DE19751581C2

DE19751581C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Prüfung von Materialien hinsichtlich ihrer potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit und der Adhäsion auf ihrer Oberfläche

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Publication number: DE19751581C2
Application number: DE1997151581
Authority: DE
Inventors: Thorsten Bechert; Peter Steinruecke
Original assignee: Individual
Current assignee: Bio-Gate Ag 90411 Nuernberg De
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 2002-05-08
Anticipated expiration: 2017-11-21
Also published as: DE19751581A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und die Verwendung dieser Vorrichtung für Verfahren zur quantitativen und qualitativen Untersuchung von Wechselwirkungen zweier Substanzen bzw. Reaktionspartner.

Insbesondere können Werkstoffe (z. B. Biomaterialien) bzw. Be schichtungsmaterialien auf antimikrobielle Wirksamkeit gete stet und diese quantifiziert werden; außerdem kann die Adhä sion von lebenden Systemen, wie z. B. Mikroorganismen, und (bio)chemischen Substanzen auf Oberflächen, insbesondere den Oberflächen von Biomaterialien, quantifiziert werden. Außer dem betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung, mit der eine große Anzahl von Proben simultan unter identischen Bedingungen untersucht werden kann.

In der Forschung und Industrie werden permanent neu- und wei terentwickelte Biomaterialien und Werkstoffe auf den Markt gebracht. In der Medizin umfassen diese Biomaterialien den Bereich der Prothetik (künstliche Gelenke, Klappen, Zahner satz etc.) und der Intensivmedizin (Zu- und Abführleitungen, Katheter). Weitere generelle Industrie-Entwicklungen umfassen Bereiche wie biologische Abbaufähigkeiten von Kunststoffen (Umwelttechnik), Widerstandskraft und Haltbarkeit der Werk stoffe, sowie deren biochemische Eigenschaften (Inertheit, Hydrophobizität, Biokompatibilität etc.). Durch Forschung und Entwicklung werden Werkstoffe neu kreiert und Oberflächen mo difiziert, um die gewünschten Eigenschaften zu erhalten.

Bei der Prüfung von Werkstoffen und Biomaterialien sind be sonders die Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit der Werk stoffe/Biomaterialien einerseits und die Quantifizierung der Adhäsion von (bio)chemischen Substanzen und Zellen auf Werkstoffoberflächen andererseits zu nennen.

Die Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit betrifft hauptsäch lich das Gebiet der Medizin. Die Implantation von Biomaterialien ist ein Meilenstein der modernen Medizin. Für den Patienten wer den durch Biomaterialien lebenserhaltende Aufgaben wahrgenommen. Gleichzeitig verbirgt sich bei der Anwendung eines der vordring lichsten Probleme in der Klinik: die fremdkörper-assoziierte In fektion, ausgelöst durch an sich harmlose Hautmikroorganismen, die das Implantat kolonisieren. In den USA werden jährlich allein bis zu 850000 katheterassoziierte Infektionen festgestellt. Die Folgekosten von Katheterinfektionen werden mit 3000-6000 US- Dollar pro Fall beziffert. Neben dem klinischen Bereich findet die Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit beispielsweise Ver wendung in der Bier- und Weinindustrie. Auch bei Küchen- und Bad/WC-Einrichtungen, Spülmitteln und Lotionen etc. ist ein Trend zu antimikrobiellen Materialien erkennbar, so daß auch auf diesen Gebieten ein wachsender Bedarf an Prüfungsmethoden für antimikro bielle Wirksamkeit besteht.

Die Entwicklung von Materialien mit antimikrobiellen Eigenschaf ten ist ein Schwerpunktthema für Forschung und Industrie und bie tet durch die Verhinderung von Infektionen das Potential zur Ret tung von Menschenleben und zu Einsparungen in Milliardenhöhe. Die Zahl eingeführter neuer Produkte mit antimikrobiellen Eigenschaf ten steigt stetig.

Die Quantifizierung der Adhäsion von lebenden Systemen und (bio)chemischen Substanzen auf Werkstoffoberflächen findet sich mit dem gleichen Stellenwert sowohl in der medizinischen Forschung und Entwicklung als auch in der chemischen/biochemischen Industrie und Werkstoffwissenschaft.

Eine antimikrobielle Wirksamkeit (Aktivität) eines Werkstoffs oder einer Substanz kann grundsätzlich auf zwei, voneinander zu trennende, Eigenschaften des Materials zurückzuführen sein:

- entweder das Material läßt eine mikrobielle Besiedelung bzw. Anhaftung nicht zu, oder
- das Material entfaltet Eigenschaften, die zur Abtötung von Mikroorganismen führen, die das Material besiedelt haben.

Die Eigenschaft eines Stoffs, Mikroben abzutöten, muß in vitro in einem Versuchsmodell nachvollziehbar sein (Qualitätskontrolle oder "Screening"). Bei einem entsprechenden Test wird das Mate rial zuerst mit Mikroorganismen besiedelt und anschließend das Wachstumsverhalten (Proliferation und Vitalität) der Mikroorga nismen verfolgt.

Bei der Quantifizierung der Adhäsion von lebenden Systemen oder (bio)chemischen Substanzen wird die Probe mit dem zu untersuchen den Material inkubiert (in vitro), um das Adhäsionsverhalten (Affinität und Chemie der Wechselwirkung) studieren zu können.

Entsprechende Testverfahren sollen idealerweise folgenden Anfor derungen genügen:

- Zur Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit sollten potentiell antimikrobielle Probe und Kontrolle (Probe ohne antimikrobielle Wirkung) unter simultanen Versuchsbedingungen gegenübergestellt werden können.
- Zur Quantifizierung der Adhäsion können verschiedene Proben auf ihr Adhäsionsverhalten nur bei simultanen Versuchsbedingungen miteinander verglichen werden.
- Um eine aussagekräftige Statistik und Fehlerrechnung zu ermög lichen und aus Gründen der Ökonomie soll das Verfahren die gleichzeitige Prüfung einer hohen Anzahl von Proben (ca. 100 Pro ben) ermöglichen.
- Für vergleichende quantitative Aussagen muß sichergestellt sein, daß bei allen Proben eine definierte, gleich große Fläche gemessen wird.
- Das Verfahren soll schnell, reproduzierbar (d. h. mit minimalem statistischen Fehler) und kostengünstig sein.
- Das Verfahren soll in der Lage sein, geringste Unterschiede in den Aktivitäten verschiedener Proben zu erfassen, d. h. hoch sen sitiv sein.
- Die Auswertung der Daten sollte durch ein EDV-gesteuertes auto matisiertes Auswerteverfahren erfolgen.
- Das Wachstumsverhalten (Proliferation) der Mikroorganismen auf den Proben sollte zeitaufgelöst (online) z. B. durch Photometrie (d. h. Messung der optischen Dichte) auswertbar sein.
- Die Adhäsion (quantitativ) der (bio)chemischen Substan zen/Mikroorganismen auf den Proben sollte durch Photometrie (Mes sung der optischen Dichte) ausgewertet werden können.

Bis heute gibt es kein Verfahren, das die oben angesprochenen An forderungen auch nur annähernd erfüllt. Die Verfahren, die bis zum heutigen Zeitpunkt in der Wissenschaft/Forschung und Entwick lung zur Prüfung von Biomaterialien Anwendung finden, sind nicht eindeutig definiert und mit großen Fehlern behaftet und daher wenig aussagekräftig; außerdem sind sie nicht ökonomisch.

Bekannt sind folgende Methoden:

Eine weltweit angewandte Methode ist der "Semiquantitative" Keim nachweis auf der Oberfläche von Biomaterialien durch Ausrolltech nik nach Maki (Maki D. G., C. E. Weise, H. W. Sarafin: A semiquantitative culture method for identifying intravenous catheter related infection. N. Engl J. Med. 296 (1977), 1305-1309). Dabei wird das zu prüfende Biomaterial unter möglichst sterilen Bedin gungen manuell auf einer Agarplatte mit einer Pinzette hin- und hergerollt (eine Probe pro Agarplatte). Nach anschließender Be brütung der Agarplatte kann über das bakterielle Wachstum "semi quantitativ" (durch Zählen der Kolonien) die antimikrobielle Wirksamkeit oder Adhäsions-Eigenschaft des Biomaterials bestimmt werden.

Diese Methode weist folgende Nachteile auf:
Die manuelle Durchführung ist nicht zu 100% reproduzierbar; au ßerdem bestehen keine simultanen Durchführungsbedingungen. Das Verfahren ist unökonomisch und mit einem hohen statistischen Feh ler belegt. Des weiteren gibt es keine definierte Meßfläche.

Ein weiteres Verfahren ist die Flush-Technik nach Cleri et al., (Cleri D. J., M. L. Corrado, und S. J. Seligman:
Quantitative culture of intravenous catheters and other intra vaskular inserts. J. Infect. Dis. 141 (1980), 781-786) bei der Biomaterialien (Schläuche) durchspült werden, das Eluat in ver schiedenen Verdünnungsstufen (manuell) auf Agarplatten plattiert und die Keimzahlen ausgezählt werden.

Die Methode weist die gleichen Nachteile auf wie die oben be schriebene von Maki.

Auch die Ultraschallbehandlung nach Sherertz (Sherertz R. J. et al., 1990: three-Year experience with sonicated vascular catheter cultures in a clinical microbiology laboratory. Jour. of clin. microbiology (1990), 76-82), bei der Bakterien auf der Oberflä che von Biomaterialien durch Ultraschall abgelöst (in Bouillon) und anschließend durch Ausplattieren die Anzahl der Keime be stimmt wird, findet Verwendung.

Abgesehen von unzureichenden Kenntnissen der Wirkungen von Ultraschall auf Mikroorganismen weist diese Methode ebenfalls die oben beschriebenen Nachteile auf.

Auch Hemmhofmessungen, bei denen die Zone der Inhibition mi krobiellen Wachstums gemessen wird, finden Verwendung (Raad I., R. Darouche, R. Hechem, M. Mansouri, G. P. Bodey: The broad-spectrum activity and efficacy of catheters coated with minocycline and rifampin. J. Infec Dis. 173 (1996), 418-424; und Sampath L. A. et al., 1995: Infection resistance of sur face modified catheters infection (1995), 201-210). Die Hemm hofmessung ist zur Beurteilung der Besiedelbarkeit von Mate rialien nur eingeschränkt geeignet, weil die potentielle Ak tivität unmittelbar auf der Oberfläche nicht erfaßt wird. Ein fehlender Hemmhof muß nicht zwangsläufig eine fehlende anti mikrobielle Aktivität bedeuten.

Die beschriebenen Verfahren basieren auf Techniken der klas sischen Mikrobiologie. Keines der Verfahren erfüllt jedoch die oben angesprochenen Anforderungen. Die Hauptangriffspunk te der aufgeführten Methoden sind die unzureichend beschrie bene Reproduzierbarkeit, die unvollständige Fehlererfassung der Methode und die fehlende simultane Versuchsdurchführung. Überaus ungenügend ist in vielen Arbeiten die Beschreibung "semiquantitativ", womit die verwendete Methode sich selbst als unzureichend deklariert.

In der DE 297 23 730 U1 sowie der WO 97-33972 A1 ist eine Vorrich tung zum Züchten eines Biofilms beschrieben, bei der biofilm bildende Organismen inkubiert werden können, um einen Biofilm auf mehreren Biofilmhaftstellen durch Bereitstellen einer Strömung von flüssigem Wachstumsmedium über die mehreren Bio filmhaftstellen zu bilden, wobei die Flüssigkeitsfließrich tung wiederholt geändert werden kann. Mit dieser Vorrichtung können biofilmbildende Organismen inkubiert werden, um einen Biofilm auf mehreren Biofilmhaftstellen zu bilden, die in mehreren Reihen mit mehreren in jeder Reihe angeordnet sind, während eine Strömung von flüssigem Wachstumsmedium über die mehreren Biofilmhaftstellen bereitgestellt wird. Diese Vor richtung weist beispielsweise den Nachteil auf, daß die je weiligen Biofilmhaftstellen umströmt werden.

In der DE 33 36 738 A1 ist eine Titierplatte zur Durchführung von Testreihen für die Wirksamkeit von Antibiotika oder Ra dio-Immuno-Essays beschrieben, die separate austauschbare Einsätze aufweist sowie auf einem Deckel in die Näpfchen der Einsätze hineinragende Zapfen, auf denen die zu untersuchen den Substanzen in die Näpfchen der Platten eingebracht werden können. Von Nachteil ist bei dieser Vorrichtung beispielswei se, daß keine ausreichend große Meßbereiche für eine Beurtei lung von Werkstoffproben auf den Zapfen vorgesehen sind.

In der DE 32 42 393 A1 ist eine Vorrichtung beschrieben, die auf ein klinisch-chemisches Untersuchungsverfahren, z. B. Im munoassays anwendbar ist, die in Kombination einen Halter, der eine Anzahl von Einsätzen für Reaktionsvertiefungen trägt, und ein Tablett mit einer Hauptausnehmung für den Hal ter und den von diesem getragenen Einsätzen und einer Mehr zahl von Reaktionsvertiefungen, die in einem Muster angeord net sind, welches zu der Mehrzahl der Einsätze gleichzeitig komplementär ist, so daß mehrere der Einsätze gleichzeitig in die entsprechende Reaktionsvertiefung eingeführt werden können, umfaßt. Als nachteilig hat sich bei diesen Vorrichtungen beispielsweise erwiesen, daß die Einsätze nicht die gleichen Abmessungen aufweisen und ferner lediglich der Spitzenbereich der Einsätze als Meßbereich dient.

In der EP 0 213 728 A1 wird eine Vorrichtung zum Testen von Flüßigkeiten beschrieben, wobei die zu testende Probe mittels einer Scheibe oder einem Streifen in die Vorrichtung einge bracht wird. In diese Vorrichtung sind Aussparungen einge bracht, die einen Napfbereich umfassen sowie einen Bereich, der von einem höherem Niveau über eine Rampe abfällt. Dieser abschüßige Bereich dient dazu, die Scheibe oder den Streifen lagernd aufzunehmen. Von Nachteil bei dieser Vorrichtung ist beispielsweise, daß kein definierter Eintauschbereich be stimmt wird sowie jeder Streifen oder jede Scheibe separat eingebracht werden muß.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Weg aufzuzeigen, wie einerseits die antimikrobielle Wirksamkeit von gegebenenfalls vorbehandelten Werkstoffen, insbesondere Biomaterialien, getestet werden kann und andererseits eine Quantifizie rung der Adhäsion von Mikroorganismen und (bio)chemischen Substanzen auf Oberfläche möglich ist, wobei die oben genann ten Anforderungen erfüllt sind.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung bereitzustellen, die es ermöglicht, die Prüfung so durchzu führen, daß eine große Anzahl von Proben unter identischen Bedingungen simultan untersucht werden kann.

Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung ge mäß Anspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausgestaltungen sind in den Ansprüchen 2 bis 6 angegeben.

Eine Prüfung von Werkstoffen auf antimikrobielle Wirksamkeit umfaßt:

a) Bereistellung einer Vielzahl von Werkstoffproben defi nierter Geometrie und Größe,
b) Inkubation der Probe mit einer Lösung, die den zu te stenden Mikroorganismus enthält (Besiedelung der Probe mit dem Mikroorganismus),
c) Überführung der Probe in ein für den entsprechenden Mi kroorganismus geeignetes Minimalmedium (Entfaltung der potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit) und Inkubati on,
d) Überführung der Probe in eine für den Mikroorganismus geeignete Nährlösung (Nachweis des Ausmaßes der antimi krobiellen Wirksamkeit), Inkubation und
e) Bestimmung der optischen Dichte der Nährlösung nach Ent nahme der Probe (Endpunktmessung),

oder

1. Entnahme der Probe und Zugabe von 1 bis 1/2000 Volumen anteil Vollmedium zum Minimalmedium, Inkubation,
2. zeitaufgelöste Bestimmung der optischen Dichte des Medi ums (Kinetik).

Eine Quantifizierung der Adhäsion von Antigenen auf Werkstof fen umfaßt:

a) Bereitstellen einer Vielzahl von Werkstoffproben defi nierter Geometrie und Größe,
b) Inkubation der Probe mit einer Lösung, die das zu te stende Antigen enthält,
c) Überführung der Probe in eine Blockierungslösung,
d) Überführung der Probe in eine Serumlösung und Inkubati on,
e) Überführung der Probe in eine Enzym-Konjugat-Lösung und Inkubation,
f) Überführung der Probe in eine Enzym-Substrat-Lösung und Inkubation,
g) Photometrische Vermessung der Enzym-Substratlösung nach Entnahme der Probe.

Fig. 1 veranschaulicht die Verwendungsmöglichkeiten eines "Mikrotiterplatten-Kamms"
bei den erfindungsgemäßen Verfahren.

Fig. 1a zeigt eine 96-Loch-Mikrotiterplatte.

Fig. 1b zeigt den mit Proben bestückten Deckel einer 96- Loch-Mokrotiterplatte ("Kamm").

Fig. 1c veranschaulicht die Verwendung des Deckels als Inku batonsgefäß.

Fig. 1d veranschaulicht die Verwendung des Deckels als Pro benträger.

Fig. 1e zeigt die erfindungsgemäß gemessene Fläche.

Fig. 2 zeigt die bakterielle Proliferantion, die bei der Prüfung der antimikrobiellen Wirksamkeit gemäß Beispiel, nachvollzogen wird

Fig. 3 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 1, wie sie die Software des Mikrotiterplatten-Lesegeräts darstellt.

Fig. 4 zeigt die Quantifizierung der Adhäsion gemäß Beispiel 2 schematisch.

Fig. 5 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 2, wie sie von der automatischen Auswerteeinheit dargestellt werden.

Fig. 6 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 3 (Prüfung des Ein flußes eines Tween-Coatings auf die Adhäsion von Bakterien).

Beim Verfahren zur Prüfung von Werkstoffen auf antimikrobiel le Wirksamkeit können die verschiedensten Arten von Werkstof fen getestet werden; besonders interessant ist die Verwendung von Biomaterialien, d. h. Materialien, die in der Prothetik und Intensivmedizin eine Rolle spielen. Die Proben können z. B. in Form von Kunststoff-Schläuchen, Strängen und Borsten vorliegen. Wichtig für vergleichende Aussagen ist, daß die zu vergleichenden Proben alle die gleiche Geometrie und Größe aufweisen, damit Effekte, die auf unterschiedliche Geometrie und Größe zurückzuführen wären, ausgeschlossen werden können. Die zu untersuchenden Proben können auf antimikrobielle Wirk samkeit gegenüber den unterschiedlichen Bakterien, Pilzen und Hefen getestet werden. Wichtig im medizinischen Bereich ist z. B. die Wirksamkeit gegenüber Staphylokokken.

Bei den zu untersuchenden Werkstoffproben kann es sich auch um vorbehandelte Werkstoffe handeln; unter Vorbehandlung wird z. B. auch eine Beschichtung mit Anstrichen oder Lacken aber auch mit Proteinen oder Detergenzien verstanden. Bei be schichteten Werkstoffen ist dann genaugenommen das Beschich tungsmaterial die zu untersuchende Probe. Auf diese Weise ist es z. B. möglich, auch Flüßigkeiten und Lotionen auf potenti elle antimikrobielle Wirksamkeit zu testen. Der "Werkstoff" stellt dann nur einen Träger dar; wichtig ist dabei allerdings, daß eine gleich mäßige Beschichtung erreicht wird, bevor die Probe erfindungsge mäß getestet werden kann.

Entscheidend für das Verfahren zur Prüfung der antimikrobiellen Wirksamkeit ist die Inkubation mit einem Minimalmedium zur Ent faltung und zum Nachweis der potentiellen Aktivität. Das zu ver wendende Minimalmedium hängt von dem verwendeten Mikroorganismus ab und kann individuell zusammengesetzt werden, sofern gewährlei stet ist, daß das Medium ausreicht, um den Mikroorganismus am Le ben zu erhalten aber die Zellteilungsrate stark reduziert ist. Die Inkubationszeit mit dem Minimalmedlum kann beliebig variiert werden und z. B. im Bereich von 2 bis 50 Stunden liegen.

Danach wird die Probe in eine Nährlösung ("Vollmedium") über führt, die dann einen Proliferationsreiz für den Mikroorganismus darstellt. Die Nährlösung richtet sich nach dem verwendeten Mi kroorganismus und kann entweder der Fachliteratur entnommen oder im Labor individuell zusammengestellt werden. Bei der Prolifera tion von Zellen auf Oberflächen werden vitale Zellen ins Medium entlassen, was zu einer Trübung führt. Diese Trübung (optische Dichte) kann photometrisch erfaßt werden: Je trüber das Medium ist, desto mehr vitale Zellen wurden abgegeben, d. h. desto gerin ger ist die antimikrobielle Wirksamkeit der geprüften Probe.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform wird die Probe aus dem Minimalmedium entfernt und 1 bis 1/100 Volumenanteil, bevorzugt 1 bis 1/10 Volumenanteil Vollmedium zum Minimalmedium zugegeben; danach erfolgt die zeitaufgelöste Bestimmung der optischen Dichte des Mediums (Kinetik). Die online entstehenden Wachstumskurven (EDV-überwacht) reflektieren das Ausmaß der antimikrobiellen Wirksamkeit.

Bei diesem Verfahren kann eine große Anzahl von Proben (bis 384) simultan untersucht werden, wenn Proben gleicher Geome trie und Größe in eine handelsübliche Mikrotiterplatte mit 96 bis 384 Vertiefungen oder eine entsprechende Vorrichtung ein gebracht werden. Die Bestimmung der optischen Dichte kann mit einem kommerziellen EDV-gesteuerten Mikrotiterplatten- Lesegerät erfolgen. Anstelle einer Endpunktmessung kann auch eine zeitaufgelöste online Messung erfolgen.

Durch Zugabe kleiner Mengen (1 bis 1/2000 Volumenanteil, be vorzugt 1/25 bis 1/1000 Volumenanteil) Vollmedium zum Mini malmedium kann die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfah rens weiter gesteigert werden. Dadurch wird die Vitalität der Mikroorganismen so eingestellt, daß auch geringste antimikro bielle Aktivitäten der Probe nachweisbar sind.

Die vorliegende Erfindung stellt aber nicht nur eine Vorrich tung für ein Verfahren zur Prüfung auf antimikrobielle Wirk samkeit von Werkstoffen bereit, sondern auch für ein Verfah ren zur Quantifizierung der Adhäsion von Antigenen, umfassend lebende Systeme und (bio)chemische Substanzen (z. B. Natur stoffe und synthetische Stoffe), auf Oberflächen. Mit diesem Verfahren können die gleichen Werkstoffe untersucht werden, wie vorne beschrieben. Auch hier ist es für Vergleiche zwi schen verschiedenen Werkstoffen erforderlich, daß die Werk stoffproben alle eine definierte Geometrie und Größe haben. Die Verfahrensschritte eines derartigen Verfahrens sind dem Fachmann von herkömmlichen ELISA-Tests geläufig. Wie beim herkömmlichen ELISA-Test erfolgt die Auswertung auch z. B. mit einem Photometer. Bei der Verwendung von Mikrotiterplatten als Reaktionsgefäße ist die Auswertung mit einem handelsübli chen Mikrotiterplatten-Lesegerät bevorzugt.

Abgesehen davon, daß beide Verfahren zu Werkstoffprüfung die nen, können beide Verfahren mit Hilfe der erfindungsgemäßen zweiteiligen Vorrichtung durchgeführt werden. Das Entschei dende der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Befestigung der Werkstoffproben an einem Teil der Vorrichtung ("Kamm"); die Proben sind dabei so angeordnet, daß sie alle zentriert zu den Vertiefungen des zweiten Vorrichtungsteils ausgerich tet sind und die Abmessungen der Proben an die Abmessungen der Vertiefungen angepaßt sind. Die Probenabmessungen sind dabei bevorzugt so gewählt, daß zwischen Probe und Boden der Vertiefungen ein Zwischenraum (z. B. im Falle einer Mikroti terplatte 1-2 mm) verbleibt, wenn das mit den Proben bestück te Teil ("Kamm") auf dem mit Vertiefungen versehenen Teil aufliegt. Besonders bevorzugt ist es, wenn der Zwischenraum kleiner als die Hälfte der Tiefe der Vertiefungen ist. Das mit den Proben bestückte Teil wird im folgenden als Kamm be zeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Pro ben mit Hilfe von Klebstoff befestigt. Es ist auch möglich, die Proben auf bereits vorhandene Adapter aufzustecken.

Die einheitliche Geometrie der Proben ist vorzugsweise zylin drisch; jedoch sind auch andere Formen wie bananenförmig, birnenförmig oder quaderförmig möglich, sofern alle Proben die gleiche Geometrie und Größe aufweisen. Der maximale Durchmesser der Proben ist vorzugsweise so groß wie die Hälf te des Durchmessers der Vertiefungen oder kleiner. Wenn der Kamm in Form eines Deckels mit auf der Innenseite befestigten Probenstücken vorliegt, zeichnet er sich durch eine flexible Verwendungsweise aus:
Einerseits kann er, auf dem Deckelrücken liegend, als Reakti onsgefäß benützt werden; zum anderen dient er als Trägersy stem für die Werkstoffproben, das es bei einer Folge von se quentiellen Reaktionsschritten erlaubt, alle Proben gleich zeitig von einer Lösung in eine andere zu überführen. Diese verschiedenen Verwendungsarten sind in Fig. 1c und 1d sche matisch dargestellt.

In einer bevorzugten Ausführungform handelt es sich bei dem mit den Vertiefungen versehenen Teil der Vorrichtung um eine Mikrotiterplatte, bei dem Kamm handelt es sich dann um den zugehörigen Mikrotiterplattendeckel, auf dessen Innenseite die Proben befestigt sind.

Durch die verschiedenen Verwendungsmöglichkeiten des Kamms (Trägersystem gemäß Fig. 1d einerseits und Inkubationsgefäß gemäß Fig. 1c andererseits) ist es möglich, die Genauigkeit der genannten Verfahren weiter zu erhöhen:
Wird z. B. bei dem Verfahren zur Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit die Inkubation mit der Mikroorganismen-Lösung und/oder die Inkubation im Minimalmedium so durchgeführt, daß der Kamm als Inkubationsgefäß (Fig. 1c) dient, so kommen Pro ben 1, sofern sie über den Deckelrand hinausragen (siehe Fig. 1c), nur zum Teil mit der entsprechenden Lösung in Kontakt. Im Schritt (d) wird dann das mit Vertiefungen versehene "Ge genstück" 4 des Kamms als Inkubationsgefäß verwendet, und zwar wird der Flüssigkeitspegel dabei so gewählt, daß wieder nur ein Teilstück der Proben benetzt wird. Es gibt daher nur einen mittleren Bereich 5 des Probenstückes der mit allen Lö sungen in Berührung gekommen ist (siehe Fig. 1e). Der mittle re Bereich 5 wird im folgenden auch als Meßbereich bezeich net. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß die Messung nicht durch "Randeffekte" oder Artefakte verfälscht wird. Als "Randeffekt" sind denkbar:
Beeinflußung der Mikroorganismen durch den verwendeten Kleb stoff oder Effekte durch unterschiedliche Schnittkanten am freien Ende der Proben (diese könnten als Proliferationsreiz) wirken und so das Ergebnis verfälschen). Auch Kapillarenef fekte z. B. bei Schlauchproben können mit diesem bevorzugten Verfahren vermieden werden.

Die beschriebene Arbeitsweise mit unterschiedlichem Einsatz des Kamms ist in analoger Weise auch beim dem Verfahren zur Quantifizierung der Adhäsion auf gegebenenfalls vorbehandel ten Oberflächen möglich; der Kamm wird dabei mindestens bei einem der Inkubationsschritte mit Mikroorganismen-Lösung, Blockierungslösung, Serumlösung und Enzym-Konjugat-Lösung als Inkubationsgefäß benützt, während die Enzym-Substrat-Lösung oder Waschlösung in den Vertiefungen des Kamm-Gegenstücks be reitgestellt wird.

Es ist auch möglich eine Vorbehandlung der Proben (z. B. Be schichtungen) mit dem Kamm-Modell durchzuführen. Zusätzlich kann der Kamm auch als Adapter dienen, auf dem flüssige Pro ben gebunden sind; dadurch können auch solche Proben geprüft werden.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden antimikro bielle Werkstoffe einer Kontrolle (Werkstoffe ohne antimikro bielle Wirkung) unter simultanen Versuchsbedingungen gegen übergestellt. Durch die gleichzeitige Untersuchung einer ho hen Anzahl von Proben (z. B. 96 Proben) ist eine aussagekräf tige Statistik und Fehlerrechnung möglich und das Verfahren ist außerdem sehr ökonomisch.

Die Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, daß bei allen Pro ben eine dem Messbereich entsprechende definierte gleich gro ße Fläche gemessen werden kann, wodurch vergleichende quanti tative Aussagen möglich sind.

Ein weiterer Vorteil ist, daß geringste Unterschiede in der Aktivität erfaßt werden können und das Verfahren damit hoch sensitiv ist; außerdem liegt der statistische Fehler bei Ad häsionsbestimmungen und dem Test auf antimikrobielle Wirksam keit über die zeitaufgelöste Meßvariante bei < 15%.

Die Anwenderfreundlichkeit der bereitgestellten Vorrichtung ist mit "sehr hoch" einzustufen. Die technischen Anforderun gen (Geräte, Software, Laboratorien usw.) zur Anwendung der Vorrichtung gehören zur Grundausstattung von Forschungsein richtungen und erfordern keine weiteren größeren Investitio nen. So ist z. B. die 96-Loch Mikrotiterplatte mit Deckel, die als Probengefäß dient, seit mehr als 20 Jahren Industriestan dard und die EDV-gesteuerte Analyse übernimmt ein herkömmli ches Mikrotiterplatten-Lesegerät (gleichzeitig Photometer und "Plattenreader").

Zur Markierung der Adhäsion von Biomolekülen und Bakterien auf den zu untersuchenden Biomaterialien können kommerzielle Antikörper verwendet werden.

Das Mikrotiterplatten-Kamm-Modell kann in allen Bereichen zur Anwendung gelangen, die sich mit der Entwicklung/Prüfung von Werkstoffen/Biomaterialien, auch von Arzneimitteln wie Salben und Lotionen und Oberflächebeschichtungen in Form von Anstri che, Lacken etc. oder Detergenzien, befassen oder die Wech selwirkungen einer Matrix mit Mikroorganismen studieren (Ad häsion), z. B. in der Großindustrie, der Biomedizin und Phar maindustrie, in mittelstädtischen Industrieunternehmen, der Lebensmittelindustrie.

In Hochschulen, sowie in Forschungseinrichtungen für angewandte Forschung und Grundlagenforschung. Die Verfahren können bei der Produktentwicklung, -verbesserung und Qualitätskontrolle einge setzt werden.

Es ist denkbar, die erfindungsgemäße Vorrichtung auch für andere Untersuchungen einzusetzen, bei denen es nicht um die Adhäsion von Mikroorganismen wie Bakterien, Pilzen, Viren und Hefen geht, sondern um die Untersuchung der Adhäsion von Naturstoffen wie Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden und Zuckern, eukaryontischen Zellen, Algen oder sonstiger Chemikalien. Insbesondere kann der Einfluß von Oberflächenbeschichtungen untersucht werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit von Biomaterialien (Beispiel 1) und die Quantifizie rung der Adhäsion von Biomolekülen auf Werkstoffoberflächen (Bei spiel 2) mit Hilfe des Mikrotiterplatten-Kamm-Modells. Beispiel 3 zeigt den Einfluß eines Detergenz-Coatings bei einem Werkstoff auf die Adhäsion von Bakterien.

In der Klinik für Kinder und Jugendliche der Universität Erlan gen-Nürnberg wird seit ca. 5 Jahren an der Entwicklung neuer Ka thetermaterialien mit antimikrobieller Wirksamkeit gearbeitet (siehe oben zur Problematik der Katheterinfektionen). Durch Ein bringung von Silber in das aus Polyurethan bestehende Katheter material wurde ein neues antimikrobielles Biomaterial entwickelt. Mit dem Mikrotiterplatten-Kamm-Modell wurde der neue Katheter- Werkstoff auf antimikrobielle und antiadhäsive Eigenschaften ge prüft und Kontrollkathetern gegenübergestellt (silberfreie kom merzielle Katheter).

Beispiel 1 Prüfung der antimikrobiellen Wirksamkeit von Katheteroberflächen gegenüber Staphylokokkus epidermidis (humane Bakterien)

Es wurden folgende Arbeitsschritte durchgeführt:

1. Kammherstellung: 6 Proben "Kontrollkatheter" (Polyurethan ohne Silber) und 6 Proben "Silberkatheter" (Polyurethan mit einge brachtem Silber) wurden so auf einen Deckel einer Mikrotiter platte geklebt, daß die Proben genau in die Mitte der Vertiefun gen der Mikrotiterplatte ragten. Die Proben waren zylinderförmig mit einer Länge von 1,1 cm und einem Durchmesser von 2 mm.
2. Füllen des Kamms mit 60 ml Bakterienlösung (10⁸ logphase Zel len pro ml Vollmedium wurden 1 : 20 mit physiologischem Phosphat puffer, pH 7.3 verdünnt).
3. Inkubation bei 37C für 60 Minuten im Brutschrank (Besiedelung der Proben mit den Bakterien).
4. Absaugen der Bakterien und 4-maliges Waschen des Kamms mit physiologischem Phosphat-Puffer pH 7,3.
5. Setzen des Kamms in eine mit "Minimal-Medium" gefüllte Mikro titerplatte (250 µl/Loch), Inkubation bei 37C für 24 Stunden im Brutschrank zur Silbereinwirkung (Entfaltung einer potentiell antimikrobiellen Aktivität).
6. Nach mehrmaligem Waschen mit physiologischem Phosphat-Puffer pH 7,3 Überführung des Kamms in eine mit sterilem Bakterien- Vollmedium (Trypcase Soya Medium) gefüllten Mikrotiterplatte, Inkubation bei 37C für 24 Stunden, Nachweis der bakteriellen Proliferation auf den Kathetern.
7. Entnahme des Kamms, Messen der Mikrotiterplatte (optische Dichte) im Photometer (Endpunktmessung bei 578 nm).

Als Minimal-Medium wurde kommerzieller physiologischer Phoshat- Puffer (PBS) mit folgenden Zusätzen verwendet:

- 0,25% Glucose
- 0,2% (NH₄)₂SO₄
- Zusatz von 1/100 Volumenanteil kommerzielles Trypcase-Soja- Vollmedium

Es wurde gefunden, daß bei allen 6 Proben des Kontrollkatheters eine bakterielle Proliferation feststellbar war. Die optische Dichte lag zwischen 0,4 und 0,8 (Endpunktmessung gemessen bei 578 nm) Der Katheter zeigte keine antibakterielle Wirksamkeit.

Dagegen war bei allen sechs Proben des Silberkatheters eine bak terielle Proliferation nicht zu erkennen. Die optische Dichte war 0,0. Der Katheter zeigte somit antibakterielle Wirksamkeit.

Fig. 2 erläutert schematisch die bakterielle Proliferation 6, wie sie im Mikrotiterplatten-Kamm-Modell nachvollzogen wird. Es ist ein Deckel einer Mikrotiterplatte 2 mit einer aufgeklebten Katheterprobe 1 sowie eine an das Medium abgegebene vitale Zelle 7 gezeigt.

Die Fig. 3 zeigt den Ausdruck der Ergebnisse von Beispiel 1, wie er vom EDV-gesteuerten Mikrotiterplatten-Lesegerät erhalten wird.

Beispiel 2 Quantifizierung der Adhäsion z. B. von Zellen auf Werkstoffoberflächen mit Hilfe eines ELISA-Tests

Es wurden folgende Arbeitsschritte durchgeführt:

1. Kammherstellung: 6 Proben Kontrollkatheter, 6 Proben Silber katheter (wie in Beispiel 1).
2. Füllen einer 96-Loch Mikrotiterplatte mit der gleichen Bakte rienlösung wie in Beispiel 1 (250 µl pro Loch).
3. Setzen des Kamms in die Platte und Inkubation bei 37C für 60 Minuten im Brutschrank.
4. Entnahme des Kammes und viermaliges Waschen mit PBS.
5. Überführung des Kamms in eine mit Blockierungslösung (0,3% Magermilch in PBS-Puffer pH 7.3) gefüllten Mikrotiterplatte, In kubation bei 22C für 60 Minuten.
6. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS Überführung des Kamms in eine mit Serum (Anti-Staphylokokken-Kaninchenserum, 1 : 1000 verdünnt mit Blockierungslösung) gefüllten Mikrotiterplatte, Inkubation bei 22C für 120 Minuten.
7. Mehrfaches Waschen des Kamms in Pufferlösung.
8. Füllen des Kamms mit 80 ml einer sekundären Antikörper Lösung (kommerzielles Enzym-Konjugat, 1 : 2000 verdünnt mit Blockierungs lösung), Inkubation bei 22C für 120 Minuten.
9. Vierfaches Waschen des Kamms in Pufferlösung.
10. Setzen des Kamms in eine mit kommerziellem Enzym-Substrat ge füllten Mikrotiterplatte (230 µl pro Loch), Inkubation bei 22C bis Verfärbung sichtbar wird.
11. Entnahme des Kamms, Messen der Mikrotiterplatte im Photometer bei 405 nm.

Es wurde festgestellt, das der Silberkatheter im Vergleich zum silberfreien kommerziellen Kontrollkatheter eine 5-fach geringere Adhäsion von Bakterien am Material zeigte.

Die oben aufgeführten Arbeitsschritte entsprechen im Prinzip den in der Routine durchgeführten Arbeitsschritten bei immunologi schen Reaktionen (ELISA-Tests).

Die von dem EDV-gesteuerten Mikrotiterplatten-Lesegeräts erhalte nen Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Fig. 4 erläutert schema tisch die immunologischen Reaktionen zur Quantifizierung der Ad häsion von Bakterien auf dem Biomaterial im Mikrotiterplatten- Kamm-Modell; im einzelnen sind die auf dem Deckel der Mikrotiter platte 2 befestigte Katheterprobe 1, ein daran haftendes Bakte rium 8, sowie ein primärer 9 und ein sekundärer Antikörper 10, wie sie im ELISA-Test verwendet wurden, gezeigt.

Beispiel 3 Prüfung der Adhäsion von Bakterien bei vorbehandelten Biomaterialien

Es wurden folgende Arbeitsschritte durchgeführt:

1. Kammherstellung: je 8 Proben von 11 verschiedenen Katheterma terialien, die sich im Ag-Gehalt unterscheiden, (Herstellung siehe Beispiel 1).
2. 44 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit Wasser ge füllt, 44 weitere Vertiefungen mit einer 0,1%igen Lösung von po lyethoxyliertes Sorbitanmonolaurat (Tween 20) in Wasser.
3. Setzen des Kamms in die Platte und zwar so, daß 4 Proben eines Kathetermaterials in Wasser inkubiert werden und 4 Proben des gleichen Materials in der Tween-Lösung, Inkubation bei 22C für 60 Minuten.
4. Entnahme des Kamms und waschen.

Die weiteren Schritte werden wie bei Beispiel 2 beschrieben (Schritte 2 bis 11) durchgeführt.

Fig. 6 zeigt graphisch die Ergebnisse, d. h. die Mittelwerte der jeweils 4 Proben gleichen Materials mit bzw. ohne Tween Vorbehandlung (d. h. "coating"). Bei allen 11 Materialien ist zu er kennen, daß bei Tween-coated Kathetern die bakterielle Adhäsion deutlich geringer ist als bei nicht-beschichteten Kathetern.

Claims

1. Vorrichtung zur Prüfung von Werkstoffproben, bei welcher Prüfung die Werkstoffproben mit einer Testlösung benetzt wer den, mit
einem ersten deckelförmigen Teil (2), auf welchem eine Vielzahl von zu untersuchenden zylinderförmigen Werkstoff proben (1) mit gleichen Abmessungen befestigt ist und
einem zweiten Teil (4) mit einer gleichen Vielzahl von Vertiefungen, die jeweils gleiche Abmessungen aufweisen
wobei die Werkstoffproben (1) so angeordnet sind, dass sie alle zentriert zu den Vertiefungen des zweiten Teils (4) ausgerichtet sind und in diese Vertiefungen eingreifen,
dadurch gekennzeichnet, dass in der Mitte in der Längsaus dehnung der Werkstoffproben der Messbereich (5) festgelegt ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Messbereich (5) so festgelegt ist, dass er bei Benutzung beider Teile (2, 4) als Inkubationsgefäß von der Testlösung bedeckt wird.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, dass die Werkstoffproben (1) aufgeklebt sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, dass die Werkstoffproben (1) mittels eines Adapters auf gesteckt sind.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da durch gekennzeichnet, dass es sich beim zweiten Teil (4) um eine Mikrotiterplatte und beim ersten Teil (2) um einen dazu passenden Deckel handelt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel Probenträger und Inkubationsgefäß ist.

7. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Prüfung von gegebenenfalls vorbehandelten Werkstoffen auf antimikrobielle Wirksamkeit und Adhäsion von Antigenen.

8. Verwendung gemäß Anspruch 7 in einem Untersuchungsverfah ren zur simultanen Prüfung von Werkstoffproben (1) auf anti mikrobielle Wirksamkeit, gekennzeichnet durch folgende Ver fahrensschritte

a) Bereitstellung einer Vielzahl Werkstoffproben (1) vorgegebener Geometrie und Größe,
b) Bereitstellung eines ersten deckelförmigen Teils (2), auf dem die Werkstoffproben (1) fixiert sind,
c) Inkubation der Werkstoffproben (1) mit einer Lö sung, die einen zu testenden Mikroorganismus enthält,
d) Überführung der Werkstoffproben (1) in ein für den Mikroorganismus geeignetes Minimalmedium und Inkubation der Werkstoffproben (1),
e) Überführung der Werkstoffproben (1) in eine für den Mikroorganismus geeignete Nährlösung und In kubation der Werkstoffproben (1),
f) Bestimmung der optischen Dichte der Nährlösung nach Entnahme der Werkstoffproben (1) oder
g) Entnahme der Werkstoffproben (1) und Zugabe ei nes angemessenen Volumenanteils Vollmedium zum Minimalmedium, vorzugsweise 1 bis 1/2000, Inku bation und
h) zeitaufgelöste Bestimmung der optischen Dich te des Mediums.

9. Verwendung gemäß Anspruch 8 in einem Untersuchungsverfah ren zur simultanen Prüfung von verschiedenen Wirksubstanzen, wobei die Werkstoffproben (1) vorbehandelte Werkstoffproben sind.

10. Verwendung gemäß Anspruch 7 in einem Untersuchungsverfah ren zur simultanen Prüfung von Werkstoffproben (1) auf Adhä sion von Antigenen, gekennzeichnet durch folgende Verfahrens schritte:

a) Bereitstellen einer Vielzahl von Werkstoffproben (1) vorgegebener Geometrie und Größe,
b) Bereitstellen eines ersten deckelförmigen Teils (2), auf dem die Werkstoffproben (1) fixiert sind,
c) Inkubation der Werkstoffproben (1) mit einer Lösung, die ein zu testendes Antigen enthält,
d) Überführung der Werkstoffproben (1) in eine Blockie rungslösung und Inkubation,
e) Überführung der Werkstoffproben (1) in eine Serumlö sung und Inkubation,
f) Überführung der Werkstoffprobe (1) in eine Enzym- Konjugat-Lösung und Inkubation,
g) Überführung der Werkstoffproben (1) in eine Enzym- Substrat-Lösung und Inkubation,
h) Photometrische Messung der Enzym-Substrat-Lösung nach Entnahme der Werkstoffproben (1).