DE69816663T2 - Vorrichtung zur bestimmung von analyten in lösungen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Assaytechnik, und insbesondere Ausführungsformen, Vorrichtungen und Verfahren zur Quantifizierung von Analyten, z. B. biologischem Material, in einer Probe.
  • Viele Industrien müssen die Konzentration und den Gehalt biologischen Materials oder anderer Analyten in einer Probe nachweisen und quantifizieren. Zum Beispiel ist die Bestimmung der Bakterienkonzentration in Nahrungsmitteln und Wasser ein wesentlicher Teil der Nahrungsmittel- und Wasserqualitätsuntersuchung. EPA-Regelungen verlangen, dass keine Coliforme wie etwa Escherichia coli in Trinkwasser anwesend sein dürfen. Das „Abwesenheit/Anwesenheit"-Format eines Testmediums wie Colilert®-chemische-Mischung (IDEXX Laboratories, ME), die als Testmedium für Escherichia coli und alle coliformen Bakterien verwendet wird, ist sehr nützlich zur Durchführung dieser Bestimmung. Colilert®-chemische-Mischung basiert auf der Defined-Substrate-Technologie, die bei Edberg, „Method and Medium for use in Detecting Target Microbes In Situ in A Specimen Sample of A Possibly Contaminated Material," U.S. Patent Nr. 4,925,789 und 5,492,933 beschrieben wird.
  • Es gibt jedoch Bereiche, wo die Quantifizierung, nicht nur der Nachweis, der Bakterienkonzentration wichtig ist. Beispiele für diese Bereiche schließen Abwasser, Zuflusswasser zu Wasserreinigungssystemen, Oberflächenwasser und Nahrungsmitteluntersuchung ein. Zum Beispiel wollen zahlreiche Restaurantketten nur rohes Rinderhack oder Geflügel akzeptieren, das weniger als eine bestimmte Konzentration bakterieller Verunreinigung enthält. Daher müssen nahrungsmittelverarbeitende Betriebe die notwendigen mikrobiologischen Tests durchführen, um die Bakterienkonzentration dieser Nahrungsmittel, bevor sie Kunden überlassen werden können, zu bestimmen.
  • Die klassischen Verfahren zur Quantifizierung biologischen Materials sind das Standard-Platten-Zähl-Verfahren oder das Mehrfach-Röhrchen-Fermentations-Verfahren (multiple tobe fermentation, MTF). Eine auf Mikrobenverunreinigung zu testende Probenmenge wird zuerst in einer Petrischale verteilt. Dann werden 15 ml der geeigneten Medien über die Probe gegossen. Die Petrischale wird dann geschüttelt, um die Probe im Medium zu mischen und die Petrischale wird zum Festwerden bei Raumtemperatur für ungefähr 20 Minuten stehengelassen. Das Medium wird dann bei einer spezifischen Temperatur für eine spezifische Zeit inkubiert und irgendwelche resultierende Kolonien werden gezählt.
  • Das Mehrfach-Röhrchen -Fermentationsverfahren wird bei Recles et al., „Most Probable Number Techniques", veröffentlicht in „Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods", 3. Aufl. 1992, auf den Seiten 105–199, und bei Greenberg et al., "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater" B. Aufl. 1992 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird ein Probenvolumen auf mehrere Röhrchen, die diesen Verdünnungsbereich repräsentieren, verteilt. Die Röhrchen werden dann bei der geeigneten Temperatur inkubiert, so dass die Bakterien in jedem Röhchen wachsen können. Nach Inkubation bei einer spezifischen Temperatur für eine spezifische Zeit wird die Anzahl der Röhrchen mit positivem Ergebnis gezählt. Die wahrscheinlichste Anzahl kann mit der bei Recles et al., siehe oben, beschriebenen Formel bestimmt werden.
  • Eine Wasseruntersuchung wird hauptsächlich mittels Membranfiltration durchgeführt, wobei ein bestimmtes Wasservolumen durch die Membran fließt und die Membran in einem Medium für eine bestimmte Zeitspanne inkubiert wird. Nach entsprechender Inkubation werden die Kolonien gezählt.
  • In vielen Industrien besteht auch ein Bedarf, die Anwesenheit eines Analyten in einer flüssigen Lösung qualitativ und/oder quantitativ nachzuweisen. Zum Beispiel kann der Nachweis anorganischer Ionen in einem Herstellungsprozess, der eine Testlösung verwendet, wichtig sein.
  • Bisher haben die Verfahren und Vorrichtungen, die üblicherweise auf das Messen eines Analyten in Lösung beruhen, entweder das Entfernen eines ganzen Aliquots aus einer Testlösung oder das Eintauchen eines Tauchstabes in eine Testlösung erfordert. Obwohl diese Verfahren und Vorrichtungen einen Analyten in Lösung nachweisen können, habe sie eine Reihe von Nachteilen.
  • Die Tauchstab-bezogenen Verfahren sind nicht quantitativ. Zum Beispiel besitzen die üblichen Tauchstabausführungen nicht die Fähigkeit zur Bestimmung oder Quantifizierung der Anwesenheit eines Analyten in einer Volumeneinheit dieser Lösung. Stattdessen wird der Tauchstab einfach mit der Testlösung in Kontakt gebracht.
  • Andere Verfahren erfordern einen Anwender, der manuell ein Aliquot aus der Testlösung entfernt und es in eine separate Vorrichtung zum Nachweis oder Quantifikation des Analyten überführt.
  • Ungeachtet der Fähigkeit dieser Verfahren und Vorrichtungen, einen Analyten in Lösung nachzuweisen, haben die derzeit verwendeten Verfahren und Vorrichtungen gezeigt, dass sie eine eingeschränkte Genauigkeit besitzen, und/oder kostspielig, kompliziert, zeitaufwändig sind, und/oder aufgrund der besonderen Assaytechnik einen eingeschränkten Anwendungsbereich haben.
  • Daher besteht ein Bedarf an einem einfachen, genauen und preiswerten Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Lösung ohne die im Stand der Technik bekannten Nachteile.
  • Insbesondere besteht ein Bedarf an Vorrichtungen und Verfahren, die eine quantitative Assay eines Analyten in einem bestimmten Volumen einer Lösung liefern können.
  • Das Dokument US-A-4197287 offenbart eine Vorrichtung, die ein Röhrchen mit offenen Enden und eine Trägerstruktur mit einem Reagenz zum Nachweis eines Analyten umfasst.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Vorrichtungen zum Nachweis und Auszählen der Anwesenheit oder Abwesenheit biologischer Materialien, Analyten und Mikroorganismen in Probenlösungen entsprechend den Ansprüchen 1, 11 und 18 bereit.
  • In einem Aspekt beschreibt die Erfindung eine Vorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit oder Menge von (einem) Analyten oder Mikroorganismen(-us) in einer Testlösung. Die Vorrichtung weist eine im wesentlichen hydrophobe Trägerstruktur mit mindestens einer Reagenzinsel, die auf der Trägerstruktur immobilisiert ist und die ein vorbestimmtes Volumen einer Testlösung absorbieren kann, auf. Die Vorrichtung umfasst auch Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge des Analyten oder Mikroorganismus, wobei die Mittel auf oder innerhalb der Reagenzinsel(n) angeordnet sind. Dieser Aspekt der Erfindung kann die Form eines Kunststoff- oder Polymertauchstabes mit einer oder mehreren darauf immobilisierten Reagenzinsel(n) annehmen. Die Reagenzinsel kann aus irgendeinem saugfähigen Material, z. B. Cellulose, hergestellt sein.
  • Die Trägerstruktur kann auf ihr immobilisierte Mehrfach-Reagenzinseln aufweisen. Die Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Mikroorganismen oder (einem) Analyten können ein Pulver, das auf oder in das Material, aus dem die Reagenzinseln hergestellt sind, inkorporiert ist, umfassen. Die Mittel können ein Reagenz oder eine Kombination von Reagenzien, die zur Erzeugung eines detektierbaren Signals führen, wenn Zielanalyt(en) oder Mikroorganismus(-en) anwesend sind, sein. Die Vorrichtung kann Mehrfach-Reagenzinseln, die verschiedene Reagenzien oder Kombinationen von Reagenzien enthalten können, enthalten, so dass zahlreiche Assays auf einer einzelnen Vorrichtung durchgeführt werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Reagenzinseln aus einem saugfähigen Material, z. B. Cellulose. Die Trägerstruktur kann aus Kunststoff, Polymer oder irgendwelchen geeigneten Materialen, auf denen eine Reagenzinsel aufgebracht werden kann und die nicht mit der dem Assay Wechselwirken, hergestellt sein. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Vorrichtung auch einen Container zum Halten der Trägerstruktur vor, während und nach der Durchführung des Assay. Der Container wird üblicherweise ein Teströhrchen umfassen und kann ferner eine Kappe für das Teströhrchen umfassen, um die Vorrichtung ferner zu schützen.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Analysevorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von (einem) Analyten oder Mikroorganismen(-us) in einer Probe bereit, die eine im wesentlichen hydrophobe, feste Trägerstruktur mit mindestens einer auf ihr immobilisierten diskreten Reagenzinsel, die ein vorbestimmtes Volumen einer Testlösung absorbieren und festhalten kann, umfasst.
  • Angebracht auf oder innerhalb der Reagenzinsel ist ein Mittel zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Zielanalyten oder Mikroorganismus. Die Vorrichtung umfasst ferner einen Container, der an entgegengesetzten Enden offen ist. Der Container hat die Form einer Pipette. Dieser Aspekt der Erfindung kann eine der verschiedenen Ausführungsformen, die in Bezug auf die oben beschriebene Vorrichtung beschrieben sind, umfassen. Die Reagenzinseln können auch in Zonen angeordnet sein, so dass jede Zone einen separaten Assay bereitstellt. Die Reagenzinseln können so angepasst sein, daß sie Flüssigkeits-Aliquote durch Oberflächenspannung oder durch Absorption zurückzuhalten. Die Vorrichtung kann üblicherweise einen langgezogenen Streifen umfassen. Das Reagenz, das von den Reagenzinseln umfasst wird, kann ein Wachstumsmedium oder Indikatorwachstumsmedium sein. Das Reagenz kann auch ein Enzym oder ein Enzymsubstrat sein.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Analysevorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von (einem) Analyten oder Mikroorganismen(-us) in einer Probe bereit, die eine feste Trägerstruktur mit mindestens einer darauf immobilisierten Reagenzinsel umfasst. Jede Reagenzinsel ist so angepasst, ein Flüssigkeits-Aliquot aufzunehmen und ist von einer Größe und Form und aus einem Material hergestellt, das geeignet ist, das Aliquot innerhalb der Reagenzinseln festzuhalten. Mindestens eine der Reagenzinseln enthält mindestens ein Reagenz zum Nachweis der(des) fraglichen Analyten und/oder Mikroorganismen(-us). Die Vorrichtung liefert keine positive Antwort für die (den) Analyten oder Mikroorganismen(-us), wenn der(die) Analyt(en) oder Mikroorganismus(-en) in der Testprobe nicht anwesend ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Reagenzinseln der Vorrichtung ein vorbestimmtes Gesamtvolumen aufnehmen. In einer Ausführungsform kann die Vorrichtung eine Kombination von Reagenzien, die in separaten Reagenzinseln untergebracht sind, umfassen. In einer anderen Ausführungsform werden die Reagenzinseln in Zonen angeordnet, wobei jede Zone einen separaten Assay bereitstellt, so dass Mehrfach-Assays auf einer einzelnen Vorrichtung durchgeführt werden können. Die Reagenzinseln können so angepasst sein, dass sie Aliquote einer Flüssigprobe durch Oberflächenspannung oder durch Absorption zurückzuhalten. Die Reagenzinseln können so angepasst sein, dass jede gleiche Flüssigkeitvolumen aufnimmt. Oder die Reagenzinseln können aus Untereinheiten von Inseln bestehen, wobei jede Untereinheit aus mindestens einer Insel besteht und jede Untereinheit von den anderen Untereinheiten abweichende Volumen aufnimmt. Die Vorrichtung kann so konstruiert sein, dass die Reagenzinseln auf mehr als einer Oberfläche immobilisiert sind. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Vorrichtung ein Plättchen oder ein langgezogener Streifen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Trägerstruktur aus einem hydrophoben Material hergestellt sein. In einer Ausführungsform kann das mindestens eine Reagenz ein Wachstumsmedium sein. In einer spezifischen Ausführungsform kann das Wachstumsmedium ein Indikatorwachstumsmedium sein. In verschiedenen Ausführungsformen kann das mindestens eine Reagenz Zellen von mindestens einer Bakterienart, ein Enzym oder ein Enzymsubstrat sein.
  • Ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung, die nützlich zum Nachweis von (einem) Analyten oder Mikroorganismen(-us) in einer Testlösung ist, wird offenbart, wobei das Verfahren die Schritte 1) Bereitstellen eines Materials, das ein vorbestimmtes Flüssigkeitsvolumen pro Materialmenge absorbieren kann; 2) Herstellen mindestens einer Reagenzinsel aus dem Material; 3) Kombinieren des Materials mit Mitteln zum Nachweis der Anwesenheit oder Menge eines Analyten oder Mikroorganismus; und 4) Befestigen der Reagenzinsel auf einer im wesentlichen hydrophobe Trägerstruktur umfasst.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann der Herstellungsschritt das Herstellen von Mehrfach-Reagenzinseln umfassen. In einer anderen Ausführungsform können die Reagenzinseln geeignet sein, ein vorbestimmtes Lösungsvolumen zu absorbieren.
  • Ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten oder Mikroorganismusses in einer Testprobe wird offenbart, das die Schritte 1) In-Kontakt-bringen der Testprobe mit mindestens einer Reagenzinsel, die ein vorbestimmtes Volumen einer Testlösung absorbieren kann und die auf einer Trägerstruktur immobilisiert ist, und die Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit eines an oder in der(den) Reagenzinsel(n) angebrachten Analyten oder Mikroorganismusses umfasst; 2) Abtrennen der Testprobe von der(den) Reagenzinsel(n), nachdem die Reagenzinsel(n) eine vorbestimmte Probenmenge absorbiert hat(haben); 3) Unterwerfen der Reagenzinsel(n) den Reaktionsparametern, die die Entwicklung des Reagenzes und Generierung eines empfindlichen Signals erlauben; und 4) Bestimmen der Anwesenheit oder Menge eines Analyten oder Mikroorganismus umfasst.
  • Ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten oder Mikroorganismusses in einer Testprobe wird offenbart, das die Schritte 1) Auswählen einer Testlösung für den Nachweis des Analyten oder Mikroorganismus; 2) Bereitstellen einer Vorrichtung, die eine im wesentlichen hydrophobe Trägerstruktur und mindestens eine auf der Trägerstruktur immobilisierte Reagenzinsel umfasst und die ein vorbestimmtes Volumen der Testlösung absorbieren kann, und die Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von (einem) Analyten oder Mikroorganismen(-us) umfasst; 3) In-Kontakt-bringen der Vorrichtung mit der Testlösung für eine Zeit, die ausreichend ist, der (den) Reagenzinsel(n) zu ermöglichen, das vorbestimmte Volumen zu absorbieren; und 4) Zulassen, daß die Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von (einem) Analyten oder Mikroorganismen(-us) die Anwesenheit oder Menge des(der) Analyten oder Mikroorganismus bestimmen. In einer Ausführungsform kann der Schritt des Kontaktierens das Einbringen der Vorrichtung in die Testlösung und das Entfernen dieser aus der Testlösung einschließen. In einer anderen Ausführungsform kann der Schritt des Bereitstellens das Bereitstellen von Bestimmungsmitteln umfassen, die ein Reagenz, das ein empfindliches Signal erzeugt, das die Anwesenheit oder Menge von (einem) Analyten oder Mikoorganismen(-us) anzeigt, umfassen. In einer anderen Ausführungsform kann der Schritt des Zulassens umfassen, die Vorrichtung Reaktionsparametern, die geeignet sind, die Entwicklung des Reagenzes zuzulassen, zu unterwerfen. Ein weiterer Schritt kann dem Verfahren zugefügt werden, der das Beobachten der Bestimmungsmittel oder einen Schritt zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von (einem) Analyten oder Mikroorganismen(-us) oder einen Schritt zur Bestimmung der Quantität des Analyten oder Mikroorganismusses umfasst.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine Aufsicht einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die als einzelne Assay-Tauchstab-Vorrichtung verwendbar ist;
  • 2 ist eine Seitensicht von 1;
  • 3 ist eine vierte Ausführungsform der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, die als Tauchstab-Assay-Vorrichtung mit Mehrfach-Reagenzinseln verwendbar ist;
  • 4 zeigt die Vorrichtung aus 3, in der Mehrfach-Assays zur Anwendung kommen;
  • 5 ist eine perspektivische Ansicht der fünften Ausführungsform der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, in der eine Tauchstab-Assay-Vorrichtung mit zwei Flächen mit Mehrfach-Reagenzinseln darauf in ein Röhrchen mit einer Kappe darauf entfernbar einschiebbar ist;
  • 6 ist eine perspektivische Ansicht einer sechsten Ausführungsform der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, in der eine Mehrzahl an Reagenzinseln auf mehr als einer Fläche auf einem Stab angeordnet sind und in ein Röhrchen mit einer entfernbaren Kappe darauf entfernbar angeordnet werden können; und
  • 7 ist eine perspektivische Ansicht einer siebten Ausführungsform der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, in der eine Laborpipette einen langgezogenen Stab mit einer Mehrzahl an Reagenzinseln auf einer oder mehreren Seiten darauf enthält.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Definitionen
  • „Mikroorganismus" – Mikroorganismen meint jede Mikrobe einschließlich Bakterien, Pilze oder Protisten.
  • „Bakterien" – alle Organismen, die zum Reich der Monera gehören.
  • „Biologisches Material" – jedes Material, das von einem biologischen Organismus abgeleitet ist.
  • „Zielorganismus" – jeder „Mikroorganismus", vorzugsweise, aber nicht beschränkt auf E. coli, Hefe und/oder Schimmelpilz.
  • „Zelle" – jede Zelle, die in einer Pflanze, Tier, Bakterien oder irgendeinem anderen lebenden Organismus gefunden wird.
  • „Analyt" – jedes Atom oder Molekül oder Ion, das am zellularen Metabolismus in einem lebenden Organismus beteiligt ist.
  • „Zielanalyt" – jeder „Analyt", bevorzugt aber nicht beschränkt auf Metaboliten und/oder Enzyme.
  • „Proteinöses Material" – Proteine, Peptide, Enzyme oder Aminosäuren.
  • „Hydrophob" – einen ausreichenden Grad an Hydrophobizität zu haben, um „Crosstalk" oder Verbinden von Flüssigkeiten wie etwa Proben oder Reagenzien zwischen angrenzenden Inkubationszellen, -vertiefungen oder -inseln vorzubeugen.
  • Aufbau
  • Ein einfacheres Verfahren zur genauen Quantifizierung der Anzahl von Mikroorganismen in einer Probe oder zur Quantifizierung eines anderen Analyt-Typs, wie etwa diskretem teilchenförmigen biologischen Material in einer Probe, wird offenbart. Ein solches biologisches Material schließt Pilze oder andere lebende Organismen als auch Protein-Aggregate wie etwa Enzyme oder auch Co-Faktoren, die Reaktionsmischungen verwenden, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, ein. Die Erfindung macht allgemein Gebrauch von einem neuen Artikel, der entworfen wurde, um ein vorbestimmtes Volumen einer Flüssigprobe aufzunehmen und festzuhalten und ein Reagenz oder Reagenzien für dieses Probenvolumen bereitzustellen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das vorbestimmte Volumen in eine Mehrzahl Probenaliquote geteilt. Die Mehrzahl Probenaliquote können alle das gleiche Volumen haben oder können Sätze von Aliquoten sein, wobei jeder Satz Aliquot ein abweichendes Volumen enthält.
  • Beispiel 1 (außerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung): Gebrauch einer Inkubationsplatte für Bulktests
  • Zur Gesamtplattenzählung wird eine Platte (außerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung) zum Nachweis und zur Quantifizierung der Gesamtbakterienkonzentration von Nahrungsmitteln verwendet. Es kann auf einer Mehrfach-Enzymtechnik, die die Enzymaktivität mit der Anwesenheit von lebensfähigen Bakterien in Nahrungsmitteln korreliert, basieren. Es nutzt Mehrfach-Enzymsubstrate, die eine blaue fluoreszierende Farbe erzeugen, wenn sie durch Bakterien metabolisiert werden. Das Mehrfach-Enzymreagenz wird auf die innere Oberfläche der Plattenvertiefungen beschichtet. Wenn eine verflüssigte präparierte Nahrungsmittelprobe in die Plattenvertiefungen wie hier beschrieben verteilt wird, kann die Gesamtkonzentration der lebensfähigen Bakterien dieses Nahrungsmittels nach 24 Stunden Inkubation bestimmt werden. Das gegenwärtig hier verwendete Medium ist für die Erfindung nicht entscheidend, sondern wird nur für illustrative Zwecke bereitgestellt.
  • Tauchstab-Testvorrichtung für Mikroorganismen Nachweis und Auszählung
  • Bezugnehmend auf 1–6 ist das Konzept, kleine individuelle saugfähige Materialien zu verwenden, die lyophylisiertes oder ein „tauchgetrockentes" Reagenz in einer Anordnung enthalten, die eine automatische Probenverteilung und Zielmikroorganismus-Auszählung ermöglicht.
  • Eine Anzahl reagenzhaltiger saugfähiger (hydrophiler) Materialien („Reagenzinseln") wird auf einer aus einem hydrophoben Material hergestellten Trägerstruktur immobilisiert, um individuelle Reagenzinseln zu bilden. Die Reagenzinseln können zum Beispiel in die Trägerstruktur eingebettet sein. Jedoch sollte dies nicht einschränkend ausgelegt werden, da jede Form der Befestigung der Reagenzinseln auf der Trägerstruktur verwendet werden kann, solange sie nicht mit dem Assay in Wechselwirkung tritt. Die Flüssigkeits-Absorbierrate jeder Reagenzinsel in dieser Ausführungsform ist die gleiche, da die Reagenzinseln aus dem gleichen Material hergestellt sind und die gleiche Größe haben. Weitere Konfigurationen können vorgenommen werden, um zwei oder mehr Gruppen von Reagenzinseln in verschiedenen Größen zu erhalten, die eine Anordnung bilden, die dazu verwendet werden kann, eine höhere Mikroorganismus-Quantifizierung Ahne serielle Verdünnung auf Basis der Prinzipien des Most-Probable-Number-Verfahren (MPN), zu erreichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reagenz eines, das entwickelt wurde, um die Anwesenheit eines Zielorganismus in einer Probe unter Verwendung, jedoch nicht darauf beschränkt, der Defined-Substrate-Technologie (DST) und/oder der Mehrfach-Enzym-Technologie (MET) zu untersuchen. Ein positiver Nachweis von Mikroorganismen in derartigen Reagenzien wird einen Farbwechsel des Reagenzes verursachen und/oder die Emission eines fluoreszierenden Signals des Reagenz beim Betrachten unter einer langwelligen UV-Lampe verursachen. Beispiele solcher Reagenzien sind Colilert®, EnterolertTM, Simplate TPCTM und Simplate CEcTM.
  • Das Proben-Inoculum wird auf Basis der maximalen Absorbierrate (Sättigungspunkt) einer Reagenzinsel und der Gesamtanzahl an Reagenzinseln auf einer Vorrichtung, vorausberechnet. Wenn die vorbestimmte Menge einer Flüssigkeitsprobe (z. B. Wasser, Milch, Saft und Nahrungsmittelhomogenate) auf diese Vorrichtung angeimpft wird, absorbiert jede Reagenzinsel die gleiche Probenmenge. Die Probe kann auf jede Reagenzinsel durch einfaches Bewegen der Vorrichtung in vor-zurück oder kreisender Bewegung verteilt werden. Der Bereich zwischen jeden Reagenzinseln ist so hydrophob, dass keine Probe zwischen den Reagenzinseln zurückbleibt und zwischen Reagenzinseln eine Kreuzkontamination verhindert wird, wenn jede Reagenzinsel eine Probe bis zu ihrem Sättigkeitspunkt absorbiert. Die durch die Reagenzinseln absorbierte Flüssigprobe rehydrolisiert auch das Reagenz in den Reagenzinseln, um das Wachstum von Mikroorganismen in der Probe zu unterstützen.
  • Nach Inkubieren der probenhaltigen Vorrichtung bei einer vorbestimmten Temperatur zeigen die Reagenzinseln, die Mikroorganismen aus der Probe enthalten, eine Farbveränderung und/oder fluoreszierende Signale emmitieren (positiv); Reagenzinseln ohne Zielmikroorganismen werden keinen Farbwechsel zeigen und kein fluoreszierendes Signal emittieren (ein negatives Resultat). Die Konzentration einer getesteten Probe des Zielmikroorganismus kann auf Basis der Anzahl der positiven und negativen Reagenzinseln, die unter der Verwendung des Most-Probable-Number-Verfahren (MPN) beobachtet wurden, berechnet werden.
  • Eine andere Anwendung dieses Konzeptes ist es, Reagenzinseln, die mit verschiedenen Arten von Reagenzien lyophylisiert sind, zu haben. Jedes Reagenz ist zum Test eines spezifischen Aspektes einer Probe wie etwa Mikroorganismen, Chemikalien oder irgendeinen anderen detektierbaren Analyten von Interesse ausgelegt. Die Kombination dieser Reagenzinseln in der gleichen Vorrichtung bildet einen Testkit, der einen Ein-Schritt-Test für mehrere Chemikalien, Analyten oder biologisches Material bereitstellt.
  • Mit besonderem Bezug auf 1 und 2 wird dort ein anderer Aspekt der Erfindung gezeigt, der einen Tauchstab 100, der eine Reagenzinsel 101 enthält, umfasst. Der Stab wird üblicherweise aus Kunststoff hergestellt, aber seine Zusammensetzung ist nicht entscheidend und er kann aus jedem hydrophoben Material, das nicht von der Testprobe ausgelaugt wird oder mit dem Assay in Wechselwirkung tritt, hergestellt werden. Die 1 und 2 stellen den Stab mit einer einzelnen Reagenzinsel dar.
  • 10 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform des Tauchstabes mit Mehrfach-Reagenzinseln 102. Zonen von Reagenzinseln können auf dem Tauchstab angeordnet sein, wobei jede Zone Reagenzinseln, die von den anderen Zonen abweichende Reagenzien oder abweichende Kombinationen von Reagenzien enthalten, aufweist; wodurch auf einem einzelnen Tauchstab auszuführende Mehrfachassays ermöglicht werden, wobei jede Zone auf einen unterschiedlichen Analyten oder Mikroorganismus testet. 4 stellt die Tauchstab-Assayvorrichtung aus 3 dar, die der Assayprozedur unterzogen wurde und veranschaulicht Reagenzinseln, die sowohl positive Ergebnisse (dunkle Reagenzinseln) und negative Ergebnisse (weiße Reagenzinseln) zeigen.
  • 5 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung. Dort wird der Tauchstab 100 mit Mehrfach-Reagenzinseln 110, der gefaltet und in ein Teströhrchen 103 eingeführt wird, gezeigt. Bei dieser Ausführungsform hat das Teströhrchen auch eine Kappe 104, die darüber hinaus die Reagenzinseln vor Umweltfaktoren schützt. Natürlich kann die Vorrichtung in anderen Container-Arten wie etwa einer Kunststoffhülle oder einem Container, der dem Schutz der Vorrichtung dient, untergebracht sein. Das auf der Reagenzinsel angeordnete Reagenz kann ein Reagenz oder eine Kombination von Reagenzien, die auf oder in dem Material der Reagenzinsel verteilt werden können, sein.
  • Anwendung einer Testprobe auf Tauchstabvorrichtung
  • Die Verfahren zum Probenauftrag zur Vorrichtung sind unterschiedlich. Der Tauchstab kann in die Testprobe eingetaucht werden und darin ausreichend lange in Kontakt gelassen werden, dass die Reagenzinseln eine vorbestimmte Flüssigkeitsmenge absorbieren. Dies wird üblicherweise weniger als drei Sekunden dauern, kann aber abhängig, aus welchem Material die Reagenzinseln hergestellt sind, länger sein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Reagenzinseln aus Cellulose hergestellt. Jedoch können sie auch aus jedem Material, das ein Flüssigkeitsvolumen absorbieren und festhalten kann, hergestellt sein. Die Testprobe kann auch mit einer Transferpipette aus der Testlösung auf die Reagenzinseln pipettiert werden.
  • Die Trägerstruktur kann auch einen aus Kunststoff oder einem anderen geeigneten hydrophoben Material hergestellten Behälter umfassen. Die Reagenzinseln können innerhalb des Behälter angebracht sein, und der Behälter kann geöffnet werden und Testlösung kann mittels einer Pipette oder durch Giessen oder irgendwelche geeigneten Mittel zugeführt werden. Der Behälter kann einen Deckel, um die Vorrichtung zu schützen, darauf gesichert oder als getrenntes Bauteil aufweisen.
  • Bezugnehmend nun auf 6 kann die Trägerstruktur einen zentralen Träger 104, an den "Blätter" 105 angebracht sind und die die Reagenzinseln 106 tragen, umfassen. Die Blätter können in einer dreidimensionalen Struktur wie in 6 dargestellt angeordnet sein, wobei die Anzahl der Blätter, die an einer Vorrichtung angebracht werden können, maximiert wird. Die Vorrichtung kann in einem runden Container 108 untergebracht werden, und eine Kappe 107 kann darauf angebracht werden, um weiter Schutz für die Vorrichtung vor, während und nach Entwicklung des Assays bereitzustellen.
  • Pipettenvorrichtung Bezugnehmend nun auf 7 stellt die Erfindung in einem anderen Aspekt eine Vorrichtung bereit, die eine Trägerstruktur 109, die in einer Laborpipette 111 enthalten ist, umfasst. Mehrfach-Reagenzinseln 110 sind auf oder in der Trägerstruktur 109 enthalten. Die Reagenzinseln bestehen aus einem festen saugfähigen Material wie etwa Cellulose, das zuerst in die gewünschte Form geschnitten und auf der Trägerstruktur 109 fixiert wird. Vorzugsweise hat die Trägerstruktur 109 mehr als eine Seite mit Reagenzinseln 110 darauf. Die Trägerstruktur 109 ist ganz besonders bevorzugt aus einem synthetischen Polymer wie etwa einem Kunststoff gebildet und wird in eine Laborpipette 111, die vorzugsweise aus Glas oder Kunststoff besteht und ein verjüngtes Ende zur Probenaufnahme hat, eingeführt. Man braucht die Probe nur durch einen im Stand der Technik bekannten Ansaugapparat in die Pipette zu ziehen, darin für ein für die Reagenzinseln ausreichende Zeit zu belassen, um ein vorbestimmtes Volumen Testprobe zu absorbieren, und aus der Vorrichtung auszustoßen. Die Vorrichtung wird dann für eine Zeit, die zum Entwickeln des Assays ausreichend ist, inkubiert, und die Ergebnisse werden bestimmt. Die Pipette selbst umfasst sowohl einfache Mittel zum Zuführen einer Probe zu der Testvorrichtung als auch eine Schutzfunktion.
  • Beispiel 1
  • Ein Bakteriennachweissystem für Coliforme und E. coli in Milch unter Verwendung der Tauchstabvorrichtung Das folgende ist ein Beispiel, wie die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Coliform-Nachweis in Milch bereitstellt, das einfach ist, nicht viele Schritte umfasst und Ergebnisse, die einfach auszuwerten sind, liefert. Der Assay wurde unter Verwendung einer Testvorrichtung mit Mehrfach-Reagenzinseln durchgeführt, wobei jede davon 0.03 ml Milch absorbierte. Die Milch wurde der Testvorrichtung zugefügt und wurde an alle Reagenzinseln auto-quotiert. Die Probe wurde für 24 Stunden inkubiert und ergab die Anzahl vorhandener Coliforme dadurch, dass man ermittelte, wie viele der Reagenzinseln die Farbe wechseln. Die Anzahl der anwesenden Coliforme wird auf Basis des MPN-Diagramms bestimmt. Die aus dem Assay erhaltenen Daten sind in Tabelle 1 angegeben. Die Flexibilität der Aufnahmefähigkeit der Testvorrichtung wird betont, da die Volumenaufnahme durch Einstellen der Anzahl und/oder der Größen der Reagenzinseln leicht eingestellt werden kann. Die Vorrichtung hat auch die Fähigkeit, Mehrfachtests auf der gleichen Vorrichtung durch Auftragen verschiedener Medien auf die Reagenzinseln zu ermöglichen.
  • Tabelle 1
    Milch Proben Tauchstab-Vorrichtung (cfu/ml)
    #7197A 10.3
    #7197B 11.8
    #7197C 16.4
    #710 56.3
    #713 18
    #3B1 0
    #3B2 37
    #2B2 0
    #2B1 9.3
    #618 69.1
    #618A All+
    #622A 12
    #622B 36
    #622C 3
    #7697A 56
    #7697B 22
    #7697C 16
    #7697D 31
    #811 3
    #815 16
    #813 6.2
    Mittel: 23.41
    Std. Abweichung 20.75
  • Die Erfindung ist im Detail mit besonderem Bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben worden, aber es ist selbstverständlich, dass Abweichungen und Modifikationen innerhalb des Anwendungsbereichs der Erfindung gemacht werden können.

Claims (23)

  1. Eine Untersuchungsvorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten oder eines Mikroorganismusses in einer Probe, wobei die Vorrichtung umfasst: eine Pipette mit zwei offenen Enden, wobei eines der offenen Enden zur Aufnahme von Flüssigkeit verjüngt ist; eine langgezogene Trägerstruktur, die innerhalb der Pipette enthalten ist und mindestens eine Oberfläche umfasst; und eine Mehrzahl an diskreten Reagenzinseln, bestehend aus einem saugfähigen Material, wobei jede der Reagenzinseln auf der langgezogenen Trägerstruktur vorliegt, wobei jede der Inseln so angepasst ist, ein Flüssigkeits-Aliquot aufzunehmen, und so dimensioniert, geformt und aus einem Material, das geeignet ist, das Aliquot innerhalb der Reagenzinsel festzuhalten, gebildet ist, wobei die Reagenzinseln mindestens ein Reagenz zum Nachweis eines Analyten oder eines Mikroorganismusses enthalten, wobei die Vorrichtung keine positive Antwort auf den Analyten oder Mikroorganismus bei Fehlen des Analyten oder Mikroorganismusses in der der Vorrichtung zugeführten Probe liefert.
  2. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, die darüber hinaus eine Mehrzahl unterschiedlicher Reagenzien umfasst.
  3. Die Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei unterschiedliche Reagenzien unterschiedlichen Reagenzinseln unter der Mehrzahl diskreter Reagenzinseln bereitgestellt werden.
  4. Die Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die unterschiedlichen Reagenzien, die unterschiedlichen Inseln unter der Mehrzahl diskreter Reagenzinseln bereitgestellt werden, unterschiedliche Tests umfassen.
  5. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Reagenz ein für einen Zielorganismus spezifisches Medium umfasst.
  6. Die Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Zielorganismen E. coli und/oder coliforme Bakterien sind.
  7. Die Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Zielorganismen vollständig lebensfähige Bakterien sind.
  8. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die langgezogene Trägerstruktur mehr als eine Oberfläche hat und die Inseln auf der mehr als einen Oberfläche angeordnet sind.
  9. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, die darüber hinaus Mittel zum Ansaugen von Flüssigkeit hinein in und aus der Pipette umfasst.
  10. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Pipette Einteilungen darauf hat, um das Ansaugen einer vorbestimmten Menge Flüssigkeit in die Pipette sicherzustellen.
  11. Eine Untersuchungsvorrichtung zur Bestimmung der Menge eines Analyten oder eines Mikroorganismusses in einer Probe, wobei die Vorrichtung umfasst eine Pipette mit zwei offenen Enden, wobei eines der offenen Enden zur Aufnahme von Flüssigkeit verjüngt ist; eine langgezogene Trägerstruktur, die innerhalb der Pipette enthalten ist und die zwei oder mehr Oberflächen umfasst; und eine Mehrzahl an diskreten Reagenzinseln, bestehend aus einem saugfähigen Material, wobei jede der Reagenzinseln auf den zwei oder mehr Oberflächen der langgezogenen Trägerstruktur vorliegt, wobei jede der Inseln so angepasst ist, ein Flüssigkeits-Aliquot aufzunehmen, und so dimensioniert, geformt und aus einem Material, das geeignet ist, das Aliquot innerhalb der Reagenzinsel festzuhalten, gebildet ist, wobei die Reagenzinseln mindestens ein Reagenz zum Nachweis eines Analyten oder eines Mikroorganismusses enthalten, wobei die Vorrichtung keine positive Antwort auf den Analyten oder Mikroorganismus bei Fehlen des Analyten oder Mikroorganismusses in der der Vorrichtung zugeführten Probe liefert.
  12. Die Vorrichtung nach Anspruch 11, die darüber hinaus eine Mehrzahl unterschiedlicher Reagenzien umfasst.
  13. Die Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei unterschiedliche Reagenzien unterschiedlichen Inseln unter der Mehrzahl der Inseln bereitgestellt werden.
  14. Die Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei mindestens einige der unterschiedlichen Reagenzien unterschiedliche Tests bereitstellen.
  15. Die Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei das mindestens eine Reagenz ein für Zellen mindestens einer bakteriellen Art spezifisches Medium umfasst.
  16. Die Vorrichtung nach Anspruch 11, die darüber hinaus Mittel zum Ansaugen von Flüssigkeit in die und aus der Pipette umfasst.
  17. Die Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Pipette Einteilungen darauf hat, um das Ansaugen einer vorbestimmten Menge Flüssigkeit in die Pipette sicherzustellen.
  18. Eine Untersuchungsvorrichtung zur Bestimmung der Menge eines Analyten oder eines Mikroorganismusses in einer Probe, wobei die Vorrichtung umfasst: eine Pipette mit zwei offenen Enden, wobei eines der offenen Enden verjüngt ist, wobei die Pipette Einteilungen darauf hat, um das Ansaugen einer vorbestimmten Menge Flüssigkeit in die Pipette zu sicherzustellen; eine langgezogene Trägerstruktur, die innerhalb der Pipette enthalten ist und mindestens eine Oberfläche umfasst; und eine Mehrzahl an diskreten Reagenzinseln, bestehend aus einem saugfähigen. Material, wobei jede der Reagenzinseln auf den zwei oder mehr Oberflächen der langgezogenen Trägerstruktur vorliegt, wobei jede der Inseln so angepasst ist, ein Flüssigkeits-Aliquot aufzunehmen, und so dimensioniert, geformt und aus einem Material, das geeignet ist, das Aliquot innerhalb der Reagenzinsel festzuhalten, gebildet ist, wobei die Reagenzinseln mindestens ein Reagenz zum Nachweis eines Analyten oder eines Mikroorganismusses enthalten; und Mittel zum Ansaugen von Flüssigkeit in die und aus der Pipette.
  19. Die Vorrichtung nach Anspruch 18, die ferner eine Mehrzahl unterschiedlicher Reagenzien umfasst.
  20. Die Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei unterschiedliche Reagenzien unterschiedlichen Inseln unter der Mehrzahl der Inseln bereitgestellt werden.
  21. Die Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei mindestens einige der unterschiedlichen Reagenzien unterschiedliche Tests bereitstellen.
  22. Die Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei das mindestens eine Reagenz ein für einen Zielorganismus spezifisches Medium umfasst.
  23. Die Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die langgezogene Trägerstruktur mehr als eine Oberfläche hat und die Inseln auf der mehr als einen Oberfläche angeordnet sind.
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