DE3687276T2

DE3687276T2 - Festphaseanalytische vorrichtung und verfahren zu ihrer verwendung.

Info

Publication number: DE3687276T2
Application number: DE9090109680T
Authority: DE
Inventors: Brown, Iii; John M Clemens; Sharon M Devereaux; John G Hofler; Kevin M Knigge; Sarah E Safford
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Alere Switzerland GmbH
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-10-03
Publication date: 1993-05-06
Anticipated expiration: 2006-10-04
Also published as: GR862328B; ATE78597T1; EP0389003A1; KR940002520B1; JPH0650973A; EP0217403A3; JPH05180841A; US5149622A; US5008080A; AU613797B2; KR870004305A; DE217403T1; EP0217403B1; DE3687276D1; JP2514878B2; DE3686116D1; CA1281642C; CA1301648C; AU593285B2; ES2001811A6

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist Teil der Europäischen Patentanmeldung 86113657.0 (EP-A-0217403), eingereicht am 3. Oktober 1986.

FACHGEBIET

Die Erfindung betrifft im allgemeinen analytische Vorrichtungen mit einer Vielzahl ablesbarer Ergebnisse durch Verwendung von Verfahrenskontrolle und analytischen Bindungsflächen an einem einzigen Reaktionsort. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue Vorrichtungen, die bei der Durchführung von Bindungstests verwendbar sind, und verbesserte analytische Geräte. Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind insbesondere bei der Durchführung von Enzym-Immuno-Tests mit biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Plasma, Vollblut, Urin, Rückenmark- und amniotischer Flüssigkeit, Speichel und dergleichen verwendbar.

HINTERGRUNDTECHNIK

Verschiedene analytische Verfahren und Vorrichtungen werden im allgemeinen bei Tests zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder der Konzentration von Substanzen von Interesse oder klinischer Bedeutung, die in Flüssigkeiten oder anderen Stoffen vorliegen können. Solche klinisch bedeutsamen oder interessanten Substanzen werden im allgemeinen als "Analyten" bezeichnet und können beispielsweise Antikörper, Antigene und die breite Kategorie von Substanzen, die allgemein unter dem Ausdruck "Liganden", bekannt sind, einschließen. Insbesondere hinsichtlich der Diagnose und Behandlung von Krankheiten oder anderen Zuständen des menschlichen Körpers kann die genaue Bestimmung der Anwesenheit oder der Menge bestimmter Analyten in biologischen Flüssigkeiten auf zeitlicher Basis einen starken Einfluß auf das Können der in der Gesundheitsvorsorge Tätigen bei der Behandlung und Betreuung pathologischer physikalischer Störungen oder bei der Durchführung einer frühen und genauen Bestimmung physiologischer Zustände wie Schwangerschaft haben.
Eine Test-Methode, die bei der Diagnose verschiedener Störungen und Zustände des menschlichen Körpers zunehmend Anwendung gefunden hat, ist der Bindungstest und insbesondere der Typ von Bindungstest, der als Enzym-Immuno-Test (EIA) bekannt ist. EIA-Techniken nutzen die Mechanismen der Immunsysteme höherer Organismen aus, worin Antikörper als Antwort auf das Vorliegen von Substanzen (d. h. Antigene) in den Organismen, die für den Organismus pathogen oder fremd sind, produziert werden. Ein oder mehrere Antikörper werden als Antwort darauf produziert und sind in der Lage, mit einem besonderen Antigen unter Bildung eines hochspezifischen Reaktionsmechanismus der in vitro vorteilhaft zur Bestimmung dieses bestimmten Antigens verwendet werden kann, zu reagieren.
Herkömmliche EIA-Verfahren schließen eine Serie naßchemischer Schritte unter Verwendung flüssiger Reagentien ein, bei denen ein Analyt in einer biologischen Probeflüssigkeit, die getestet wird, z. B. ein Antigen oder ein Antikörper in einer Urin-, Vollblut- oder Serumtestprobe, detektiert wird. Bei einem Typ des EIA-Verfahrens wird der Analyt in der Probe anfangs an ein entsprechendes Antigen- oder Antikörper-Reagens, das in die Probe eingeführt wird, gebunden. Dann wird ein weiteres Antigen oder ein Antikörper eingeführt. Dieses zweite Antigen oder Antikörper ist eines, das markiert oder mit einem Enzym oder einer anderen Substanz, die zur Produzierung oder Erzeugung einer detektierbaren Antwort, wie Farbentwicklung, oft bei Umsetzung mit oder in Gegenwart eines geeigneten zusätzlichen Indikator-Reagens, wie einem Chromogen oder Farbstoff, konjugiert worden ist. Die so produzierte detektierbare Antwort kann dann, visuell oder instrumentell, abgelesen und interpretiert werden, als Anzeige oder Maß für das Vorliegen oder die Menge des in der Originalprobe vorhandenen Antigens oder Antikörpers.
Festphasen EIA-Verfahren werden im allgemeinen so eingeschätzt, daß sie sowohl für die Antikörper- als auch Antigentests auf Grund ihrer Sicherheit, Leichtigkeit der Verwendung, Spezifität und Empfindlichkeit im Vergleich mit zuvor verwendeten flüssigen Reagens-Bindungstechniken, wie der Radio-Immuntest (RIA), und andere herkömmliche naßchemische Methoden vorzuziehen sind. Darüberhinaus ist die Möglichkeit, die Farbentwicklung instrumentell abzulesen, wie unter Verwendung eines Spekrophotometers, ein Merkmal vieler Festphasen-EIA-Techniken, die zu ihrer weitverzweigten Verwendung geführt hat.
Somit wird bei einem Typ des herkömmlichen Festphasen-EIA-"Sandwich"- Tests eine Testprobe, die vermutlich einen Antikörper oder ein Antigen von Interesse enthält, anfänglich mit einem Feststoff, im wesentlichen inerte Kunststoff- oder Glasperlen, oder ein anderes Trägermaterial, das vorher mit einem Protein oder einer anderen Substanz, die mit dem Antigen oder Antikörper reagieren kann, um ihn auf der Oberfläche des Trägers zu halten, beschichtet worden sind, entweder durch Immobilisierung des Antigens oder Antikörpers auf der Oberfläche oder durch chemische Bindung damit in Kontakt gebracht. Ein zweites Antigen oder Antikörper, das in allgemeinen mit einem Enzym konjugiert (chemisch gebunden) ist, wird dann hinzugegeben, und diese zweite Spezies wird auf dem Träger an ihren entsprechenden Antikörper oder Antigen gebunden. Es folgen ein oder mehrere Waschschritt(e) zur Entfernung von ungebunden Material, und dann wird eine Indikator-Substanz, beispielsweise eine chromogene Substanz, die in Anwesenheit eines Enzyms reaktiv ist, zugegeben und die wegen ihrer Empfindlichkeit gegenüber der Anwesenheit des Enzyms eine detektierbare Farb- Antwort produziert. Die Entwicklung der Farb-Antwort, ihrer Intensität etc. kann visuell oder instrumentell bestimmt und mit der Menge an Antigen oder Antikörper, welches in der Probe vorhanden ist, korreliert werden.
Solche Test-Techniken und die Verwendung der Festphasen-Perlen oder anderer Träger-Typen für die Durchführung der immunologischen Reaktionen und Veränderungen, die bei solchen Tests nötig sind, sind gut bekannt, sind jedoch noch nicht ohne Nachteile. Beispielsweise kommt es durch die Notwendigkeit einer komplizierten Vorrichtung für die Durchführung des Tests und als Behälter für die verwendeten flüssigen Reagentien zu wesentlichen Arbeits- und Materialkosten, insbesondere bei Tests mit geringem Volumen einzelner Proben. Darüberhinaus kann die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit solcher Tests oft weniger als das Optimum betragen, da es manchmal schwierig ist, auf herkömmliche Weise beschichtete feste Träger und andere mit solchen Tests verbundene Vorrichtungen herzustellen, so daß für einen besonderen Test die gesamten hier verwendeten Materialien speziell gebaut sind, um die zuvor festgelegten Empfindlichkeits- und Spezifitätserfordernisse zu erfüllen.
Ein deutlicher Nachteil der bekannten Tests ist die Schwierigkeit bei der Interpretation der Ergebnisse. Beispielsweise beschreibt die U.S. 4632901 eine Festphasen-Testvorrichtung unter Einsatz einer über einem Absorbent-Material angeordneten Membran. Ein Fang-Reagens oder Antikörper ist in einer örtlich begrenzten Fläche auf der Membran immobilisiert. Probe und Entwicklungsreagentien werden zur Herstellung einer visuellen Ableseanzeige zu der Membran hinzugegeben. Jedoch existiert bei diesem System kein Mechanismus, der sicherstellt, daß die Reagentien richtig zugegeben worden sind oder daß sie richtig funktioniert haben. Ein ungültiges Ergebnis kann nicht von einem negativen Ergebnis unterschieden werden.
Die in der EP-A-200 381 offenbarte Vorrichtung löst das Problem teilweise, indem eine diskrete Zone, die in der Lage ist, ein gültiges, negatives Ergebnis anzuzeigen, vorgesehen ist. Jedoch ist es auch bei dieser Vorrichtung für den Anwender möglich, eine diskrete Zone mit Reagens-Tropfen in Kontakt zu bringen und doch die andere(n) Zone(n) nicht zu berühren. Weil die Zonen diskret und getrennt sind, löst sie die zuvorerwähnten Probleme nicht vollständig.
Entsprechend gibt es ein Bedürfnis für relativ simple, leicht handzuhabende und vergleichsweise billige Festphasenmaterialien und analytische Vorrichtungen, die bei EIA-Verfahren insbesondere von Laien in vorteilhafter Weise verwendet werden können und die in der Lage sind, schnelle, empfindliche und leicht ablesbare Ergebnisse, die mit herkömmlichen Methoden, wie den zuvorbeschriebenen, vergleichbar sind, zu produzieren, ohne die Notwendigkeit zahlreicher, mühsamer naßchemischer Schritte oder komplexer Instrumente.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden die obengenannten Probleme durch eine wie in Patentanspruch 1 beschriebene Festphasen-Testvorrichtung gelöst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die obengenannten Probleme durch ein Verfahren, das eine wie in Patentanspruch 11 beschriebene Festphasen-Testvorrichtung verwendet, gelöst.
Die vorliegende Erfindung wendet sich direkt an das zuvorgenannte Bedürfnis und stellt in einer Ausführungsform eine neue Festphasen-Testvorrichtung und einen Bindungstest unter Verwendung der Vorrichtung bereit, was gegenüber in der Technik bekannten Vorrichtungen und Test-Verfahren von großem Vorteil ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eindeutige, eingebaute Verfahrenskontrollen für die Verwendung mit analytischen Festphasen-Vorrichtungen bereit.
Die verbesserte erfindungsgemäße Vorrichtung enthält einen Reaktionsort zur Durchführung eines Bindungstests. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform verwendet eine Durchfluß-Testvorrichtung eine im wesentlichen planare Reaktionsschicht mit einer ersten Probe-Kontaktoberfläche für die erste Probe und einer zweiten Oberfläche gegenüber der ersten Oberfläche. Die planare Schicht ist so in der Vorrichtung angeordnet, daß, wenn die Vorrichtung zur Durchführung eines Bindungstests verwendet wird, mindestens ein Teil der Probe, die die erste Oberfläche berührt, durch die im wesentlichen planare Schicht zu der zweiten Oberfläche hindurchtritt. Die erfindungsgemäße Vorrichtung enthält bevorzugt ein Absorptionsmittel (zur Absorption von Flüssigkeit, die durch die im wesentlichen planare Schicht hindurchtritt).
Die Ausführungsformen der Erfindung sind nicht nur hinsichtlich der Durchführung der Bindungstests zur Bestimmung des unbekannten Vorliegens oder der Konzentration verschiedener Analyten in Test-Proben, sondern auch bei der Bereitstellung von eingebauten Kontrollen für die Festphasen Test-Vorrichtungen von Vorteil. Wie infra ausführlicher beschrieben, beinhalten die bevorzugten analytischen Festphasen- Vorrichtungen gemäß der Erfindung Test-Kontrollen, wie eine sichtbare positive Kontrollfläche zur Anzeige eines negativen Ergebnisses, die in einem visuellen Testsystem eine eindeutige Interpretation der Testergebnisse ermöglicht.
Darüberhinaus werden erfindungsgemäß verbesserte Verfahren zur Durchführung eines Bindungstests unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung bereitgestellt. Bei einem bevorzugten Verfahren wird eine Probe mit einem Analyten, z. B. einem Antigen oder einem Antikörper, mit einer Reaktionsmatrix aus einem porösen Material in Kontakt gebracht. Der Analyt wird an das Reagens innerhalb des Materials gebunden; die Reaktionsoberfläche wird dann mit einem zweiten "markierten",Reagens in Kontakt gebracht, das ebenfalls an den Analyten, der durch das innerhalb des Materials festgehaltenen Reagens gebunden ist, gebunden werden kann. Alternativ kann das zweite Reagens ein unmarkierter Antikörper sein, auf den dann die Zugabe der markierten Substanz oder des Reagens, das gegen den Antikörper gerichtet ist (Amplifikation oder ungerichteter Immunotest), folgt. Anschließend wird das ungebundene Material entfernt, z. B. durch Waschen, und die Vorrichtung wird mit einer Indikator-Substanz in Kontakt gebracht, die in Gegenwart der "Markierung" des zweiten Reagens eine detektierbare Antwort produziert, die für das Vorhandensein und/oder die Menge des Analyten in der Probe kennzeichnend ist.
Eine solche detektierbare Antwort kann visuell oder instrumentell abgelesen werden und kann vorteilhafterweise eine Farb-Antwort sein. Obwohl viele andere Formen, die in den Bereich der Erfindung fallen, dem Fachmann naheliegen werden, liegt die Antwort am zweckmäßigsten in Form des sichtbaren Erscheines eines "+" oder "-"- Zeichens vor, um das Testergebnisanzuzeigen, insbesondere, wenn nur positive bzw. negative Ergebnisse von dem Test gewünscht werden oder nötig sind. Alternativ können quantitative oder halbquantitative Ergebnisse durch visuelles oder instrumentelles Ablesen der detektierbaren Antwort erhalten werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Seitenansicht in teilweisem Querschnitt einer erfindungsgemäßen analytischen Vorrichtung.
Fig. 2 ist eine Aufsicht der Vorrichtung aus Fig. 1 von oben.
Fig. 3A, 3B und 3C sind Aufsichten der Vorrichtung aus Fig. 1 von oben.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die erfindungsgemäßen, neuen, ablesbaren Antworten und die dafür hergestellten Vorrichtungen sind, obwohl sie auf viele Typen von Analysen anwendbar sind, insbesondere für der Verwendung bei Immunotests zur Verbesserung der herkömmlichen Festphasen Immunotest-Techniken zur Durchführung eines colorimetrischen oder anderen EIAs mit biologischen Flüssigkeiten, wie sie zuvor beschrieben worden sind, vorteilhaft. Des weiteren sind die erfindungsgemäß hergestellten Vorrichtungen relativ leicht zu verwenden und erfordern im Vergleich zu in der Technik bekannten Tests weniger Verfahrens-Schritte und eine weniger komplexe Test-Technik und liefern auch den zusätzlichen Vorteil schneller quantitativer, halbquantitativer oder qualitativer Ergebnisse beim Testen unbekannter Proben. Das Material und die Vorrichtungen werden für eine vorteilhafte Verwendung als Kontrollen, z. B. zur Abschätzung der Genauigkeit und Verläßlichkeit solcher Tests, zusätzlich angepaßt. Des weiteren können die erfindungsgemäßen Vorrichtungen während der Herstellung relativ leicht hergestellt werden. Tests unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen wurden für hochempfindlich gegenüber verschiedenen Gehalten an Analyten befunden. Die zuvorerwähnten Vorteile ebenso wie andere Vorteile werden aus der ausführlichen Beschreibung der Erfindung in folgenden deutlich.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind auf verschiedene Typen von Bindungstests anwendbar. Schematische Darstellungen von Beispielen von verschiedenen solcher Typen von Tests auf Antigen- und Antikörper-Analyten können in der EP-A 217403 gefunden werden, von der diese Anmeldung ein Teil ist. Die Fachleute können sich viele andere Test-Typen, die andere Analyten wie Antigene oder Antikörper einschließen, auf die die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, vorstellen.
Unter Bezugnahme auf Abb. 1 und 2 der Zeichnungen ist eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen analytischen Vorrichtung allgemein in 10 gezeigt (käuflich erhältlich von Abbott Laboratories, North Cicago, Illinois unter dem Handelsnamen ABBOTT TESTPACK). Die bevorzugte Vorrichtung 10 schließt eine im wesentlichen planare, im allgemeinen kreisförmige, scheibenförmige Reaktionsmatrix 12 ein. Die Matrix 12 ist innerhalb der Vorrichtung 10 so angeordnet, daß innerhalb der Matrix 12 die verschiedenen chemischen Reaktionen und Veränderungen, die bei einem Bindungstest notwendig sind, stattfinden können, wenn die Vorrichtung 10 bei der Durchführung solcher Tests verwendet wird, um das Vorhandensein oder die Menge von Analyt(en) in einer zu analysierenden Probe zu bestimmen. Die Matrix 12 hat eine Oberfläche, die mit der Probe in Kontakt tritt (Reaktionsort) 12a und eine Oberfläche 12b gegenüber davon; eine bevorzugte Zusammensetzung der Matrix 12 wird ausführlicher in den Beispielen, infra, und in der zuvorgenannten EP-A 217403 beschrieben.
Die bevorzugte Vorrichtung 10 umfaßt weiterhin ein Absorptionsmittel 20, das, wie gezeigt, in dem Träger 14 zur Absorption von Flüssigkeiten während der Verwendung der Testvorrichtung, angeordnet ist. Das Absorptionsmittel 20 der Vorrichtung 10 kann aus einer oder mehreren Material-Schichten bestehen und steht, wie gezeigt, mit dem Dämm-Material 18, wenn es verwendet wird, oder mit der Reaktionsmatrix 12 in physikalischem Kontakt. Dieses besonders vorteilhafte Merkmal ermöglicht es, daß während der Durchführung eines Tests unter Verwendung der Vorrichtung 10 überschüssige Flüssigkeit leicht absorbiert wird, nötigenfalls nach dem Durchtritt solcher Überschuß-Flüssigkeit während des Test-Verfahrens durch die Reaktionsmatrix 12. Das Absorptionsmittel 20 kann tatsächlich jedes Feuchtigkeits- oder Flüssigkeits-zurückhaltende Material, z. B. das, welches von James River unter der Bezeichnung "105 point" oder "50 point" erhältlich ist, oder, wie besonders bevorzugt, eine Kombination aus jeweils einer oder mehrerer Schichten des zuvorgenannten sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Vorrichtung 10 ist ein Dämm- Mittel zur Begrenzung des Flüssigkeit-Flußes in analytischen Festphasen-Vorrichtungen vorgesehen. Diese Ausführungsform ist insbesondere bei Verwendung in analytischen Festphasen-Vorrichtungen mit einer durchlässigen Reaktionsoberfläche oder Matrix oder Filterschicht und einer Absorptionsschicht zur Absorption in der Vorrichtung verwendeten Flüssigkeiten vorteilhaft, um den Fluß der Flüssigkeiten von der Reaktionsoberfläche zu dem Absorptionsmittel oder der -schicht zu ermöglichen, während der Rückfluß der Flüssigkeiten aus der Absorptionsschicht in die Reaktionsmatrix verhindert wird.
Wie in Fig. 1 gezeigt, enthält das Dämm-Mittel eine Schicht aus Dämm- Material 18, das sich unter der Matrix 12 und innerhalb des Trägers 14 erstreckt. Das Dämm-Material 18 steht mit der Oberfläche 12b der Matrix 12 in Kontakt und dient, wenn die Vorrichtung in Gebrauch ist, dazu, die Flüssigkeit, die durch die Matrix 12 zu der und durch die Oberfläche 12b und in die Schicht 18 tritt, von einem nochmaligen Kontakt mit der Oberfläche 12b abzuhalten. Es muß geschätzt werden, daß, obwohl es bei einer erfindungsgemäßen Vorrichtung am meisten bevorzugt wird, die Schicht 18a als Flüssigkeits-abhaltende Schicht zu verwenden, dieses Merkmal für die Grundfunktionen oder Ausführungsformen der Matrix 12 nicht essentiell oder kritisch ist und gegebenenfalls bei der Vorrichtung weggelassen werden kann. Wenn es weggelassen wird, erbringt die Vorrichtung bei einem Test zufriedenstellende Leistungen, jedoch wahrscheinlich mit geringerer Empfindlichkeit (verringerte detektierbare Antwort).
Die Schicht 18 kann aus jedem geeigneten Material bestehen, das zu einem einschränkenden im wesentlichen Einweg-Fluß von Flüssigkeit oder Feuchtigkeit in der Lage ist. Beispiele von besonders für diesen Zweck geeigneten Materialien sind Polyethylen-Webematerialien, die von Ethyl Visqueen Corp., Baton Rouge, Lousiana, unter den Bezeichnungen "X-6057" 25,4 um (1,0 mil) und "X-6108" 3,75 um (1,25 mil) hergestellt werden, und auch die, die in den U.S. Patentschriften 3929 135 und 4342314 beschrieben werden.
Es muß geschätzt werden, daß zusätzlich zu der Fähigkeit der Vorrichtung 10, wie infra beschrieben, eine visuell-ablesbare Antwort, wie eine Farb-Entwicklung, die für einen Analyten in der Testprobe kennzeichnend ist, zu produzieren, die instrumentelle Bestimmung aus einer detektierbaren Antwort davon, z. B. entsprechend der Reflexion von sichtbarem Licht, oder der Intensität der Fluoreszenz oder dergleichen, produziert durch die Matrix 12 als Ergebnis der chemischen und biologischen Reaktionen und Veränderungen, die bei Durchführung eines Tests darin auftreten, gebildet werden kann. Entsprechend kann die detektierbare Antwort aus der Vorrichtung 10 mit beispielsweise einem herkömmlichen Spektrophotometer gemessen werden. Beispielsweise, wenn die detektierbare Antwort in der Matrix 12, die durch die Reaktionen und Veränderungen während eines bestimmten Tests produziert worden ist, eine ist, bei der sich eine Farbe entwickelt, und bei der eine zunehmende Farbentwicklung einen zunehmenden Gehalt eines bestimmten Analyten in einer Testprobe, die der Analyse unterzogen wird, anzeigt, dann entspricht ein abnehmender Gehalt an Licht, der von der Matrix 12 zu dem Spektrophotometer reflektiert worden ist, diesem zunehmenden Gehalt des Analyten in der Probe. Die Interpretation solcher Ergebnisse kann auf in der Technik bekannten Wegen, wie durch Umwandlung von Analogsignalen, die durch den Detektor des Spektrophotometers erzeugt worden sind, zu einer digitalen Information weitgehend unter Verwendung herkömmlicher Elektonika erreicht werden. Solche Elektronika sind in der Technik bekannt und sind in der Lage, ein Signal, das von Menschen gelesen werden kann, aus einer solchen digitalen Imformation, die dem Vorhandensein und/oder der Menge des Analyten in der Testprobe entspricht oder mit ihm in Korrelation steht, zu erzeugen.
Erfindungsgemäß besitzt das faserige Reaktionsmaterial vorzugsweise eine Vielzahl von im wesentlichen kugeligen, festen Teilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 0,1 bis etwa 10 um (microns) oder mehr, am meisten bevorzugt von etwa 0,1 bis etwa 5 um (microns), die auf den Fasern des Materials festgehalten und immobilisiert sind. Mit "festgehalten und immobilisiert" ist gemeint, daß die Teilchen, wenn sie sich einmal auf dein Material befinden, nicht mehr in der Lage sind, sich wesentlich zu anderen Positionen anderswo in dem Material zu bewegen, (d. h. zu anderen Fasern), oder nicht mehr vollständig von dem Material ohne dessen Zerstörung entfernt werden können. Der Mechanismus, durch den die Teilchen so festgehalten und immobilisiert werden, ist nicht bekannt, kann jedoch mit den physikalischen Oberflächen- Anziehungskräften zwischen den Fasern und den Teilchen und/oder zwischen den Teilchen selbst zusammenhängen. Die Teilchen können von einem Fachmann aus jedem geeigneten Typ von teilchenförmigem Material, das im allgemeinen als Mikroteilchen bekannt ist, ausgewählt werden. Solche Teilchen bestehen typischerweise z. B. aus Polystyrol, Polymethacrylat, Polypropylen, Latex, Polytetrafluorethylen, Polyacrylnitril, Polycarbonat oder ähnlichen Materialien. Was auch immer für ein Typ von Mikroteilchen für die erfindungsgemäße Verwendung ausgewählt wird, ist es wichtig, daß die Substanz oder Substanzen, aus denen die Teichen bestehen, in der Lage sind, auf der Oberfläche der Teilchen eine Substanz, die in der Lage ist, mit einem Analyten in einer Testprobe, z. B. einem Antikörper oder Antigen, oder einer Kombination davon, zu reagieren oder selbst in der Lage sind, einen Analyten auf der Oberfläche der Teilchen zu halten. Des weiteren ist die Größe der Teilchen nicht kritisch und, solange der durchschnittliche Teilchendurchmesser im wesentlichen innerhalb des zuvorgenannten Bereiches liegt (obwohl es bevorzugt wird, daß der durchschnittliche Durchmesser der Teilchen kleiner als die durchschnittliche Porengröße der Faser-Matrix ist),ist jeder Typ von Teilchen mit den zuvorgenannten Eigenschaften für die Verwendung geeignet. Ein verallgemeinertes Beispiel für ein hier bevorzugtes "Sandwich"-Immuntest-Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Materials ist wie folgt:
Schritt a) Zurückhalten von Antikörper oder Antigen auf den Teilchen in dem Material, Bildung einer Reaktionsmatrix wie zuvor beschrieben;
Schritt b) Anwendung einer Testprobe mit für die Matrix bestimmten Antigen oder Antikörper;
Schritt c) Anwendung eines Enzym-konjugierten Antigens oder Antikörpers auf den Antikörper oder das Antigen aus Schritt b);
Schritt d) Waschen, zur Entfernung von ungebundenem Material; und
Schritt e) Anwendung einer Indikator-Substanz, die in Gegenwart des Enzymteils des Konjugates aus Schritt c) eine detektierbare Farbe oder eine andere Antwort in der Reaktionsmatrix produziert.
Eine ausführlichere Diskussion darüber, wie "Sandwich"-Testverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorteilhaft durchgeführt werden können, erfolgt in den Beispielen, infra.
Erfindungsgemäß wird eine detektierbare Antwort auf der Reaktionsoberfläche oder an einem Ort auf einem porösen Material oder auf einer Reaktionsmatrix einer analytischen Vorrichtung gebildet; die Antwort ist eine, die für das Vorliegen und/oder die Menge eines Analyten in einer zu testenden Probe kennzeichnend ist. Eine solche detektierbare Antwort kann gemäß bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung Farbentwicklung, gefolgt von einer Serie von Testschritten, wie die, die zuvor beschrieben worden sind, sein, oder kann irgendeine Zahl von Antworten, die in der analytischen Technik gut bekannt ist und für ähnliche Zwecke verwendet wird, sein. Die Antwort kann auch Chemoluminiscenz oder eine Vielzahl von Strahlungsenergie-Antworten (z. B. radioaktive Emissionen), die durch verschiedene bekannte Ausrüstungen entweder visuell oder instrumentell detektierbar sind, sein. Somit wird es besonders geschätzt, daß bei Verwendung der erfindungsgemäßen Materialien und Vorrichtungen viele verschiedenen Typen detektierbarer Antworten möglich und erwünscht sind und die erfindungsgemäßen Ausführungsformen dadurch nicht eingeschränkt werden.
Gemäß einer sehr wichtigen erfindungsgemäßen Ausführungsform sind "eingebaute" Verfahrens-Kontrollflächen auf der analytischen Festphasen-Vorrichtung vorgesehen, um detektierbare Antworten entsprechend einer positiven Kontrollfläche (die, die eine für ein gültiges Testergebnis charakterisische Antwort aufzeigt, ohne Rücksicht auf die Anwesenheit oder Abwesenheit des Analyten von Interesse in einer Testprobe), einer negativen Kontrollfläche (die eine detektierbare Antwortänderung nur anzeigt, wenn die Testergebnisse ungültig sind) und der Analyt-Probenfläche an einem einzigen Reaktionsort der analytischen Vorrichtung gleichzeitig anzuzeigen. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung werden gleichzeitig dasselbe Volumen an Testprobe und Test-Reagentien mit den Verfahrenskontrollen und Testflächen in Kontakt gebracht, womit die Notwendigkeit getrennter Kontroll-Tests, wie sie in der Technik allgemein durchgeführt werden, vermieden wird.
Das Verfahren zum Aufbringen von Probe und Reagentien auf den Reaktionsort kann jeder für die bestimmte Vorrichtung verwendete Weg sein. Beispielsweise können bei der bevorzugten Durchfluß-Vorrichtung Probe und Reagentien tropfenweise oder anders auf die Verfahrenskontroll- und Testflächen gegossen werden, so daß die genauen Volumina von Probe und Reagens mit dem Reaktionsort in Kontakt treten. Alternativ kann der Reaktionsort in eine Probelösung, die auch bestimmte Reagentinen enthalten kann, eingetaucht werden. Ohne Rücksicht auf die bestimmte verwendete Vorrichtung werden der Reaktionsort mit den Verfahrenskontrollen (negative Kontrolle und positive Kontrolle) und die Analyten-Bindungsfläche durch Aufbringen von Reagens und Probe gleichzeitig in Kontakt gebracht.
Dem Fachmann ist klar, daß die Verfahrenskontrollen oder ablesbaren Ergebnisse der Erfindung nicht mit der bevorzugten Mikroteilchen-Matrix und -Vorrichtung, die hier beschrieben sind, verwendet werden brauchen. Sie können eher auf ähnliche Weise bei jeder analytischen Vorrichtung mit einem Reaktionsort, der in der Lage ist, eine Vielzahl und Vielfalt von Reaktionsergebnissen gleichzeitig anzuzeigen, eingesetzt werden. Solche anderen Typen von Reaktionsoberflächen schließen beispielsweise beschichtete oder unbeschichtete Faser-Matrices, Filter, aus Papier oder Membranen, relativ planare feste Oberflächen und dergleichen ein.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 3A-C sind die eingebauten negativen und positiven Kontrollflächen 30 bzw. 32 vorzugsweise an dein Reaktionsort auf der Reaktionsoberfläche oder Matrix 12 der analytischen Vorrichtung 10 vorgesehen. Die negativen und positiven Kontrollflächen können quantitativ funktionieren, wodurch sie als negative und positive Test-Referenzkontrollen funktionieren und die Gültigkeit der Verfahren und Reagentien, die bei der Durchführung eines Tests verwendet werden, anzeigen. Wie hier verwendet schließt der Ausdruck "Kontrolle" sowohl quantitative wie qualitative Ausführungsformen ein.
Die negative Kontrollfläche 30 wird dadurch gebildet, daß die Kontrollfläche 30 von Substanzen, die während der normalen Verwendung der Vorrichtung 10 bei der Durchführung eines Bindungstests, wie hier beschrieben, die die Markierung oder ein anderes Signal-Antwortmaterial beibehalten, freigehalten werden. Die positive Kontrollfläche 32 wird dadurch gebildet, daß eine Substanz vorgesehen ist, die in der Lage ist, die Markierung oder ein anderes Signal-Antwortmaterial innerhalb der Kontrollfläche der Matrix ohne Berücksichtigung der Anwesenheit oder Abwesenheit des Analyten von Interesse in der Testprobe zu binden. Die positive Kontrollfläche 32 kann, wie in Verbindung mit der besonders bevorzugten Reaktionsmatrix verwendet, wie es zuvor beschrieben worden ist, durch Überschichten der Mikroteilchen innerhalb der Kontrollfläche mit dem Analyten, oder anderen Substanzen, die in der Lage sind, die Enzymmarkierung während der Durchführung eines Bindungstests innerhalb der Fläche zu binden oder zurückzuhalten, gebildet werden.
Darüberhinaus sind auf der Matrix 12 eine oder mehrere Analyten- Bindungsfläche(n) 34 zur Bindung oder Zurückhaltung des Analyten von Interesse aus einer Testprobe während der Durchführung eines Bindungstests auf der Fläche vorgesehen. Die Analyten-Bindungsfläche(n) 34 können in dem hier beschriebenen besonders bevorzugten Reaktions-Matrixmaterial durch Überschichten der Miktoteilchen innerhalb der Fläche(n) der Matrix 12 mit einer Substanz, wie einem Antigen oder Antikörper, die in der Lage ist, den Analyten zu binden, gebildet werden.
Die positive Kontrollfläche 32 und die Analyten-Bindungsfläche(n) 34 können in irgendeiner gleichzeitig kontaktierbaren Konfiguration, die die Leichtigkeit der Verwendung der Vorrichtung 10 bei der Durchführung eines Bindungstests erleichtert, vorgesehen sein. Jedoch sind hier eine positive Kontrollfläche und eine Analyten- Bindungsfläche bevorzugt in einer interaktiven Konfiguration, in der das durch die positive Kontrollfläche gebildete Zeichen mit dem durch die Analyten-Bindungsfläche beim Auftreten eines positiven Testergebnisses unter Bildung eines ersten repräsentativen Zeichens mit einer dem Anwender bekannten Bedeutung gebildeten Zeichen in Wechselwirkung tritt, vorgesehen; während das von der postiven Kontrollfläche gebildete Zeichen beim Auftreten eines negativen Testergebnisses allein die Bildung eines zweiten symbolischen Zeichens mit einer dem Anwender bekannten, von der des ersten symbolischen Zeichens verschiedenen Bedeutung veranlaßt.
Die interaktive positive Kontrolle und die Analyten-Bindungsflächen sind am besten bei der besonders bevorzugten Ausführungsform in den Fig. 3A-C, bei der die positive Kontrollfläche in Form eines rechteckigen Stabes oder "-" geformt ist, während die Analyten-Bindungsflächen 34 auf gegenüberliegenden Seiten und zu der positiven Kontrollfläche 32 rechtwinklig in Form rechteckiger Stäbe angeordnet sind. Entsprechend führt bei der Verwendung der Vorrichtung 10 ein positives Testergebnis, das bei richtiger Verwendung der Vorrichtung erhalten worden ist, zu einer detektierbaren Antwort in Form eines "+"-Zeichens, das sowohl die positive Kontrollfläche 32 wie die Analyten- Bindungsflächen 34, wie in Fig. 3C gezeigt, umfaßt und dem Anwender ein "+" oder positives Testergebnis anzeigt. Ein negatives Testergebnis, das bei richtiger Verwendung der Vorrichtung erhalten worden ist, führt, wie in Fig. 3B gezeigt, nur in der positiven Kontrollfläche 32 zu einer detektierbaren Antwort in Form eines "-"-Zeichens und zeigt dem Anwender ein "-" oder negatives Testergebnis an. Wenn der Bindungstest nicht richtig durchgeführt worden ist, oder wenn die Reagentien bei dem Testablauf nicht richtig verwendet worden sind, wird weder in der positiven Kontrollfläche 32 noch in den Analyten-Bindungsflächen 34, wie in Fig. 3A gezeigt, eine detektierbare Antwort erhalten, was ein ungültiges Testergebnis anzeigt. Zusätzlich kann jede detektierbare Antwort in der negativen Kontrollfläche 30, wie sie durch eine nicht-spezifische Bindung oder durch Fehler bei der richtigen Durchführung der Waschschritte während der Durchführung des Tests verursacht worden ist, für ein ungültiges Testergebnis kennzeichnend sein.
Die Anordnung in den Fig. 3A-C ist hier besonders bevorzugt, da sie dem Anwender in eindeutiger symbolischer Form, was die positive (+) oder negative (-) Natur des Testergebnisses betrifft, und was die Gültigkeit des Tests betrifft, eine sofortige Information liefert. Obwohl die "plus" und "minus"-interaktive Anordnung bevorzugt ist, sind weitere gleichzeitig kontaktierbare interaktive Anordnungen in der Technik gut bekannt. Beispielsweise kann das erste Zeichen-Symbol (gebildet durch Wechselwirkung der Symbole, die von der postiven Kontrollfläche und der Analyten-Bindungsfläche gebildet worden sind) ein Dreieck, ein Rechteck oder ein Kreis sein. In jedem Falle kann das zweite Zeichensymbol (gebildet von der positiven Kontrollfläche allein) jeweils ein Punkt, ein Kreis oder ein rechteckiger Stab, wie ein Minus-Zeichen, sein. Es ist nur wichtig, daß das zweite Zeichen-Symbol mit dem Symbol, das von der analytischen Bindungsfläche 34 gebildet worden ist, unter Bildung des ersten Zeichen-Symbols in Wechselwirkung tritt. Ein Weg, um sowohl die Wechselwirkung der Symbole als auch die gleichzeitige Kontaktierbarkeit der Flächen mit Probe und Reagens sicherzustellen, ist, daß man das zweite Symbol eine Grenze oder einen unmittelbar anschließenden Rand mit dem anderen Symbol teilen läßt. Das erste Symbol ist dann der geometrische Anschluß an das zweite Symbol (positive Kontrollfläche) und das andere Symbol (Analyten- Bindungsfläche). Weitere äquivalente Anordnungen für die negative Kontrollfläche 30, die positive Kontrollfläche 32 und die Analyten-Bindungsfläche(n) 34, wie weitere Symbole, Zahlen und dergleichen sind für den Fachmann sofort ersichtlich.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte Wege, um das erfindungsgemäße neue Material herzustellen und zu verwenden, und analytische Vorrichtungen, die das Material verwenden, ebenso wie Testverfahren, die sie verwenden. Die hergestellten analytischen Vorrichtungen hatten im wesentlichen die Gesamtform und Erscheinung der Vorrichtung, die hier unter Bezugnahme auf die Fig. 1 und 2 gezeigt und beschrieben wurde, und wurden in Tests erfindungsgemäß unter Verwendung der folgenden Verfahren hergestellt und verwendet. Jedoch sollen die Beispiele nur erläuternd sein und keinesfalls dazu dienen, dem Umfang der Erfindung Einschränkungen aufzuerlegen, wobei der Umfang nur durch die beigefügten Patentansprüche definiert ist.
Wenn nicht anderweitig angegeben, sind hier alle Prozentangaben in Gewicht ausgedrückt.

Beispiel 1: Herstellung von Antikörper-beschichteten Mikroteilchen

100 Microliter Carboxylat-modifizierte Microteilchen (2,5% Feststoffe, 0,45 um (microns) durchschnittlicher Durchmesser; käuflich erhältlich durch Polyscience und Seragen) wurden zu 1,0 Milliliter (ml) Methylethylsulfonat-Puffer (MES) (5 millimolar (mM), pH 4,75) und 75 Microlitern einer Antikörperlösung (beta-hCG) (2 Milligramm pro Milliliter (mg/ml)) gegeben. Die Lösung wurde gerührt und dann wurden 100 ml 1-Ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)-carbodiimid HCl (EDAC) (2 mg pro 10 ml H&sub2;O) hinzugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei 2-8 Grad C gerührt, wonach die Mikroteilchen durch Zentrifugation abgetrennt, zweimal mit 0,1% Tween-Lösung gewaschen und in "PBS" mit Phosphat gepufferter Salzlösung (0,01 M KH&sub2;SO&sub4;; 0,15 M NaCl: Ph 7,2) resuspendiert wurden, um eine 0,125%ige Lesung zu ergeben. Nach der Resuspension in PBS, wurden die Teilchen bei 2-8 Grad C zur weiteren Verwendung bei den folgenden Verfahren aufbewahrt.

Beispiel 2: Herstellung der Festphasen-Reaktionsmatrix

50 Microliter Antkörper-beschichtete Microteilchen aus Beispiel 1 wurden tropfenweise auf die Mitte eines Whatman GF/D Glasfilters gegeben; 100 Microliter Schweineseren wurden dann hinzugegeben und das Filter und die Micropartikel 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert. Danach wurde das Filter, das jetzt die Microteilchen enthielt, dreimal mit 300 Microlitern PBS-Puffer gewaschen. Das Filter wurde dann in einer Feuchtigkeitskammer gelagert, bis es bei dem folgenden Immunotest-Beispiel verwendet wurde. Die Microteilchen wurden durch Abtasten mit einem Elektronenmikroskop dahingehend beobachtet, ob sie irreversibel festgehalten werden oder auf den Glasfasern des Filtermaterials agglomerieren.
Es sei angemerkt, daß zusätzlich zu den im vorhergehenden Beispiel beschriebenen Techniken Antikörper (oder Antigen) an die Teilchen durch verschiedene Verfahren, z. B. Adsoption oder Verwendung von verschiedenen chemischen Aktivatoren, angeheftet werden können. Es muß weiterhin geschätzt werden, daß die Teilchen nach der Zugabe von beispielsweise tierischen Seren zu der Fasermatrix hinzugegeben werden können und daß die Verwendung solcher Seren nicht von kritischer Wichtigkeit ist. Darum ist die Reihenfolge der Zugabe der Teilchen zu der Matrix und ihrer Behandlung vor oder nach der Einarbeitung in die Matrix für die vorliegende Erfindung nicht kritisch. Des weiteren wird es geschätzt, daß beschichtete faserartige Materialien, wie Polystyrolbeschichtetes Glas, an Stelle des Glasfilter-Matrixmaterials, das insbesondere hier beschrieben worden ist, verwendet werden können und die Vorteile der Erfindung auch dadurch erkannt werden können.

Beispiel 3: Immunotest-Bericht Bestimmung von beta-hCG

Das Glasfaser-Material, das die Antikörper-beschichteten Microteilchen, wie zuvor beschrieben, enthält, wurde in im wesentlichen kreisförmige "Scheiben" geschnitten und die Scheiben, die die Reaktionsmatrices bildeten, wurden mit einem Blotter-Material in Kontakt gebracht, um überschüssige Flüssigkeit aus den bei dem Test verwendeten Lösungen zu absorbieren. Danach wurden fünf Tropfen Testproben von menschlichem Urin (etwa 280 Microliter) mit einem Gehalt von Null und 50 und 100 mIU/ml an betahCG (Tabelle 1, infra) zu jeder Matrix gegeben, nachdem die Probetropfen einen oberhalb jeder Matrix angebrachten Vorfilter passiert hatten. Drei Tropfen eines Antikörper- Enzym-Konjugates (Tabelle 1, infra) wurden dann durch den Vorfilter auf jede Matrix gegeben, und jede Matrix wurde bei Raumtemperatur etwa 2 Minuten lang inkubiert. Als nächstes wurde der Vorfilter entfernt, und 1,0 ml einer Detergens-Waschlösung wurde zu jeder Matrix gegeben, um überschüssiges Antikörper-Enzym-Konjugat zu entfernen. Dann wurde ein Tropfen eines chromogenen Indikators (Tabelle 1, infra) zu jeder Matrix gegeben, und nach zwei Minuten wurde jede Matrix visuell auf Farbentwicklung geprüft. Für die Testproben, die beta-hCG enthielten, wurde eine Farbentwicklung beobachtet, und die Lichtabsorption, die mit der Farbentwicklung korrelierte, wurde instrumentell unter Verwendung eines herkömmlichen Spekrophotometers bestimmt. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle aufgezeigt. Tabelle 1 Daten für beta-hCG: Meerettich-Peroxidase-(HRPO)-Antikörper-Enzym- Konjugat/3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-(TMB)-Chromogen (Absorption nach zwei Minuten bei 650 Nanometern (nm)) (hCG) mIU/ml in Urin-Proben Instrumentell Visuell nicht sichtbar sichtbar Tabelle 2 Daten für beta-hCG: Alkalische Phosphatase-Antikörper-Enzym- Konjugat/Bromchlorindolphosphat-Nitroblautetrazolinium-Chromogen (Absorption nach zwei Minuten bei 650 Nanometern (nm)) (hCG) mlU/ml in Urin-Proben Instrumentell Visuell nicht sichtbar sichtbar
Die zuvorgenannten Enzym-Antikörper-Konjugate wurden im allgemeinen nach den folgenden Referenzen hergestellt: HRPO: Nakane, P.K. und Kawaoi, A., Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 22 (12) 1084-1091 (1974); Alkalische Phosphatase: hergestellt unter leichten Modifizierungen eines Glutardialdehyd-Verfahrens, erhältlich durch Boehringer, Mannheim GmbH.
Urin-Proben von zwölf nicht schwangeren und sechs tatsächlich schwangeren Frauen wurden unter Verwendung des HRPO-Antikörper-Enzym-Konjugates, beschrieben supra, und im wesentlichen des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens getestet. Die zwölf Proben der nicht schwangeren Individuen bildeten in der Reaktionsmatrix keine sichtbare Farbe, d. h. alle Absorptionen betrugen weniger als 0,050, unter welcher Schwelle Farbe nicht leicht sichtbar gemacht werden kann. Die Proben aller sechs schwangeren Individuen bildeten während des Tests sichtbare Farbe.

Beispiel 4: Herstellung der beta-hCG-Verfahrenskontrolle

1,0 ml Mikroteilchen (wie zuvor beschrieben, 0,125% Feststoffe) mit auf ihrer Oberfläche angebrachten Antikörpern gegen beta-hCG wurden mit 14,0 Microlitern beta-hCG-Lösung (1,0 mg/ml) umgesetzt. Die Lösung wurde drei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann bei 2-8ºC bis zum Gebrauch gelagert. Es war kein weiteres Waschen der Teichen erforderlich.
50 ml der vorhergehenden Verfahrenskontroll-Mikroteilchen mit auf ihren Oberflächen gebundenem beta-hCG wurden auf verschiedene Konzentrationen verdünnt und auf das Glasfaser-Material, das zuvor beschrieben worden ist, auf dieselbe Weise wie die Antikörper-beschichteten Mikroteilchen aufgetragen worden sind (beschrieben supra), aufgetragen. Die Aktivität einer jeden Verdünnung wurde dann durch Zugabe zweier Tropfen (etwa 100 Microliter) HPRO-Antikörper-Enzym-Konjugat, Inkubation für fünf Minuten, Waschen mit 1,0 ml einer Detergens-Waschlösung und dann Farbentwicklung durch Zugabe von einem Tropfen (etwa 50 Microliter) TMB-Lösung getestet. Die Absorption einer jeden Kontrolle wurde dann unter Verwendung eines herkömmlichen Spektrometers gemessen, wie in der folgenden Tabelle aufgezeigt. Tabelle 3 Verdünnung der Stammlösung Absorption nach 2 Minuten bei 650 nm
Die Absorption der Verfahrenskontrolle bei der Verdünnung 1:32 wurde für annähernd gleich der eines beta-hCG-Standards von 100 mIU/ml befunden.

Beispiel 5: Bakteriologisches Testen heterologer Bakterien

Tests auf Strep A Antigen und Tests auf Antigene für verschieden, in der folgenden Tabelle aufgeführten Organismen, wurden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen, wie zuvor beschrieben, durchgeführt. Der Protokoll der Tests kann wie folgt zusammengefaßt werden:
1. Eine vorher vorbereitete bakterielle Abstrichprobe (hergestellt durch eine gut bekannte Technik) wurde in Lösung gebracht und auf den Filter-Aufbau über der Reaktionsmatrix der Vorrichtung pipettiert. Die Probe wurde das Filter passieren gelassen.
2. Zwei Tropfen (etwa 100 Microliter) des Antikörper-Enzym-Konjugates wurden hinzugegeben und das Filter passieren gelassen.
3. Das Filter wurde dann entfernt und die Matrix mit 10-12 Tropfen (etwa 500 Microliter) PBS-Puffer gewaschen.
4. Ein Tropfen (etwa 50 Microliter) TMB wurden hinzugegeben und die Farbentwicklung in der Matrix nach etwa zweiminütiger Inkubationszeit bei Raumtemperatur abgelesen.
Die Absorption des Lichtes bei 650 nm, das von der Matrix reflektiert wurde, wurde dann unter Verwendung eines herkömmlichen Reflexionsgerätes als Ergebnis von Tests, die, wie zuvor beschrieben, mit Proben, die die in der folgenden Tabelle aufgeführten Microorganismus-Antigene enthielten, durchgeführt worden sind, bestimmt. Tabelle 4 Tests auf heterologe Bakterien Mikroorganismus a Absorption b Serratia macescenes Klebsiella pneumonia Pseudomonas aeruginosa Neisseria meningitidis Neisseria sicca Haemopnilus influenzae Stapgylococcus aureus Cowan I Stapglylococcus aureus Cowan II Bordetella pertussis Candida albicans Streptococcus pneumoniae Streptococcus agalactiae (Gruppe B) Streptococcus equisimilis (Gruppe C) Streptococcus faecalis (Gruppe D) Streptococcus cariis (Gruppe G) Streptococcus pyogenes (Gruppe A) Negative Kontrolle a Die Microorganismen wurden bei einer Konzentration von 10&sup6; CFU pro Test getestet. b Absorption bei 650 Nanometern.

Beispiel 6: Festphasenbewertung: Verwendung verschiedener erfindungsgemäßer Reaktionsmatrix-Materialien

Urinproben, mit einer Konzentration von Null und 250 mIU/ml beta-hCG, wurden wie zuvor beschrieben (Beispiel 3), unter Verwendung von Mikroteilchen, die erfindungsgemäß in verschiedene faserartige Matrix-Materialien eingearbeitet worden waren, getestet. Die in der folgenden Tabelle aufgeführten Materialien besaßen verschiedene Porengrößen und Fluß-Geschwindigkeiten. Das Whatman GF/D-Material wurde vor der Teilchenzugabe ebenfalls vorbehandelt. Ein HPRO-Konjugat wurde verwendet. Bei jedem Versuch wurde die Farbentwicklung, die den Testerfolg anzeigte, visuell beobachtet, und die Absorptionsablesungen wurden bei 650 Nanometern vorgenommen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Tabelle 5 Matrix 0 mIU/ml 250 mIU/ml *Porengröße **Flußgeschwindigkeit 1. Whatman GF/D 2. Whatman GF/D, vorbeschichter mit Polystyrol (4,4 mg/ml THM) 3. Whatman GF/D, vorbeschichtet mit Schweineseren 4. Whatman 934-AH 5. Whatman GF/C 6. Whatman GF/A * um ** Sekunden/100 ml bei 10 cm Fallhöhe *** Schleicher und Schuell
Die vorhergehenden Daten zeigen, daß eine Vielzahl faserartiger Rohmaterialien bei dem neuen Material und den Reaktionmatrices der erfindungsgemäßen Vorrichtungen verwendet werden kann. Solche alternativen Rohmaterialien können nach der Vorbehandlung mit Proteinseren oder Polystyrol (hydrophil oder hydrophob) verwendet werden, um die Eigenschaften des Materials gegebenenfalls etwas zu verändern (z. B. Flußgeschwindigkeit).

Beispiel 7: Wirkung der Teilchengröße

Teilchen im Bereich von 0,19 bis etwa 3,0 um oder microns (durchschnittlicher Durchmesser) wurden zu Proben der Matrix-Materialien (Whatman GF/D) gegeben. Die Menge an Antikörper pro Probe wurde bei etwa 3,0 Microgramm gehalten und Urinproben mit einer Konzentration von Null und 100 mIU/ml beta-hCG wurden wie zuvor beschrieben unter Verwendung eines alkalischen Phosphatase- Konjugates getestet. Die Absorptionsablesung wurde bei 650 Nanometern vorgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt. Tabelle 6 Durchschnittlicher Durchmesser der Teilchen in um (microns) Null beta-hCG 100 mIU/ml beta-hCG
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß Teilchen, die in der Größe des Durchmesser im Bereich von 0,19 bis etwa 3,0 um (microns) liegen, besonders wirksam sind und somit bevorzugt werden. Teichen innerhalb des Bereichs von etwa 0,1 bis etwa 5 um (microns) sind jedoch für eine erfindungsgemäße Verwendung geeignet. Weiterhin zeigen die Daten daß, da die Porengröße des GF/D-Filtermaterials etwa 2,7 um (microns) beträgt, daß Teilchen, die viel kleiner oder größer als die durchschnittliche Porengröße des faserartigen Matrix-Materials sind, verwendet werden können.

Beispiel 8: Schneller Test auf beta-hCG

Ein vorteilhaft schneller und verfahrensmäßig einfacher Test auf beta-hCG wurde unter Verwendung einer erfindungsgemäß hergestellten analytischen Vorrichtung, wie zuvor unter Verweis auf die Fig. 1 und 2 gezeigt und beschrieben, durchgeführt. Der Test-Protokoll war wie folgt.
Fünf Tropfen einer Patienten-Urinprobe wurden aus einer medizinischen Tropfvorrichtung auf die Mitte eines Filters über der Reaktionsmatrix der Vorrichtung unter Verwendung einer Überführungspipette gegeben. Die Probe wurde sich durch die Matrix saugen gelassen (etwa 10 Sekunden). Drei Tropfen Antikörper-Enzym- Konjugat alkalische Phosphatase) wurden wurden zugegeben und die Reaktionsmatrix 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Als nächstes wurde der Filter entfernt und verworfen, und etwa 1 ml einer Citrat/NaCl-Waschlösung, kombiniert mit Tween®- und Triton®-Pufferlösungen, wurden zugegeben und durch die Matrix fließen gelassen.
Drei Tropfen eines chromogenen Enzym-Substrates (Bromchlorindolphosphat-Nitroblautetrazolinium) wurden dann zugegeben, und die Farbe wurde sich in der Matrix für volle zwei Minuten entwickeln gelassen. Danach wurden weitere 1,0 ml Waschlösung zugegeben und die Ergebnisse visuell abgelesen. Das Auftreten eines visuell detektierbaren positiven Zeichens (+) zeigte an, daß die Probe erhöhte Werte (größer als etwa 50 mIU/ml) an beta-hCG enthielt. Proben, die unter Verwendung der vorausgegangenen Verfahren getestet worden sind, aber nicht solche erhöhten Werte an beta-hCG enthielten, bildeten ein negatives (-) Zeichen in der Matrix.
Tests, die unter Verwendung eines im wesentlichen ähnlichen Testprotokolls wie in Beispiel 8 durchgeführt wurden, aber bei denen sich kein Auftreten weder eines positiven (+) noch eines negativen (-) Zeichens ergab, zeigten die unrichtige Zugabe des Reagens oder die Verschlechterung des Reagens an.
Das folgende ist ein allgemeines Beispiel für die Herstellung einer erfindungsgemäßen analytischen Vorrichtung, in die zusätzlich eine Verfahrenskontroll-Fläche zur Bestimmung der nicht-spezifischen Reaktivität (Interferenz) der Probe mit der festen Phase eingearbeitet ist.
Reaktions-Matrices, die das erfindungsgemäße Material verwenden, können im wesentlichen wie zuvor beschrieben hergestellt werden und die Teilchen in einem Muster mit im wesentlichen der Gesamtform eines "Kreuzes" in das Material eingearbeitet werden. Die vertikale Achse des Kreuzes kann aus den Teilchen mit einer Analyten- Bindungssubstanz auf ihren Oberflächen gebildet werden, wogegen die horizontale Achse des "Kreuzes" aus einer Substanz gebildet werden kann, die in der Lage ist, die Enzymmarkierung (d. h. der Antikörper, der konjugiert oder an die Markierung geheftet werden kann) zu binden. Demgemäß bildet, wenn diese Reaktionsmatrices in einem Test verwendet werden (wie zuvor beschrieben), z. B. für beta-hCG, falls keine detektierbare Menge des Analyten in der Probe vorhanden ist, nur die "Verfahrenskontroll-Fläche" der Matrix eine detektierbare Antwort, d. h. die horizontale Achse des "Kreuzes" (ein "Minus"-Zeichen) entwickelt Farbe oder eine andere Antwort, die ein negatives Ergebnis anzeigt. Wenn jedoch eine detektierbare Menge des Analyten vorhanden ist, bindet der Analyt zusammen mit der Markierung sowohl in der horizontalen als auch in der vertikalen Achse an die Teilchen, wobei in beiden Achsen ein detektierbares Zeichen (ein "Plus"- Zeichen) gebildet wird.
Alternativ können die Flächen, in denen die Antworten gebildet werden, die hier beschriebenen verschiedenen Formen, ebenso wie viele andere Formen annehmen. Während die zuvorgenannten Kontrollen in diesem Beispiel so beschrieben wurden, daß sie in Verbindung mit dein hier bevorzugten erfindungsgemäßen Matrixmaterial verwendet werden, können die eingebauten Kontrollen in ähnlicher Weise in Verbindung mit anderen Festphasen-Testvorrichtungen, wie zuvor beschrieben, verwendet werden. Die Vorteile der Einarbeitung solcher Verfahrenskontrollen in das Material und die Vorrichtung, die hier beschrieben worden sind, ebenso wie in die Festphasentestvorrichtungen, die andere Typen von Matrixmaterial verwenden, schließen ein, daß a) eine Kontrolle ein Maß für Bewertung von Materialien bei jeder Testdurchführung vorsieht; b) eine Kontrolle bei jeder Testdurchführung eine Vergleichsinterpretation der Ergebnisse ermöglicht, insbesondere wenn spezifische Muster, wie ein "Plus"- und ein "Minus"-Zeichen, verwendet werden, und c) die Einarbeitung einer Kontrolle in jede Testvorrichtung eine ausgedehnte Bewertung des Tests vorsieht, was dein Anwender ein größeres Vertrauen in die Testergebnisse erlaubt.
Wo technische Eigenschaften, die in einem Anspruch erwähnt werden, durch Bezugszeichen erläutert werden, sind diese Bezugszeichen zum alleinigen Zweck der Verbesserung der Verständlichkeit der Ansprüche eingearbeitet worden,und entsprechend haben solche Bezugszeichen keine limitierende Auswirkung auf den Umfang eines jeden Elements, das durch ein Beispiel mit solchen Referenzzeichen gekennzeichnet wird.

Claims

1. Festphasen-Testvorrichtung für die Verwendung in einem Bindungstest, um das Vorliegen oder die Menge eines Analyten in einer flüssigen Probe zu bestimmen, mit der Maßgabe, daß Probe, geeignete Reagentien und Markierungsstoff einer Reaktionsfläche eine negative Kontrollfläche (30) zur Anzeige eines ungültigen Ergebnisses, eine positive Kontrollfläche (32) zur Anzeige einer detektierbaren Antwort, die auf einen gültigen Test schließen läßt und eine Biildungsfläche (34) eines Analyten zur Anzeige einer detektierbaren Antwort, die auf das Vorliegen oder die Menge eines Analytes in der flüssigen Probe schließen läßt, besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß die positive Kontrollfläche (32) ein erstes Zeichen anzeigt, das ein gültiges negatives Ergebnis darstellen kann, wobei das Zeichen mindestens teilweise als Antwort auf das Vorliegen des Markierungsstoffes gebildet wird, daß die detektierbare Antwort der Bindungsfläche des Analyten (34) ein zweites Zeichen, das mit dem ersten Zeichen unter Bildung eines interaktiven Zeichens, das für ein gültiges positives Ergebnis steht, in Wechselwirkung tritt, bildet, dadurch daß das interaktive Zeichen nicht aus zwei diskreten Punkten besteht; und daß die Flächen (30, 32 und 34) so angeordnet sind, daß sie gleichzeitig mit Probe und Reagens in Kontakt treten.

2. Festphasen-Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die genannte Reaktionsfläche so auf einem porösen Material befindet, daß die genannte Reaktionsfläche von einzeln aufgebrachten Tropfen der flüssigen Probe und des Reagens, die bei dem Test verwendet werden, kontaktiert wird.

3. Festphasen-Testvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte poröse Material über einem absorbierenden Material, das Probe und Reagens durch die Reaktionsfläche zieht, angeordnet ist.

4. Festphasen-Testvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der positiven Kontrollflächen (32) und die Bindungsfläche (34) des Analyten in Punktform geformt sind.

5. Festphasen Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der positiven Kontrollflächen (32) ein "Minus"-Symbol, das für ein gültiges negatives Ergebnis stehen kann, umfaßt.

6. Festphasen-Testvorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsfläche des Analyten (34) auf der Reaktionsoberfläche in Form mindestens eines Stabes, der senkrecht zu dem rechteckigen Stab der positiven Kontroll-Fläche (32) ausgerichtet ist, geformt ist, so daß das durch die Bindungsfläche (34) des Analyten gebildete Zeichen, zusammengenommen mit dem "Minus"- Zeichen, gezeigt auf der positiven Kontrollfläche (32), ein "Plus"-Zeichen als interaktives Symbol bildet, das einen gültigen positiven Wert darstellt.

7. Festphasen-Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die negative Kontrollfläche (30) die positive Kontrollfläche (23) und die Bindungsfläche (34) des Analyten umgibt.

8. Festphasen-Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die positive Kontrollfläche (32) und die Bindungsfläche (34) des Analyten benachbart zueinander in der Reaktionsfläche liegen.

9. Festphasen-Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die positive Kontrollfläche (32) immobilisiertes Bindungsreagens zur Bindung von Markierungssoff enthält.

10. Festphasen-Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Zeichen vollständig als Antwort auf das Vorliegen des Markierungsstoffes gebildet wird.

11. Festphasen-Testvorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die positive Kontrollfläche (32) immobilisiertes Reagens zur Bindung von Markierungsstoff enthält, wobei das "Minus"-Zeichen als Antwort auf das Vorliegen des Markierungsstoffes gebildet wird.

12. Verfahren unter Verwendung einer Festphasen-Testvorrichtung, um das Vorliegen oder die Abwesenheit eines Analyten in einer flüssigen Probe zu bestimmen, umfassend die Stufen:

a) Bereitstellen einer Vorrichtung mit einer Reaktionsfläche, die eine negative Kontrollfläche (30) zur Anzeige eines ungültigen Ergebnisses besitzt, mit einer positiven Kontrollfläche (32) zum Anzeigen einer sichtbar detektierbaren Antwort, die auf ein gültiges Testergebnis schließen läßt, und mit einer Bindungsfläche (34) des Analyten zum Anzeigen einer sichtbar detektierbaren Antwort, die auf das Vorliegen oder die Menge des Analytes in der flüssigen Probe schließen läßt, wobei die genannte Vorrichtung dadurch gekennzeichnet ist, daß die positive Kontrollfläche (32) ein erstes Zeichen anzeigt, das für ein gültiges negatives Ergebnis stehen kann, wobei das Zeichen mindestens teilweise als Antwort auf das Vorliegen des visuell detektierbaren Markierungsstoffes gebildet wird; daß die visuell detektierbare Antwort der Bindungsfläche (34) des Analyten ein zweites Zeichen, das mit dem ersten Zeichen unter Bildung eines interaktiven Zeichens, das ein gültiges positives Ergebnis darstellt, in Wechselwirkung tritt, bildet, daß das interaktive Zeichen nicht aus zwei diskreten Punkten besteht; und daß die Flächen (30), (32) und (34) so ausgerichtet sind, daß sie gleichzeitig zusammen von Probe und/oder Reagens berührt werden;

(b) Kontaktieren der genannten Reaktionsfläche mit einer flüssigen Probe und mit Markierungsreagentien, die zur Herstellung der genannten visuell detektierbaren Antwort notwendig sind; und

(c) Beobachten der genannten Reaktionsfläche auf Anzeige des genannten ersten Zeichens und des genannten interaktiven Zeichens.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte interaktive Symbol als gültiges positives Ergebnis für das Vorliegen des genannten Analytes interpretiert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte erste Symbol in Abwesenheit des genannten zweiten Symbols als gültiges negatives Ergebnis für den genannten Analyten interpretiert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufen der Bereitstellung der auf einem porösen Material aufgebrachten Reaktionsfläche und der Kontaktierung der genannten Reaktionsfläche mit einzeln aufgebrachten Tropfen der flüssigen Probe und des Reagens, die bei dem Test verwendet werden, umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufe der Bereitstellung einer positiven Kontroll-Fläche (32) in Form eines "Minus"- Symbols, das für ein gültiges negatives Ergebnis stehen kann, umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin die Stufe der Bereitstellung einer Bindungsfläche (34) für den Analyten, gebildet auf der Reaktions-Oberfläche in Form mindestens eines Stabes, der senkrecht zu dem rechteckigen Stab der positiven Kontroll-Fläche (32) ausgerichtet ist, so daß das durch die Bindungsfläche (34) des Analyten geformte Zeichen, das zusammen mit dem dem "Minus"-Zeichen, das sich in der positiven Kontroll-Fläche (32) zeigt, registriert wird, ein "Plus"-Zeichen als interaktives Zeichen, das für ein gültiges positives Ergebnis steht, bildet, umfaßt.

18. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufe der Bereitstellung der positiven Kontroll-Fläche (32) und der Bindungs-Fläche (34) des Analyten, die in der Reaktionsfläche benachbart zueinander ausgerichtet sind, umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufe der Bereitstellung einer positiven Kontroll-Fläche (32) mit immobilisiertem Bindungs-Reagens für die Bindung des Markierungsstoffes umfaßt.