JP7320951B2 - ペーパーベースのイムノアッセイにおいて使用するためのバイオマーカー濃縮及びシグナル増幅、ならびにdnaを抽出、濃縮、及び増幅するための単一プラットフォーム - Google Patents
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Description
本出願は、2016年6月9日出願のUSSN62/348,038の利益及び優先権を主張し、当該出願は、すべての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
政府による支援の記載
[該当なし]
試料における分析対象物を検出及び/または定量化するためのデバイスであって、
前記デバイスが、
第1の相溶液と第2の相とに分離する混合相溶液を含む水性二相系(ATPS)であって、使用時に、前記第1の相溶液が先行相となり、前記第2の相溶液が遅行相となる、前記ATPSと、
ラテラルフローアッセイ(LFA)またはフロースルーアッセイと、
プローブ及び/または増進試薬(development reagent)であって、使用時に、前記プローブが、前記ATPSの前記先行相における前記第1の相溶液と結び付き、及び/または前記増進試薬が、前記ATPSの前記遅行相における前記第2の相溶液と結び付く、前記プローブ及び/または増進試薬と、
を含む、前記デバイス。
前記LFAが、前記ATPSもしくはその構成成分、及び/または前記プローブ、及び/または前記増進試薬を、受け入れ、及び/または含むように構成された多孔性マトリックスを含む、実施形態1に記載のデバイス。
前記LFAが、複合パッド、前記分析対象物と結合する抗体を含む試験ライン、任意選択で、二次抗体を含む対照ライン、任意選択で吸収パッド、及び任意選択で試料パッドを含む、実施形態1~2のいずれか1つに記載のデバイス。
試料における分析対象物を検出及び/または定量化するためのデバイスであって、
前記デバイスが、フロースルー系を含み、
前記フロースルー系が、
混合相溶液を含む水性二相系(ATPS)を含む濃縮コンポーネントであって、使用時に、前記第1の相溶液が先行相となり、前記第2の相溶液が遅行相となる、前記濃縮コンポーネントと、
プローブ及び/または増進試薬であって、使用時に、前記プローブが、前記ATPSの前記先行相における前記第1の相溶液と結び付き、及び/または前記増進試薬が、前記ATPSの前記遅行相における前記第2の相溶液と結び付く、前記プローブ及び/または増進試薬と、
前記濃縮コンポーネントの真下に配置された検出コンポーネントと、
を含む、
前記デバイス。
前記濃縮コンポーネントが、1つまたは複数のペーパー層を含む、実施形態4に記載のデバイス。
前記検出コンポーネントが、複合パッド、反応パッド、及び任意選択でシンクを含む、実施形態4~5のいずれか1つに記載のデバイス。
前記プローブが、前記ATPSに含められる、実施形態1~6のいずれか1つに記載のデバイス。
前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液と結び付く、実施形態7に記載のデバイス。
前記増進試薬が、前記ATPSに含められる、実施形態1~8のいずれか1つに記載のデバイス。
前記増進試薬が、前記ATPSの前記第2の相溶液と結び付く、実施形態9に記載のデバイス。
前記試料が前記デバイスに加えられる前に、前記ATPSが前記試料と混合されるように、前記デバイスが構成される、実施形態1~10のいずれか1つに記載のデバイス。
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記ATPSが脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、実施形態1~11のいずれか1つに記載のデバイス。
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記プローブが脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、実施形態12に記載のデバイス。
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記増進試薬が脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、実施形態12~13のいずれか1つに記載のデバイス。
前記デバイスが前記試料と接触した後に、前記ATPSが、第1の相溶液と第2の相溶液とに分離する混合相溶液を含む、実施形態12~14のいずれか1つに記載のデバイス。
前記プローブが、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態1~15のいずれか1つに記載のデバイス。
前記プローブが、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態1~15のいずれか1つに記載のデバイス。
前記増進試薬が、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態1~17のいずれか1つに記載のデバイス。
前記増進試薬が、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態1~17のいずれか1つに記載のデバイス。
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、実施形態1~19のいずれか1つに記載のデバイス。
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含む、実施形態20に記載のデバイス。
前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態20に記載のデバイス。
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態20に記載のデバイス。
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSである、実施形態20に記載のデバイス。
前記ATPSが、PEG/塩ATPSである、実施形態24に記載のデバイス。
前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、実施形態24~25のいずれか1つに記載のデバイス。
前記ATPSが、ミセルATPSである、実施形態20に記載のデバイス。
前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、実施形態27に記載のデバイス。
前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、実施形態1~28のいずれか1つに記載のデバイス。
前記標的分析対象物が、タンパク質、核酸、糖またはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、実施形態29に記載のデバイス。
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、実施形態30に記載のデバイス。
前記標的分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態30に記載のデバイス。
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態32に記載のデバイス。
前記標的分析対象物が、病状に対するバイオマーカー、食品安全(もしくは危険)に対するバイオマーカー、またはバイオテロ物質に対するバイオマーカーを含む、実施形態32に記載のデバイス。
前記結合部分が、抗体または抗体断片、レクチン、核酸、及びアプタマーからなる群から選択される、実施形態29~34のいずれか1つに記載の方法。
前記プローブが、抗体または抗体断片を含む、実施形態35に記載のデバイス。
前記プローブが、合成ポリマー、金属、ミネラル、ガラス、石英、セラミック、生体ポリマー、及びプラスチックからなる群から選択される材料を含む、実施形態1~36のいずれか1つに記載のデバイス。
前記プローブが、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはポリ塩化ビニル、デキストラン、ポリプロピレン、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される材料を含む、実施形態37に記載のデバイス。
前記プローブが、金、銀、鉄、白金、パラジウム、セリウム、及びチタンからなる群から選択される金属を含む、実施形態37に記載のデバイス。
前記プローブが、ナノ粒子を含む、実施形態1~39のいずれか1つに記載のデバイス。
前記プローブが、前記増進試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含む、実施形態1~40のいずれか1つに記載のデバイス。
前記物質が、基質と反応して強力な可視シグナルを形成する酵素を含む、実施形態41に記載のデバイス。
前記増進試薬が、前記基質を含む、実施形態42に記載のデバイス。
前記増進試薬が、前記酵素と結合する抗体を含む、実施形態42に記載のデバイス。
前記物質が、酵素と反応して強力な可視生成物を形成する基質を含む、実施形態41に記載のデバイス。
前記増進試薬が、前記酵素を含む、実施形態45に記載のデバイス。
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ(または他の)ペルオキシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される、実施形態42及び実施形態46のいずれか1つに記載のデバイス。
前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液または前記第2の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含む、実施形態1~47のいずれか1つに記載のデバイス。
前記コーティングが、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、親水性タンパク質、及び疎水性タンパク質からなる群から選択される材料を含む、実施形態48に記載のデバイス。
前記デバイスが、異なる分析対象物とそれぞれが相互作用する2つ以上のプローブを含む、実施形態1~49のいずれか1つに記載のデバイス。
前記デバイスが、少なくとも2つの異なるプローブ、または少なくとも3つの異なるプローブ、または少なくとも4つの異なるプローブ、または少なくとも5つの異なるプローブ、または少なくとも7つの異なるプローブ、または少なくとも10の異なるプローブ、または少なくとも15の異なるプローブ、または少なくとも20の異なるプローブを含む、実施形態50に記載のデバイス。
前記デバイスが、サンドイッチアッセイを実施するために構成される、実施形態1~51のいずれか1つに記載のデバイス。
第1の相溶液と第2の相とに分離する混合相溶液であって、LFAまたは他の多孔性媒体における使用時に、前記第1の相溶液が先行相になり、前記第2の相溶液が遅行相になる、前記混合相溶液と、
プローブ及び/または増進試薬であって、前記プローブが、前記第1の相溶液と結び付き、前記増進試薬が、前記第2の相溶液と結び付く、前記プローブ及び/または増進試薬と、
を含む、水性二相系(ATPS)。
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、実施形態53に記載の水性二相系。
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態54に記載の水性二相系。
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSである、実施形態54に記載の水性二相系。
前記ATPSが、PEG/塩ATPSである、実施形態56に記載の水性二相系。
前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、実施形態56~57のいずれか1つに記載の水性二相系。
前記ATPSが、ミセルATPSである、実施形態54に記載の水性二相系。
前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、実施形態59に記載の水性二相系。
前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、実施形態1~60のいずれか1つに記載の水性二相系。
前記ATPSが、多孔性媒体に含められる、実施形態1~61のいずれか1つに記載の水性二相系。
前記ATPSが、ペーパーに含められる、実施形態1~61のいずれか1つに記載の水性二相系。
前記ATPSが、ラテラルフローアッセイ(LFA)に含められる、実施形態1~61のいずれか1つに記載の水性二相系。
前記ATPSが、フロースルー系に含められる、実施形態1~61のいずれか1つに記載の水性二相系。
分析対象物の検出方法及び/または定量化方法であって、
前記方法が、
水性二相系(ATPS)へ試料を加えることであって、前記加えることによって、前記分析対象物が、前記試料に存在するのであれば、前記ATPSの1つの相に濃縮されて分析対象物含有相が得られる、前記加えることと、
ラテラルフローアッセイ(LFA)またはフロースルーアッセイへ前記分析対象物含有相を加えることであって、前記LFAまたはフロースルーアッセイにおいて検出プローブが前記分析対象物に結合する、前記加えることと、
前記LFAまたはフロースルーアッセイへ増進試薬を加えることであって、前記加えることによって、前記検出プローブが生成するシグナルが増強される、前記加えることと、
前記試料における前記分析対象物の存在及び/または量を示すための、前記シグナルの検出及び/または定量化と、
を含む、前記方法。
前記ラテラルフローアッセイまたはフロースルーアッセイが、ラテラルフローアッセイである、実施形態66に記載の方法。
前記ラテラルフローアッセイまたはフロースルーアッセイが、フロースルーアッセイである、実施形態66に記載の方法。
前記ATPSがペーパーに加えられ、前記ATPSが前記ペーパーを通過するにつれて相が分離することで、「流れながら濃縮する」ATPSが得られる、実施形態66~68のいずれか1つに記載の方法。
前記ATPSがペーパーに加えられると、より疎水的な相が先行し、より親水的な相が遅行する、実施形態69に記載の方法。
前記ATPSがペーパーに加えられると、より親水的な相が先行し、より疎水的な相が遅行する、実施形態69に記載の方法。
前記LFAまたはフロースルーアッセイが、結合部分が前記分析対象物を捕捉し、前記検出プローブが前記捕捉分析対象物に結合するものである、実施形態66~71のいずれか1つに記載の方法。
前記分析対象物含有相が、手動またはロボット制御で前記ATPSから取り出された後、前記ラテラルフローアッセイに加えられる、実施形態66~72のいずれか1つに記載の方法。
前記検出プローブが、前記LFAまたはフロースルーアッセイのコンポーネントとして提供される、実施形態73に記載の方法。
次に、前記増進試薬が、前記ATPSとは別に、前記ラテラルフローアッセイに加えられる、実施形態73~74のいずれか1つに記載の方法。
前記プローブと前記増進試薬との両方が、前記ATPSに加えられるか、または前記ATPSに含めて提供され、前記ATPSの前記構成成分が、前記プローブが前記ATPSの第1の相に実質的に分配され、前記増進試薬が前記ATPSの第2の相に実質的に分配されるように選択される、実施形態66~72のいずれか1つに記載の方法。
前記ATPSが、ペーパー基質に加えられると、先行相及び遅行相を形成し、前記先行相が、前記濃縮分析対象物及び前記プローブをLFA試験ストリップまたはフロースルーアッセイに送達した後、前記遅行相が、前記試験ストリップまたはフロースルーアッセイに前記増進試薬を遅れて送達する、実施形態76に記載の方法。
前記プローブが、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態76~77のいずれか1つに記載の方法。
前記プローブが、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態76~77のいずれか1つに記載の方法。
前記増進試薬が、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態76~79のいずれか1つに記載の方法。
前記増進試薬が、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態76~79のいずれか1つに記載の方法。
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、実施形態66~81のいずれか1つに記載の方法。
前記ATPSの前記第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態82に記載の方法。
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSである、実施形態82に記載の方法。
前記ATPSが、PEG/塩ATPSである、実施形態84に記載の方法。
前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、実施形態84~85のいずれか1つに記載の方法。
前記ATPSが、ミセルATPSである、実施形態82に記載の方法。
前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、実施形態87に記載の方法。
前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、実施形態66~88のいずれか1つに記載の方法。
前記標的分析対象物が、タンパク質、核酸、糖またはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、実施形態89に記載の方法。
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、実施形態90に記載の方法。
前記標的分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態90に記載の方法。
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態92に記載の方法。
前記結合部分が、抗体または抗体断片、レクチン、核酸、及びアプタマーからなる群から選択される、実施形態89~92のいずれか1つに記載の方法。
前記プローブが、抗体または抗体断片を含む、実施形態94に記載の方法。
前記プローブが、合成ポリマー、金属、ミネラル、ガラス、石英、セラミック、生体ポリマー、及びプラスチックからなる群から選択される材料を含む、実施形態66~95のいずれか1つに記載の方法。
前記プローブが、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはポリ塩化ビニル、デキストラン、ポリプロピレン、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される材料を含む、実施形態96に記載の方法。
前記プローブが、金、銀、鉄、白金、パラジウム、セリウム、及びチタンからなる群から選択される金属を含む、実施形態96に記載の方法。
前記プローブが、ナノ粒子を含む、実施形態66~98のいずれか1つに記載のデバイス。
前記プローブが、前記増進試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含む、実施形態66~99のいずれか1つに記載の方法。
前記物質が、基質と反応して強力な可視シグナルを形成する酵素を含む、実施形態100に記載の方法。
前記増進試薬が、前記基質を含む、実施形態101に記載の方法。
前記増進試薬が、前記酵素と結合する抗体を含む、実施形態101に記載の方法。
前記物質が、酵素と反応して強力な可視生成物を形成する基質を含む、実施形態100に記載の方法。
前記増進試薬が、前記酵素を含む、実施形態104に記載の方法。
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ(または他の)ペルオキシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される、実施形態101及び実施形態105のいずれか1つに記載の方法。
前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液または前記第2の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含む、実施形態66~106のいずれか1つに記載のデバイス。
前記コーティングが、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、親水性タンパク質、及び疎水性タンパク質からなる群から選択される材料を含む、実施形態107に記載のデバイス。
前記方法が、実施形態1~52のいずれか1つに記載のデバイスを使用して実施される、実施形態66~108のいずれか1つに記載の方法。
分析対象物を検出及び/または定量化するためのキットであって、前記キットが、実施形態1~52のいずれか1つに記載のデバイスと、試料を採取するための採取デバイスと、を含む、前記キット。
前記採取デバイスが、口腔液を採取するためのデバイスを含む、実施形態110に記載のキット。
前記採取デバイスが、血液を採取するためのデバイスを含む、実施形態110に記載のキット。
前記採取デバイスが、尿採取デバイスを含む、実施形態110に記載のキット。
前記採取デバイスが、膣液を採取するためのデバイス、または子宮頸管内スワブから採取するためのデバイスを含む、実施形態110に記載のキット。
前記採取デバイスが、環境試料のためのデバイスを含む、実施形態110に記載のキット。
核酸を精製及び増幅する方法であって、前記方法が、第1の相溶液及び第2の相溶液に分離する混合相溶液を含む水性二相系(ATPS)を提供することであって、前記ATPSが、核酸が前記第1の相溶液もしくは前記第2の相溶液のいずれかに分配されることになるものであるか、または前記ATPSが、核酸が前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との間の界面に局在化することになるものである、前記提供することと、前記ATPSへ核酸を含む試料を導入することであって、前記核酸が、前記第1の相溶液もしくは前記第2の相溶液、または前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との間の前記界面に分配されることで濃縮核酸が得られる、前記導入することと、増幅核酸を得るために核酸増幅反応において前記濃縮核酸を増幅することと、を含む、前記方法。
前記核酸が、DNAである、実施形態116に記載の方法。
前記核酸が、RNAである、実施形態116に記載の方法。
前記核酸が、RNAから逆転写されたDNAである、実施形態116に記載の方法。
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、実施形態116~119のいずれか1つに記載の方法。
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態120に記載の方法。
前記増幅することが、前記第1の相から前記濃縮核酸を回収することであって、その方法が、回収濃縮核酸を得るために、前記第1の相溶液もしくは前記第2の溶液、または前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との前記界面から前記核酸を回収することを含む、前記回収することと、前記核酸を増幅するために核酸増幅反応へ前記回収濃縮核酸を導入することと、を含む、実施形態116~121のいずれか1つに記載の方法。
前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応系を含む、実施形態122に記載の方法。
前記核酸増幅反応が、等温増幅系を含む、実施形態122に記載の方法。
前記核酸増幅反応が、自己持続性シーケンス反応(3SR)、核酸ベースの転写アッセイ(NASBA)、転写増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ステムループ増幅、シグナル介在RNA増幅技術(SMART)、等温多置換増幅(IMDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(cHDA)、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)からなる群から選択される増幅系を含む、実施形態124に記載の方法。
前記増幅することが、等温核酸増幅のために試薬と前記ATPSを混合することを含む、実施形態116~121のいずれか1つに記載の方法。
前記核酸増幅反応が、等温増幅系を含む、実施形態126に記載の方法。
前記核酸増幅反応が、自己持続性シーケンス反応(3SR)、核酸ベースの転写アッセイ(NASBA)、転写増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ステムループ増幅、シグナル介在RNA増幅技術(SMART)、等温多置換増幅(IMDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(cHDA)、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)からなる群から選択される増幅系を含む、実施形態127に記載の方法。
前記方法が、室温または室温未満の温度で前記等温増幅を実施することを含む、実施形態127~128のいずれか1つに記載の方法。
前記方法が、等温増幅のための試薬を含む前記ATPSを実質的に一定な温度まで加熱することを含む、実施形態127~128のいずれか1つに記載の方法。
前記増幅が、ヘリカーゼ依存性増幅を含み、約65℃の一定温度で実施される、実施形態127~130のいずれか1つに記載の方法。
前記方法が、単一の容器で実施される、実施形態126~131のいずれか1つに記載の方法。
前記方法が、マルチウェルプレートのウェルに異なる試料をそれぞれ含めて複数の核酸試料で実施される、実施形態126~131のいずれか1つに記載の方法。
前記複数の試料が、少なくとも2つの試料、または少なくとも4つの試料、または少なくとも8つの試料、または少なくとも16の試料、または少なくとも32の試料、または少なくとも64の試料、または少なくとも128の試料を含む、実施形態133に記載の方法。
前記方法が、マイクロ流体系(例えば、ラボ・オン・チップ)のチャンバーまたはチャネルにおいて実施される、実施形態126~131のいずれか1つに記載の方法。
前記試料が、細胞溶解物である、実施形態116~135のいずれか1つに記載の方法。
前記試料が、核酸である、実施形態116~135のいずれか1つに記載の方法。
前記試料が、インタクトな細胞を含み、前記ATPSが、細胞を溶解するATPSである、実施形態116~135のいずれか1つに記載の方法。
前記ATPSが、ミセルATPSである、実施形態116~138のいずれか1つに記載の方法。
前記試料が、血液または濾紙血を含み、前記ATPSが、濾紙血を再溶解するものである、実施形態116~138のいずれか1つに記載の方法。
前記ATPSが、PEG/デキストランATPSを含む、実施形態140に記載の方法。
前記ATPSが、UCON/デキストランATPSを含む、実施形態140に記載の方法。
核酸を精製及び増幅するためのキットであって、
前記キットが、
水性二相系(ATPS)の構成成分を含む容器と、
等温核酸増幅系の1つまたは複数の構成成分を含む容器と、
を含む、前記キット。
ATPSの構成成分を含む前記容器と、等温核酸増幅系の構成成分を含む前記容器と、が同一の容器である、実施形態143に記載のキット。
ATPSの構成成分を含む前記容器と、等温核酸増幅系の構成成分を含む前記容器と、が異なる容器である、実施形態143に記載のキット。
等温核酸増幅系の1つまたは複数の構成成分を含む前記容器が、自己持続性シーケンス反応(3SR)、核酸ベースの転写アッセイ(NASBA)、転写増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ステムループ増幅、シグナル介在RNA増幅技術(SMART)、等温多置換増幅(IMDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(cHDA)、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)からなる群から選択される反応系の1つまたは複数の構成成分を含む、実施形態143~145のいずれか1つに記載のキット。
前記1つまたは複数の構成成分が、前記核酸増幅反応を実行する酵素を含む、実施形態146に記載のキット。
前記1つまたは複数の構成成分が、ヘリカーゼを含む、実施形態146に記載のキット。
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、実施形態143~148のいずれか1つに記載のキット。
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態149に記載のキット。
前記ATPSが、ミセルATPSを含む、実施形態143~149のいずれか1つに記載のキット。
前記ATPSが、PEG/デキストランATPSを含む、実施形態143~149のいずれか1つに記載のキット。
前記ATPSが、UCON/デキストランATPSを含む、実施形態143~149のいずれか1つに記載のキット。
前記キットが、実施形態126~142のいずれか1つに記載の方法を実施するためのプロトコールを提供する説明資料を含む、実施形態143~153のいずれか1つに記載のキット。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、天然起源のアミノ酸ポリマーだけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
さまざまな実施形態において、ATPSの濃縮能力をLFA(またはフロースルーアッセイ)と併用し、これによってLFA(またはフロースルーアッセイ)の検出限界を顕著に(例えば、10~100倍以上)改善することで、実験室ベースのアッセイの感度に近づけることができる。こうした実験室ベースのアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)(例えば、PCT出願第WO2015/134938号(PCT/US2015/019297)、及び2015年9月4日出願の同時係属出願USSN62/214,801を参照のこと)(これらの文献は両方共、そこに開示される方法及びデバイスを対象として参照によって本明細書に組み込まれる)などである。分析対象物の濃縮にATPSを使用するために、目的の試料は、典型的には、ATPSに加えられ、添加された分析対象物は、そこでサイズ及び親水性などのさまざまな物理的特性及び化学的特性に基づいて2つの水性相に分布または分配される。2つの相のうちの1つに極度に分配される分析対象物は、その相の体積を著しく減らすことによってその相に濃縮することができる。系の水性性質は、生体分子にとって穏和な環境を提供することにもなり得、これによってその構造及び生物学的活性が安定する。
ある特定の実施形態では、DNA増幅技術と、DNAの抽出段階及び予備濃縮段階と、を組み合わせて、すべてを1つの統合プラットフォームに組み込む方法及びデバイスが提供される。ある特定の実施形態では、このプラットフォームは、水性二相系(ATPS)からなり、これによって、所与の構成成分濃度及び温度で、ATPS混合物が2つの異なる相に分離することが可能となる。両方の相が水性であり、生体分子にとって安定な環境を提供する。
本明細書に記載のアッセイのさまざまな実施形態において、分析対象物(例えば、標的生体分子)は、水性二相系(ATPS)を使用して濃縮することができる。さまざまな実施形態において、ATPSは、バルクの液体形態(例えば、容器)において実施するか、またはラテラルフローアッセイもしくはフロースルーアッセイ(例えば、ペーパー膜)において試料溶液を流しながら実施することができる。
採取した試料(例えば、組織試料、生体液(尿、唾液、及び血液、痰、膣液、精液、脳脊髄液、リンパ液など)、子宮頸管内スワブ、歯に由来するプラーク、食品試料、ならびに環境試料、ならびに同様のもの)は、任意選択で、懸濁液(例えば、緩衝液)と混合されるか、もしくはATPS溶液と直接的に混合されるか、もしくはペーパーに直接的に加えられるか、または試料を含む懸濁液がペーパーに加えられることで、事前にペーパーに乾燥吸着したATPS構成成分が再水和し得る。場合によっては、よく混合された均一溶液を得るために、使用者による混合が必要であり得る。例示的であるが非限定的なさまざまな実施形態において、ポリマー/塩、ポリマー/ポリマー、ミセル/ポリマー、またはミセルATPSが使用され得る。
さまざまな実施形態において、濃縮段階は、ペーパーを用いても促進され得る。例えば、採取した検体をATPS構成成分と混合し、相分離を推進、強化、及び促進することができるペーパーデバイスに導入にすることができる。標的生体分子は、ペーパー膜での流れの先行前部において濃縮することができ、次の検出コンポーネントへと途切れることなく導入することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイスは、例えば、シリンジまたは他の容器における水性二相系(ATPS)と併せて働くように構成されるか、または水性二相系(ATPS)を支持するように構成される。いくつかの実施形態では、ATPSは、相溶液を含む。「相溶液」という用語は、一般に、ATPSの第1の相溶液または第2の相溶液を指す。いくつかの実施形態では、相溶液は、混合溶液(例えば、第1の相溶液/第2の相溶液との混合溶液)に存在する。いくつかの実施形態では、相溶液は、ATPSの混合溶液からそれが分配された後の第1の相溶液/第2の相溶液である。いくつかの実施形態では、相溶液は、LFAまたはフロースルーアッセイにおいて混合溶液からそれが分配された後の第1の相溶液/第2の相溶液である。ある特定の実施形態では、相溶液は、それが混合状態(例えば、第1の相溶液との混合状態)にある間、第2の相溶液と称され得る。いくつかの実施形態では、相溶液は、LFAまたはフロースルーアッセイにおける先行流体である。いくつかの実施形態では、相溶液は、LFAまたはフロースルーアッセイにおける遅行流体である。
さまざまな実施形態において、ペーパーベースの検出コンポーネントは、ラテラルフロー試験ストリップ(例えば、図1を参照のこと)またはフロースルーデバイス(スポット試験)(例えば、図11を参照のこと)の形態であり得る。さまざまな実施形態において、両方の形態要素は、下記のコンポーネントのうちの1つまたは複数を含み得る:
ある特定の実施形態では、試料パッドは、存在するとき、濃縮コンポーネントを検出コンポーネントに連結することができる。試料パッドは、採取した流体に由来するデブリ、混入物、及び粘液を除去することができるフィルターとして働くことができる。試料パッドは、乾燥試薬を保持することもでき、再水和時に、こうした試薬は、(i)検出条件(pH、イオン強度など)が最適となるように溶液を調整し、(ii)採取した検体に含まれ、検出に影響し得る粘液、糖タンパク質、及び他の粘性材料を分解することができる。試料パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、または不織紙などが含まれる。パッドに加える試薬には、限定はされないが、界面活性剤(TritonX-100、Tween20、またはドデシル硫酸ナトリウムなど)、ポリマー(ポリエチレングリコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン(PVP)など)、緩衝剤(リン酸緩衝生理食塩水、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)、ホウ酸ナトリウム、TRICINEなど)、タンパク質(アルブミンなど)、酵素(プロテアーゼなど)、塩(塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、リン酸カリウムなど)が含まれ得る。さまざまな実施形態において、こうした試薬は、(i)試薬溶液へのペーパー材料の浸漬、または(ii)毛細管流動を介する膜の浸潤によって試料パッドに加えることができる。処理した試料パッドは、(i)風乾(室温に放置)、(ii)ベーキング(オーブンもしくは加温デバイス使用し、高温下に置く)、(iii)減圧、または(iv)凍結乾燥によって乾燥させることができる。
さまざまな実施形態において、複合パッドは、存在するとき、標的分析対象物(複数可)と結合する結合部分で修飾され、かつ脱水された比色指示薬を含み得る。ある特定の実施形態では、結合部分は、標的分析対象物(複数可)(例えば、細菌、真菌、ウイルス、タンパク質、DNAなど)に対して高親和性を有する特異的な結合部分である。試料溶液が複合パッドに到達すると、比色指示薬は再水和する。その後、比色指示薬に存在する結合部分は、標的分析対象物(複数可)に結合することができ、得られる複合体は、反応パッドへと流れることができる。ある特定の実施形態では、比色指示薬は、金属粒子(金粒子、銀粒子など)、多量体粒子(ラテックスビーズなど)、及び可視色素または蛍光色素を封入するポリスチレン粒子を含み得る。複合パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、または不織紙などが含まれる。ある特定の実施形態では、比色指示薬は、上記のパッドに加え、脱水吸着させることができる。
ある特定の実施形態では、反応パッドは、存在するとき、固定化された試薬を含み得、固定化された試薬は、試料溶液と反応すると、シグナル(例えば、視覚的シグナル)を生成することで標的分析対象物(複数可)の存在の有無またはその量を示し得る。反応パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、または不織紙などが含まれる。
ある特定の実施形態では、ラテラルフロー試験ストリップについては、反応パッドに加える試薬は、流れの方向に対して垂直のラインの形態で固定化されることで、すべての試料が固定化試薬と確実に相互作用し得ることになる。試薬の濃度は、シグナル強度を制御し、したがって、アッセイの感度を制御するために最適化することができる。例えば、半定量的アッセイを、さまざまな濃度で同一の試薬を複数のラインとして固定化することによって設計できる。したがって、それぞれのラインは、特定濃度の標的生体分子が到達したときにのみ、シグナルを生成することになる。その後、視認可能なラインの数を数えることによって標的生体分子の濃度を解釈することができる(例えば、図2を参照のこと)。
ある特定の実施形態では、フロースルー試験ついては、試薬は、ラインの代わりに、反応パッド全体に固定化することができる。標的分析対象物は、存在するのであれば、複合パッドに存在する比色指示薬に結合し、指示薬-標的複合体が固定化試薬に結合するにつれて反応パッドに捕捉されることになる。したがって、標的生体分子が存在するのであれば、可視スポットが出現することになる。この試験は、ラテラルフロー試験ストリップで吸い上げるには試料体積が小さすぎる場合に使用することができる。可視スポットの色の強度は、標的生体分子の濃度と相関し、スポットのサイズは、試料体積と相関する。ある特定の実施形態では、フロースルー試験の真上に濃縮コンポーネントを配置することで、抽出し、濃縮した試料を検出コンポーネントに加えるという手間を省くことができる。
ある特定の実施形態では、シンクは、存在するとき、過剰な流体を回収し、試験性能に影響し得る逆流を防ぐ吸収パッドを含み得る。シンクのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、及び不織紙などが含まれる。
上記のように、さまざまな実施形態において、可視シグナル強度を増強することによって検出アッセイの感度及び/または精度を改善することができる。これは、最初の検出アッセイ(分析対象物の結合)の後に、追加の増進(シグナル増強)試薬を反応パッドに導入することによって実施できる。上に説明されるように、プローブ及びATPSは、プローブが検出ゾーンに最初に送達され(例えば、ATPSの先行相または界面に含まれて送達される)、その後、増進試薬が遅れて送達される(例えば、ATPSの遅行相に含まれて送達される)ように設計することができる。
上に説明されるように、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイス及び系は、試料における標的分析対象物を検出するためのラテラルフローアッセイ(LFA)またはフロースルー(スポット)アッセイを提供するように構成され、LFAまたはスポットアッセイは、単独で使用されるか、または水性二相系(ATPS)と併せて使用される。いくつかの実施形態では、LFAまたはスポットアッセイは、ATPSまたはその構成成分が流れ込む多孔性マトリックスを含み、多孔性マトリックスは、ATPSまたはその構成成分が流体相に含まれるとき、ATPSまたはその構成成分が多孔性マトリックスを通過することが可能なように構成されると共に、それを可能にする十分な多孔度を有する。そのような多孔性のLFAまたはスポットアッセイデバイスは、本明細書でペーパーデバイスまたはペーパー流動性デバイスと称され、これらの用語は、互換的に使用される。
ATPSは、当該溶液が多孔性基質(例えば、ペーパー)を通過するにつれて相分離し得ることが発見され、このことを我々は「流れながら濃縮」と命名した。さらに、ペーパーを通過することによって濃縮プロセスが顕著に迅速化することも発見された。この現象に基づくと、本明細書に記載のラテラルフローアッセイデバイス及びフロースルーアッセイデバイスは、ATPSによる濃縮をLFAまたはフロースルーによる検出と組み合わせるために必要なコンポーネントを完全に統合するペーパー流動性コンポーネントを含み得る。混合されたATPS溶液が、ある特定のペーパー材料に加えられると、当該溶液が流れるにつれて、相分離及び分析対象物の濃縮が生じることが発見された。我々は、ATPSにさまざまな体積比(例えば、上相の体積を下相の体積で割ったもの)を持たせたときでさえ、この現象が維持されることも実証した。
いくつかの実施形態では、LFAまたはフロースルー(スポット)アッセイデバイスは、サンドイッチアッセイが提供または実施されるように構成される(例えば、本明細書の図1、及び2015年3月6日に出願された同時係属中のPCT出願第PCT/US2015/019297号(当該文献は、そこに記載のLFA構成を対象として参照によって本明細書に組み込まれる)の図1の左下を参照のこと)。いくつかの実施形態では、サンドイッチアッセイは、標的分析対象物と結合する捕捉部分を含む。いくつかの実施形態では、デバイスは、プローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な特性(比色性、蛍光性、放射性など)を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、標的分析対象物と相互作用する結合部分(例えば、抗体)を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、試料に添加され、標的分析対象物と結合することでプローブ-分析対象物複合体を形成する。
いくつかの実施形態では、LFAは、競合アッセイを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、試料に添加され、標的分析対象物と結合することでプローブ-分析対象物複合体を形成する。いくつかの実施形態では、LFAは、試験ラインに固定化された標的分析対象物を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、試料における標的分析対象物によって飽和し、そのプローブは、試験ラインに固定化された標的分析対象物に結合しないことになる。いくつかの実施形態では、試験ラインに検出可能なシグナルが存在しないことによって結果が陽性であることが示される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物が試料に存在せず、試験ラインに存在する標的分析対象物にプローブが結合することによって結果が陰性であることが示される。いくつかの実施形態では、LFAは、対照ラインにプローブ捕捉部分を含み、このプローブ捕捉部分は、プローブと直接的に相互作用するものであり、標的分析対象物が試料に存在するか否かを問わず、プローブは、プローブ捕捉部分に結合し、対照ラインに蓄積することができる。いくつかの実施形態では、プローブが対照ラインで捕捉固定化及び検出されることによって、試験が有効であることが示される。いくつかの実施形態では、結果が陽性であること(例えば、試料に標的分析対象物が存在すること)は、試験ライン及び対照ラインにおける検出可能なシグナルによって示される。いくつかの実施形態では、結果が陰性であることは、対照ラインにおける検出可能なシグナルによって示される。
いくつかの実施形態では、ATPSもしくはその構成成分及び/またはプローブ及び/または増進試薬は脱水されて、LFAを構成する多孔性マトリックスの少なくとも第1の部分に加えられ、及び/または含められるか、あるいはフロースルーアッセイデバイスの濃縮コンポーネントに含められる。いくつかの実施形態では、デバイスに試料が加えられると、ATPS、及び/またはプローブ及び/または増進試薬(複数可)が水和し、それによってATPSもしくはその構成成分及び/またはプローブ及び/または増進試薬(複数可)が流体相に変換される。使用者に必要なことは、デバイスに試料(例えば、唾液、血液、尿、膣液、精液、痰、脳脊髄液、リンパ液、または同様の流体)を添加することのみになるため、脱水しておくことは、使用者にとってのデバイスの使い勝手を向上させることになり得る。いくつかの実施形態では、使用者に必要なことは、標的分析対象物の存在/非存在を検出ために、または分析対象物を定量化するために、ストリップに試料の溶液を加えることのみである。いくつかの実施形態では、試料の溶液がLFAまたはフロースルーデバイスを通過し、ATPSが再溶解することで、LFAまたはフロースルーデバイスの中で相分離が誘発され、その結果、標的分析対象物が濃縮される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の系及び/またはデバイス、及び/または本明細書に記載の方法では、プローブが利用され、プローブは、標的分析対象物に結合することでプローブ-分析対象物複合体を形成する結合部分を含む。
いくつかの実施形態では、結合部分は、標的分析対象物(例えば、細菌、真菌、ウイルス、レクチン、糖、タンパク質、DNAなど)と結合する分子である。いくつかの実施形態では、結合部分は、標的分析対象物と特異的に結合する分子である。いくつかの実施形態では、「特異的に結合する」は、分子が、標的分析対象物に優先的に結合するか、または他の分子と比較して高い親和性で標的分析対象物に結合することを示す。非限定的な例として、抗体は、抗原を標的として産生し、その抗原に選択的に結合することになる。また、非限定的な例として、DNA分子は、実質的に相補的な配列に結合することになり、厳密条件下では、無関係の配列には結合しない。いくつかの実施形態では、「特異的な結合」は、分子(例えば、タンパク質及び他の生物製剤)の異種性集団に標的分析対象物が存在することを決定付ける結合反応を指し得る。いくつかの実施形態では、結合部分は、その特定の標的分析対象物に結合し、試料に存在する他の分子に顕著な量で結合しない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び/またはデバイスは、熱サイクリングを伴わずに標的核酸を増幅する(例えば、等温増幅)。等温核酸増幅方法は、二本鎖DNAに適用され得る。しかしながら、標的核酸分子を二本鎖DNA標的に限定する必要はない。例えば、本明細書に記載の等温増幅方法において使用するための二本鎖DNAは、ウイルスRNA、またはmRNA、または他の一本鎖RNA標的源から逆転写酵素によって調製され得る。別の例では、本明細書に記載の非サイクリング増幅方法において使用するための二本鎖DNAは、一本鎖DNA標的からDNAポリメラーゼによって調製され得る。さまざまな実施形態において、そのような方法は、以下に議論される等温増幅方法を適用する前に、最初の段階として適用され得る。
さまざまな実施形態において、本明細書に記載のデバイス及び方法を使用してアッセイされる試料は、生体試料、環境試料、食品試料などを含む。生体試料の例には、限定はされないが、生体液(血液または血液分画物、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、口腔液、膣液、及び同様のものなど)、組織試料、プラーク試料、子宮頸管内スワブ試料、細胞試料、組織または臓器の生検物または吸引物、組織学的検体、ならびに同様のものが含まれる。
口腔液は、空のバイアルによだれを垂らすことによって採取した後、アッセイの濃縮コンポーネントに当該液を移すことができる。
プラークは、歯の表面、歯茎、または歯間に対してブラシ、スワブ、またはピックを適用することによって採取できる。ある特定の実施形態では、その後、採取したプラークは、緩衝液またはその後の濃縮のためにATPS溶液に混合して含めることができる。
さまざまな実施形態において、尿は、採取カップを用いて取得することができる。その後、採取した尿は、その後の濃縮のためのATPS溶液に混合して含めるか、またはATPS構成成分が脱水されて濃縮コンポーネントに含められているのであれば、デバイスに直接的に加えることができる。カテーテルが挿入された対象では、カテーテルまたはカテーテル受入バッグから尿を取得することができる。
膣表面もしくは子宮頸部表面上及び/または膣液内の標的分析対象物は、商業的に利用可能なスワブによって採取することができる。採取したスワブは、標的を遊離させるために緩衝液に含めるか、または標的生体分子を直接的に濃縮するためにATPS溶液に含めることができる。
血液は、ピン(ランセット)穿刺、及び毛細管に採取するもの、シリンジによるもの、ならびに同様のものによって採取することができる。
本明細書に記載のアッセイデバイス及び方法を使用すると、基本的にどのような分析対象物でも検出及び/または定量化することができるが、ある特定の実施形態では、分析対象物は、臨床的に意義を有する分析対象物(例えば、細菌、真菌、原生動物、アメーバ、ウイルス、及び同様のもの)である。
膣液または組織試料、パップスメアにおいてTrichomonas vaginalis、細菌性膣疾患、及びアクチノマイセス感染症が発見されることは、他の診断試験を実施せずとも、治療を要するという指標であると考えられ得る。選択患者では無症候性感染症を治療することで合併症を予防することができる。カンジダは、膣における共生細菌であり得、それ故に、無症候性患者の治療は必要ないこともあり得る。IUD使用者においてtrichomonas vaginalis及びカンジダによる感染症が検出される割合がより高いことは、IUDが膣感染症及び関連合併症のリスクを増加させ得ることを示している。
Escherichia coli及びProteus属の1種は細菌病原体であり、この病原体が尿に見られると、典型的には、尿路感染症であることを意味する。
グラム陰性口腔内嫌気性生物は、歯周病と関連する頻度が高く、種によっては、他と比較して高い頻度で関連する。そのような嫌気性生物には、限定はされないが、Prevotella属の種(例えば、Pr.intermedia、Pr.Nigrescens、Pr.Melaninogenica、Pr.Veroralis、及び同様のもの)、ならびにPorphyromonas属の種(例えば、Porph.Gingivalis)が含まれる。
DNA増幅の結果
材料及び方法
tHDAのみの反応及びワンポットプラットフォームの調製
Escherichia coli(E.coli)O157:H7を検出するために、tHDAのみの反応とワンポット系との両方を設計した。製造者のプロトコールに従い、緩衝剤、塩、ヌクレオチド塩基、遺伝子特異的プライマー、及びヘリカーゼとポリメラーゼとの酵素混合物を含むtHDAのみの従来反応を50μLの反応液として調製した。全E.coli細胞もこの反応液に直接的に添加した。この懸濁液を65℃で1時間加熱した後、試料を抽出し、ゲル電気泳動を介して解析した。ワンポットプラットフォームについては、単一のチューブにおいてTriton X-100界面活性剤をtHDA反応の構成成分と混合した。全E.coli細胞も添加し、この懸濁液を混合することで混合ミセル水性二相系(ATPS)を形成させた。この懸濁液を65℃で1時間加熱し、これによって相分離とDNA増幅との両方を生じさせた。その後、ミセル低含有相である上相を抽出し、ゲル電気泳動を介して解析することで増幅が良好に生じたことを確認した。
ATPSの両方の相におけるDNAの濃度を比較するために、定量的DNA分配試験を実施した。この試験については、ワンポット系に関係するDNAを模倣するモデルとして、E.coli O157:H7に由来するゲノムDNA、100bpのDNA断片、及び25bpのDNA断片を選択した。混合ミセルATPSは、Triton X-100界面活性剤、tHDA反応に関係する塩、及び二本鎖DNAを混合することによって調製した。混合ATPSは、3つのDNA型のそれぞれについて個別に調整した。これらの懸濁液を65℃で1時間加熱することで相分離を誘導した。相が分離したところで、ミセル含量の低い上相とミセル含量の高い下相との両方を抽出し、Quant-iT dsDNA蛍光結合色素を添加した。その後、プレートリーダーで蛍光強度を測定した。濃度が既知のDNAで作成した標準曲線を使用し、上相及び下相のDNA濃度を推定した。
ワンポットプラットフォームにおけるDNAの分配
DNA分配試験を実施することで、我々は、ワンポット系におけるそれぞれのDNA型の分配係数を決定した。分配係数は、上相のDNA濃度を下相のDNA濃度で割ることによって計算した。試験した3つのDNA型の中で、より大きなゲノムDNA及び100bpのDNA断片が同様の分配係数を有しており、これらの分配係数が1を超えることが明らかとなった(図11)。このことは、ミセル低含有相である上相にDNAが優先的に分配され、それによってその相にDNAが濃縮されたことを示すものであった。一方、より小さな25bpのDNA断片は、より小さな分配係数を有しており、その値は1に近く、このことは、2つの相に25bpのDNA断片がより均等に分配されたことを示している。
tHDA反応は、ミセルATPSに適合することが明らかとなり、その結果、ワンポットプラットフォームの実証に成功した。ゲル電気泳動の実施に基づいて増幅が良好であることが決定され、このことは、増幅DNA領域の予測サイズに相当する100bpのバンドが存在することによって示された。ワンポット系を使用すると増幅及び検出が改善することを実証するために、tHDAのみの従来反応での増幅を、ワンポットプラットフォームにおいて実施した増幅と比較した。図12に可視化されるように、tHDAのみの従来反応では、106cfu/mLを含む細胞試料からはDNAが良好に増幅されたが、細胞濃度が低くなると増幅は達成されなかった。代わりに、ワンポットプラットフォームでは、105cfu/mLを含む細胞試料からDNAが良好に増幅され、これによって、検出限界が10倍改善することが実証された。
酵素的なシグナル増強の結果
材料及び方法
アッセイ構成成分の調製
水性二相系(ATPS)を、0.1Mのトリス緩衝液(pH9)においてポリ(エチレングリコール-ran-プロピレングリコール)及び硫酸ナトリウム塩から調製した。アルカリホスファターゼ(ALP)と、Chlamydia trachomatis(CT)に特異的な抗体と、を金ナノ粒子に複合化することで、アルカリホスファターゼ-金ナノプローブ(ALP-GNP)を創出した。ニトロセルロース膜に対して、試験ラインとして抗CT抗体をプリントし、対照ラインとしてプロテインAをプリントすることによって、サンドイッチアッセイ形式のLFA試験ストリップを構築した。3x10mmのガラス繊維パッドにALP-GNPを脱水吸着させることで複合パッドを創出し、これを膜の直ぐ上流に配置した。ニトロセルロース膜の下流に綿繊維吸収パッドを配置した。従来のLFAでは、3x10mmのガラス繊維の単一試料パッドを複合パッドの上流に配置した。増強LFAでは、ガラス繊維パッドの4つの(7x15mm)層からなる3-Dペーパー芯を複合パッドの上流に配置した。
シグナル増強アッセイを実施するために、CT(全体濃度が3.2ng/μLとなるようにした)、及びALP基質であるニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(NBT/BCIP)を添加したATPSに、3-Dペーパー芯を備えたLFA試験ストリップを浸漬した。10分、30分、及び50分の時点で写真を撮った。
従来のLFAを実施するために、さまざまな濃度の不活化CTを含むPBS溶液に試験ストリップを浸漬した。シグナル増強アッセイを実施するために、さまざまな濃度の不活化CT、及びALP基質であるニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(NBT/BCIP)を添加したATPSに、3-Dペーパー芯を備えたLFA試験ストリップを浸漬した。30分の時点で写真を撮った。
自動化シグナル増強の実証
3-Dペーパー芯を備えたLFA試験ストリップを、CT及びNBT/BCIP基質を含むATPSに浸漬すると、ATPSは、それが試験ストリップを通過するにつれて分離し、その2つの巨視的な相となった。最初に、濃縮されたCT細菌を含む塩高含有相が先行し、ALP-GNPを可溶化すると共に、試験ライン及び対照ラインにALP-GNPが結合し得る場所であるLFA試験ゾーンにALP-GNPを送達し、このことは、10分後に2つのラインが出現することによって可視化された。その後、ポリマー高含有相が遅行し、NBT/BCIP基質を送達することでシグナル増強反応が始まり、その結果、30分及び50分の時点で、試験ラインと対照ラインとの両方が黒くなった(図14)。NBT/BCIP基質は、ポリマー高含有相に好都合に分配されたため、シグナル増強の早発が回避された。
バックグラウンドの増進を最小化しながらLFAでのシグナル増強反応を自動化するというATPSの能力を実証した後、我々は、このアッセイの検出限界が従来のLFAを上回って改善したかどうかを決定したいと考えた。最初に、我々は、バイオマーカーの予備濃縮段階及びシグナル増強段階を行うことなく、PBSにおいて希釈した不活化CTを試験することによって従来のLFAの検出限界を同定した。サンドイッチアッセイ形式では2つのラインが存在することによって試験が陽性であることが示されるため、我々の従来のLFAでは10ng/μLのCTを良好に検出することが可能であった。従来のLFAの検出限界を改善するために、次に我々は、バイオマーカーの予備濃縮段階及びシグナル増強段階をATPSによって自動化してLFAと組み合わせた。CTのさまざまな希釈物で試験をすると、増強LFAでは、0.32ng/μLのCTを検出することが可能であり、これによって、従来のLFAを上回って30倍の改善が生じたことが実証された(図15)。こうして検出限界が30倍改善したことは、バイオマーカーの予備濃縮とシグナル増強との両方に起因して複合的な改善が生じた結果である。バイオマーカーの予備濃縮とシグナル増強の構成成分との両方をさらに最適化することで、30倍を超える改善が可能である。
Claims (20)
- 試料における分析対象物を検出及び/または定量化するためのデバイスであって、
前記デバイスが、ラテラルフローアッセイ(LFA)デバイスであり、
前記デバイスは、第1の相溶液と第2の相溶液とに分離する混合相溶液を含む水性二相溶液(ATPS)であって、使用時に、前記第1の相溶液が先行相となり、前記第2の相溶液が遅行相となる、前記ATPSと、
検出試薬としてのプローブ及びシグナル増強試薬であって、使用時に、前記プローブが、前記ATPSの前記先行相における前記第1の相溶液に分配され、及び前記シグナル増強試薬が、前記ATPSの前記遅行相における前記第2の相溶液に分配される、前記プローブ及びシグナル増強試薬と、
を含む、あるいは、
前記デバイスが、
フロースルーアッセイのための濃縮コンポーネントであって、使用時に、前記第1の相溶液が先行相となり、前記第2の相溶液が遅行相となる混合相溶液を含む水性二相溶液(ATPS)を含む前記濃縮コンポーネントであり、
前記濃縮コンポーネントの下に検出コンポーネントが配置され、
前記濃縮コンポーネントが、検出試薬としてのプローブ及びシグナル増強試薬であって、使用時に、前記プローブが、前記ATPSの前記先行相における前記第1の相溶液に分配され、及び前記シグナル増強試薬が、前記ATPSの前記遅行相における前記第2の相溶液に分配される、前記プローブ及びシグナル増強試薬を含む、
前記デバイス。 - 前記LFAが、前記ATPSもしくはその構成成分、及び前記プローブ、及び前記シグナル増強試薬を、受け入れ、及び/または含むように構成された多孔性マトリックスを含む、並びに/または
前記濃縮コンポーネントが、1つもしくは複数のペーパー層を含む、
請求項1に記載のデバイス。 - 前記LFAが、複合パッド、前記分析対象物と結合する抗体を含む試験ライン、任意選択で、二次抗体を含む対照ライン、任意選択で吸収パッド、及び任意選択で試料パッドを含むか、あるいは、
前記検出コンポーネントが、複合パッド、反応パッド、及び任意選択でシンクを含む、
請求項1~2のいずれか1項に記載のデバイス。 - 前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記ATPSが、前記ラテラルフローアッセイ上で、またはフロースルーアッセイの前記濃縮コンポーネント中で脱水される、あるいは
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記プローブが、前記ラテラルフローアッセイ上で、またはフロースルーアッセイの前記濃縮コンポーネント中で脱水される、あるいは
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記シグナル増強試薬が、前記ラテラルフローアッセイ上で、またはフロースルーアッセイの前記濃縮コンポーネント中で脱水される、
請求項1~3のいずれか1項に記載のデバイス。 - 前記ATPSが、前記デバイスが前記試料と接触した後に、第1の相溶液と第2の相溶液とに分離する、及び/または
前記プローブが、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、もしくは、前記プローブが、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、及び/または
前記シグナル増強試薬が、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、もしくは、前記シグナル増強試薬が、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、
請求項4に記載のデバイス。 - 前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、あるいは
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含む、あるいは
前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、あるいは
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、あるいは
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSである、あるいは
前記ATPSが、PEG/塩ATPSである、
請求項1~5のいずれか1項に記載のデバイス。 - 前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSであり、前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記シグナル増強試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、あるいは
前記ATPSが、ミセルATPSであり、前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記シグナル増強試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、
請求項6に記載のデバイス。 - 前記プローブが、前記分析対象物に結合する結合部分を含む、あるいは
前記プローブが、前記分析対象物に結合する結合部分を含み、前記結合部分が、抗体または抗体断片、レクチン、核酸、及びアプタマーからなる群から選択される、あるいは
前記プローブが、合成ポリマー、金属、ミネラル、ガラス、石英、セラミック、生体ポリマー、及びプラスチックからなる群から選択される材料を含む、あるいは
前記プローブが、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはポリ塩化ビニル、デキストラン、ポリプロピレン、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される材料を含む、あるいは
前記プローブが、金、銀、鉄、白金、パラジウム、セリウム、及びチタンからなる群から選択される金属を含む、あるいは
前記プローブが、ナノ粒子を含む、
請求項1から7のいずれか一項に記載のデバイス。 - 前記プローブが、前記シグナル増強試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含む、または
前記プローブが、前記シグナル増強試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含み、前記物質が、基質と反応して強力な可視シグナルを形成する酵素を含む、もしくは、前記物質が、酵素と反応して強力な可視シグナルを形成する基質を含む、または
前記プローブが、前記シグナル増強試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含み、前記シグナル増強試薬が、酵素基質を含む、または
前記シグナル増強試薬が、酵素と結合する抗体を含む、並びに/または
前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液もしくは前記第2の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含む、並びに/または
前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液もしくは前記第2の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含み、前記コーティングが、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、親水性タンパク質、及び疎水性タンパク質からなる群から選択される材料を含む、
請求項1~8のいずれか一項に記載のデバイス。 - 前記標的分析対象物が、タンパク質、核酸、糖もしくはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、並びに/または
前記分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、並びに/または
前記分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、並びに/または
前記分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、並びに/または
前記分析対象物が、病状に対するバイオマーカー、食品安全(もしくは危険)に対するバイオマーカー、またはバイオテロ物質に対するバイオマーカーを含む、
請求項8または9に記載のデバイス。 - 第1の相溶液と第2の相溶液とに分離する混合相溶液であって、LFAまたは多孔性膜層における使用時に、前記第1の相溶液が先行相になり、前記第2の相溶液が遅行相になる、前記混合相溶液と、
プローブ及びシグナル増強試薬であって、前記プローブが、前記第1の相溶液に分配され、前記シグナル増強試薬が、前記第2の相溶液に分配される、前記プローブ及びシグナル増強試薬と、
を含む、水性二相溶液(ATPS)。 - 前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSであり、前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記シグナル増強試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、または
前記ATPSが、ミセルATPSであり、前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記シグナル増強試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、
請求項11に記載の水性二相溶液。 - 分析対象物の検出方法及び/または定量化方法であって、
前記方法が、
水性二相溶液(ATPS)へ試料を適用する加える工程であって、前記適用によって、前記分析対象物が、前記試料に存在するのであれば、前記ATPSの1つの相に濃縮されて分析対象物含有相が得られる、工程と、
ラテラルフローアッセイ(LFA)またはフロースルーアッセイへ前記分析対象物含有相を適用する工程であって、前記LFAまたはフロースルーアッセイにおいて検出プローブが前記分析対象物に結合する、工程と、
前記LFAまたはフロースルーアッセイへシグナル増強試薬を適用する工程であって、前記適用によって、前記検出プローブが生成するシグナルが増強される、工程と、
前記試料における前記分析対象物の存在及び/または量を示すための、前記シグナルの検出及び/または定量化工程と、
を含み、
前記ATPSが、第1の相溶液と第2の相溶液を含み、前記LFAまたはフロースルーアッセイにおいて、前記第1の相溶液が先行相となり、前記第2の相溶液が遅行相となり、
前記ATPSが、プローブ及びシグナル増強試薬であって、前記プローブが、前記ATPSの前記先行相における前記第1の相溶液に分配され、及び前記シグナル増強試薬が、前記ATPSの前記遅行相における前記第2の相溶液に分配される、プローブ及びシグナル増強試薬を含む、前記方法。 - 請求項1~10のいずれか1項に記載のデバイスを使用して実施される、請求項13に記載の方法。
- 前記分析対象物が、タンパク質、核酸、糖またはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、あるいは
前記分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、あるいは
前記分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、あるいは
前記分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、
請求項13または14に記載の方法。 - 前記試料が、核酸を含み、
前記水性二相溶液が、第1の相溶液及び第2の相溶液に分離する混合相溶液を含み、前記ATPSが、核酸が前記第1の相溶液もしくは前記第2の相溶液のいずれかに分配されることになるものであるか、または前記ATPSが、核酸が前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との間の界面に局在化することになるものであり、それにより、前記核酸が、前記第1の相溶液もしくは前記第2の相溶液、または前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との間の前記界面に分配されることで濃縮核酸が得られ、且つ
前記方法が、前記第1の相溶液もしくは前記第2の溶液、または前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との前記界面から前記濃縮核酸を回収し、回収濃縮核酸を得ることを含み、及び、核酸増幅反応へ前記回収濃縮核酸を導入して、前記回収された濃縮核酸を増幅することを含む、
請求項13に記載の方法。 - 前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応系を含む、あるいは
前記核酸増幅反応が、等温増幅系を含む、あるいは
前記核酸増幅反応が、自己持続性シーケンス反応(3SR)、核酸ベースの転写アッセイ(NASBA)、転写増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ステムループ増幅、シグナル介在RNA増幅技術(SMART)、等温多置換増幅(IMDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(cHDA)、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)からなる群から選択される増幅系を含む、あるいは
前記増幅することが、等温核酸増幅のために試薬と前記ATPSを混合することを含む、あるいは
前記増幅する方法が、室温または室温未満の温度で前記等温増幅を実施することを含む、あるいは
前記方法が、等温増幅のための試薬を含む前記ATPSを実質的に一定な温度まで加熱することを含む、あるいは
前記増幅が、ヘリカーゼ依存性増幅を含み、約65℃の一定温度で実施される、
請求項16に記載の方法。 - 前記方法が、単一の容器で実施される、あるいは
前記方法が、マルチウェルプレートのウェルに異なる試料をそれぞれ含めて複数の核酸試料で実施される、あるいは
前記方法が、マイクロ流体系のチャンバーまたはチャネルにおいて実施される、
請求項16または17に記載の方法。 - 前記試料が、細胞溶解物である、または
前記試料が、核酸である、または
前記試料が、インタクトな細胞を含み、前記ATPSが、細胞を溶解するATPSである、及び/または
前記ATPSが、ミセルATPSである、及び/または
前記試料が、血液もしくは血液のスポットを含み、前記ATPSが、血液のスポットを再溶解するものである、または
前記試料が、血液もしくは血液のスポットを含み、前記ATPSが、血液のスポットを再溶解するものであり、前記ATPSが、PEG/デキストランATPSもしくはUCON/デキストランATPSを含む、
請求項16~18のいずれか1項に記載の方法。 - 核酸を精製及び増幅するためのキットであって、
前記キットが、
水性二相溶液(ATPS)の構成成分を含む容器と、
等温核酸増幅系の1つまたは複数の構成成分を含む容器と、
を含み、
前記ATPSが、第1の相溶液と第2の相溶液を含み、ラテラルフローアッセイ(LFA)またはフロースルーアッセイにおいて、前記第1の相溶液が先行相となり、前記第2の相溶液が遅行相となり、
前記ATPSが、プローブ及びシグナル増強試薬であって、前記プローブが、前記第1の相溶液に分配され、及び前記シグナル増強試薬が、前記第2の相溶液に分配される、プローブ及びシグナル増強試薬を含む、前記キット。
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