080254440A1/en
Priority to JP2005515168A priority patent/JPWO2005042579A1/ja
Publication of WO2005042579A1 publication Critical patent/WO2005042579A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae

Definitions

  • Anti-SARS virus antibody hybridoma producing the antibody, and immunoassay reagent using the antibody
  • the present invention relates to a monoclonal antibody against a nuclear capsid protein (hereinafter, referred to as "nucleoprotein") of a coronavirus (hereinafter, referred to as SARS virus) causing severe acute respiratory syndrome (SARS),
  • SARS virus coronavirus
  • the present invention relates to a hybridoma producing a monoclonal antibody, an immunoassay reagent or an immunoassay instrument for a SARS virus using the monoclonal antibody as a solid phase antibody and Z or a labeled antibody.
  • Non-Patent Document 1 The virus isolated from the patient was named SARS virus and was confirmed to be a new type of coronavirus. The entire gene sequence of this SARS virus has been decoded by the Michael Smith Genome Science Center in Pretty Columbia, Canada (Non-Patent Document 1).
  • a person infected with SARS develops a fever of over 38 degrees, cough, headache, dyspnea, etc. after a 2 to 7 day incubation period after being infected with the virus.
  • the symptoms of SARS-infected persons are similar to those of influenza, and it is necessary to determine early whether or not they are infected by the SARS virus in order to determine appropriate treatment.
  • the following methods are currently reported as methods for diagnosing the presence or absence of SARS virus infection.
  • Antibody measurement method by ELISA Antibody (IgMZlgA) in the serum of SARS patients can be detected from about 20 days after the appearance of clinical symptoms.
  • Immunofluorescence antibody method Immunofluorescence antibody method (Ig M detection) using SARS virus-infected VERO cells. Approximately 10 days after onset, serum antibodies can be detected.
  • PCR method Amplifies and detects SARS virus gene from various samples such as blood, feces, and respiratory secretions.
  • Non-Patent Document 1 Science; 2003 May 30; 300 (5624): 1394-9.
  • an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically recognizes a SARS virus, and to provide an immunoassay method, an immunoassay reagent or an immunoassay using the monoclonal antibody that detects the SARS virus.
  • a measuring instrument is provided.
  • the inventors of the present application made an effort to obtain an anti-SARS virus monoclonal antibody having specificity and high affinity for SARS virus, and as a result, the SARS virus was synthesized by polynucleotide synthesis using PCR. Nucleoprotein gene, a transformant containing the gene is prepared by genetic recombination technology, and immunization of an animal using the SARS virus nucleoprotein obtained as an immunogen is carried out. Thus, the desired monoclonal antibody was obtained. Furthermore, the present inventors were able to develop an immunoassay reagent using this monoclonal antibody.
  • the present invention provides an anti-SARS virus monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof against a nucleoprotein of coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS).
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • the present invention also provides a hybridoma that produces the above-described monoclonal antibody of the present invention, wherein the hybridoma is obtained by cell fusion of an anti-SARS virus monoclonal antibody-producing cell and a tumor cell. Offer.
  • the present invention provides an immunoassay reagent for SARS-causing coronavirus, wherein the monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof is used as at least one of a solid phase antibody and a labeled antibody.
  • the present invention provides an immunoassay for SARS-causing coronavirus having a detection zone in which an anti-SARS antibody is immobilized on a transfusable matrix and a labeled reagent zone in which a labeled anti-SARS antibody is movably spotted on the matrix.
  • an instrument wherein at least one of the antibody immobilized in the detection zone and the labeled anti-SARS antibody is the monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides an immunoassay using an antigen-antibody reaction between the anti-SARS virus monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present invention and a SARS virus in a test sample, whereby SARS in the test sample is determined.
  • a method for immunoassay of a SARS virus comprising measuring a virus.
  • the monoclonal antibody of the present invention has high specificity and affinity for a nucleoprotein of a SARS virus, and thus can be used for a highly sensitive SARS virus immunoassay. Further, the hybridoma of the present invention can provide a monoclonal antibody that specifically recognizes the SARS virus. Furthermore, the immunoassay reagent using the monoclonal antibody of the present invention can detect only a sample containing a SARS virus or a sample derived from a SARS patient by simple operation without dropping.
  • FIG. 1 is a diagram showing a restriction map of a nuclear protein expression plasmid pW6A used as an immunogen, which was used in Examples of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of a recombinant protein (S-N) expressed in an example of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Western blotting showing the reactivity of monoclonal antibodies (rSN-18 antibody, rSN-122 antibody, rSN-150 antibody) performed in Examples of the present invention. .
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of Western blotting showing the reactivity of monoclonal antibodies (rSN-21-2 antibody, rSN-29 antibody, rSN-122 antibody) performed in Examples of the present invention. is there.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view of one specific example of an immunoassay instrument using immunochromatography of the present invention.
  • the monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody against a nucleoprotein (ie, capsid protein) of a coronavirus that causes SARS (hereinafter, simply referred to as "nucleoprotein").
  • nucleoprotein ie, capsid protein
  • the “monoclonal antibody against the nucleoprotein” means a monoclonal antibody that reacts with the nucleoprotein with an antigen antibody.
  • an antibody fragment having a binding property to a corresponding antigen is obtained by decomposing the antibody with papain or pepsin (the present invention).
  • an "antigen-binding fragment" can be obtained in the detailed description, but the antigen-binding fragment of the monoclonal antibody of the present invention can also be used in the same manner as the monoclonal antibody of the present invention. Yes, and fall within the scope of the present invention.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by using a nucleoprotein as an immunogen.
  • the amino acid sequence of the nucleoprotein is known (Non-Patent Document 1), and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the nucleic acid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained using a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as an immunogen. Also, it may be a natural variant of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the nucleoprotein may be used as an immunogen even if it is not necessarily purified to a high degree of purity but is a crude product.
  • a protein in which other amino acid sequences are added to the N-terminus and Z- or C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 without affecting the immunogen may be used as the immunogen.
  • it can be obtained by using a partial region in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as an immunogen. Some of these regions are 10 Preferably, it contains more than one amino acid.
  • the upper limit of the size of the partial region is that the monoclonal antibody of the present invention can be induced even with a peptide having 10 to 50 amino acids, preferably 15 to 30 amino acids, which is less than the full length.
  • a peptide having 10 to 50 amino acids preferably 15 to 30 amino acids, which is less than the full length.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by using the peptide shown in SEQ ID NO: 3 (sequence comprising amino acids 244 to 260 and cysteine power) as an immunogen. You.
  • Such a relatively small peptide is convenient because it can be easily chemically synthesized using a commercially available peptide synthesizer.
  • such a relatively small peptide binds to a carrier protein such as, for example, keyhole limpet hemocyanin (KLH) serum serum albumin (BSA), and is used as an immunogen.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • BSA serum serum albumin
  • the immunogen it is preferable to use a nucleoprotein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a partial region thereof, particularly the full length of the nucleoprotein, but the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a partial region thereof is preferred.
  • the monoclonal antibody of the present invention may be induced even when a polypeptide in which a small number of amino acids are substituted and Z or deleted and Z or a small number of amino acids are inserted is used as an immunogen.
  • the amino acid sequence of such an immunogen preferably has the highest possible identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a partial region thereof. The identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • Amino acid sequence identity can be easily calculated using well-known computer software such as BLAST, and such software is also available on the Internet. Further, when a small number of amino acids are substituted, deleted and Z or inserted, the total number of substituted, deleted and Z or inserted amino acids is preferably one or several.
  • the 20 amino acids that make up the natural protein are neutral amino acids with low polar side chains (Gly, lie, Val, Leu, ala, Met, Pro) and neutral amino acids with hydrophilic side chains (Asn , Gin, Thr, Ser, Tyr Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp) Grouping can be performed, and substitution within each of these groups often does not substantially change the immunogenic properties.
  • the nucleoprotein of the SARS virus used as the immunogen is, for example, a gene recombination technique. It can be obtained by the following method using surgery.
  • a DNA fragment encoding a polypeptide substantially comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is obtained. That is, for example, the virus is extracted from the SARS virus, and RT-PCR is performed. That is, the terminal force of the N protein gene is also restricted to the region up to the restriction site Nhel (a restriction site, for example, an EcoRI recognition sequence is added to the 5 'end), and the region from the restriction site Nhel to the end of the N protein gene (3' Restriction sites, such as adding a BamHI recognition sequence), are each amplified by RT-PCR.
  • Nhel a restriction site, for example, an EcoRI recognition sequence is added to the 5 'end
  • each fragment is treated with a restriction enzyme and ligated, whereby a DNA fragment encoding a polypeptide substantially comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be obtained.
  • an expression vector can be prepared by inserting the DNA fragment into an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment encoding a polypeptide substantially comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 3 in the sequence listing can be obtained by chemical synthesis based on the above base sequence.
  • the DNA fragment thus obtained is introduced into an expression vector having an appropriate marker gene such as an ampicillin resistance gene, and a host such as Escherichia coli is transformed with the vector to obtain a transformant.
  • the SARS virus nucleoprotein can be obtained by culturing the transformant and purifying the culture.
  • a polypeptide containing the sequence represented by SEQ ID NO: 3 can be obtained according to a known synthesis method using a danigami synthesizer.
  • the anti-SARS virus monoclonal antibody is obtained by immunizing an animal with the above-mentioned immunogen, and hybridizing the antinuclear protein antibody-producing cells obtained from the animal with tumor cells by a conventional method using a hybridoma. Can be produced.
  • hybridomas can be obtained, for example, by the following method. That is, the nucleoprotein obtained as described above, together with Freund's complete adjuvant, is administered intraperitoneally or intravenously to an animal such as a mouse every two to three weeks in several divided doses. Immunize
  • antibody-producing cells derived from the spleen and the like obtained from the immunized animal are fused with immortalized cell types, such as myeloma cell lines, and tumor cells capable of growing in vitro such as selected myeloma cells.
  • immortalized cell types such as myeloma cell lines
  • tumor cells capable of growing in vitro such as selected myeloma cells.
  • the polyethylene glycol method can be applied according to Koehler-Milstein's ordinary method (Nature, 256, 495, 1975), or the Sendai virus method, etc. May also be employed.
  • a method for selecting a hybridoma that produces an antibody that recognizes the fused cell force SARS virus nucleoprotein can be performed, for example, as follows. That is, cells that survive in the HAT medium are selected as hybridomas from the fused cells. Next, the culture medium of the above-mentioned hybridoma is reacted on an Atsie plate on which a highly purified SARS virus nucleoprotein is immobilized. Further, the aseptate is reacted with anti-mouse immunoglobulin (Ig) or the like.
  • Ig anti-mouse immunoglobulin
  • the hybridoma of the present invention is not particularly limited as long as it is a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes a nucleoprotein.
  • a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes a nucleoprotein.
  • six types of hybridomas established by the present inventors by the above-described method are available. Hypridoma.
  • hybridomas are respectively hybridoma rSN-18, hybridoma rSN-122, hybridoma rSN-150, hybridoma rSN-21-2, hybridoma rSN-29, and hybridoma SN5— Named 25.
  • Each of the above hybridomas has been registered with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary [Address: Tsukuba, Ibaraki, Japan 1-1-1, Higashi No. 6], and the hybridoma rSN-18 has the accession number FERM P — 19 572 (Acceptance date; October 24, 2003), Neubridoma rSN—122, accession number FERM
  • accession number FERM BP-10143 is accession number FERM BP-10144
  • Each of the above hybridomas can be cultured in a medium usually used for cell culture.
  • a monoclonal antibody can be recovered from the culture supernatant.
  • Monoclonal antibodies can also be obtained by transplanting the hybridomas into the abdominal cavity of the animal species from which the hybridomas are derived, collecting the ascites fluid after waiting for growth, and then purifying the ascites fluid.
  • a conventional purification method can be used, and examples thereof include gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography using protein A. .
  • the reactivity of the above monoclonal antibody can be confirmed by an ordinary confirmation method.
  • the specificity of reactivity with the nucleoprotein of the SARS virus is confirmed as an index.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be used for immunoassay for detection or quantification of SARS virus.
  • the immunoassay method itself is well known, and any known immunoassay method can be adopted. That is, if classified according to the measurement format, there are sandwich method, competition method, agglutination method, Western plot method, etc.If classified according to the label used, there are fluorescence method, enzyme method, radiation method, biotin method, etc. Either can be used. Furthermore, the diagnosis can be made by immunohistological staining. When a labeled antibody is used for the immunoassay, the method of labeling the antibody itself is well known, and the well-known V and deviation methods can also be used.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof is used.
  • the first antibody is immobilized on a solid phase, reacted with a sample, washed, and then reacted with a second antibody that reacts with the enzyme of the present invention as an antigen-antibody. After washing, the second antibody bound to the solid phase is measured.
  • the second antibody bound to the solid phase can be measured.
  • the above method was used to measure a plurality of standard samples with known concentrations, and the relationship between the measured amount of label and the enzyme of the present invention in the standard sample was measured.
  • the enzyme of the present invention in the test sample can be quantified.
  • the first antibody and the second antibody may be interchanged with the above description.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof is immobilized on particles such as latex, and reacted with a sample to measure the absorbance.
  • a plurality of standard samples with known concentrations were measured by the above method, and a calibration curve was created based on the relationship between the measured label amount and the enzyme of the present invention in the standard sample. By applying the calibration curve, the enzyme of the present invention in the test sample can be quantified.
  • the sample to be subjected to the above immunoassay is not particularly limited as long as it contains a nucleoprotein of the SARS virus.
  • a nucleoprotein of the SARS virus for example, human or animal-derived serum, plasma, whole blood, and nasal swabs Fluids (nasal swabs), nasal aspirates, pharyngeal swabs (pharyngeal swabs) and other body fluid extracts, respiratory tract secretions, cell or tissue homogenates, and the like.
  • a SARS virus measurement reagent can be produced using the antibody as at least one of a solid phase antibody and a labeled antibody.
  • solid phases conventionally used in immunoassays can be used as the solid phase to which the monoclonal antibody is bound, such as various types of solid phases such as ELISA plates, latex, gelatin particles, magnetic particles, polystyrene, and glass, beads, and the like.
  • An insoluble carrier such as an infusible matrix is exemplified.
  • the labeled antibody can be produced by labeling the antibody with an enzyme, metal colloid particles, colored latex particles, a luminescent substance, a fluorescent substance, a radioactive substance, or the like.
  • Reagents used in enzyme immunoassays, radioimmunoassays, fluorescent immunoassays, and the like can be produced by combining these solid phase antibodies and reagents such as Z or labeled antibodies.
  • These measurement reagents are reagents for measuring a target antigen in a sample by a sandwich method or a competitive binding measurement method.
  • the SARS virus immunoassay device of the present invention is based on the principle of immunochromatography, and comprises a detection zone in which the monoclonal antibody of the present invention is immobilized on a transfusable matrix, and a labeled antibody of the present invention. It has a labeling reagent zone in which a SARS virus monoclonal antibody is movably spotted on the matrix.
  • the reagent for the immunoassay by the sandwich method includes, for example, the monochromator of the present invention. Two kinds of antibodies are prepared, and one of them is used as the labeled antibody, and the other is used as a solid phase antibody bound to the solid phase. First, the solid-phase antibody is reacted with a sample containing the antigen to be measured, and then the antigen captured by the solid-phase antibody is reacted with a labeled antibody (second antibody) to detect the presence of the labeled substance bound to the insoluble carrier. By detecting, an immunoassay can be performed.
  • the solid-phase antibody was reacted with a sample containing the antigen to be measured, and in the next step, the antigen captured by the solid-phase antibody was reacted with the labeled antibody (second antibody) to bind to the insoluble carrier.
  • An immunoassay can be performed by quantifying the amount of the antigen to be measured from the amount of the labeled substance, that is, the amount of the labeled antibody.
  • one monoclonal antibody can be used as a solid phase antibody and a labeled antibody (for example, when the antigen is a multimer), but two different epitopes of the antigen to be measured are usually used. It is preferred to use two or more antibodies that recognize.
  • a solid-phase antibody and a labeled antibody by selecting a monoclonal antibody that recognizes different epitopes. Further, for both the solid phase antibody and the labeled antibody, two or more types of monoclonal antibodies can be selected and used in combination.
  • an immunoassay reagent by a competitive binding assay for example, a fixed amount of a labeled virus antigen labeled with an enzyme, metal colloid particles, colored latex particles, a luminescent substance, a fluorescent substance, a radioactive substance or the like is prepared.
  • a fixed amount of the monoclonal antibody of the present invention the labeled virus antigen, and a sample containing the antigen to be measured are allowed to react competitively to bind to the antibody or to bind to the antibody.
  • the immunoassay can also be performed by quantifying the amount of antigen to be measured for the amount of labeled virus antigen.
  • a method such as a physical adsorption method or a chemical bonding method can be used to bind the antibody or antigen to a solid phase or a labeled substance (Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Supplement No. 31, 37-). 45 (1987)).
  • the anti-SARS virus monoclonal antibody of the present invention When the anti-SARS virus monoclonal antibody of the present invention is used in an immunoassay to which immunochromatography is applied, it is possible to detect SARS virus in a sample simply and without using a special measuring device. it can.
  • This measuring instrument is provided with a band-like matrix capable of infusion (development) by capillary action as an insoluble carrier, and the matrix is immobilized with at least one kind of anti-SARS virus monoclonal antibody. Inspection Exit zone, a labeled reagent zone in which a labeled anti-SARS virus monoclonal antibody is movably spotted, a sample spotting zone, and a developing solution supply zone in which a developing solution pad is attached to one end of the matrix in the longitudinal direction. And a developing liquid absorption zone provided at another end of the matrix in the longitudinal direction.
  • FIG. 5 shows a schematic cross-sectional view of a preferable example of such an immunoassay immunoassay instrument.
  • reference numeral 1 is an immunoassay device for immunochromatography
  • 2 is an infusible matrix
  • 3 is a developing solution supply zone having a dried substrate zone
  • 4 is a labeling reagent zone
  • 5 is a labeling reagent zone.
  • the developing solution absorption zone, 6 is the detection zone
  • 8 is the sample spotting zone
  • 9 is the sample
  • 10 is the developing solution.
  • each component of the immunoassay device will be described.
  • the matrix in this immunoassay device is composed of a strip of absorbent material capable of transporting liquids by capillary action.
  • the absorbent material include a filter paper, a membrane, and a porous material produced by using cellulose or a derivative thereof such as cellulose or nitrocellulose, glass fiber, or the like, alone or in combination.
  • the thickness of the matrix can be, for example, 100 m-1 mm.
  • the matrix may be partially or wholly used to prevent adsorption of a protein derived from a sample to the matrix due to a non-specific reaction during measurement, for example, animal serum such as bovine serum albumin (BSA), casein, sucrose, etc. Can be used after blocking.
  • animal serum such as bovine serum albumin (BSA), casein, sucrose, etc.
  • BSA bovine serum albumin
  • sucrose sucrose
  • the detection zone can be provided with a SARS virus detection section in which an anti-SARS virus monoclonal antibody is immobilized on the matrix.
  • the anti-SARS virus monoclonal antibody in the detection section is provided on a matrix, and is preferably provided in a line in a direction perpendicular to the direction of movement of the liquid developed on the matrix (the longitudinal direction of the matrix) in order to measure with high sensitivity. Is preferred.
  • the anti-SARS virus monoclonal antibody in this detection zone is the aforementioned antibody, Noclonal antibodies can be used alone or in combination.
  • the anti-SARS virus monoclonal antibody may be an IgG antibody, an IgM antibody, or a fragment of these antibodies, such as Fab, FaW, F (ab ').
  • the anti-SARS virus monoclonal antibody immobilized in the detection unit may be physically adsorbed directly to the detection zone of the matrix, or may be provided in the detection unit by immobilization by a chemical bond such as a covalent bond.
  • an anti-SARS virus monoclonal antibody may be bound to a water-insoluble carrier, and the carrier may be contained in a matrix.
  • the insoluble carrier include particles obtained by insoluble a mixture of gelatin, gum arabic and sodium hexametaphosphate (JP-B-63-22323), polystyrene latex particles, glass fibers and the like.
  • the insoluble carrier and the anti-SARS virus monoclonal antibody can be bound by the chemical bond or physical adsorption.
  • the detection unit is provided on the matrix, and is provided on the downstream side in the moving direction of the developing solution with respect to the labeling reagent zone, the sample spotting zone, and the developing solution supply zone, and the developing solution absorbing zone. Located upstream of.
  • the detection unit can be provided on the matrix as a line having a width of about 0.5 mm to 5 mm, or can be provided as a plurality of lines. If Ma Toritasu about width 5 mm, the antibodies and Z or antigen normally deposited respectively 0.1 8 shell 10 8 extent point, it is possible to produce a detection unit by drying.
  • the labeling reagent zone can be provided by movably spotting a labeled anti-SARS virus monoclonal antibody.
  • the labeling reagent zone can be provided on the upstream side of the detection zone in the moving direction of the developing solution from the developing solution supply zone.
  • This labeling reagent zone can be prepared by spotting the labeling reagent on the matrix, by laminating a water-absorbent pad containing the labeling reagent on the matrix, or by labeling a part or all of the matrix part that adheres to the pad together with the pad. It can be provided by a method of containing a reagent. As a water-absorbing node, a pad similar to a pad used in a sample spotting zone described later can be used.
  • At least one of the labeled antibodies is the anti-SARS virus monoclonal antibody of the present invention together with the antibody provided in the detection zone, and both antibodies are the anti-SARS virus monoclonal antibodies of the present invention. ! / ,.
  • Labeled anti-SARS virus monochrome As the null antibody, a fragment thereof can be used in the same manner as the antibody in the detection zone.
  • the labeled anti-SARS virus monoclonal antibody can be produced by binding the anti-SARS virus monoclonal antibody and a label.
  • Labels include enzymes, metal colloid particles, colored latex particles, fluorescent latex particles, luminescent substances, fluorescent substances, and the like.
  • the enzyme various enzymes used for enzyme immunoassay (EIA) can be used, and examples thereof include alkaline phosphatase, peroxidase, and
  • the metal colloid particles for example, gold colloid particles, selenium colloid particles and the like can be used.
  • a known method for forming a covalent bond or a non-covalent bond can be used as a method for binding the labeled substance to the anti-SARS virus monoclonal antibody.
  • the binding method include the dartalaldehyde method, the periodic acid method, the maleimide method, the pyridyl disulfide method, and the method using various crosslinking agents (for example, “Protein Nucleic Acid Enzyme”, Supplement No. 31, 37). See page 45 (1985)).
  • examples of the cross-linking agent include N-succinimidyl 4-maleimidobutyric acid (GMBS), N-succinimidyl 6-maleimidohexanoic acid, N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane 1 carbon An acid or the like can be used.
  • GMBS N-succinimidyl 4-maleimidobutyric acid
  • N-succinimidyl 6-maleimidohexanoic acid N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane 1 carbon
  • An acid or the like can be used.
  • functional groups existing in the antibody can be used, and a functional group such as, for example, a thiol group, an amino group, a carboxyl group, or a hydroxyl group can be introduced into the antibody by a conventional method.
  • a labeled anti-SARS virus monoclonal antibody can be produced by
  • the amount of the labeled anti-SARS virus monoclonal antibody is usually about 0.01 ⁇ g to about 5 ⁇ g in terms of dry weight, which can be appropriately changed depending on the expected amount of the test object.
  • the labeled anti-SARS virus monoclonal antibody can be applied together with a reagent stabilizing agent, a dissolution regulator and the like.
  • the sample spotting zone is on the downstream side in the moving direction of the developing solution in the developing solution supply zone, and
  • the matrix on the upstream side of the detection zone can be provided without particularly including a reagent or the like.
  • the sample spotting zone is 1) downstream of the developing solution supply zone in the developing solution moving direction and at a predetermined position on the upstream side of the labeling reagent zone, 2) downstream of the labeling reagent zone and the detection zone At a predetermined location on the upstream side of the labeling reagent, or 3) at a predetermined location on the labeling reagent zone.
  • a water-absorbing pad containing a labeling reagent as described above from the viewpoint of efficient analysis.
  • a large amount of the sample liquid can be spotted, so that a trace component in the sample can be measured with high detection sensitivity.
  • This water-absorbing pad is selected from materials that do not adsorb the labeling reagent or the SARS virus in the specimen, and is, for example, a porous synthetic or natural polymer such as polyvinyl alcohol (PVA), nonwoven fabric, or cellulose. Materials which also have a compound power can be constituted singly or in combination.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • Materials which also have a compound power can be constituted singly or in combination.
  • the size, thickness, density, etc. of the pad are not limited, it is usually necessary to use a pad having a length and width of about 3 mm to 10 mm and a thickness of about 0.5 mm to 4 mm for efficient measurement. preferable.
  • the developing liquid supply zone is a zone provided at one end in the longitudinal direction of the matrix and supplied with the developing liquid.
  • the measurement can be started by immersing this zone in a container containing the developing solution in an amount at least reaching the developing solution absorption zone.
  • a liquid tank containing the developing liquid may be added to the developing liquid supply zone, and the measurement may be started by breaking the cover of the liquid tank and bringing the developing liquid into contact with the matrix.
  • the developing solution can appropriately contain a surfactant, a buffer, a stabilizer, an antibacterial agent and the like.
  • a substrate can be added to the developing solution together with the substrate zone described later.
  • the buffer containing a buffer examples include an acetate buffer, a borate buffer, a tris-monohydrochloride buffer, a diethanolamine buffer and the like.
  • the developing liquid supply zone may be provided with a developing liquid pad for stably and continuously supplying the developing liquid to the matrix.
  • a developing liquid pad for example, filter paper such as cellulose or a cellulose derivative can be used.
  • the developing liquid absorption zone is provided at the other end with respect to the developing liquid supply zone provided at one end of the matrix. This zone is provided to absorb the developing solution supplied to the matrix and to smoothly perform the analysis.
  • the developing liquid absorption zone can be secured by forming the matrix to be long. In addition, by attaching a water-absorbing material to the matrix, an absorption zone can be formed. In this case, the spreading of the developing solution can be promoted.
  • a water-absorbing material a high-water-retentivity filter paper, sponge, or the like, which can be used as a natural polymer compound or a synthetic polymer compound, can be used.
  • the developing liquid absorption zone is provided with a pad-shaped absorbent material having a capacity to absorb all the developing liquid.
  • the developing solution absorption zone is provided by laminating the absorbent material on or under the matrix, a miniaturized immunoassay instrument can be manufactured.
  • the developing solution may contain a substrate as described above, or a substrate reagent zone may be provided in the matrix near the developing solution supply zone.
  • the substrate reagent zone is preferably provided so as to be impregnated with the developing solution node provided in the developing solution supply zone in order to increase the base mass and perform high-sensitivity measurement.
  • the substrate various chromogenic substrates, fluorescent substrates, luminescent substrates and the like shown below corresponding to the enzyme of the labeling reagent can be used.
  • Luminescent substrate For alkaline phosphatase: 3- (2'-spiroadamantane) 4-methoxy-4-(3 "-phosphoryloxy) phenyl- 1,2-dioxetane disodium salt (AMPPD) ⁇ -D
  • AMPPD phenyl- 1,2-dioxetane disodium salt
  • galactosidase 3- (2'-spiroadamantane) 4-methoxy-4- (3 "-j8-D -Galactopyranosinole) Feru 1,2-dioxetane (AMGPD)
  • the substrate zone can usually be formed by dissolving the substrate in an aqueous solution, applying the solution in a line to a developing solution pad, and then drying the solution. If desired, a signal enhancer, a stabilizer, and a solution A regulator and the like can also be added.
  • the substrate zone is not particularly limited as long as it is within the developing solution pad attached to the end of the matrix.
  • the base weight to be added to the developing solution and the developing solution pad can be determined according to the measurement conditions, but usually about 5 to 500 ⁇ g per instrument can be used.
  • the measurement reagent of the present invention can measure SARS virus in various sample samples.
  • the measurement is performed by first supplying the sample to the sample spotting zone of the measuring instrument of the present invention, then supplying the developing solution to the developing solution pad, and developing the matrix on the matrix.
  • the developing solution moves through the matrix by capillary action, reaches the developing solution absorption zone, and the components in the specimen that are not bound to the detection zone, the enzyme-labeled reagent, and the like are absorbed by the developing solution absorption zone, and the development is completed.
  • the detection zone After a lapse of a predetermined time (usually 10 to 20 minutes), the detection zone is observed, and the labeled substance immobilized on the detection section by the SARS virus antigen in the sample solution is detected and Z- or measured to detect the SARS virus. Can be measured.
  • This detection can be carried out visually, depending on the label, or using a measuring device such as a colorimeter, a fluorometer, a photon counter, a photosensitive film, or the like.
  • a method of visually measuring the color development of the detection zone is simple. This method also enables semi-quantitative analysis by using a color chart (color chart) corresponding to the concentration of SARS virus. Further, the color development of the detection zone can be quantified by a colorimeter or the like to perform quantitative determination.
  • the matrix can be laminated and fixed on a support member such as plastic, metal, paper or the like. Further, the matrix is fixed to a case made of plastic or the like, a liquid tank containing a developing solution is provided in a developing solution supply zone, and a cover having a hole in at least a sample spotting zone and a detection zone is provided. This makes it possible to construct an instrument that is easy to handle.
  • Samples that can be measured by the above reagents include those containing a nucleoprotein of the SARS virus. It is not particularly limited as long as it is, for example, human or animal-derived serum, plasma, whole blood, body fluid extracts such as nasal swabs (nasal swabs), nasal aspirates, pharyngeal swabs (pharyngeal swabs), Examples include airway secretions, cell or tissue homogenate solutions, and the like.
  • a solution obtained by treating the virus with a surfactant containing a SARS virus which can be used as it is, such as a nonionic surfactant or an anionic surfactant, can also be used.
  • a nonionic surfactant for example, Nordet (Nodet T-40), Triton, Brij and the like are used, and as the anionic surfactant, for example, SDS and the like are used.
  • the nuclear proteins of the SARS virus distributed in the cells, tissues and the like are obtained. Can also be measured directly. Further, using the monoclonal antibody of the present invention, so-called western blotting, affinity chromatography and the like can also be performed.
  • an antigen-binding fragment of the monoclonal antibody of the present invention can be used instead of the monoclonal antibody of the present invention.
  • N protein The nuclear protein (referred to as "N protein") gene is composed of 1270 base pairs in total length. Based on the previously reported gene sequence, the fragment is divided into two fragments before and after the restriction site Nhel, which hydrolyzes almost the middle of the N protein gene, and each has a 15-base overlap synthesized based on known sequence information
  • the 50-55 base oligomer was annealed, subjected to an extension reaction under the conditions of DNA synthesis, and then amplified sequentially by PCR. This operation was repeated to provide an EcoRI site on the 5 ′ side of the first half of the forward primer, a Nhel site on the third side of the reverse primer, and a BamHI site on the third side of the second half of the reverse primer.
  • the Nhel site was added to the 5th side of the forward primer, and PCR was performed.
  • BL21 (DE3) (obtained from Brookhaven National Laboratory) was transformed to obtain an ampicillin-resistant transformant Escherichia coli BL21 (DE3) / pWS-N.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the nucleoprotein are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the transformant prepared in Reference Example 1 was cultured at 37 ° C. in 2 ml of LB medium containing 50 g / ml of ampicillin. In the preliminary culture, the cells were grown until the OD at 600 nm became 0.6-0.8, and then the culture was supplemented with 0.4 mM IPTG to induce expression, and the cells were further cultured for 3 hours. The cells were collected by centrifuging 1.5 ml of the bacterial culture at 5000 rpm for 2 minutes, and suspended in 100 / z 1 buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M sodium chloride, ImMEDTA). The cells were completely disrupted by sonication for 15 minutes. This was used as a cell sample.
  • SDS polyacrylamide buffer 0.15 M Tris-HCl, ⁇ 6.8, 6% SDS, 24% glycerol, 6 mM EDTA, 2% 2-mercaptoethanol, 0.03% After bromophenol blue 41 was thoroughly stirred, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed. After electrophores
  • the anti-N5 peptide serum was used to immunize mice using the N5 peptide KLH conjugate prepared as described in Reference Example 4, and the blood power collected from the mice was also separated.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) / pWS-N prepared in Reference Example 1 was cultured under LB medium containing ampicillin at 37 ° C. The transformant was propagated in a preliminary culture, and after adjusting the OD at 600 nm to a density of about 0.7, 0.4 mM IPTG was added to induce expression. After culturing for 18 hours, centrifugation was performed to collect Escherichia coli. The recovered Escherichia coli was treated with 20 mM Tris-HCl pH 8.0, ImM PMSF (fermented methylsulfur fluoride), and subjected to sonication under ice cooling.
  • Tris-HCl pH 8.0 ImM PMSF (fermented methylsulfur fluoride)
  • ammonium sulfate was added to the soluble fraction S-N, and a 20-40% fraction was recovered.
  • This ammonium sulfate fraction was applied to SP Sepharose Fast Flow (manufactured by Amersham) equilibrated with 0.1 M sodium chloride, 8 M urea, and 20 mM phosphate buffer pH 6.9, and 0.2 M sodium chloride was added. Eluted with 8M urea, 20mM phosphate buffer pH 6.9 and purified. The eluted fraction was permeated with 0.2 M sodium chloride, 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0. The purity of this preparation was confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western plot as in Reference Example 2. The results showed a single band.
  • An anti-N protein monoclonal antibody was prepared by immunizing a mouse with the recombinant N protein prepared in Reference Example 3 and fusing spleen lymphocytes of the mouse with myeloma cells.
  • BALB / C mice were initially immunized with 50-100 g / mouse of recombinant N protein emulsified with Freund's complete adjuvant, and 2-3 weeks later, the same antigen 50-100 was emulsified with incomplete Freund's adjuvant.
  • Booster immunizations were performed with g / mouse.
  • the antibody titer was checked by solid-phase ELISA using a 96-well ELISA plate coated with recombinant N protein.
  • mice 25-100 g of free recombinant N protein was intravenously administered to the mouse in which the antibody titer was increased, and 3-4 days later, the mouse spleen was also removed and spleen cells were prepared.
  • Mouse myeloma cells (P3U1) and spleen cells were mixed at a ratio of 1: 2-1: 5, and cell fusion was performed using PEG (manufactured by Boehringer). The fused cells were suspended in a HAT medium, dispensed into a 96-well culture plate, and cultured in a 37 ° C CO incubator.
  • Screening was performed by the solid-phase ELISA described above. That is, the recombinant N protein is dispensed into 96-well ELISA plates (Pharmacia) at a concentration of 1 ⁇ g / ml at 50 ⁇ l / well, and left at 4 ° C for adsorption. I let it. Block the wells with 1% skim milk, wash three times with washing buffer (PBS containing 0.05% Tween 20), add the culture supernatant 501 of the cell-fused plate, and react at 37 ° C for 1 hour I let it.
  • washing buffer PBS containing 0.05% Tween 20
  • a POD-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody manufactured by DACO
  • DACO a POD-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody
  • the substrate ABTS was added, and a well showing color development was selected.
  • the cells in the selected wells are transferred to a 24-well culture plate and cultured in a CO incubator at 37 ° C.
  • hybridomas rSN-18, rSN-122, rSN-150, rSN-21-2 and rSN-29 producing the following anti-N protein monoclonal antibodies were established.
  • These hybridomas are deposited at the Patent Organism Depositary, and their deposit numbers are FERM P-19572, FERM P-19573, FERM P-19574, and accession numbers F ERMP-19619 and FERM P-, respectively. 19620.
  • These hybridomas were registered on October 18, 2004 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center [address: 1-1-1, Tsukuba, Higashi, Ibaraki, Japan, No. 6, Chuo No. 6].
  • rSN-18 has accession number FERM BP-10143
  • hybridoma rSN-122 has accession number FERM BP-10101
  • hybridoma rSN-150 has accession number FERM BP-10145
  • hybridoma rSN-21-2 has accession number FERM BP — 10146 and hybridoma rSN-29 have been transferred to the International Depository under accession number F ERM BP-10147.
  • each of the established monoclonal antibodies to the natural antigen was confirmed by WB using a concentrated virus suspension as a sample. Vero E6 cells were infected with the SARS virus Hanoi strain and cultured for 48 hours in a CO incubator.
  • TCID 7.95 ⁇ 10 6 / ml
  • E2CT-38 is an irrelevant monoclonal antibody that uses rSN-18, rSN-122, rSN-150, rSN-29, rSN-21-2, and rSN-122 antibodies as anti-N protein monoclonal antibodies.
  • WB was performed using the antibody as a negative control.
  • the reaction with the antibody is as follows. Each monoclonal antibody was shaken for 1 hour at room temperature with the antigen-transferred WB membrane, subjected to a reaction, and then washed three times with a washing buffer (PBS containing 0.05% Tween 20) (washing with shaking for 5 minutes). Next, a POD-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by DACO) was added, and the mixture was further reacted at room temperature for 1 hour. After washing with a washing buffer four times (washing with shaking for 5 minutes), a four-cloth naphthol solution of the substrate was added, and the band was confirmed. As shown in FIGS. 3 and 4, when each monoclonal antibody was used, a band was confirmed at a position corresponding to the N protein having a molecular weight of less than 50 Kd.
  • Example 3 Detection of N Protein in Virus Culture Supernatant by Sandwich ELISA Method
  • Sandwich ELISA was performed using recombinant N protein and virus culture supernatant as samples to confirm whether an N protein measurement system was established.
  • ELISA was performed as follows. That is, each monoclonal antibody is diluted with PBS (pH 7.4) to a concentration of 5 g / ml in a Falcon ELISA plate, and 50 1 is added to each well and allowed to stand at 4 ° C- ⁇ . Coated. Next, 150% / ⁇ of 1% BSA-PBS (pH 7.4) was added and left at 37 ° C. for 1 hour to perform masking.
  • the labeled antibody labeled with alkaline phosphatase was added to the well in a volume of 50 / well. And reacted at 37 ° C for 1 hour. After washing 3 times with the washing buffer, add 50 ⁇ l / ⁇ of the substrate p-trophyl phosphate (p-NPP), leave it at room temperature for 15 minutes, observe it visually, and measure the wavelength at 405 nm. did. As shown in Table 1, it was confirmed that ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ protein could be detected in all the monoclonal antibodies used in this example.
  • Example 4 Production of Alkaline Phosphatase-Labeled Anti-SARS Virus Monoclonal Antibody 2-iminothiolane hydrochloride (manufactured by Aldrich) was reacted with the anti-SARS virus monoclonal antibody produced in Example 1 to introduce a thiol group.
  • alkaline phosphatase having a maleimide group introduced therein was reacted with the antibody having a thiol group introduced thereinto, and subjected to gel filtration treatment to obtain a purified alkaline phosphatase-labeled anti-SARS virus monoclonal antibody.
  • the following sandwich ELISA was performed using the recombinant N protein and the culture supernatant of the inactivated Dani virus obtained by heat treatment at 56 ° C for 90 minutes.
  • Nunc IMMUNOMODULE MAXISORP plate was diluted with a phosphate buffer solution (pH 7.5) to a concentration of 10 to 15 ⁇ g / ml of each monoclonal antibody alone or a mixture thereof. 100 1 was added to each well and left at 4 ° C for immobilization. Then wash After washing each well three times with buffer [TBS containing 0.02% Triton X-100 (Tris buffered saline) pH 7.2], add 250 1 / well of 1% BSA-phosphate buffer (pH 7.4), The plate was allowed to stand at 37 ° C for blocking to prepare an antibody-immobilized plate.
  • a phosphate buffer solution pH 7.5
  • the recombinant N protein (1.0 ng / ml) diluted with the reaction solution (1% BSA, containing PBS, pH 7.5) and the virus culture supernatant (100 ⁇ l) were used. 1 / well) and reacted at room temperature (25 ° C) for 1 hour. At this time, the culture supernatant of cells not infected with the virus was used as a negative control.
  • the plate four times with washing buffer add 100 1 / ⁇ of the labeled antibody prepared in Example 4 alone or in a mixture of 1.0-5.0 g / ml, and react at room temperature (25 ° C) for 1 hour. I let it.
  • Table 2a and Table 2b show the results of the absorbance measurements measured for the recombinant ⁇ protein and the virus culture supernatant, respectively. As shown in Table 2a, in all the monoclonal antibodies, it was confirmed that the reactivity due to the combination was different, and it was possible to detect the recombinant N protein. In addition, as shown in Table 2b, almost the same reactivity as the recombinant N protein was observed with the virus culture supernatant.
  • Example 6 Measurement by Immunochromatography Rapid detection of N protein by immunochromatography was confirmed using the recombinant N protein and the inactivated virus culture supernatant obtained by heat treatment at 56 ° C for 90 minutes as a sample.
  • the immunoassay instrument 1 for immunochromatography shown in Fig. 5 was prepared as follows.
  • a nitrocellulose membrane 2 5 mm x 50 mm
  • 20 mg / ml of 5-bromo-4-cloth-3- indolyl-sodium phosphate (BCIP'Na) was used as a substrate and spotted onto a water-absorbent nonwoven fabric.
  • a developing solution supply zone 3 having a dried substrate zone 7 and a water-absorbing absorption pad (developing solution absorption zone 5) were provided at the other end.
  • a detection zone 6 was provided downstream of the labeling reagent zone 4 (sample spotting zone 8) in the membrane direction in the infusion direction.
  • Detection zone 6 was prepared by spotting monoclonal antibodies (lmg / ml) listed in Table 3a or b on a line and drying.
  • Labeling reagent zone 4 was produced by spotting single or two kinds of alkaline phosphatase-labeled monoclonal antibodies (35 ng / pad) shown in Table 3a or b on a water-absorbent nonwoven fabric and drying.
  • the labeling reagent zone 4 was attached to the above-mentioned trocellulose membrane provided with the detection zone 6 as it was or after blocking with PBS containing BSA.
  • a sample 9 prepared by diluting the recombinant N protein or the culture supernatant with Tris-buffered saline (sample treatment solution) containing 3% BSA (25-30 ⁇ l) was added to the sample spotting zone 8 provided above the labeling reagent zone 4. Subsequently, 300 1 of the developing solution 10 was dropped into the developing solution supply zone 3, and the sample and the substrate were spread on the nitrocellulose membrane. After 15 minutes, the appearance of the line in the detection zone 6 was confirmed. The results are shown in Table 3a.
  • the numerical value (color intensity) in the table is the detection level 15 minutes after the start of the reaction.
  • the figures are the dilution ratios at which the culture supernatant can be detected.
  • GQTVTKKSAAEASKKPRC SEQ ID NO: 3
  • PSSM-8 peptide synthesizer
  • the method for synthesizing the N5 peptide was in accordance with the method described in the synthesizer.
  • the synthesized peptide was bound to keyhole limpet 'and mosine (KLH) according to a conventional method to prepare a KLH conjugate.
  • KLH keyhole limpet 'and mosine
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody against the anti-N protein was prepared by immunizing a mouse with the N5 peptide KLH conjugate prepared in Reference Example 4 and fusing spleen lymphocytes of the mouse with myeoma cells. The details of the production method were performed according to the method described in Example 1, and screening was performed to establish a hybridoma SN5-25 producing an anti-N protein monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody obtained from this hybridoma was named SN5-25.
  • Example 4 alkaline phosphatase-labeled anti-SARS virus monoclonal antibodies shown in Table 4 were produced. Further, an antibody-immobilized plate shown in Table 4 was prepared in the same manner as in Example 5, and the measurement was performed using the virus culture supernatant. The results are shown in Table 4. The results showed that N protein in the virus culture supernatant could be detected with high sensitivity (samples with high dilution ratio) using a reagent using a monoclonal antibody with a peptide corresponding to SARS nucleoprotein (244-260) as the antigen. .
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be used for an immunoassay method for detecting or quantifying SARS virus in a sample, a reagent therefor, or an immunoassay instrument.
  • SEQ ID NO: 3 Peptide sequence that is also potent with amino acids 244-260 of SEQ ID NO: 2 and cysteine.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

ＳＡＲＳウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体を提供し、ＳＡＲＳウイルスを検出する該モノクローナル抗体を用いた免疫測定方法、免疫測定試薬又は免疫測定器具が開示されている。本発明のモノクローナル抗体は、重症急性呼吸器症候群（Severe acute respiratory syndrome ；ＳＡＲＳ）原因コロナウイルスの核タンパク質に対するモノクローナル抗体である。

Description

明 細 書
抗 SARSウィルス抗体、該抗体を産生するハイプリドーマ及び該抗体を 用いる免疫測定試薬
技術分野
[0001] 本発明は、重症急性呼吸器症候群（Severe acute respiratory syndrome ； SARS) 原因コロナウィルス（以下 SARSウィルスという）の核キヤプシドタンパク質（以下、「核 タンパク質」とする）に対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生する ハイプリドーマ、前記モノクローナル抗体を固相抗体及び Z又は標識抗体として用い る SARSウィルスの免疫測定試薬又は免疫測定器具に関する。
背景技術
[0002] 2002年から 2003年にかけて、重症肺炎感染患者が世界各地で報告され、感染 患者とともに多数の死亡者も報告された。患者力ゝら単離されたウィルスは、 SARSゥ ィルスと命名され、新型のコロナウィルスであることが確認された。この SARSウィルス の全遺伝子配列は、カナダ ·プリティシュコロンビア州のマイケル ·スミス ·ゲノム科学 センターによって解読されて ヽる (非特許文献 1)。
[0003] SARS感染者は、ウィルスに感染して 2日間から 7日間の潜伏期間後、 38度を超す 高熱、咳、頭痛、呼吸困難などを引き起こす。 SARS感染者の症状は、一見、インフ ルェンザの症状と似ており、適切な処置を決定するために、早期に SARSウィルスに よる感染か否かを判定することが求められて 、る。 SARSウィルスの感染の有無を診 断する方法として、現在以下の方法が報告されている。
1) ELISAによる抗体測定法: SARS患者血清中の抗体 (IgMZlgA)を、臨床症 状出現後約 20日目以降から検出することができる。
2)免疫蛍光抗体法： SARSウィルス感染 VERO細胞を用いた免疫蛍光抗体法 (Ig M検出）。発症後約 10日後から血清中の抗体を検出することができる。
3) PCR法:血液、便、気道分泌物などの様々な検体から SARSウィルス遺伝子を 増幅して検出する。
4)細胞培養法: SARS患者検体 (気道分泌物、血液）中のウィルスを VERO細胞 などの培養細胞へ感染させて検出する。
[0004] 非特許文献 1：サイエンス (Science)； 2003 May 30;300(5624)： 1394-9.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] これまでの SARSウィルスの感染を確認する方法は、抗体検査法では感染後 10日 目以降でなくては確認をすることができず、特に信頼性の高い蛍光抗体法は操作が 煩雑であった。また、 PCR法は、 SARS関連遺伝子を単離して増幅する必要があり、 特殊な増幅装置、測定装置を必要とし、簡便な測定法とはいえな力つた。更に、細胞 培養法は、一度に多数の検体を処理することが難しぐコロナウィルスへの感染の有 無は判別できるが、 SARSウィルスへの感染をこの方法だけで特定することはできな かった。 SARSウィルスを認識する抗体については、より優れた特異性及び親和性 が常に望まれている。
[0006] 本発明の目的は、上記現状に鑑み、 SARSウィルスを特異的に認識するモノクロ一 ナル抗体を提供し、 SARSウィルスを検出する該モノクローナル抗体を用いた免疫 測定方法、免疫測定試薬又は免疫測定器具を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本願発明者らは、 SARSウィルスに対して特異性を有し、かつ高い親和性を有する 抗 SARSウィルスモノクローナル抗体を得るべく努力した結果、 PCR法を利用したポ リヌクレオチド合成により SARSウィルスの核タンパク質遺伝子を得、遺伝子組換え 技術を用いて同遺伝子を含有する形質転換体を作製し、これから得た SARSウィル スの核タンパク質を免疫原として用いた動物への免疫を実施することによって、目的 のモノクローナル抗体を得た。更に、本発明者らは、このモノクローナル抗体を用い て免疫測定試薬を開発することができた。
[0008] すなわち、本発明は、重症急性呼吸器症候群（Severe acute respiratory syndrome ； SARS)原因コロナウィルスの核タンパク質に対する抗 SARSウィルスモノクローナ ル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。また、本発明は、上記本発明のモノク ローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、抗 SARSウィルスモノクローナル 抗体産生細胞と腫瘍細胞とを細胞融合させることよって得られるハイプリドーマを提 供する。さら〖こ、本発明は、上記本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性 断片を固相抗体及び標識抗体の少なくとも一方に用いた SARS原因コロナウィルス の免疫測定試薬を提供する。さらに本発明は、輸液可能なマトリクス上に抗 SARS抗 体を固定した検出ゾーンと、標識抗 SARS抗体を前記マトリクス上に移動可能に点 着した標識試薬ゾーンとを有する SARS原因コロナウィルスの免疫測定器具であつ て、前記検出ゾーンに固定した抗体及び標識抗 SARS抗体の少なくとも一方が上記 本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である器具を提供する。さら に、本発明は、上記本発明の抗 SARSウィルスモノクローナル抗体又はその抗原結 合性断片と、被検試料中の SARSウィルスとの抗原抗体反応を利用した免疫測定に より被検試料中の SARSウィルスを測定することを含む、 SARSウィルスの免疫測定 方法を提供する。
発明の効果
[0009] 本発明のモノクローナル抗体は、 SARSウィルスの核タンパク質に対する特異性及 び親和性が高 、ので、高感度な SARSウィルスの免疫測定法に利用することができ る。また、本発明のハイプリドーマは、 SARSウィルスを特異的に認識するモノクロ一 ナル抗体を提供することができる。更に、本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫 測定試薬は、簡便な操作で SARSウィルスを含む検体又は SARS患者由来の検体 のみを拾 、落としなく検出することができる。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]本発明の実施例で使用した、免疫原として用いた核タンパク質発現用プラスミド pW6Aの制限酵素地図を示す図である。
[図 2]本発明の実施例において発現させた、組換えタンパク質 (S-N)の SDS-ポリア クリルアミドゲル電気泳動の結果を模式的に示す図である。
[図 3]本発明の実施例にぉ ヽて行なった、モノクローナル抗体 (rSN-18抗体、 rSN-122抗体、 rSN-150抗体）の反応性を示すウェスタンブロット法の結果を示す図で める。
[図 4]本発明の実施例にぉ 、て行なった、モノクローナル抗体 (rSN-21-2抗体、 rSN-29抗体、 rSN-122抗体）の反応性を示すウェスタンブロット法の結果を示す図で ある。
[図 5]本発明のィムノクロマトグラフィーによる免疫測定器具の 1具体例の模式断面図 である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 上記の通り、本発明のモノクローナル抗体は、 SARSを引き起こすコロナウィルスの 核タンパク質 (すなわち、キヤプシドタンパク質）（以下、単に「核タンパク質」）に対す るモノクローナル抗体である。ここで、「核タンパク質に対するモノクローナル抗体」と は、核タンパク質と抗原抗体反応するモノクローナル抗体という意味である。従って、 核タンパク質を免疫原として作製されたモノクローナル抗体のみならず、核タンパク 質の一部領域又は核タンパク質若しくはその一部領域の変異体を免疫原として作製 されたモノクローナル抗体であっても、核タンパク質と抗原抗体反応するモノクローナ ル抗体は本発明の範囲に含まれる。
[0012] また、周知のとおり、抗体をパパイン分解やペプシンで分解することにより、 Fabフラ グメントゃ F(ab')フラグメントのような、対応抗原との結合性を有する抗体断片 (本明
2
細書にぉ 、て「抗原結合性断片」 t 、う)が得られることが知られて 、るが、本発明の モノクローナル抗体の抗原結合性断片も本発明のモノクローナル抗体と同様に用い ることができ、本発明の範囲内に入る。
[0013] 本発明のモノクローナル抗体は、核タンパク質を免疫原として用いて得ることができ る。核タンパク質のアミノ酸配列は公知であり（非特許文献 1)、該アミノ酸配列を配列 番号 2に示す。また、配列番号 2に示すアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を 配列番号 1に示す。従って、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号 2に示すアミ ノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として用いて得ることができる。また、配列番 号 2のアミノ酸配列の天然の変異体であってもよ 、。核タンパク質は必ずしも高純度 に精製されなくてもよぐ粗精製物であっても免疫原として使用することができる。また 、配列番号 2に示すアミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に、免疫原として影響を 与えな 、範囲で他のアミノ酸配列が付加されたタンパク質も免疫原として用いること ができる。あるいは、配列番号 2に示されるアミノ酸配列中の一部領域を免疫原として 用いても得ることができる場合がある。このような一部領域は、特異性の観点から 10 個以上のアミノ酸を含むことが好ましい。一部領域のサイズの上限は、全長未満であ る力 アミノ酸数が 10個ないし 50個、好ましくは 15個ないし 30個程度のペプチドでも 本発明のモノクローナル抗体を誘起することができる。例えば、下記実施例では、配 列番号 3 (配列番号 2のアミノ酸 244— 260とシスティン力 成る配列）に示すぺプチ ドを免疫原として用いて本発明のモノクローナル抗体が得られることが確認されてい る。このような比較的サイズの小さいペプチドは、市販のペプチド合成機を用いて容 易に化学合成できるので便利である。なお、このような比較的サイズの小さいぺプチ ドは、周知の通り、例えばキーホールリンペットへモシァニン (KLH)ゃゥシ血清アルブ ミン (BSA)のようなキャリアタンパク質に結合して免疫原として用いることにより、抗原性 をより高めることができる。
[0014] 免疫原としては、配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有する核タンパク質又はその 一部領域、特に核タンパク質全長を用いることが好ましいが、配列番号 2で示される アミノ酸配列又はその一部領域中の少数のアミノ酸が、置換及び Z若しくは欠失し並 びに Z又は少数のアミノ酸が挿入されたポリペプチドを免疫原として用いても本発明 のモノクローナル抗体が誘起される場合がある。このような免疫原のアミノ酸配列は、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列又はその一部領域とできるだけ高い同一性を有し ていることが好ましぐ同一性は好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上であ る。アミノ酸配列の同一性は、 BLASTのような周知のコンピューターソフトを用いて容 易に算出することができ、このようなソフトはインターネットによっても利用に供されて いる。さらに、少数のアミノ酸が置換、欠失及び Z又は挿入される場合、置換、欠失 及び Z又は挿入されるアミノ酸の総数は 1個ないし数個であることが好ましい。また、 天然のタンパク質を構成する 20種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸 (Gly, lie, Val, Leu, ala, Met, Pro),親水性側鎖を有する中性アミノ酸 (Asn, Gin, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸 (Asp, Glu)、塩基性アミノ酸 (Arg, Lys, His),芳香族 アミノ酸 (Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これら の各グループ内での置換であれば免疫原としての性質が実質的に変化しないことが 多い。
[0015] 上記免疫原として用いる SARSウィルスの核タンパク質は、例えば遺伝子組換え技 術を用いた以下のような方法によって得ることができる。
[0016] 核タンパク質をコードする遺伝子領域 (配列番号 1)を PCR法によって増幅すること によって、配列番号 2のアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドをコードする DNA 断片を得る。すなわち、たとえば、 SARSウィルス力も RNAを抽出し、 RT-PCRを実 施する。すなわち、 Nタンパク質遺伝子の 末端力も制限部位 Nhelまでの領域（5 ' 末端に制限部位、たとえば EcoRIの認識配列を付加する）と、制限部位 Nhelから Nタンパク質遺伝子の 末端までの領域（3' 末端に制限部位、たとえば BamHI の認識配列を付加する）とを、それぞれ RT— PCRにより増幅する。ついで、各断片を 制限酵素で処理し、ライゲーシヨンを行うことによって、配列番号 2のアミノ酸配列を実 質的に含むポリペプチドをコードする DNA断片を得ることができる。さらに、同 DNA 断片を適当な発現ベクターに挿入することにより、発現ベクターを作製することができ る。別法として、上記の塩基配列に基づいて、化学合成により、配列表の配列番号 2 又は 3のアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドをコードする DNA断片を得ること も可能である。こうして得た DNA断片を、アンピシリン耐性遺伝子等の適当な標識遺 伝子を有する発現ベクターに導入し、同ベクターにより大腸菌等の宿主を形質転換 し、形質転換体を得る。この形質転換体を培養し、培養物を精製することによって上 記 SARSウィルスの核タンパク質を得ることができる。また、配列番号 3で表される配 列を含むようなポリペプチドであればィ匕学合成装置による公知の合成方法に従い得 ることちでさる。
[0017] 上記抗 SARSウィルスモノクローナル抗体は、上記した免疫原で動物を免疫し、同 動物から得た抗核タンパク質抗体産生細胞と腫瘍細胞とを常法により細胞融合する ことによって得られるハイプリドーマにより産生させることができる。
[0018] 上記ノ、イブリドーマは、例えば以下の方法で得ることができる。即ち、上述のように して得た核タンパク質を、フロイントの完全アジュバンドとともに、数回に分けて、マウ ス等の動物に、 2— 3週間おきに、腹腔内又は静脈内投与することによって免疫する
。次いで、免疫した動物から得られた脾臓等に由来する抗体産生細胞と、骨髄腫細 胞株等の不死化細胞種力 選択されたミエローマ細胞等の試験管内で増殖可能な 腫瘍細胞とを融合させる。 [0019] 上記融合方法としては、例えばケーラーとミルシュタインの常法 (ネーチヤ一（Natu re)、 256卷、 495頁、 1975年）に従ってポリエチレングリコール法が適用可能であり 、又は、センダイウィルス法等も採用されうる。
[0020] 上記融合した細胞力 SARSウィルスの核タンパク質を認識する抗体を産生するハ イブリドーマを選択する方法は、例えば以下のようにして行うことができる。即ち、上記 融合した細胞から、 HAT培地中で、生存している細胞をハイプリドーマとして選択す る。次いで、上記ハイプリドーマの培養培地を、高純度に精製した SARSウィルスの 核タンパク質を固定ィ匕したアツセィプレート上で反応させる。更に、同アツセィプレー トを抗マウス免疫グロブリン (Ig)等と反応させる。このような EIA法等によって、 SARS ウィルスの核タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマを選択することができる。
[0021] 本発明のハイプリドーマとしては、核タンパク質を特異的に認識するモノクローナル 抗体を産生するハイプリドーマであれば特に限定されないが、例えば、本発明者らが 上述の方法によって榭立した 6種のハイプリドーマが挙げられる。
[0022] 上記 6種のハイプリドーマは、それぞれ、ハイプリドーマ rSN— 18、ハイプリドーマ rS N— 122、 ノヽイブリドーマ rSN— 150、ハイプリドーマ rSN— 21— 2、ハイプリドーマ rSN —29及びノヽイブリドーマ SN5— 25と命名された。上記各ハイブリドーマは、独立行政 法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター〔あて名；日本国茨城県つくば巿 東 1丁目 1番 1号中央第 6〕に、ハイプリドーマ rSN— 18は、受託番号 FERM P— 19 572 (受託日；平成 15年 10月 24日）、ノヽイブリドーマ rSN— 122は、受託番号 FERM
P— 19573 (受託日；平成 15年 10月 24日）、ノヽイブリドーマ rSN— 150は、受託番 号 FERM P— 19574 (受託日；平成 15年 10月 24日）、ハイブリドーマ rSN— 21— 2 は、受託番号 FERM P— 19619 (受託日；平成 15年 12月 26日）及びハイプリドー マ rSN— 29は、受託番号 FERM P— 19620 (受託日；平成 15年 12月 26日）として 寄託されている。これらハイプリドーマは、平成 16年 10月 18日、独立行政法人産業 技術総合研究所特許生物寄託センター〔あて名；日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 番 1号中央第 6〕に、ハイプリドーマ rSN— 18は受託番号 FERM BP— 10143、ハイ ブリドーマ rSN— 122は受託番号 FERM BP - 10144、ハイプリドーマ rSN - 150は 受託番号 FERM BP— 10145、ハイプリドーマ rSN— 21— 2は受託番号 FERM BP —10146及びハイプリドーマ rSN— 29は受託番号 FERM BP— 10147として国際寄 託に移管された。
[0023] 上記各ハイブリドーマは、通常、細胞培養に用いられる培地において培養すること 力 Sできる。同培養上清からはモノクローナル抗体を回収することができる。また、モノク ローナル抗体は、ハイプリドーマが由来する動物種の腹腔内にハイプリドーマを移植 し、増殖を待って腹水を採取し、これから精製すること〖こよって得ることもできる。
[0024] 上記モノクローナル抗体の回収方法としては、通常行われている精製方法を用いる ことができ、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロ ティン Aによるァフィユティークロマトグラフィー等が挙げられる。
[0025] 上記のモノクローナル抗体は、通常の確認方法よつてその反応性を確認することが できる。本発明の抗体においては、 SARSウィルスの核タンパク質との反応性の特異 性を指標として確認される。
[0026] 本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、 SARSウィルスの検出 又は定量のための免疫測定に用いることができる。免疫測定方法自体は、周知であ り、周知のいずれの免疫測定方法をも採用することができる。すなわち、測定形式で 分類すれば、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンプロット法などがあり、用い る標識で分類すれば蛍光法、酵素法、放射法、ピオチン法等があるが、これらのい ずれをも用いることができる。さらに、免疫組織染色によって診断することもできる。免 疫測定方法に標識抗体を用いる場合、抗体の標識方法自体は周知であり、周知の V、ずれの方法をも採用することができる。
[0027] なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はな 、が、 簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、本発明の抗体又はその抗原結合 性断片を第 1抗体として固相に不動化し、検体と反応させ、洗浄後、本発明の酵素と 抗原抗体反応する第 2抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した第 2抗体を測定す る。第 2抗体を酵素、蛍光物質、放射性物質、ピオチン等で標識しておくことにより固 相に結合した第 2抗体を測定することができる。濃度既知の複数の標準試料中につ いて上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の本発明の酵素の関係 に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料にっ 、ての測定結果をこの検量線 に当てはめることにより、被検試料中の本発明の酵素を定量することができる。なお、 第 1抗体と第 2抗体を上記の説明と入れ替えてもよい。また、凝集法では、ラテックス 等の粒子に本発明の抗体又はその抗原結合性断片を不動化し、検体と反応させて 吸光度を測定する。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、 測定された標識量と標準試料中の本発明の酵素の関係に基づき検量線を作成し、 未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被 検試料中の本発明の酵素を定量することができる。
[0028] 上記免疫測定法に供される検体としては、 SARSウィルスの核タンパク質を含むも のであれば特に限定されず、例えば、ヒト又は動物由来の血清、血漿、全血の他、鼻 腔ぬぐい液 (鼻腔スヮブ）、鼻腔吸引液、咽頭ぬぐい液（咽頭スヮブ)等の体液抽出液 、気道分泌物、細胞又は組織ホモジネート液等を挙げることができる。
[0029] 上記本発明に係るモノクローナル抗体を使用することにより、同抗体を固相抗体及 び標識抗体の少なくとも一方に用いて SARSウィルス測定試薬を製造することができ る。上記モノクローナル抗体を結合させる固相としては、従来免疫測定に用いられる 各種固相を用いることができ、例えば ELISAプレート、ラテックス、ゼラチン粒子、磁 性粒子、ポリスチレン、ガラスなどの各種固相、ビーズ、輸液可能なマトリクス等の不 溶性担体等が例示される。また、酵素、金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子、発光 物質、蛍光物質、放射性物質等によって抗体を標識し、標識抗体を製造することが できる。これらの固相抗体及び Z又は標識抗体等の試薬を組み合わせて、酵素免疫 測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法等に用いる試薬を製造することができる 。これらの測定試薬は、サンドイッチ法又は競合的結合測定法により、検体中の目的 とする抗原を測定するための試薬である。本発明の SARSウィルスの免疫測定器具 は、ィムノクロマトグラフィーの原理を適用したものであり、本発明のモノクローナル抗 体を輸液可能なマトリクス上に固定した検出ゾーン、及び標識された本発明の抗 SA RSウィルスモノクローナル抗体を前記マトリクス上に移動可能に点着した標識試薬ゾ ーンを有する。
[0030] 上記サンドイッチ法による免疫測定の試薬としては、例えば、本発明のモノクローナ ル抗体を 2種用意し、そのうち 1種を前記標識抗体とし、他の 1種を前記固相に結合 させた固相抗体とした試薬を用いることができる。まず、この固相抗体に測定すべき 抗原を含む検体を反応させ、次いで同固相抗体に捕捉された抗原に、標識抗体 (第 二抗体)を反応させ、不溶性担体に結合した標識物の存在を検出することにより、免 疫検定を実施することができる。また同様に、固相抗体に測定すべき抗原を含む検 体を反応させ、次!ヽで同固相抗体に捕捉された抗原に標識抗体 (第二抗体)を反応 させ、不溶性担体に結合した標識物、即ち、標識抗体の量から測定すべき抗原の量 を定量することにより、免疫測定を実施することができる。サンドイッチ法の免疫測定 試薬では、 1種類のモノクローナル抗体を固相抗体と標識抗体として用いることもでき るが (たとえば、抗原が多量体の場合)、通常測定すべき抗原の 2つの異なるェピトー プを認識する 2種以上の抗体を用いることが好ましい。すなわち、固相抗体と標識抗 体とをそれぞれ異なるェピトープを認識するモノクローナル抗体力 選択して用いる ことが好ましい。更に、固相抗体と標識抗体のいずれについても、それぞれ 2種以上 のモノクローナル抗体力も選択し組合せて用いることもできる。
[0031] 競合的結合測定法による免疫測定試薬としては、例えば酵素、金属コロイド粒子、 着色ラテックス粒子、発光物質、蛍光物質、放射性物質等によって標識した一定量 の標識ウィルス抗原を作製する。この試薬を用いて、例えば、一定量の本発明のモノ クローナル抗体、前記標識ウィルス抗原及び測定すべき抗原を含む検体とを競合的 に反応させ、抗体と結合した、又は、結合しな力つた標識ウィルス抗原の量力も測定 すべき抗原の量を定量することにより免疫測定を実施することができる。
[0032] 本発明において、前記抗体又は抗原を固相又は標識物と結合させるには、物理吸 着法、化学結合法等の方法を用いることができる（蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31, 37— 45(1987年)参照）。
[0033] また、本発明の抗 SARSウィルスモノクローナル抗体を、ィムノクロマトグラフィーを 適用した免疫測定器具に用いると、検体中の SARSウィルスを特別な測定装置を用 いることなぐ簡便に検出することができる。この測定器具は、不溶性担体として毛細 管作用により輸液 (展開)可能な帯状のマトリクスを備え、該マトリクスに、少なくとも 1種 類の抗 SARSウィルスモノクローナル抗体を不動化（固相ィ匕）した SARSウィルス検 出ゾーンと、標識された抗 SARSウィルスモノクローナル抗体を移動可能に点着した 標識試薬ゾーンと、検体点着ゾーンと、前記マトリクスの長手方向の一端に展開液パ ッドを付設した展開液供給ゾーンと、前記マトリクスの長手方向の他の端部に設けた 展開液吸収ゾーンとを有する。
[0034] このようなィムノクロマトグラフィー用の免疫測定器具の好ましい 1例の模式断面図 が図 5に示されている。図 5中、参照番号 1はィムノクロマトグラフィー用の免疫測定器 具、 2は輸液可能なマトリクス、 3は乾燥させた基質ゾーン 7を有する展開液供給ゾー ン、 4は標識試薬ゾーン、 5は展開液吸収ゾーン、 6は検出ゾーン、 8は検体点着ゾー ン、 9は検体、 10は展開液を示す。以下、この免疫測定器具の各構成要素について 説明する。
[0035] マトリクス
この免疫測定器具におけるマトリクスは、帯状の、毛細管作用によって液体を輸送 することができる吸収性の材料で構成される。この吸収性材料としては、例えばセル ロース、ニトロセルロース等のセルロース又はその誘導体、ガラス繊維等を単独又は 混合して製造したろ紙、膜、多孔性材料である。このマトリクスの大きさに制限はない 1S 幅 3mm— 10mm程度、長さ 30mm— 100mm程度のストリップ状のものが取り扱 いが容易で好ましい。マトリクスの厚さは、たとえば、 100 m— lmmのものを用いる ことができる。またマトリクスは、その一部又は全体を、測定時に検体由来のタンパク 質のマトリクスへの非特異反応による吸着を防止するために、例えば牛血清アルブミ ン（BSA)等の動物血清、カゼイン、シユークロース等でブロッキングして用いることが できる。
[0036] 検出ゾーン
検出ゾーンには、前記マトリクス上に抗 SARSウィルスモノクローナル抗体を固相化 した SARSウィルス検出部を設けることができる。検出部の前記抗 SARSウィルスモ ノクローナル抗体は、マトリクス上にあり、マトリクス上で展開される液体の移動方向（ マトリクスの長手方向）に直交する方向にライン状に設けることが感度よく測定するた めには好ましい。
[0037] この検出ゾーンの抗 SARSウィルスモノクローナル抗体は、前記した抗体であり、モ ノクローナル抗体を単独又は混合して用いることもできる。抗 SARSウィルスモノクロ ーナル抗体は、 IgG抗体、 IgM抗体、更にこれらの抗体のフラグメントである Fab、 Fa W 、F (ab' )等であってもよい。
2
[0038] 検出部に不動化される抗 SARSウィルスモノクローナル抗体は、直接マトリクスの検 出ゾーンに物理吸着させてもよいが、共有結合などの化学結合によって固定すること によって検出部に設けることもできる。また、抗 SARSウィルスモノクローナル抗体を 水不溶性の担体に結合させ、これをマトリクス内に含有させてもよい。この不溶性の 担体としては、ゼラチン、アラビアゴム及びへキサメタリン酸ナトリウム力もなる混合物 を不溶ィ匕して得られる粒子（特公昭 63— 29223)、ポリスチレンラテックス粒子、ガラス 繊維等を挙げることができる。不溶性の担体と抗 SARSウィルスモノクローナル抗体 とは、前記化学結合又は物理吸着により結合させることができる。
[0039] この検出部は、マトリクス上にぉ 、て、標識試薬ゾーン、検体点着ゾーン及び展開 液供給ゾーンに対して展開液の移動方向の下流側に設けられ、かつ展開液吸収ゾ ーンの上流側に位置する。検出部は、マトリクスに巾 0. 5mmから 5mm程度のライン として設けることができ、また複数のラインとして設けることもできる。巾 5mm程度のマ トリタスであれば、前記抗体及び Z又は抗原を通常それぞれ 0. 1 8カら10 8程 度点着し、乾燥させることにより検出部を作製することができる。
[0040] 標識試薬ゾーン
標識試薬ゾーンは、標識抗 SARSウィルスモノクローナル抗体を移動可能に点着 して設けることができる。この標識試薬ゾーンは展開液供給ゾーンからの展開液の移 動方向にお 、て前記検出ゾーンの上流側に設けることができる。この標識試薬ゾー ンは、マトリクスに標識試薬を点着する方法、標識試薬を含む吸水性のパッドをマトリ タス上に積層する方法、又はパッドと密着するマトリクス部分の一部又は全部にパッド とともに標識試薬を含有させる方法により設けることができる。吸水性のノ¾ドとしては 、後述する検体点着ゾーンに使用するパッドと同様のものを用いることができる。
[0041] 標識抗体は、前記検出ゾーンに設けられる抗体とともに、少なくとも一方が本発明 の抗 SARSウィルスモノクローナル抗体であり、更に両方の抗体が本発明の抗 SAR Sウィルスモノクローナル抗体であることが好まし!/、。標識抗 SARSウィルスモノクロ一 ナル抗体としては、前記検出ゾーンの抗体と同様にそのフラグメントを用いることもで きる。
[0042] 前記標識抗 SARSウィルスモノクローナル抗体は、抗 SARSウィルスモノクローナ ル抗体と標識物とを結合させて製造することができる。標識物としては、酵素、金属コ ロイド粒子、着色ラテックス粒子、蛍光ラテックス粒子、発光物質、蛍光物質などを挙 げることができる。酵素としては酵素免疫測定法 (EIA)に用いられる各種酵素を用い ることができ、例示的にはアルカリホスファターゼ、パーォキシダーゼ、 |8—D—ガラタト シダーゼ等を挙げることができる。また、金属コロイド粒子としては、例えば金コロイド 粒子、セレンコロイド粒子などを用いることができる。
[0043] また、標識物と抗 SARSウィルスモノクローナル抗体との結合方法は、公知の共有 結合又は非共有結合を作る方法を利用することができる。結合の方法には、例えば ダルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル ·ジスルフイド法、各種架 橋剤を用いる方法等を挙げることができる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊 31号、 37 一 45頁（1985)参照)。架橋剤を用いる結合方法において、架橋剤としては例えば N—スクシンィミジル 4—マレイミド酪酸（GMBS)、 N—スクシンィミジル 6—マレイミド へキサン酸、 N—スクシンィミジル 4— (N マレイミドメチル）シクロへキサン 1 カル ボン酸等を用いることができる。共有結合による方法においては、抗体に存在する官 能基を用いることができる他、例えばチオール基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基 等の官能基を、常法により抗体に導入したのち、前記結合法を適用して同官能基と 標識物とを結合させることにより、標識抗 SARSウィルスモノクローナル抗体を製造す ることができる。また非共有結合による方法としては物理吸着法等を挙げることができ る。
[0044] 標識抗 SARSウィルスモノクローナル抗体量は、通常検査対象物の予測される量 に応じて適宜変更することができる力 通常乾燥重量で 0. 01 μ g— 5 μ g程度である 。標識抗 SARSウィルスモノクローナル抗体は、試薬の安定化剤、溶解調節剤等とと もに塗布することができる。
[0045] 検体点着ゾーン
検体点着ゾーンは、展開液供給ゾーンの展開液の移動方向の下流側であり、かつ 検出ゾーンの上流側のマトリクスに特に試薬等を含まずに設けることができる。さらに 検体点着ゾーンは、 1)展開液供給ゾーンの展開液移動方向の下流側であり、かつ 標識試薬ゾーンの上流側の所定箇所、 2)標識試薬ゾーンの下流側であり、かつ検 出ゾーンの上流側の所定箇所、または 3)標識試薬ゾーン上の所定箇所等に設ける ことができる。また、前記標識試薬ゾーンに検体点着ゾーンを設けた装置では、前記 した如く標識試薬を含有する吸水性パッドを付設することが効率よく分析を行う上で 好ましい。このノッドを付加する装置では、多量の検体液を点着することができるため 、検体中の微量成分を検出感度よく測定を行うことができる。この吸水性のパッドは、 標識試薬や検体中の SARSウィルスを吸着することの少な ヽ材料から選択され、例 えばポリビュルアルコール（PVA)、不織布、セルロース等の多孔質の合成又は天然 の高分子化合物力もなる材料を単独又は組み合わせて構成することができる。この パッドの大きさ、厚さ、密度等は限定されないが、通常縦と横が 3mm— 10mm程度 で、厚さが 0. 5mm— 4mm程度のパッドを用いることが効率よく測定を行うためには 好ましい。
[0046] 展開液供給ゾーン
展開液供給ゾーンは、マトリクスの長手方向の一端に設けられ展開液が供給される ゾーンである。測定の開始は、このゾーンを、少なくとも展開液吸収ゾーンに達する 量の展開液の入った容器に浸すことにより行うことができる。さらに展開液の供給に は、展開液供給ゾーンに展開液の入った液槽を付加し、この液槽のカバーを破り展 開液とマトリクスを接触させることにより測定を開始することもできる。展開液は、界面 活性剤、緩衝剤、安定化剤、抗菌剤等を適宜含有することができる。また、標識物と して酵素を用いる場合には、後述する基質ゾーンとともに展開液に基質を添加するこ ともできる。緩衝剤を含む緩衝液としては、例えば酢酸緩衝液、ほう酸緩衝液、トリス 一塩酸緩衝液、ジエタノールァミン緩衝液等を挙げることができる。また展開液供給ゾ 一ンには展開液のマトリクスへの供給を安定して連続的に実施するため展開液パッド を付設するができる。展開液パッドとしては、例えばセルロース又はセルロース誘導 体等のろ紙用いることができる。
[0047] 展開液吸収ゾーン 展開液吸収ゾーンは、マトリクスの一端に設けられた前記展開液供給ゾーンに対し て他端に設置される。このゾーンはマトリクスに供給される展開液を吸収し分析を円 滑に行うために設けられる。展開液吸収ゾーンは、マトリクスを長く形成することにより 確保することができる。また、マトリクスに吸水性材料を付設することにより吸収ゾーン とすることもでき、この場合、展開液の展開を促進することができる。この吸水性材料 には、天然高分子化合物、合成高分子化合物等力 なる保水性の高いろ紙、スポン ジ等を用いることができる。展開液吸収ゾーンには、展開液を全て吸収する容積をも つたパッド状の吸収性材料を設けることが好ま U、。吸収性材料をマトリクスの上又は 下に積層することにより展開液吸収ゾーンを設ける場合、小型化した免疫測定器具 を製造することができる。
[0048] 基質試薬ゾーン
更に、標識試薬ゾーンの標識物として酵素を用いる場合には、前記した通り展開液 に基質を含有させるか、基質試薬ゾーンをマトリクスの前記展開液供給ゾーン近傍に 設けることができる。基質試薬ゾーンは、展開液供給ゾーンに付設した前記展開液 ノ^ドに含浸させ設けることが基質量を多くして高感度測定を行う上で好ましい。
[0049] 基質としては標識試薬の酵素に対応して以下に示す各種発色基質、蛍光基質、発 光基質等を用いることができる。
[0050] (a)発色基質パーォキシダーゼ用：過酸化水素と組合せた 2, 2' アジノービス（3— ェチルベンゾチアゾリンー 6—スルホン酸）（ABTS)、 3, 3', 5, 5'—テトラメチルベンチ ジン（TMB)、ジァミノベンチジン（DAB)、アルカリホスファターゼ用： 5—ブロモー 4— クロ口— 3—インドリルリン酸（BCIP)、 p—-トロフエ-ルホスフェート（p— NPP)、 5—ブ 口モー 4—クロ口— 3—インドリルリン酸ナトリウム（BCIP'Na)
(b)蛍光基質アルカリホスファターゼ用： 4ーメチルゥムベリフエ-ルーホスフェート（4 MUP)
β—D ガラクトシダーゼ用： 4ーメチルゥムベリフエ-ルー β D ガラクトシド（4MUG)
(c)発光基質アルカリホスファターゼ用： 3—（2'—スピロアダマンタン) 4ーメトキシー 4 — (3"—ホスフオリルォキシ）フエ-ル— 1, 2—ジォキセタン · 2ナトリウム塩 (AMPPD) β—D ガラクトシダーゼ用： 3—（2'—スピロアダマンタン) 4ーメトキシー 4ー（3"— j8—D ーガラクトピラノシノレ）フエ-ルー 1 , 2—ジォキセタン (AMGPD)
パーォキシダーゼ用：過酸化水素と組み合わせたルミノール、イソルミノール
[0051] 基質ゾーンは、通常前記基質を水溶液に溶解して展開液パッドにライン状に塗布 した後、乾燥させることにより形成することができ、所望により基質のシグナル増強剤 、安定化剤、溶解調節剤等を添加することもできる。基質ゾーンは、マトリクスの端部 に付設した展開液パッド内であれば、特に限定されない。展開液及び展開液パッド に添加する基質量は、測定条件により決定することができるが、 1個の器具当たり通 常 5— 500 μ g程度を用いることができる。
[0052] 測定試薬の使用方法
本発明の測定試薬により各種検体試料中の SARSウィルスの測定を行うことができ る。測定は、まず検体を本発明の測定器具の検体点着ゾーンに供給した後、展開液 を展開液パッドに供給し、マトリクスに展開して行う。展開液は毛細管作用によりマトリ タスを移動し、展開液吸収ゾーンに達し、検出ゾーンに結合されな力つた検体中の成 分、酵素標識試薬等が展開液吸収ゾーンに吸収され展開が完了する。所定時間 (通 常 10分から 20分)経過後、検出ゾーンを観察し、検体液中の SARSウィルス抗原に より検出部に固定ィ匕された標識物を検出および Zまたは測定することにより、 SARS ウィルスの測定を行うことできる。この検出は、標識物に応じて目視にて、又は比色計 、蛍光光度計、フオトンカウンター、感光フィルム等の測定装置を用いて実施すること ができる。測定は、例えば検出ゾーンの発色を目視で測定する方法が簡便である。 また、この方法では SARSウィルスの濃度に対応した色票 (カラーチャート）を用いる ことにより半定量的な分析が可能となる。更に、比色計等により検出ゾーンの発色を 数値化して、定量を行うこともできる。
[0053] また、前記マトリクスは、プラスチック、金属、紙等の支持部材上に積層し固定して 用いることもできる。更に前記マトリクスは、プラスチック等のケースに固定し、展開液 を含む液槽を展開液供給ゾーンに付設し、少なくとも検体点着ゾーンおよび検出ゾ ーン部分に穴の開いたケースでカバーをすることにより取扱の容易な器具を構成す ることがでさる。
[0054] 上記試薬によって測定できる検体としては、 SARSウィルスの核タンパク質を含むも のであれば特に限定されず、例えば、ヒト又は動物由来の血清、血漿、全血の他、鼻 腔ぬぐい液 (鼻腔スヮブ）、鼻腔吸引液、咽頭ぬぐい液（咽頭スヮブ)等の体液抽出液 、気道分泌物、細胞又は組織ホモジネート液等を挙げることができる。これらの検体 は、 SARSウィルスを含む溶液をそのまま検体として用いることもできる力 界面活性 剤、例えば非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤等を用いてウィルスを処理を した溶液を用いることもできる。非イオン界面活性剤としては、例えばノ-デット (ノ- デット T-40)、トライトン、 Brij等、陰イオン界面活性剤としては、例えば SDS等が用 いられる。
[0055] また、ヒト又は動物由来の種々の細胞、組織等を固定ィ匕し、本発明のモノクローナ ル抗体を反応させることによって、細胞、組織等に分布する SARSウィルスの核タン ノ ク質を直接測定することも可能である。更に、本発明のモノクローナル抗体を用い て、いわゆるウェスタンブロッテイング、ァフィ-ティクロマトグラフィー等を行うこともで きる。
[0056] 本発明のモノクローナル抗体を用いた SARSウィルスの核タンパク質の測定方法を 、ヒト又は動物由来の種々の検体に適用することにより、 SARSウィルス感染の診断 を実施することができる。本発明のモノクローナル抗体を用いることによって、免疫化 学的方法や免疫組織化学的方法により、ヒト又は動物由来の種々の体液、細胞、組 織等における SARSウィルスの核タンパク質を直接測定することが可能となる。 SAR Sウィルスは、哺乳動物、鳥類など力もヒトへ感染したルートが疑われており、通常の ヒト検体のほ力、動物検体の測定によって、感染ルートの解明にも用いることができる
[0057] なお、上記した免疫測定方法、試薬及び器具の説明にお 、て、本発明のモノクロ ーナル抗体に代えて本発明のモノクローナル抗体の抗原結合性断片を用いることも できる。
実施例
[0058] 以下、本発明を参考例及び実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発 明は下記実施例に限定されるものではない。
[0059] 参考例 1 プラスミドの作製 核タンパク質 (「Nタンパク質」とする)遺伝子は全長 1270塩基対で構成されている。 既に報告された遺伝子配列より、 Nタンパク質遺伝子のほぼ真中を水解する制限部 位 Nhelの前後で 2つの断片に分け、それぞれを既知の配列情報に基づいて合成さ れた互いに 15塩基の重なりを有する 50— 55塩基のオリゴマーをァニールさせて DN A合成条件下で伸長反応に付し、次いで PCRにて順次増幅した。この操作を反復し 、前半部分のフォワードプライマーの 5'側に EcoRI部位を、またリバースプライマーの 3，側に Nhel部位を持たせ、かつ後半部分のリバースプライマーの 3，側に BamHI部位 を、またフォワードプライマーの 5，側に Nhel部位を付カ卩して PCRを行った。
[0060] これらの断片を QIAGEN社の PCR Purification Kitで精製し、前半部は EcoRIおよび Nhel、後半部は Nhelおよび BamHIで水解し、図 1に示す発現用プラスミド pW6Aの EcoRI-BamHI部位に挿入し、プラスミド pWS-Nを作製した。これを用い大腸菌
BL21(DE3) (Brookhaven National Laboratoryより入手)を形質転換させ、アンピシリン 耐性の形質転換体大腸菌 BL21(DE3)/pWS-Nを得た。核タンパク質の塩基配列およ びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 1及び 2に示す。
[0061] 参考例 2 組換えタンパク質 (S-N)の発現
参考例 1で作製した形質転換体を、 50 g/mlのアンピシリンを含む LB培地 2ml中に て 37°Cで培養した。予備培養にお!、て 600nmでの ODが 0.6— 0.8となるまで増殖させ た後、培養物に 0.4mM IPTGを添カ卩して発現誘導を行い、更に 3時間培養した。 1.5ml 量の菌体培養液を 5000rpmで 2分間遠心分離して菌体を集め、 100 /z 1の緩衝液（ 10mMトリス-塩酸、 pH8.0、 0.1M塩化ナトリウム、 ImMEDTA)に懸濁し、 15分間の超音 波破砕により完全に菌体を破砕した。これを菌体試料とした。
[0062] 菌体試料 8 μ 1に 3倍濃度の SDSポリアクリルアミド緩衝液 (0.15Mトリス-塩酸、 ρΗ6.8、 6%SDS、 24%グリセロール、 6mM EDTA、 2% 2—メルカプトエタノール、 0.03%ブロモフエ ノールブルー) 4 1をカ卩ぇ十分攪拌した後、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行 つた。電気泳動後、展開された試料を-トロセルロースフィルターに転写し、 1%BSAに よるフィルターのブロッキング後、リン酸緩衝液（10mMリン酸、 pH7.4、 0.15M塩化ナト リウム)で 1000倍に希釈した抗 N5ペプチド血清を反応させた。更に、ペルォキシダー ゼ酵素標識された抗マウス Igゥサギポリクローナル抗体 (ダコ社製)を反応させ、洗浄 後 10mlの基質発色液（0.01%過酸化水素水、 0.6mg/ml 4 クロロー 1 ナフトール）を 添加し発色させた。結果を図 2に示す。
[0063] なお、抗 N5ペプチド血清は、参考例 4の記載に従って調製した N5ペプチド KLHコ ンジュゲイトを用いてマウスを免疫し、同マウスより採取した血液力も分離した。
[0064] 参考例 3 可溶性 S-Nの精製
参考例 1で作製した大腸菌 BL21 (DE3)/pWS-Nをアンピシリンを含む LB培地 37°C条 件下で培養した。該形質転換体を予備培養にて増殖させ、 600nmでの ODが約 0.7の 密度となるようにしたのち、 0.4mM IPTGを添加し、発現誘導を行った。 18時間培養後 、遠心操作を行い、大腸菌を回収した。回収した大腸菌に 20mMトリスー塩酸 pH8.0、 ImM PMSF (フエ-ルメチルスルホ -ルフルオリド）をカ卩え、氷冷下で超音波破砕処 理を行った。遠心後、可溶性画分 S-Nに硫酸アンモニゥムを加え、 20— 40%画分を回 収した。この硫酸アンモ-ゥム画分を、 0.1M塩化ナトリウム、 8M尿素、 20mMリン酸 緩衝液 pH6.9で平衡化した SP セファロース ファースト フロー（アマシャム社製）に アプライし、 0.2M塩ィ匕ナトリウム、 8M尿素、 20mMリン酸緩衝液 pH6.9で溶出し精 製した。溶出画分を 0.2M塩ィ匕ナトリウム、 20mMトリスー塩酸緩衝液 pH8.0に対して透 祈した。この調製物を、参考例 2と同様に SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び ウェスタンプロットによって、その精製度を確認した。その結果では単一のバンドを示 した。
[0065] 実施例 1 抗 Nタンパク質モノクローナル抗体の確立
抗 Nタンパク質モノクローナル抗体を、参考例 3で作製したリコンビナント Nタンパク 質をマウスに免疫し、同マウスの脾臓リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより 作製した。すなわち、 BALB/Cマウスに、フロイント完全アジュバントでェマルジヨン化 したリコンビナント Nタンパク質を 50— 100 g/マウスで初回免疫を行い、 2— 3週間後 、フロイント不完全アジュバントでェマルジヨン化した同抗原 50— 100 g/マウスで追 加免疫を行った。抗体価のチェックは、リコンビナント Nタンパク質をコートした 96ゥェ ル ELISAプレートを用いた固相 ELISAで行った。抗体価の上昇が認められたマウス に遊離のリコンビナント Nタンパク質 25— 100 gを静脈内投与し、その 3— 4日後、マ ウスカも脾臓を取り出し、脾細胞を調製した。前もって RPMト 1640培地で培養してい たマウスミエローマ細胞 (P3U1)と脾細胞を 1 : 2— 1 : 5の比率で混合し、 PEG (ベーリン ガー社製)を用いて細胞融合を行った。融合した細胞は HAT培地に浮遊した後、 96 ゥエル培養プレートに分注し、 37°C COインキュベーターで培養した。
2
[0066] スクリーニングは上記に示した固相 ELISAで行った。すなわち、リコンビナント Nタン パク質を 96ゥエル ELISAプレート（フアルマシア社製）に 1 μ g/mlの濃度で 50 μ 1/ゥェ ルずつ分注し、 4°Cにてー晚放置することにより吸着させた。ゥエルを 1%スキムミルク でブロッキングした後、洗浄緩衝液（0.05% Tween20を含む PBS)で 3回洗浄し、細胞 融合を行ったプレートの培養上清 50 1を加え、 37°Cにて 1時間反応させた。同様に 洗浄緩衝液で 3回洗浄後、 POD標識抗マウスィムノグロブリン抗体 (DACO社製)を加 え、さらに 37°Cにて 1時間反応させた。洗浄緩衝液で 4回洗浄後、基質 ABTSを加え、 発色の見られるゥエルを選択した。次に、選択したゥエルの細胞を 24ゥエル培養プレ ートに移し 37°Cの COインキュベータ一中で培養した後、限外希釈法にて単一クロ
2
ーンとし、以下に示す抗 Nタンパク質モノクローナル抗体を産生する 5種類のハイプリ ドーマ rSN— 18、 rSN— 122、 rSN— 150、 rSN— 21— 2及び rSN— 29を確立した。こ れらのハイプリドーマは、前記特許生物寄託センターに寄託され、その寄託番号はそ れぞれ FERM P-19572, FERM P— 19573、 FERM P— 19574、受託番号 F ERMP— 19619及びFERM P— 19620である。これらハイプリドーマは、平成 16年 10月 18日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター〔あて名；日 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号中央第 6〕に、ノ、イブリドーマ rSN-18は受託 番号 FERM BP— 10143、ハイプリドーマ rSN— 122は受託番号 FERM BP— 101 44、ハイプリドーマ rSN— 150は受託番号 FERM BP - 10145、ハイプリドーマ rSN -21-2は受託番号 FERM BP— 10146及びハイブリドーマ rSN—29は受託番号 F ERM BP— 10147として国際寄託に移管された。
[0067] 実施例 2 ウェスタンブロッテイング法 (WB)によるモノクローナル抗体の反応性の確 認
確立した各モノクローナル抗体の天然型抗原（ウィルス由来の Nタンパク質）に対す る反応性を、濃縮ウィルス懸濁液をサンプルとした WBで確認した。 Vero E6細胞に SARSウィルス Hanoi株を感染させ、 48時間、 COインキュベーターで培養した後、
2 2000rpm、 15分間遠心し、ウィルス培養上清（TCID は 7.95 x 106/ml)を調製した。
50
この培養上清に対して 56°C、 90分で不活性ィ匕処理を行なった後、その 31.5mlを日立 超遠心機 (40Tローター)を用いて、 30Krpmで 3時間遠心した。得られた沈殿に TNE( Tris- NaC卜 EDTA)緩衝液 (0.3ml)を加え、ピペッティングを行い、濃縮ウィルス懸濁液 を調製した。本懸濁液に等量の電気泳動用サンプル処理液を添加し、次いで過熱 処理を行うことにより分析用サンプルとした。 12.5%ゲルを用いて SDSポリアクリルアミ ド電気泳動（SDS-PAGE)を行った後、サンプルを-トロセルロース膜に転写し、 WB 用転写膜 (抗原転写 WB膜)を作製した。転写膜をスキムミルクでブロッキングした後 、抗体との反応に付した。抗 Nタンパク質モノクローナル抗体として rSN- 18抗体、 rSN-122抗体、 rSN-150抗体、 rSN-29抗体、 rSN-21-2抗体、 rSN-122抗体を用い、無 関係なモノクローナル抗体である E2CT-38抗体を陰性コントロールとして用いて WB を実施した。
[0068] 抗体との反応は以下のとおりである。それぞれのモノクローナル抗体を、抗原転写 WB膜と室温にて 1時間振盪し、反応に付した後、洗浄緩衝液 (0.05% Tween20を含 む PBS)で 3回洗浄 (5分の振盪洗浄)した。次に POD標識抗マウスィムノグロブリン抗 体 (DACO社製)を加え、さらに室温、 1時間反応させた。洗浄緩衝液で 4回洗浄 (5分 の振盪洗浄)後、基質 4 クロ口ナフトール溶液を加え、バンドの確認を行った。図 3及 び図 4に示すように各モノクローナル抗体を用いた場合、分子量 50Kd弱の Nタンパク 質に相当する位置にバンドが確認された。
[0069] 実施例 3 サンドイッチ ELISA法によるウィルス培養上清中の Nタンパク質の検出 リコンビナント Nタンパク質及びウィルス培養上清をサンプルとしてサンドイッチ ELISAを行い、 Nタンパク質測定系が成立するかどうかを確認した。 ELISAを以下のよ うに行った。すなわち、ファルコン社製 ELISAプレートに、各モノクローナル抗体を 5 g/mlの濃度に PBS (pH7.4)で希釈し、 1ゥエルに 50 1づっ入れ、 4 °Cー晚放置するこ とにより抗体をコートした。次に 1%BSA- PBS (pH7.4)を 150 1/ゥエル入れ、 37°C、 1時 間放置しマスキング（masking)を行った。洗浄緩衝液 (0.05%Tween20含有 PBS (pH7.4 ))でゥエルを 3回洗浄後、リコンビナント Nタンパク質またはウイノレス培養上清を 50 1/ ゥエル入れ、 37°C、 1時間反応させた。リコンビナント Nタンパク質は 20ng/ml、培養上 清はそのまま或いは洗浄緩衝液で希釈して用いた。このとき、ウィルスで感染させて いない細胞の培養上清を陰性コントロールとして用いた。次に、実施例 1で記したノヽ イブリドーマ培養上清力 抗マウスィムノグロブリン抗体ァフィユティーカラムで精製し たモノクローナル抗体をプール後、アルカリフォスファターゼで標識した標識抗体を、 ゥエルに 50 1/ゥヱル入れ、 37°C、 1時間反応させた。洗浄緩衝液で 3回洗浄後、基 質 p—-トロフエ-ルホスフェート（p- NPP)を 50 μ 1 /ゥエル入れ、室温で 15分間放置後 、 目視で観察し、さらに 405應の波長を測定した。表 1に示すように、本実施例で用い た全てのモノクローナル抗体において Νタンパク質の検出が可能であることが確認さ れた。
[0070] [表 1]
Figure imgf000024_0001
[0071] 実施例 4アルカリホスファターゼ標識抗 SARSウィルスモノクローナル抗体の作製 実施例 1で作製した抗 SARSウィルスモノクローナル抗体に 2—イミノチオラン塩酸 塩 (アルドリッチ社製)を反応させ、チオール基を導入した。
[0072] 次にマレイミド基を導入したアルカリホスファターゼと前記チオール基を導入した抗 体とを反応させ、ゲルろ過処理を行い、精製アルカリホスファターゼ標識抗 SARSゥ ィルスモノクローナル抗体を得た。
[0073] 実施例 5 アルカリホスファターゼ標識抗 SARSウィルスモノクローナル抗体を用いた サンドイッチ ELISA法による測定
リコンビナント Nタンパク質及び 56°Cにて 90分間熱処理して得た不活ィ匕ウィルス培 養上清を検体として用い、以下に示すサンドイッチ ELISAを行った。
[0074] Nunc社製 IMMUNOMODULE MAXISORPプレートに、各モノクローナノレ抗体単独 又は混合したものを 10— 15 μ g/mlの濃度となるようにリン酸緩衝液 (pH7.5)を用いて 希釈し、 1ゥエルに 100 1ずつ入れ、 4 °Cにてー晚放置し、固相化した。次に、洗浄 緩衝液 [0.02% TritonX- 100含有 TBS (Tris緩衝生理食塩水） pH7.2]で各ゥヱルを 3回 洗浄後、 1%BSA-リン酸緩衝液 (pH7.4)を 250 1/ゥエル入れ、 37°Cにてー晚放置し、 ブロッキングを施すことにより抗体固相化プレートを作製した。抗体固相化プレートを 洗浄緩衝液で 3回洗浄後、反応溶液（1%BSA,含有 PBS, pH7.5)で希釈したリコンビ ナント Nタンパク質 (1.0ng/ml)及びウィルス培養上清（100 μ 1/ゥエル）を入れ、室温（ 25°C)にて 1時間反応させた。このとき、ウィルスで感染させていない細胞の培養上清 を陰性コントロールとして用いた。プレートを洗浄緩衝液で 4回洗浄後に、実施例 4で 作製した 1.0— 5.0 g/mlの標識抗体の単独又は混合したものを 100 1/ゥエル入れ、 室温 (25°C)にて 1時間反応させた。プレートを洗浄緩衝液で 4回洗浄後、基質 p—二ト 口フエ-ルホスフェート（p-NPP)を 100 μ 1 /ゥエル入れ室温で 30— 60分間放置後、波 長 405應で測定した。リコンビナント Νタンパク質及びウィルス培養上清につ!/、て測定 した吸光度測定の結果を、それぞれ表 2aおよび表 2bに示す。表 2aに示すように、全 てのモノクローナル抗体において、組合せによる反応性は異なる力 リコンビナント N タンパク質の検出が可能であることが確認された。また、表 2bに示すように、ウィルス 培養上清に対してもリコンビナント Nタンパク質に対する反応性とほぼ同じ反応性が 認められた。
[0075] [表 2a]
Figure imgf000025_0001
[0077] 実施例 6 ィムノクロマトグラフィーによる測定 リコンビナント Nタンパク質及び 56°Cにて 90分間熱処理して得た不活ィ匕ウィルス培 養上清を検体としてィムノクロマトグラフィーによる Nタンパク質の迅速検出を確認し た。図 5に示すィムノクロマトグラフィーの免疫測定器具 1を以下のようにして作製した
[0078] ニトロセルロース膜 2 (5mmx50mm)の一端に、 20mg/mlの 5—ブロモー 4—クロ口— 3— インドリル-リン酸ナトリウム (BCIP'Na)を基質として吸水性の不織布へ点着し、乾燥 させた基質ゾーン 7を有する展開液供給ゾーン 3、他端に吸水性の吸収パッド (展開 液吸収ゾーン 5)を設けた。メンブレン部の標識試薬ゾーン 4 (検体点着ゾーン 8)の輸 液方向の下流側に検出ゾーン 6を設けた。検出ゾーン 6は、表 3a又は bに記載のモノ クローナル抗体 (lmg/ml)をライン点着し、乾燥することにより調製した。標識試薬ゾ ーン 4は、吸水性不織布へ表 3a又は bに示す単独又は 2種類のアルカリホスファタ一 ゼ標識モノクローナル抗体 (35ng/パッド)を点着し、乾燥することによって製造した。 次!、で検出ゾーン 6を設けた前記-トロセルロース膜をそのまま、又は BSAを含む P BSでブロッキングを行ったものに、標識試薬ゾーン 4を付設した。
[0079] このようにして作製した免疫測定器具 1につ ヽて、 3%BSA含有トリス緩衝生理食塩 水 (検体処理液)でリコンビナント Nタンパク質または培養上清を希釈することにより調 製した検体 9 (25— 30 μ 1)を標識試薬ゾーン 4上に設けた検体点着ゾーン 8へ添加し た。ついで、展開液供給ゾーン 3へ展開液 10を 300 1滴下して検体および基質を二 トロセルロース膜上に展開させ、 15分後に検出ゾーン 6でのラインの出現を確認した 。その結果を表 3aに示す。表 3aに示すように、リコンビナント Nタンパク質は、抗体の 組合せにより反応性に差が見られるが、反応時間 15分間で検出が可能であった。一 方、表 2a,bおよび表 3aの結果から、固相抗体と標識抗体の組合せで反応性が高い 組合せを選択した系で、ウィルス培養上清の測定を行い、高希釈倍率でウィルス培 養上清中の Nタンパク質を検出できた。その結果を表 3bに示す。
[0080] [表 3a] き几体
固相抗体 rSN-150 rSN-122 rSN-18
4w 2
rSN-122 3 3w 4
rSN-18 2 4
o
表中の数値 （発色強度） は反応開始 15分後の検出ラ
インの色の濃さを目視で判定
(4>4w>3>3w>2>2w> 1 , —： ライン来検出）
[0081] [表 3b]
Figure imgf000027_0001
数値は培養上清の検出可能な希釈倍率
> 3000は 3000倍以上を検出可能
[0082] 参考例 4 N5ペプチドの合成と KLHコンジュゲートの作成
SARS核タンパク質 244-260を含むペプチド配列（N5ペプチド、
GQTVTKKSAAEASKKPRC：配列番号 3)を、島津製作所社製（PSSM— 8)のぺプチ ド合成機で Fmoc法により合成した。 N5ペプチドの合成方法は、合成機に記載の方 法に従った。次いで、合成した前記ペプチドを常法に従ってキーホールリンペット'へ モシァニン (KLH)と結合させ、 KLHコンジュゲイトを作成した。
[0083] 実施例 7 N5ペプチド抗原を用いた抗 Nタンパク質モノクローナル抗体の確立
抗 Nタンパク質に対するモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを、参考例 4で作製 した N5ペプチド KLHコンジュゲイトをマウスに免疫し、同マウスの脾臓リンパ球とミエ口 一マ細胞を融合することにより作製した。作製法の詳細は、実施例 1に記載された方 法に従って実施し、スクリーニングして抗 Nタンパク質モノクローナル抗体を産生する ハイプリドーマ SN5— 25を確立した。このハイプリドーマから得られるモノクローナル 抗体を SN5— 25と命名した。
[0084] 実施例 8 アルカリホスファターゼ標識抗 SARSウィルスモノクローナル抗体を用いた サンドイッチ ELISA法による測定
実施例 4に従い表 4に示すアルカリホスファターゼ標識抗 SARSウィルスモノクロ一 ナル抗体を作製した。更に、実施例 5と同様に表 4に示す抗体固相化プレートを作成 し、ウィルス培養上清を用いて測定を実施した。その結果を表 4に示す。結果は、 SA RS核タンパク質 (244-260)に相当するペプチドを抗原とするモノクローナル抗体を 用いた試薬によって高感度（高希釈倍率の試料)でウィルス培養上清中の Nタンパク 質を検出できた。
[0085] [表 4]
Figure imgf000028_0001
産業上の利用可能性
[0086] 本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、検体中の SARSウィル スを検出又は定量するための免疫測定方法、そのための試薬又は免疫測定器具に 使用することができる。
配列表フリーテキスト
[0087] 配列番号 3：配列番号 2のアミノ酸 244— 260とシスティンと力もなるペプチド配列。

Claims

請求の範囲
[1] 重症急性呼吸器症候群（Severe acute respiratory syndrome ； SARS)原因コロナ ウィルスの核タンパク質に対する抗 SARSウィルスモノクローナル抗体又はその抗原 結合性断片。
[2] モノクローナル抗体である請求項 1記載の抗 SARSウィルスモノクローナル抗体又 はその抗原結合性断片。
[3] 配列番号 1で表される塩基配列を組み込んだベクターから発現させた前記コロナゥ ィルスの核タンパク質を免疫原として使用することにより作製されたハイプリドーマより 産生される請求項 1記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[4] 受託番号 FERM BP— 10143のハイブリドーマ rSN— 18、 FERM BP— 10144の ハイプリドーマ rSN— 122、 FERM BP— 10145のハイブリドーマ rSN— 150、 FER M BP— 10146のハイブリドーマ rSN— 21— 2又は FERM BP— 10147のハイブリド 一マ rSN— 29であるハイプリドーマより産生されるモノクローナル抗体の結合特異性 を有する請求項 3記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[5] 配列番号 3で表されるアミノ酸配列を免疫原として使用することにより作製されたハ イブリドーマより産生される請求項 1記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性 断片。
[6] 請求項 1な 、し 5の 、ずれか 1項に記載のモノクローナル抗体を産生するノ、イブリド 一マであって、抗 SARSウィルスモノクローナル抗体産生細胞と腫瘍細胞とを細胞融 合させることよって得られるハイプリドーマ。
[7] 請求項 1な 、し 5の 、ずれか 1項に記載のモノクローナル抗体を産生する受託番号 FERM BP— 10143のハイブリドーマ rSN— 18、 FERM BP— 10144のハイブリド 一マ rSN— 122、 FERM BP— 10145のハイブリドーマ rSN— 150、 FERM BP— 1 0146のハイブリドーマ rSN— 21—2又は FERM BP— 10147のハイブリドーマ rSN— 29。
[8] 請求項 1な 、し 5の 、ずれか 1項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性 断片を固相抗体及び標識抗体の少なくとも一方に用いた SARS原因コロナウィルス の免疫測定試薬。
[9] 輸液可能なマトリクス上に抗 SARS抗体を固定した検出ゾーンと、標識抗 SARS抗 体を前記マトリクス上に移動可能に点着した標識試薬ゾーンとを有する SARS原因コ ロナウィルスの免疫測定器具であって、前記検出ゾーンに固定した抗体及び標識抗 SARS抗体の少なくとも一方が請求項 1ないし 5のいずれ力 1項に記載のモノクロ一 ナル抗体又はその抗原結合性断片である器具。
[10] 標識が酵素であり、マトリクスの標識試薬ゾーンの輸液方向の上流側に酵素と反応 する基質を有する請求項 9記載の免疫測定器具。
[11] 請求項 1ないし 5のいずれ力 1項に記載の抗 SARSウィルスモノクローナル抗体又 はその抗原結合性断片と、被検試料中の SARSウィルスとの抗原抗体反応を利用し た免疫測定により被検試料中の SARSウィルスを検出することを含む、 SARSウィル スの免疫測定方法。
PCT/JP2004/016099 2003-10-31 2004-10-29 抗ｓａｒｓウイルス抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬 WO2005042579A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/577,310 US20080254440A1 (en) 2003-10-31 2004-10-29 Anti-Sars Virus Antibody, Hybridoma Producing the Antibody and Immunoassay Reagent Using the Antibody
JP2005515168A JPWO2005042579A1 (ja) 2003-10-31 2004-10-29 抗ｓａｒｓウイルス抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-373779 2003-10-31
JP2003373779 2003-10-31
JP2004034268 2004-02-10
JP2004-034268 2004-02-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005042579A1 true WO2005042579A1 (ja) 2005-05-12

Family

ID=34554795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/016099 WO2005042579A1 (ja) 2003-10-31 2004-10-29 抗ｓａｒｓウイルス抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20080254440A1 (ja)
JP (1) JPWO2005042579A1 (ja)
WO (1) WO2005042579A1 (ja)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007043582A1 (ja) * 2005-10-11 2007-04-19 Sysmex Corporation Sarsウイルスヌクレオカプシドタンパク質を測定するための測定方法、測定用試薬キット、試験具、sarsウイルスヌクレオカプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
CN1903878B (zh) * 2005-07-26 2011-09-07 复旦大学 抗SARS病毒人源性抗体IgG Fab片段
JP2011209140A (ja) * 2010-03-30 2011-10-20 Sekisui Medical Co Ltd ヒトｃ反応性タンパク質（ｃｒｐ）測定用イムノクロマト試薬
KR20190006597A (ko) * 2016-06-09 2019-01-18 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 종이-기반 면역검정법에서 사용하기 위한 바이오마커 농축 및 신호 증폭, 그리고 dna의 추출, 농축 및 증폭을 위한 단일 플랫폼
CN112630426A (zh) * 2020-11-17 2021-04-09 上海优晶生物科技有限公司 一种用于检测新型冠状病毒covid-19的胶体金试纸条
US11209427B2 (en) 2017-03-27 2021-12-28 The Regents Of The University Of California Semi-quantitative lateral-flow immunoassay for the detection of CSF leaks
US11327075B2 (en) 2016-08-22 2022-05-10 The Regents Of The University Of California Hydrogel platform for aqueous two-phase concentration of a target to enhance its detection
US11635432B2 (en) 2014-03-07 2023-04-25 The Regents Of The University Of California Methods and devices for integrating analyte extraction, concentration and detection
US11885803B2 (en) 2015-09-04 2024-01-30 The Regents Of The University Of California Methods and devices for analyte collection, extraction, concentration, and detection for clinical applications

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10656079B2 (en) * 2016-02-01 2020-05-19 Micro Detect, Inc. UV solid state detection and methods therefor
CN111435136A (zh) * 2020-03-03 2020-07-21 李翀 用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒及其制备方法
CN113848319B (zh) * 2020-04-16 2024-04-05 杭州博拓生物科技股份有限公司 免疫法检测冠状病毒的横向流动检测装置
WO2021226123A1 (en) * 2020-05-06 2021-11-11 Academia Sinica Recombinant antibodies, kits comprising the same, and uses thereof
JP6960508B1 (ja) * 2020-07-29 2021-11-05 シスメックス株式会社 試料中のウイルス抗原を測定する方法、抗体セット及び試薬キット
CN112710844B (zh) * 2020-12-16 2023-07-07 北京开景基因技术有限公司 用于检测新型冠状病毒中和抗体的半定量试剂盒及方法
RU2771288C1 (ru) * 2021-02-02 2022-04-29 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2E1B5 - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10300750A (ja) * 1997-04-23 1998-11-13 Fujirebio Inc 酵素免疫測定方法及び試験片

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7547512B2 (en) * 2003-03-24 2009-06-16 The University Of Hong Kong High-throughput diagnostic assay for the human virus causing severe acute respiratory syndrome (SARS)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10300750A (ja) * 1997-04-23 1998-11-13 Fujirebio Inc 酵素免疫測定方法及び試験片

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERRY J.D. ET AL.: "Development and characterization neutralizing monoclonal antibody to the SARS-coronavirus", J. VIROLOGICAL. METHODS, vol. 120, June 2004 (2004-06-01), pages 87 - 96, XP002332533 *
CHE X.Y. ET AL.: "Rapid and efficient preparation monoclonal antibodies against SARS associated coronavirus nucleocapsid protein by immunizing mice", J. FIRST. MIL. MED. UNIV., vol. 23, no. 7, July 2003 (2003-07-01), pages 640 - 642, XP008028243 *
CHE X.Y. ET AL.: "Sensitive and specific monoclonal antibody-based capture enzyme immuno assay for detection of nucleocapside antigen in Sera from patients with severe acute respiratory syndrome", J. CLIN. MICROBIOL., vol. 42, no. 6, June 2004 (2004-06-01), pages 2629 - 2635, XP002997483 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1903878B (zh) * 2005-07-26 2011-09-07 复旦大学 抗SARS病毒人源性抗体IgG Fab片段
WO2007043582A1 (ja) * 2005-10-11 2007-04-19 Sysmex Corporation Sarsウイルスヌクレオカプシドタンパク質を測定するための測定方法、測定用試薬キット、試験具、sarsウイルスヌクレオカプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
JP2011209140A (ja) * 2010-03-30 2011-10-20 Sekisui Medical Co Ltd ヒトｃ反応性タンパク質（ｃｒｐ）測定用イムノクロマト試薬
US11635432B2 (en) 2014-03-07 2023-04-25 The Regents Of The University Of California Methods and devices for integrating analyte extraction, concentration and detection
US11885803B2 (en) 2015-09-04 2024-01-30 The Regents Of The University Of California Methods and devices for analyte collection, extraction, concentration, and detection for clinical applications
JP7320951B2 (ja) 2016-06-09 2023-08-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ペーパーベースのイムノアッセイにおいて使用するためのバイオマーカー濃縮及びシグナル増幅、ならびにｄｎａを抽出、濃縮、及び増幅するための単一プラットフォーム
JP2019525136A (ja) * 2016-06-09 2019-09-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ペーパーベースのイムノアッセイにおいて使用するためのバイオマーカー濃縮及びシグナル増幅、ならびにｄｎａを抽出、濃縮、及び増幅するための単一プラットフォーム
KR102592388B1 (ko) 2016-06-09 2023-10-20 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 종이-기반 면역검정법에서 사용하기 위한 바이오마커 농축 및 신호 증폭, 그리고 dna의 추출, 농축 및 증폭을 위한 단일 플랫폼
US11828755B2 (en) 2016-06-09 2023-11-28 The Regents Of The University Of California Biomarker concentration and signal amplification for use in paper-based immunoassays and a single platform for extracting, concentrating, and amplifying DNA
KR20190006597A (ko) * 2016-06-09 2019-01-18 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 종이-기반 면역검정법에서 사용하기 위한 바이오마커 농축 및 신호 증폭, 그리고 dna의 추출, 농축 및 증폭을 위한 단일 플랫폼
US11327075B2 (en) 2016-08-22 2022-05-10 The Regents Of The University Of California Hydrogel platform for aqueous two-phase concentration of a target to enhance its detection
US11209427B2 (en) 2017-03-27 2021-12-28 The Regents Of The University Of California Semi-quantitative lateral-flow immunoassay for the detection of CSF leaks
US11867693B2 (en) 2017-03-27 2024-01-09 The Regents Of The University Of California Semi-quantitative lateral-flow immunoassay for the detection of CSF leaks
CN112630426A (zh) * 2020-11-17 2021-04-09 上海优晶生物科技有限公司 一种用于检测新型冠状病毒covid-19的胶体金试纸条
CN112630426B (zh) * 2020-11-17 2023-12-22 上海优晶生物科技有限公司 一种用于检测新型冠状病毒covid-19的胶体金试纸条

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2005042579A1 (ja) 2008-01-10
US20080254440A1 (en) 2008-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210190797A1 (en) Methods and reagents for diagnosis of SARS-CoV-2 infection
JP2733059B2 (ja) Ｈｔｌｖ−▲ｉｉｉ▼抗体の診断用ペプチド並びにそれらの製造法及び用途
WO2007043582A1 (ja) Sarsウイルスヌクレオカプシドタンパク質を測定するための測定方法、測定用試薬キット、試験具、sarsウイルスヌクレオカプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
WO2005042579A1 (ja) 抗ｓａｒｓウイルス抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬
US20060188519A1 (en) Peptides, antibodies, and methods for the diagnosis of SARS
JP5580967B2 (ja) ブタ繁殖性呼吸器症候群ウイルスに対する抗体を検出するためのペプチド
KR102549704B1 (ko) Pivka-ii의 측정 방법, 및 pivka-ii 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법
WO2011012053A1 (zh) 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法
JP7175147B2 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法およびキット
JP2022174541A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法および試薬
WO2005007697A1 (ja) 抗インフルエンザａ型ウイルスモノクローナル抗体及び該抗体を用いる免疫測定器具
JP2022174540A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法および試薬
JP2016500659A (ja) 抗ウロプラキンｉｉ抗体システムおよび方法
US20100227339A1 (en) Differential immunoassay for prrs vaccine antibody
Xie et al. Preparation of highly specific monoclonal antibodies against SARS‐CoV‐2 nucleocapsid protein and the preliminary development of antigen detection test strips
KR20060054333A (ko) 항-인플루엔자 ｂ형 바이러스 모노클로날 항체 및 상기항체를 사용하는 면역 측정 기구
JP6808178B2 (ja) ヒトパルボウイルスｂ１９抗原および抗体の同時検出方法及びキット
JP2022528465A (ja) 対称性ジメチル化アルギニン分析物に対する抗体及びその用途
KR101876535B1 (ko) 소바이러스성 설사병 바이러스의 탐지용 항체, 이를 이용한 항원 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트
US20090111123A1 (en) Compositions for detecting antibodies to babesia microti and methods of uses thereof
US20240280575A1 (en) Compositions and Methods for the Detection of Mycoplasma
KR101329342B1 (ko) 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 검출용 항체 및 이의 용도
CN109884295B (zh) 假单胞菌多肽、抗体捕获器件及试剂盒
CN116047065A (zh) 一种能鉴别Omicron株的新型冠状病毒抗原快速检测试剂盒
IL295754A (en) Methods and reagents for the diagnosis of sars-cov-2 infection

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200480039648.4

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005515168

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1457/KOLNP/2006

Country of ref document: IN

122 Ep: pct application non-entry in european phase
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10577310

Country of ref document: US