CN108896506B - 检测碱性磷酸酶活性以及碱性磷酸酶抑制剂浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测碱性磷酸酶活性的方法，其包括如下步骤：A1：将三(羟甲基)氨基甲烷、焦磷酸盐混匀后，分成若干份反应体系，每一份所述反应体系中分别加入不同浓度的碱性磷酸酶，在37℃下孵育后，在每一份反应体系中依次加入醋酸缓冲液、CeO2纳米粒子和3,3',5,5'‑四甲基联苯胺，在22～47℃下孵育后，分别进行紫外‑可见吸收光谱的测量，得到碱性磷酸酶活性与ΔA的关系方程；A2：将待测碱性磷酸酶按照步骤A1的操作进行紫外‑可见吸收光谱的测量，得到ΔA，将ΔA代入步骤A1中得到的碱性磷酸酶活性与ΔA的关系方程，计算出待测碱性磷酸酶的活性。本发明具有如下的有益效果：1、本发明所利用的CeO2纳米粒子在水溶液中分散较好；2、本发明所提出方法检测时间短。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测碱性磷酸酶活性以及碱性磷酸酶抑制剂浓度的方法，属于分析测试技术领域。
背景技术
谭等人利用Cu-MOFs类过氧化物酶活性实现了碱性磷酸酶的检测(AnalyticaChimicaActa,2018,1004,74)。具体检测步骤：首先，将PPi及不同浓度ALP置于37℃恒温孵育40分钟；然后向溶液中依次加入Cu-MOFs、过氧化氢、ABTS及HEPES缓冲溶液，混合均匀后后置于37℃恒温孵育50分钟进行紫外-可见吸收光谱测试。该方法需要制备的Cu-MOFs分散性较差，检测时间较长，同时需要使用不稳定的过氧化氢用于氧化过氧化物酶底物。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种检测碱性磷酸酶活性以及碱性磷酸酶抑制剂浓度的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种检测碱性磷酸酶活性的方法，其包括如下步骤：
A1：将三(羟甲基)氨基甲烷、焦磷酸盐混匀后，分成若干份反应体系，每一份所述反应体系中分别加入不同浓度的碱性磷酸酶，在37℃下孵育后，在每一份反应体系中依次加入醋酸缓冲液、CeO2纳米粒子和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，在22～47℃下孵育后，分别进行紫外-可见吸收光谱的测量，得到碱性磷酸酶活性与ΔA的关系方程；
A2：将待测碱性磷酸酶按照步骤A1的操作进行紫外-可见吸收光谱的测量，得到ΔA，将ΔA代入步骤A1中得到的碱性磷酸酶活性与ΔA的关系方程，计算出待测碱性磷酸酶的活性。
作为优选方案，所述三(羟甲基)氨基甲烷的pH值为7.4，焦磷酸盐的浓度为0.07mM，CeO2纳米粒子的浓度为0.05～0.30mg/mL，3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为0.1～0.9mM。
作为优选方案，所述孵育时间不超过9min。
作为优选方案，所述醋酸缓冲液的pH值为3.6～5.6。
一种检测正钒酸钠浓度的方法，其包括如下步骤：
B1：将三(羟甲基)氨基甲烷、碱性磷酸酶混匀后，分成若干份反应体系，每一份所述反应体系中分别加入不同浓度的正钒酸钠，在37℃下孵育后，在每一份反应体系中依次加入焦磷酸盐，在22～47℃下孵育后，加入醋酸缓冲液、CeO2纳米粒子和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，在22～47℃下孵育后，分别进行紫外-可见吸收光谱的测量，以正钒酸钠对碱性磷酸酶的抑制效率和正钒酸钠的浓度作图，得到正钒酸钠浓度与正钒酸钠对碱性磷酸酶的抑制效率的关系方程；
B2：将待测正钒酸钠按照步骤B1的操作进行紫外-可见吸收光谱的测量，计算得到抑制效率值，将抑制效率值代入步骤B1中得到的正钒酸钠浓度与正钒酸钠对碱性磷酸酶的抑制效率的关系方程，计算出待测正钒酸钠的浓度。
作为优选方案，所述焦磷酸盐的浓度为0.07mM，CeO2纳米粒子的浓度为0.25mg/mL，3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为0.5mM，三(羟甲基)氨基甲烷的pH值为7.4，醋酸缓冲液的pH值为4.0。
本发明的检测原理如图1所示：CeO2纳米粒子具有类过氧化物酶活性，可以直接氧化TMB生成oxTMB，溶液在652nm处有紫外-可见吸收峰；PPi加入后，CeO2纳米粒子类过氧化物酶活性升高，这是由于CeO2纳米粒子同时具有类磷酸酶活性可以使PPi水解释放大量的能量；ALP加入后，CeO2纳米粒子类过氧化物酶活性降低，表现为紫外-可见吸收峰强度降低；ALP抑制剂(Na3VO4)加入后，CeO2纳米粒子类过氧化物酶活性恢复，表现为紫外-可见吸收峰强度增大。基于体系紫外-可见吸收峰强度的变化，可实现ALP及其抑制剂的定量检测。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明所利用的CeO2纳米粒子在水溶液中分散较好；
2、本发明所提出方法检测时间短，在ALP与PPi孵育后加入氧化底物、CeO2纳米粒子及缓冲溶液后仅需孵育3分钟；
3、本发明所提出的方法无需使用不稳定的过氧化氢，较为简单。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明中基于CeO2纳米粒子类过氧化物酶活性检测ALP及Na3VO4的原理示意图；
图2为本发明实施例1中CeO2-PPi体系中加入不同浓度ALP后的紫外-可见吸收光谱图；从上到下ALP的浓度依次为0、0.5、1、2、4、6、8、10、20、40mU/mL；
图3为本发明实施例1中ΔA与ALP的浓度关系；插图为ΔA与ALP浓度的线性关系及加入不同浓度ALP时溶液的数码照片(ALP浓度从左到右依次为0,0.5,1,2,4,6,8,10mU/mL)；
图4为本发明实施例2中CeO2-PPi-ALP体系中加入不同浓度Na3VO4后的紫外-可见吸收光谱图；从下到上Na3VO4的浓度依次为0,0.005,0.01,0.03,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.15,0.20,0.25mM；
图5为本发明实施例2中CeO2-PPi-ALP体系对Na3VO4的抑制效率与Na3VO4的浓度关系；
图6为本发明的方法的选择性测试结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明中涉及的缩写及术语解释：PPi：焦磷酸根；ALP：碱性磷酸酶；BSA：牛血清蛋白；CeO2：二氧化铈；TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺；oxTMB：氧化态的3,3',5,5'-四甲基联苯胺；Tris：三羟甲基氨基甲烷；HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；ABTS:2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸代替；Na3VO4：正钒酸钠；Cu-MOFs：铜基金属有机框架化合物；ΔA：ALP加入前后CeO2-PPi紫外-可见吸收峰强度的变化值；ALP抑制效率：IE(％)＝100×(Ai-A)/ΔA，A和Ai分别代表抑制剂加入前后CeO2-PPi-ALP体系的紫外-可见吸收峰强度；IC50：ALP抑制效率效率为50％时所需抑制剂的浓度。
实施例1
本实施例涉及一种检测碱性磷酸酶(ALP)活性的方法，具体包括如下步骤：
80μL Tris-HCl(pH为7.4)，10μL 7mM PPi和10μL不同浓度ALP(0.5，1，2，4，6，8，10，20，40mU/mL)依次加入到1.5mL离心管中，混合均匀后置于37℃水浴锅内孵育1小时。然后，向离心管中依次加入700μL醋酸缓冲溶液(pH为4.0)，100μL 2.5mg/mL CeO2纳米粒子及100μL 5mM TMB，于37℃水浴锅内孵育3分钟后进行紫外-可见吸收光谱测量，如图2所示。利用ΔA与ALP活性进行线性拟合，得到的线性方程分别为：ΔA＝-0.0031+0.0293c(c为ALP活性，单位是mU/mL))，线性系数为0.995，如图3所示。本实施例对实验条件进行了优化，包括醋酸缓冲溶液pH、CeO2纳米粒子和TMB的浓度，孵育时间及温度。醋酸缓冲溶液pH为：3.6～5.6；CeO2纳米粒子的浓度范围为：0.05～0.30mg/mL；TMB的浓度范围为：0.1～0.9mM；孵育时间范围为：0～9分钟；孵育温度为：22～47℃。
实施例2
本实施例涉及一种检测钒酸钠(Na3VO4)浓度的方法，具体包括如下步骤：将70μLTris-HCl(pH为7.4)，10μL 2U/mL ALP及10μL不同浓度的Na3VO4(0，0.005,0.01,0.03,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.15,0.20,0.25mM)依次加入到1.5mL离心管中，混合均匀后置于37℃水浴锅内孵育30min；然后向离心管中10μL 7mM PPi置于37℃水浴锅内孵育1小时。然后，向离心管中依次加入700μL醋酸缓冲溶液(pH为4.0)，100μL 2.5mg/mL CeO2纳米粒子及100μL 5mM TMB，于37℃水浴锅内孵育3分钟后进行紫外-可见吸收光谱测量，如图4所示。我们以抑制效率与Na3VO4浓度拟合曲线，如图5所示，得到其IC50值为71μM。
检测结果：最佳实验条件为：醋酸缓冲溶液pH为4.0，CeO2纳米粒子的浓度为0.25mg/mL，TMB浓度为0.5mM，孵育时间为3min，孵育温度为37℃。随着ALP浓度的升高，体系紫外-可见吸收峰强度逐渐降低；ALP检测线性范围为：0.5-10mU/mL，检测限为：0.32mU/mL；随着Na3VO4浓度的升高，体系紫外-可见吸收峰强度逐增大，IC50值为71μM。
实施例3
本实施例涉及一种抗干扰实验，具体步骤为：
80μL Tris-HCl(pH为7.4)，10μL 7mM PPi和10μL 0.1mg/mL干扰物质(牛血清蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰酶)依次加入到1.5mL离心管中，混合均匀后置于37℃水浴锅内孵育1小时。然后，向离心管中依次加入700μL醋酸缓冲溶液(pH为4.0)，100μL2.5mg/mL CeO2纳米粒子及100μL 5mM TMB，于37℃水浴锅内孵育3分钟后进行紫外-可见吸收光谱测量。
70μL Tris-HCl(pH为7.4)，10μL 7mM PPi和10μL 0.1mg/mL碱性磷酸酶及干扰物质(牛血清蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰酶)依次加入到1.5mL离心管中，混合均匀后置于37℃水浴锅内孵育1小时。然后，向离心管中依次加入700μL醋酸缓冲溶液(pH为4.0)，100μL 2.5mg/mL CeO2纳米粒子及100μL 5mM TMB，于37℃水浴锅内孵育3分钟后进行紫外-可见吸收光谱测量。
结果如图6所示，其它酶或BSA加入后体系紫外-可见吸收峰强度没有明显变化，说明该方法选择性较好。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (6)
1.一种检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A1：将三(羟甲基)氨基甲烷、焦磷酸盐混匀后，分成若干份反应体系，每一份所述反应体系中分别加入不同活性的碱性磷酸酶，在37℃下孵育后，在每一份反应体系中依次加入醋酸缓冲液、CeO2纳米粒子和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，在22~47℃下孵育后，分别进行紫外-可见吸收光谱的测量，得到碱性磷酸酶活性与ΔA的关系方程；ΔA为没有碱性磷酸酶和有碱性磷酸酶的条件下紫外-可见吸收峰强度的变化；
A2：将待测碱性磷酸酶按照步骤A1的操作进行紫外-可见吸收光谱的测量，得到ΔA，将ΔA代入步骤A1中得到的碱性磷酸酶活性与ΔA的关系方程，计算出待测碱性磷酸酶的活性。
2.如权利要求1所述的检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述三(羟甲基)氨基甲烷的pH值为7.4，焦磷酸盐的浓度为0.07 mM，CeO2纳米粒子的浓度为0.05~0.3 mg/mL，3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为0.1~0.9 mM。
3.如权利要求1所述的检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述在22~47℃孵育时间不超过9 min。
4.如权利要求1所述的检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述醋酸缓冲液的pH值为3.6~5.6。
5.一种检测正钒酸钠浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
B1：将三(羟甲基)氨基甲烷、碱性磷酸酶混匀后，分成若干份反应体系，每一份所述反应体系中分别加入不同浓度的正钒酸钠，在37℃下孵育后，在每一份反应体系中依次加入焦磷酸盐，在37℃下孵育后，加入醋酸缓冲液、CeO2纳米粒子和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，在22~47℃下孵育后，分别进行紫外-可见吸收光谱的测量，以正钒酸钠对碱性磷酸酶的抑制效率和正钒酸钠的浓度作图，得到正钒酸钠浓度与正钒酸钠对碱性磷酸酶的抑制效率的关系方程；
B2：将待测正钒酸钠按照步骤B1的操作进行紫外-可见吸收光谱的测量，计算得到抑制效率值，将抑制效率值代入步骤B1中得到的正钒酸钠浓度与正钒酸钠对碱性磷酸酶的抑制效率的关系方程，计算出待测正钒酸钠的浓度。
6.如权利要求5所述的检测正钒酸钠浓度的方法，其特征在于，在步骤B1的混合后，所述焦磷酸盐的浓度为0.07 mM，CeO2纳米粒子的浓度为0.25 mg/mL，3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为0.5 mM，在步骤B1的混合前，三(羟甲基)氨基甲烷的pH值为7.4，醋酸缓冲液的pH值为4.0。
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