SI25919A

SI25919A - Metoda za določitev najverjetnejšega števila bakterij v tekočih vzorcih in model za porazdelitev vzorcev, uporaben za to metodo

Info

Publication number: SI25919A
Application number: SI201900207A
Authority: SI
Inventors: Rutar Sabina Ott; Rok Poglajen; Gregor Zupin
Original assignee: Microbium D.O.O.
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2021-05-31
Also published as: US20220411845A1; BR112022007945A2; WO2021089504A1; EP4110937A1; CN114641579A

Abstract

Predstavljena Metoda za določitev najverjetnejšega števila bakterij v tekočih vzorcih je metoda za odkrivanje in/ali kvantifikacijo mikroorganizmov v tekočem vzorcu, zlasti v vzorcu vode, ki obsega naslednje korake: (a) porazdelitev tekočega vzorca v številne različne in ločene prostorninske dele, ki sledijo linearnem porazdelitvenem vzorcu ali redčenje tekočega vzorca, da dobimo več redčitev izvornega vzorca na podlagi faktorja redčenja, ki sledi vzorcu linearne porazdelitve; (b) inkubacija; in (c) uporaba metode najverjetnejšega števila za zaznavanje in/ali kvantifikacijo mikroorganizmov na linearno porazdeljenih prostorninskih delih ali linearno porazdeljenih redčitvah. Izum poleg tega predstavlja model za porazdelitev vzorcev za zaznavanje in/ali kvantifikacijo mikroorganizmov v tekočem vzorcu, pri čemer je nosilec vzorcev zgrajen tako, da tekoči vzorec vanj namestimo v več različnih prekatov, ti različni prekati pa sledijo linearni porazdelitvi prostornine.

Description

METODA ZA DOLOČITEV NAJVERJETNEJŠEGA ŠTEVILA BAKTERIJ V TEKOČIH VZORCIH IN MODEL ZA PORAZDELITEV VZORCEV, UPORABEN ZA TO METODO

TEHNIČNO PODROČJE, NA KATEREGA SE NANAŠA IZUM

[1] Ta izum se nanaša na metodo zaznavanja in/ali kvantifikacije mikroorganizmov, kot so bakterije, v tekočih vzorcih, po možnosti vzorcih vode, ter se nanaša tudi na model za porazdelitev vzorcev (nosilec vzorcev), kije še posebej uporaben za to metodo.

NAVEDBA DOSEDANJEGA STANJA TEHNIKE

[2] Zaznavanje in kvantifikacija mikroorganizmov, kot so bakterije, je ključni element številnih industrijskih področjih: sektor pitne vode, sektor odpadnih voda, kemična industrija (proizvodnja barv, pigmentov, barvil, premazov), prehrambna industrija, kompostiranje in farmacevtska industrija zaradi vsaj dveh razlogov. Vse te panoge se soočajo s kontaminacijo z mikrobi, ki lahko ogrozijo kakovost njihovih izdelkov in neugodno vplivajo na zdravje uporabnikov. Nadalje pa so izpostavljene velikim zakonodajnim pritiskom. V sektoiju pitne vode na primer Direktiva Evropskega Parlamenta in Sveta o kakovosti vode, namenjene za prehrano ljudi (Direktiva 98/83/ES), zahteva, da v vzorcu vode ni prisotnih bakterij E. coli, enterokokov in koliformnih bakterij. V vzorcih vode, ki se ponuja v prodajo v steklenicah ali posodah (plastenkah) pa poleg omenjenega ne sme biti prisotna P. aeruginsa.

[3] Dobro znana metoda za zaznavanje in opredelitev/kvantifikacijo mikroorganizmov v tekočem vzorcu je metoda najverjetnejšega števila (metoda MPN, angl. »Most Probable Number«). Metoda temelji na naključni porazdelitvi skupnega števila bakterijskih celic v prvotno opredeljeni evklidski prostornini tekočega vzorca. Doslej sta bili uporabljeni dve različni seriji statističnih dogodkov kot standard pri metodi MPN. Prva serija je obsegala pripravo serije 2-kratnih ali 10-kratnih redčitev vzorcev. Vse redčitve so nato porazdeljene v več prekatov (prostorčkov, razdelkov) z enako prostornino. Pri drugi seriji pa je vzorec z določenim številom (ali gostoto) bakterijskih celic porazdeljen v več prekatov (razdelkov) z različnimi prostorninami in večkratno ponovitvijo iste prostornine, pri čemer je lahko razmeije med zaporednima prostorninama 10-kratno ali 2-kratno. Za oba primera serij statističnih dogodkov velja stohastičen geometrijski proces, kjer so bakterijske celice naključno porazdeljene in se dokončno nahajajo v povsem novi prostorski porazdelitvi v novem abstraktnem evklidskem prostoru prekatih na mikrotiterski plošči ali njenih različicah. Vse izide navedene porazdelitve bakterijskega vzorca je mogoče pojasniti s Poissonovo porazdelitvijo. Enačbo veijetnostne funkcije (funkcije verjetnostne porazdelitve) za Poissonovo porazdelitev vzorca z bakterijami (ki predstavlja veijetnost, da bo v opredeljeni prostornini prekata j bakterijskih celic) je mogoče opisati na naslednji način:

_p _ (dV^e'^

J!

kjer j predstavlja število bakterijskih celic v vdolbini, d je faktor redčenja, Vje prostornina v vdolbini, μ je začetna (izvorna) koncentracija bakterij (mikroorganizmov) in zmnožek dVp opredeljuje število bakterijskih celic (celic mikroorganizmov). Vsaka bakterijska celica je točka, neodvisna od ostalih točk v matematičnem prostoru. Zaznava vsaj ene bakterije (celice) v novem prekatu ali novem evklidskem stohastičnem prostoru predstavlja pozitiven rezultat. Veijetnost zaznavanja pozitivnega rezultata v več ponovitvah (od ene do vseh ponovitev) istega opredeljenega redčenja in/ali iste opredeljene prostornine je nadalje mogoče pojasniti z binominalno veijetnostno porazdelitvijo. Izračun verjetnosti zaznavanja vsaj ene bakterije v opredeljenem prekatu daje ponderirano (tehtano) veijetnost binominalne distribucije. Veijetnostna funkcija, ki opisuje veijetnost pridobitve opredeljenega števila pozitivnih rezultatov v vseh ponovitvah iste prostornine čez celotno območje redčenja in/ali prostornine (oz. določen izid), je funkcija veijetja (L). Za opredeljeni sistem z x različnimi prostorninami in y ponovitvami iste prostornine je mogoče naravni logaritem te funkcije veijetja opisati, kot sledi:

Σ^Χ ridiVie~^diVai v-i rd-Vi=l i = l

[4] Pri tem je r opredeljeno število pozitivnih prekatov v vseh ponovitvah istega faktoija redčenja in/ali iste prostornine. Najveijetnejša koncentracija bakterij na podlagi opredeljenega izida (določeno število pozitivnih rezultatov) je μ, pri čemer je naravni logaritem funkcije veijetja najvišji, ko je prvi odvod funkcije veijetja glede na oz. po μ enak nič.

[5] Vsak od zgoraj opisanih industrijskih sektoijev se zanima za zaznavanje celokupnih prisotnih bakterij (mikroorganizmov) ali pa se osredotoča na prisotnost določenih vrst bakterij, kot je Escherichia coli, ali določeno skupino bakterij, kot so koliformne bakterije. Pridobitev pozitivnih rezultatov za ciljno skupino bakterij je mogoča s selektivnimi diferencialnimi kromogenimi gojišči. Za zaznavanje E. coli, koliformnih bakterij in enterokokov je bilo razvitih več selektivnih diferencialnih kromogenih gojišč, kot so AquaChrom™ECC in AquaChrom™Enterococcus podjetja ChromAgar, COLILERT® in ENTEROLERT® podjetja Idexx ali EC Blue™ podjetja Nissui Pharmaceutical. Omenjena selektivna diferencialna kromogena gojišča vsebujejo selektivne kromogene. Selektivni kromogeni so analogi substratov—substrati, povezani s kromoforom - ki jih cepi encim, prisoten samo v ciljni skupini bakterij. Če je v vzorcu prisotna ciljana skupina bakterij in s tem tudi encim, se bo kromofor odcepil in akumuliral. Posledično nevezan kromofor bo omogočil specifično obarvanje vzorca zaradi svojega specifičnega absorpcijsko/emisijskega spektra.

[6] Več različnih metod je bilo razvitih, ki se opirajo na uporabo omenjenih gojišč. Eden od njih je sistem Idexx Colilert-18/Quantitray™ (ameriški pat. št. 5,753,456). Ta sistem temelji na dveh različnih tipih vrečk, tj. vrečkami z 51 prekati enake prostornine ali vrečkami s 97 prekati z dvema različnima prostorninama. Prav tako več virov s področja patentov obravnava prilagoditve na MPN osnovanih metod in pripadajočih modulov, namenjenih porazdelitvi izvornega vzorca z bakterijami, kot so US

2017/0240949 Al; US 2017/0247737 Al; WO 2016/051167 Al; US 2013/0189770 Al; US 2010/0136608 Al; US 2010/0273209 Al; US 2005/0048597 Al; US 6,509,168 B2; ameriški pat. št. 6, 696, 286 BI; ameriški pat. Št. 6, 365, 368 BI; ameriški pat. Št. 6,492, 133 BI; ameriški pat. št. 6, 190, 878 BI; ameriški pat. št. 4, 868, 110; britanska pat. prijava GB 2 106 539.

[7] Ce modele za porazdelitev vzorcev iz patentne literature razdelimo na posamezne kategorije, lahko navedemo primere: mikrotiterska plošča s prekati, ki zadržijo od 0,1 do 100 μΐ vzorca z reagentom (ameriški pat. št. 6, 190, 878 BI); trak za MPN z enim 50-mililitrskim, petimi 10-mililitrskimi in petimi 1-mililitrskimi prekati (britanska pat. prijava GB 2 106 539); model za porazdelitev vzorcev, ki vsebuje pet prekatov s prostornino po 10 ml, pet s prostornino po 1 ml in pet s prostornino po 0,1 ml skupaj s sistemom porazdelitve vzorca po prekatih (US 2013/0189770 Al); model za porazdelitev vzorca po posamičnih prekatih s pomočjo kapilarnega toka po radialno razporejenih kapilarnih kanalih (US 2005/0048597 Al); model za porazdelitev vzorca (znan tudi kot Simplate™), ki obsega okroglo ploščo za inkubacijo, razdeljeno na vsaj 20 prekatov (US 6,509,168 B2); modeli za porazdelitev vzorcev, sestavljeni iz setov mikro prekatov z razponom prostornine od 0,01 μΐ do 25 μΐ (ameriški pat. št. 6,696, 286 BI).

[8] Vsi od zgoraj navedenih izumov imajo določene omejitve. Ena omejitev je najverjetneje dejanska kompleksnost uporabe. Pristopi na podlagi filtrov zahtevajo dodatne korake izpiranja in analize po filtraciji vzorca, da dobimo želeno najverjetnejšo koncentracijo bakterij. Metode zaznavanja na osnovi CO2 zahtevajo namestitev več aparatov za dejansko kvantifikacijo mikroorganizmov v vzorcu; poleg tega sam CO2 ne loči med prokanonti in evkanonti, v nekaterih primerih pa je vseeno zahtevana identifikacija specifičnih skupin ali vrst bakterij.

[9] Ko gre za modele za porazdelitev vzorcev, so dosedanji izumitelji opredelili statistično naravo temeljne metode MPN kot glavno težavo, zlasti v smislu ohranitve določenega želenega intervala zaupanja (IZ), ki bi moral znašati 95 %. Glede na funkcijo veijetja statistične analize, na kateri temelji metoda MPN — ki opisuje veijetnost vseh izidov skladno z opredeljeno vrednostjo koncentracije (vrednostjo μ) — vsi izidi niso enako veijetm. V primeru metode MPN je mogoče praviloma pridobiti več ocen vrednosti μ z več izidi, poleg tega pa je več možnih izidov mogoče tudi pridobiti z večjim skupnim številom prekatov v nosilcu vzorcev (ker je mogoče večje teoretično število izidov). Idealno bi najbolj natančne rezultate teoretično pridobili, če bi pripravili neomejeno število razredčenih vzorcev (ali neomejeno število prekatov), kar pa je praktično nemogoče, saj bi mora biti prostornina prekatov v rangu velikosti bakterij, rezultate pa bi bilo nemogoče interpretirati.

OPIS IZUMA

[10] Predmet tega izuma je torej »Metoda za določitev najverjetnejšega števila bakterij v tekočih vzorcih in model za porazdelitev vzorcev, uporaben za to metodo«, katere koncept omogoča enostavno izvedbo in enostavne detekcijske sisteme za mikrooorganizme - ter s tem povezan poenostavljen model za porazdelitev in obdelavo vzorcev - vendar brez neugodnega vpliva na zanesljivost rezultatov zaznavanja mikroorganizmov ter ovrednostenje njihovega števila.

[11] Predmeni izum kot rešitev problematike, izpostavljene v segmentu »Navedba dosedanjega stanja tehnike - Odstavek 8 in 9, predstavlja metodo za zaznavanje in/ali kvantifikacijo mikroorganizmov v tekočem vzorcu, označeno z naslednjimi koraki: (a) porazdelitev tekočega vzorca na manjše prostornine, katerih vrednosti sledijo vzorcu linearne porazdelitve ali redčenje tekočega vzorca, da dobimo več redčitev izvornega vzorca na podlagi faktorjev redčenja, katerih vrednosti sledijo vzorcu linearne porazdelitve; (b) inkubacija; in (c) uporaba statistične metode najverjetnejšega števila na vzorcu, porazdeljenem na manjše prostornine, katerih vrednosti sledijo vzorcu linearne porazdelitve ali na redčitvah izvornega vzorca na podlagi faktorjev redčenja, katerih vrednosti sledijo vzorcu linearne porazdelitve za zaznavanje in/ali kvantifikacijo mikroorganizmov v izvornem vzorcu, kot je opredeljeno v zahtevku 1, ter model za porazdelitev vzorcev, kot je opredeljeno v zahtevku 9. Zaželene izvedbe so opredeljene v zadevnih pripadajočih zahtevkih k zahtevku 1 oz. 9. Ta izum opredeljuje tudi komplet delov, kot je opredeljeno v zahtevku 18.

[12] V metodi skladno s predmetnim izumom različne prostornine - ki jih imajo prekati modela za porazdelitev vzorcev - sledijo vzorcu linearne porazdelitve, ki naj bi predstavljala tudi vzorec linearne regresije. Alternativno, vendar po istem načelu linearne regresije, metoda lahko vključuje korak redčenja izvornega tekočega vzorca, da dobimo več redčitev izvornega vzorca na podlagi faktoija redčenja, ki sledi vzorcu linearne porazdelitve. Skladno s tem načelom je bil v praksi odkrit optimalen model, ki integrira ravnovesje med statistično relevantnostjo in preprosto interpretacijo rezultatov — poenostavljena metoda, ki zagotavlja statistično reprezentativne rezultate v predvidenem razponu koncentracije mikroorganizmov med 0 in manj kot 100 CFU/lOOmL oz. po možnosti največ 60CFU/100mL, upoštevajoč razpon koncentracije, ki ga lahko pričakujemo v tipičnem tekočem vzorcu pri dotičnem problemu. Ta koncept na primer upošteva pričakovan razpon koncentracije med 10 in 100 CFU (angl. »Colony Forming Units«, predstavlja število bakterij v tekočem vzorcu) na 100 ml pri analizi pitne vode ter pričakovan razpon koncentracije, kije 10-krat večji, tj. 100-1000 CFU na 100 ml, pri analizi odpadnih voda - katerih izvorno stanje pa je mogoče preprosto prilagoditi na ustrezen koncentracijski rang predmetne analitske metode - pitno vodo lahko npr. neredčeno obdelamo z analitsko metodo, odpadno vodo ali industrijsko vodo pa pred obdelavo s predmetno analitsko metodo ustrezno redčimo.

[13] Na podlagi načela linearne porazdelitve je mogoče model za porazdelitev vzorcev kot predmetni izum predstaviti v različnih izvedbah. Skladno z večimi izvedbami modela za porazdelitev vzorcev je tudi več načinov uporabe modela za porazdelitev vzorcev za metodo MPN (»metodo najverjetnejšega števila«) za namene zaznavanja in opredelitve števila bakterij v tekočem vzorcu prostornine, ki ni manjša od lOOmL oz. po možnosti znaša približno lOOmL. Vsi načini uporabe modela za porazdelitev vzorcev temeljijo na izvornem tekočem vzorcu, ki mu v prvi fazi lahko dodamo selektivno liofilizirano gojišče (liofilizirano gojišče s komponentami, ki so namenjene ciljani detekciji posameznih bakterijskih skupin ali bakterijskih vrst) in ga raztopimo v vzorcu. Izvorni vzorec (ki vsebuje določeno koncentracijo in določeno število bakterij) z raztopljenim gojiščem nato porazdelimo po prekatih. Prekati imajo definirano prostornino, definirano število različnih prostornin (vsaj pet, po možnosti osem in po možnosti do največ 20), katerih vrednosti sledijo shemi linearne regresije in definirano število ponovitev iste prostornine (vsaj tri oz. po možnosti tri) (prekati so organizirani v definirano število različnih prostornin pri čemer ima vsaka različna prostornina določeno število ponovitev). Glede na definirano število različnih prostornin in definirano število ponovitev iste prostornine je določeno skupno število prekatov (vsaj 15, po možnosti 24 oz. do največ 60). Pri prednostni izvedbi je definirano število različnih prostornin po možnosti osem, ki sledijo shemi linearne regresije, število ponovitev iste prostornin?! pa tri pri čemer so prostornine po vzorcu linearne porazdelitve torej Vi = Vi (prostornina najmanjše trojice), V₂ = 2Vi, V₃ = 3V., V₄ = 4V_b V₅ = 5Vi, V₆ = 6V_b V₇ = 7Vi in V₈ = 8Vi ali x (prostornina najmanjše trojice), 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x in 8x. Prostornine prednostne izvedbe modela so po možnosti: Vi = 0,926 ml, V₂ = 1,852 ml, V₃ = 2,778 ml, V₄ = 3,704 ml, V, = 4,63 ml, V₆ = 5,556 ml, V₇= 6,481 ml in V₈ = 7,407 ml. Pri prednostni izvedbi je model za porazdelitev vzorcev izdelan po možnosti iz hidrofobnega materiala - plastičnega hidrofobnega ali drugega hidrofobnega materiala, ki je primeren za zadrževanje frakcij tekočega vzorca v skladu s fizikalnimi lastnostmi površinske napetosti in preprečuje medsebojne vplive in pretakanje vode med sosednjimi prekati ali pa plastičnega materiala s hidrofobnim premazom vsaj po delu površine ali po celotni površini, kije obrnjena v notranjost modela za porazdelitev vzorcev. Pri prednostni izvedbi je model za porazdelitev vzorcev po možnosti cilindrične oblike in so prekati modela za porazdelitev vzorcev cilindrične oblike. Pri drugih izvedbah je model za porazdelitev vzorcev lahko pravokotne, okrogle ali druge oblike in/ali različnih dimenzij v smislu višine in širine (oz. polmera ali premera). Ravnotako so pri drugih izvedbah modela za porazdelitev vzorcev lahko prekati modela za porazdelitev vzorcev pravokotne, okrogle ali druge oblike in/ali različnih dimenzij v smislu višine in širine (oz. polmera ali premera); tako, da se ohranijo vrednosti volumnov pri danem številu različnih volumnov, ki sledijo shemi linearne porazdelitve in dani ponovitvi števila prekatov z istim volumnom; ter so lahko sosednji prekati med seboj na različnih višinskih razlikah. Pri prednostni izvedbi so prekati modela za porazdelitev vzorcev med seboj povezani s centralnim kanalom, ki omogoča harmonizirano pretakanje tekočine med prekati. Pri drugih izvedbah je lahko centralni kanal različnih dimenzij (širine in/ali globine). Celokupni notranji volumen modela za porazdelitev vzorcev m manjši od lOOmL oz. je približno enak lOOmL oz. še bolje je točno lOOmL ali povedano drugače vsota notranjih volumnov vseh prekatov ni manjša od lOOmL oz. je približno lOOmL oz. še bolje je enaka lOOmL. Statistični izračun ocene najverjetnejšega števila mikroorganizmov (MPN) na prostominsko enoto je nato izpeljan iz izida števila pozitivnih prekatov (prekatov, ki na podlagi detekcije s selektivnim liofiliziranim gojiščem zagotovo vsebujejo vsaj en mikroorganizem) izmed vseh ponovitev iste prostomineprekatov za vse različne prostornine prekatov (oz. koliko prekatov z isto prostornino - izmed vseh prekatov z isto prostornino - vsebuje vsaj en mikroorganizem). Na podlagi ciljnega 95-odstotnega zaupanja (in ločeno izračunanega standardnega odklona) za vsako oceno najverjetnejšega števila mikroorganizmov na prostominsko enoto (ki jo pridobimo na osnovi izida števila pozitivnih prekatov izmed vseh ponovitev prekatov iste prostornine za vse različne prostornine prekatov) nato za vsako oceno najverjetnejšega števila mikroorganizmov izračunamo pripadajoč 95odstotni interval zaupanja, ki prikazuje interval koncentracij mikroorganizmov (števil mikroorganizmov na prostominsko enoto), znotraj katerih bo s 95 — odstotno veijetnostjo dejansko število mikroorganizmov na enoto prostornine. 95-odstotni intervali zaupanja dosegajo vrednosti med 0,02 in 0,15 za opredeljeno izvedbo s 24 prekati. Način uporabe modela za porazdelitev vzorcev za metodo MPN za namene zaznavanja in opredelitve števila mikroorganizmov v tekočem vzorcu se opira na lastnost statističnega izračuna najveijetnejše koncentracije mikrobiološkega vzorca. Najveijetnejše število mikroorganizmov je mogoče izpeljati iz vseh možnih kombinacij redčitve in prostornine zadevnega alikvota vzorca po porazdelitvi. Ni potrebno, daje razmeije med prostorninami stalno, pato tudi ni potrebno, da je 2 ali 10. Aplicirati je mogoče različno število prekatov s specifično kombinacijo redčitve in prostornine. Uporabna vrednost predmetnega izuma je v izboljšanju statistike v smislu 95odstotnih intervalov zaupanja pri manjši oceni števila mikroorganizmov na prostominsko enoto (manj kot 100 CFU/100 ml oz. po možnosti od 0 do 60 CFU/lOOmL) v vodnem vzorcu (95 - odstotni intervali zaupanja so ozki pri manjši oceni števila mikroorganizmov na prostominsko enoto, na primer med 0 in 10 CFU/mL, hkrati se linearno širijo z naraščanjem ocene najveijetnejšega števila mikroorganizmov na prostominsko enoto, pri čemer lahko glede na 95- odstotne intervale zaupanja statistično relevantno opredelimo dejansko število mikroorganizmov pri oceni števila mikroorganizmov med 0 in 60 CFU/lOOmL), kar pomeni izboljšanje statistike za točno opredeljeno uporabo modela (izboljšanje statistike za opredeljen predviden koncentracijski rang mikroorganizmov). Ožji intervali zaupanja so preferirani pri manjšem številu mikroorganizmov (< 100 CFU/100 ml oz. po možnosti od 0 do 60 CFU/1 OOmL), saj se prednostne izvedbe modela nanašajo na vzorce pitne vode, kjer so navadno prisotne zelo nizke koncentracije mikroorganizmov (po možnosti od 0 do 60 CFU/lOOmL) ali kjer je preprosto treba potrditi negativen rezultat (odsotnost mikroorganizmov). Razlog za opisano korelacijo med oceno najverjetnejšega števila mikroorganizmov in 95 — odstotnimi intervali zaupanja je, da različne prostornine prekatov zadevnega modela za porazdelitev vzorcev sledijo vzorcu linearne regresije. Osnovna zakonitost v ozadju metode MPN in ustrezne zgradbe modela za porazdelitev vzorcev s pripadajočim številom prekatov, ki morajo slediti vzorcu linearne regresije, vedno omogoča optimalno ravnovesje med preprostostjo uporabe, preprostostjo metode obdelave podatkov in zgradbe modela za porazdelitev vzorcev na eni straniin statistično zanesljivostjo pridobljenih rezultatov zaznavanja in opredelitve števila mikroorganizmov na prostominsko enoto na drugi strani.

KRATEK OPIS SKIC

Na skicah:

Slika 1 prikazuje nosilec vzorcev, skladno s prednostno izvedbo tega izuma v perspektivi od zgoraj (tloris).

Sliki 2A in 2B prikazujeta tloris modela za porazdelitev vzorcev, skladno z izvedbo na Sliki 1 (Slika 2A), ter presek (naris) (Slika 2B).

Slika 3 prikazuje model za porazdelitev vzorcev, skladno z izvedbo na Sliki 1, v perspektivi od strani in v delnem prerezu.

Slika 4 prikazuje rezultate intervalov zaupanja po linearnem vzorcu porazdelitve različnih prostornin, skladno z metodo MPN v tem izumu. Vodoravna os predstavlja oceno najverjetnejšega števila celic na mL vzorca (MPN; angl. »Most Probable Number«) glede na določen izid, navpična os pa dejansko vrednost števila celic na ml vzorca. Navpične črte predstavljajo intervale zaupanja. Oznaka A: Število ponovitev iste prostornine, Oznaka B; Prostornine v mL

Slika 5 prikazuje rezultate intervalov zaupanja po eksponentnem vzorcu porazdelitve različnih prostornin za primerjavo glede na Sliko 4 z linearnim vzorcem porazdelitve različnih prostornin. Vodoravna os predstavlja oceno najveijetnejšega števila celic na mL vzorca (MPN; angl. »Most Probable Number«) glede na določen izid, navpična os pa dejansko vrednost števila celic na ml vzorca. Navpične črte predstavljajo intervale zaupanja. Oznaka A: Število ponovitev iste prostornine, Oznaka B; Prostornine v mL

Slika 6 predstavlja linearno umeritveno krivuljo iz Primera 2, ki prikazuje korelacijo med dejanskim številom bakterij in optično gostoto (OG) E. coli. Oznaka A: Linearna umeritvena krivulja E. coli,

Slika 7 prikazuje redčenje in pripravo vzorcev, uporabljenih v Primeru 3. Oznaka 1 - 300pL izvorne suspenzije celic E. coli v sterilni destilirani dH₂O ali 300pL predhodne redčitve, Oznaka 2 3000pL izvorne bakterijske suspenzije E. coli v sterilni destilirani dH₂O, Oznaka 3 - 2700pL sterilne destilirane dH₂O, Oznaka A — 00=0,2, Oznaka B — OG =0,1, Oznaka C — Predvidene koncentracije celic E. coli (y CFU/mL) in Oznaka D - Redčitve. Pri OG 0,2 (Oznaka A) je bilo 1 ml redčitev 10^, ΙΟ⁷, 10Λ ΙΟ’⁹, ΙΟ’¹⁰ in 10-'¹, prenesenih k 99 ml sterilne destilirane dH2O, filtriranih skozi celulozni filter z velikostjo por 0,45 pm in nato nanešenih na rehidrirano, trdno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče, specifično za E. coli in koliformne bakterije. Pri OG 0,1 (Oznaka B) je bilo 1 ml redčitev 1CT⁷,10Λ ΙΟ’⁹, ΙΟ’¹⁰, ΙΟ¹¹ in 10’¹², prenesenih k 99 ml sterilne destilirane dH2O, filtriranih skozi celulozni filter z velikostjo por 0,45 pm in nato nanešenih na rehidrirano, trdno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče specifično za E. coli in koliformne bakterije. Po prekonočni inkubaciji je sledilo štetje kolonij, in

Slika 8 prikazuje redčenje in pripravo vzorcev, uporabljenih v Primeru 4. Oznaka 1 - 600pL izvorne suspenzije celic E. coli v sterilni destilirani dH₂O ali 600pL predhodne redčitve, Oznaka 2 3000pL predhodne redčitve, Oznaka 3 - 6000pL izvorne suspenzije celic E. coli v sterilni destilirani dH₂O, Oznaka 4 - 5400pL sterilne destilirane dH₂O, Oznaka 5 - 3000pL sterilne destilirane dH₂O, Oznaka A - Redčitve, Oznaka B - Predvidene koncentracije celic E. coli (v CFU/mL), Oznaka C dodatek ImL pripadajoče redčitve k 99mL sterilne destilirane dH₂O, filtracija skozi filter z velikostjo por 0,45pm in nanos filtra na rehidrirano, trdno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče, specifično za E. coli in koliformne bakterije (sledi štetje kolonij), Oznaka D - dodatek ImL pripadajoče redčitve k 99mL sterilne destilirane dH₂O, dodatek liofiliziranega, sterilnega, selektivnega, kromogenega, diferencialnega gojišča, specifičnega za E. coli in koliformne bakterije in nanos na model za porazdelitev vzorcev (sledi analiza rezultatov), Oznaka E - lOOmL sterilne destilirane dH₂O, filtracija skozi filter z velikostjo por 0,45pm in nanos filtra na rehidrirano, trdno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče, specifično za E. coli in koliformne bakterije (sledi štetje kolonij), Oznaka F - lOOmL sterilne destilirane dH₂O in dodatek liofiliziranega, sterilnega, selektivnega, kromogenega diferencialnega gojišča, specifičnega za E. coli in koliformne bakterije in nanos na model za porazdelitev vzorcev (sledi analiza rezultatov), Oznaka G - lOOmL sterilne destilirane dH₂O (NEGATIVNA KONTROLA). Redčitve in pripadajoča negativna kontrola, ki se jim doda liofilizirano sterilno, selektivno, kromogeno, gojišče se nato nanesejo v model

OPIS PREDNOSTNIH IZVEDB

[14] Predmet tega izuma je »Metoda za določitev najveijetnejšega števila bakterij v tekočih vzorcih in model za porazdelitev vzorcev, uporaben za to metodo«. Predmetni izum se nanaša na možnost več različnih izvedb metode, ki temelji na »najveijetnejšem številu« (MPN) mikroorganizmov, in model za porazdelitev vzorcev, ki se pri MPN uporablja za identifikacijo mikroorganizmov v vzorcih pitne vode, površinske/naravne vode, industrijske procesne vode ter odpadne vode.

[15] Ustrezno s tem vzorec linearne porazdelitve zajema porazdelitev prostornin na vsaj 5 različnih prostornin, po možnosti pa zagotavlja vzorec linearne porazdelitve prostornin na največ 20 različnih prostornin.

[16] Skladno s tem je lahko model za porazdelitev vzorcev strukturiran na ustrezno število različnih prostornin prekatov, pri čemer so te dimenzionirane tako, da sledijo vzorcu linearne porazdelitve Torej se lahko model za porazdelitev vzorcev in s tem metoda prilagodita na vsako od naslednjih vzorcev linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov:

linearno porazdelitev različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno in 5kratno prostornino;

linearno porazdelitev različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno in 8-kratno prostornino;

linearno porazdelitev različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno, 8-kratno in 9-kratno prostornino;

in nadalnje linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov, ki sledijo, ustrezno povečane za naslednjo vrednost do linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov na največ 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno, 8-kratno, 9-kratno, 10-kratno, 11-kratno, 12-kratno, 13-kratno, 14-kratno, 15-kratno, 16-kratno, 17-kratno, 18-kratno, 19-kratno in 20-kratno prostornino, po možnosti na vzorec linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno in 8-kratno prostornino.

[17] V praktični rabi izuma je uporabno in so generirani bolj zanesljivi rezultati, če je porazdelitev različnih prostornin prekatov, ki sledi linearnemu vzorcu glede na odstavek 16, prilagojena predvidenemu številu pričakovanih mikroorganizmov v izvornem vzorcu, v odvisnosti od tipa izvornega vzorca. Skladno s tem je za razmeroma čiste tekočine (kjer je razmeroma nizka predvidena koncentracija mikroorganizmov), kot je pitna voda, primemo razmeroma nizko število linearno porazdeljenih različnih prostornin prekatov, ki na primer obsega linearno porazdelitev različnih prostornin prekatov na vsaj 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno in 5-kratno prostornino in največ na 1-kratno, 2-kratno, 3kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno, 8-kratno, 9-kratno, 10-kratno, 11-kratno in 12-kratno prostornino, po možnosti pa linearno porazdelitev različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno in 8-kratno prostornino. Po drugi strani pa je preferirano razmeroma visoko število linearno porazdeljenih različnih prostornin prekatov od na primer najmanj na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno, 8-kratno, 9-kratno, 10-kratno, 11-kratno in 12-kratno prostornino do največ na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6kratno, 7-kratno, 8-kratno, 9-kratno, 10-kratno, 11-kratno, 12-kratno, 13-kratno, 14-kratno, 15-kratno, 16-kratno, 17-kratno, 18-kratno, 19-kratno in 20-kratno prostornino, če analiziramo razmeroma nečist vzorec tekočine, kot je odpadna ali industrijska voda, kjer je razmeroma visoka predvidena koncentracija mikroorganizmov).

[18] Alternativno k takšni prilagoditvi ali v kombinaciji s takšno prilagoditvijo vrsti tekočine, ki jo nameravamo analizirati, je zaželeno, da tekoči vzorec, ki ga analiziramo po koraku (a), vsebuje manj kot 100 CFU mikroorganizmov na 100 ml, po možnosti največ 60 CFU mikroorganizmov na 100 ml in da prostornina analizirane tekočine ni manjša od lOOmL oz. po možnosti znaša približno lOOmL. Če je tekoči vzorec pitna voda, pred izvedbo koraka (a) redčenje potrebno. Če vzorec tekočine pridobimo iz odpadnih voda, industrijske procesne vode in/ali vode iz narave, gaje ob uporabi modela za porazdelitev vzorceev v prednostni izvedbi (z linearno porazdelitvijo različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno in 8-kratno prostornino) zaželeno redčiti pred obdelavo po koraku (a), po možnosti v razmerju 1 : 10, še bolje v razmerju 1 ; 100.

[19] Pri prednostni izvedbi, ki je skupna vsem prilagoditvam in izvedbam modela za porazdelitev vzorcev, je vsak zadevni prekat, z določeno prostornino znotraj linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov, prisoten vsaj po trikrat oz. po možnosti po trikrat (v triplikatu). Slednje botruje močno izboljšanim in statistično zanesljivejšim rezultatom v predvidenem območju med 0 in manj kot 100 CFU/lOOmL oz. po možnosti največ 60CFU/100mL. Skladno s predhodno navedenim številom različnih linearno porazdeljenih prostornin prekatov je možno ustrezno x-kratno redčenje vzorca prisotno med analitsko metodo ter ustrezno s tem tudi v modelu za porazdelitev vzorcev, in sicer v trikratni ponovitvi (v treh ponovitvah). To pomeni, da je mogoče oblikovati skupaj 15 prekatov z linearno porazdelitvijo različnih prostornin prekatov na 1-kramo, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno in 5kratno prostornino, skupaj 24 prekatov z linearno porazdelitvijo različnih prostornin prekatov na 1kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno, in 8-kratno prostornino ter tako naprej z ustreznim večanjem števil linearne regresije vse do 60 prekatov z linearno porazdelitvijo različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno, 8-kratno, 9kratno, 10-kratno, 11-kratno, 12-kratno, 13-kratno, 14-kratno, 15-kratno, 16-kratno, 17-kratno, 18kratno, 19-kratno in 20-kratno prostornino. Opredeljena prednostna izvedba skupaj z vsemi prilagoditvami navedenimi v odstavkih 15-19 omogočajo statistično natančnejšo pridobitev ocene najverjetnejšega števila mikroorganizmov (MPN) za definiran tip vodnega vzorca (na podlagi števila pozitivnih izidov znotraj vsakega tripleta prekatov z isto prostornino čez vse definirane različne prostornine prekatov, ki sledijo vzorcu linearne porazdelitve) v predvidenem območju med 0 in manj kot 100 CFU/1 OOmL oz. Po možnosti njveč 60CFU/100mL in skupaj z izračunom standardnega odklona tudi pripadajoče 95-odstotne intervale zaupanja za vsako oceno najveijetnejšega števila mikroorganizmov. 95-odstotni intervali zaupanja predstavljajo interval znotraj katerih se s 95-odstotno veijetnostjo nahaja dejansko število mikroorganizmov in so ozki pri nizki oceni najveijetnejšega števila mikroorganizmov in se linearno širijo z večanjem ocene najveijetnejšega števila mikroorganizmov in dosegajo vrednosti med 0,02 in 0,15 za opredeljeno prednostno izvedbo s 24 prekati.

[20 J Pri ponazorjenih izvedbah in z njimi povezanih različicah je lahko zunanja oblika nosilca vzorcev cilindrična, okrogla ali pravokotna. Ne glede na izbrano zunanjo obliko modela je mogoče ustrezno obliko vsakega prekata izbrati izmed možn npr. cilindrične, pravokotne ali kakšne druge oblike. Prednostno model za porazdelitev vzorcev vsebuje cilindrične prekate kot prekate, ki sledijo navedenemu vzorcu linearne porazdelitve, še bolje v kombinaciji s cilindrično obliko modela za porazdelitev vzorcev.

[21] Pri zadevni izvedbi je model za porazdelitev vzorcev sestavljen tako, da prekati opredeljujejo specifično celokupno prostornino vzorca, ki ga model zadržuje. Če takšno specifično celokupno prostornino vzorca izrazimo kot V = 100 % in če je skladno z navedeno prednostno izvedbo vsak prekat točno določene prostornine znotraj vzorca linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov, prisoten trikrat, za vsakega od treh prekatov vzorca linearne porazdelitve 1-kratna enota prostornine (vsake različne prostornine znotraj linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov) znaša 0,926 % od V, 2kratna enota prostornine 1,852% od V, 3-kratna enota prostornine 2,778% od V, 4-kratna enota prostornine 3,704 % od V, 5-kratna enota prostornine 4,63 % od V, 6-kratna enota prostornine 5,556 % od V, 7-kratna enota prostornine 6,481 % od V in 8-kratna enota prostornine 7,407 % od V, pri čemer vsak odstotek prostornine vključuje dovoljeno odstopanje v višini ±10%, po možnosti dovoljeno odstopanje ±5 %, še bolje pa dovoljeno odstopanje ±1 %. Kot je navedeno, je za namene standardizacije zaželeno, daje tekoči vzorec obdelan po koraku (a) metode ali da skladno s tem skupna prostornina vzorca v nosilcu ne znaša manj kot 100 ml oz. po možnosti približno 100 ml, torej je zgoraj opredeljena vrednost V= 100% enaka 100 ml. Celokupni notranji volumen modela za porazdelitev vzorcev ni manjši od lOOmL oz. je približno enak lOOmL oz. še bolje je točno lOOmL ali povedano drugače vsota notranjih volumnov vseh prekatov ni manjša od lOOmL oz. je približno lOOmL oz. še bolje je enaka lOOmL.

[22] Pri eni izvedbi je nosilec vzorcev po možnosti (preferenčno) izdelan tako, da vsebuje 24 prekatov, razdeljenih na osem skupin s po tremi prekati, kar pomeni po tri ponovitve vsake od osmih različnih prostornin, ki sledijo vzorcu linearne porazdelitve. Prostornine po vzorcu linearne porazdelitve so torej Vi = Vi (prostornina najmanjše trojice), V₂ = 2Vi, V₃ = 3V_h V₄ = 4V_b V₅ = 5V_b V₆ = 6V_bV₇ = 7Vi in V₈ = 8Vi ali x (prostornina najmanjše trojice), 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x in 8x. Prostornine modela so po možnosti: Vi = 0,926 ml, V₂ = 1,852 ml, V₃ = 2,778 ml, V₄ = 3,704 ml, V₅ = 4,63 ml, V₆ = 5,556 ml, V₇= 6,481 ml in V₈ = 7,407 ml. Skupna notranja prostornina vseh prekatov je 100 ml, kar ustreza standardom ISO 7899-1, ISO 9308-3 in ISO 9308-2.

[23] Pri eni izvedbi prekate modela za porazdelitev vzorcev predstavljajo cilindrični stolpci. Primer takšne izvedbe je prikazan na Slikah 1-3. Trojice cilindričnih prekatov obsegajo prostornine Vi, ki je najmanjša prostornina, V₂ = 2V_b V₃ = 3Vi, V₄ = 4V_b V₅ = 5V_b V₆ = 6Vi, V₇ = 7Vi in V₈ = 8Vi, kar torej predstavlja linearno porazdelitev različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno in 8-kratno prostornino. Cilindrični prekati so organizirani v vijačno ali spiralno strukturo. Višinska razlika med sosednjimi prekati naj bo po možnosti približno 5 mm. Celotna višina modela je lahko na primer približno 116 mm in celoten premer modela je lahko na primer 120 mm (Sliki 2A in 2B). Po možnosti naj bo prisoten 5-milimetrski centralni kanal, ki vodi iz enega prekata v drugega.

[24] Razporeditev prednostne izvedbe modela je povezana z usklajeno (harmonizirano) porazdelitvijo vzorca v prekate, pri kateri vsebina vsakega prekata ni v stiku z vsebino sosednjih prekatov. Torej med polnjenjem vzorca v model za porazdelitev vzorcev začnemo s prvim prekatom s prostornino V₈ (Slika 2); ko je prekat napolnjen, voda neprekinjeno teče v naslednji prekat. Ko je drugi prekat napolnjen, voda nadaljuje v tretji prekat in tako naprej. Na koncu vsebina prekata ne more biti v stiku z vsebino v ostalih (sosednjih) prekatih.

[25] Ker model opredeljuje relativno linearno porazdelitev prostornin, je absolutna prostornina na prekat pri izvedbi modela za porazdelitev vzorca s cilindričnimi prekati odvisna od polmera ali premera vsakega cilindričnega prekata; skladno s tem višina vsakega cilindričnega prekata prav tako sledi linearnemu vzorcu.

[26] Pri primeru, ki ne navaja omejitev, je premer točno ali približno 14 mm, zato so višine prav tako skladno z linearnim vzorcem porazdelitve naslednje: vi = 6,01 mm, v₂ = 12,03 mm, v₃ = 18,05 mm, v₄ = 24,06 mm, v₅ = 30,08 mm, v₆ = 36,09 mm, v₇ = 42,10 mm in v₈ = 48,12 mm. Višinska razlika med sosednjimi prekati je po možnosti lahko približno 5 mm. Celotna višina modela je po možnosti približno 116 mm in celoten premer modela je po možnosti približno 120 mm.

[27] Pri zadevni izvedbi je mogoče prostornino najmanjše od osmih prostominskih trojic (Vi) izračunati na naslednji način:

3Vi + 3 x 2Vi + 3 χ 3Vi + 3 x 4Vi + 3 x 5Vi + 3 χ 6Vi + 3 x 7Vi + 3 x 8Vi = 100 ml.

[28] Skupna prostornina vzorca v nosilcu je v tem primeru torej 108 χ Vi = 100 ml, V i = 0,926 ml = 0,926 cm³.

[29] Pri še enem vidiku so prostornine osmih trojic (vsaka trojica prostornin sledi vzorcu linearne porazdelitve) navedene v Preglednici 1 spodaj:

Preglednica 1

Oznaka prostornine	Prostornina (ml ali cm³)	Število ponovitev iste prostornine
Vj	0,926	3
V₂	1,852	3
V₃	2,778	3
v₄	3,704	3
v₅	4,63	3
v₆	5,556	3
v₇	6,481	3
v₈	7,407	3

[30] Pri prednostni izvedbi je model za porazdelitev vzorcev cilindrične oblike in so prekati modela za porazdelitev vzorcev cilindrične oblike z enakim premerom, po možnosti približno 14 mm, pri čemer pa višina korelira z želeno prostornino vsake trojice (in sledi vzorcu linearne porazdelitve). Višine je mogoče izračunati na naslednji način:

PU ^v = kjer je v višina vsake trojice prekata in r polmer vsakega prekata.

[32] Višine so po možnosti takšne, kot je navedeno spodaj v Preglednici 2, kjer so vrednosti za višino približne vrednosti:

Preglednica 2

Oznaka višine	Višina (mm)	Število ponovitev iste prostornine
Vi	6,01	3
V2	12,03	3
V3	18,05	3
V₄	24,06	3
Vs	30,08	3
V«	36,09	3
V7	42,10	3
V8	48,12	3

[33] Poleg tega je pri prednostni izvedbi model za porazdelitev vzorcev izdelan po možnosti iz hidrofobnega materiala - plastičnega hidrofobnega ali drugega hidrofobnega materiala, kar preprečuje medsebojne vplive in pretakanje vode med sosednjimi prekati ali pa plastičnega materiala s hidrofobnim premazom vsaj po delu površine ali po celotni površini, ki je obrnjena v notranjost modela za porazdelitev vzorcev.

[34] Pri nadaljnjem vidiku prednostne izvedbe je mogoče stožčast plastičen modul povezati s prvim prekatom modela, da omogočimo bolj enakomeren (harmoniziran) pretok vodnega vzorca in nadaljnjo porazdelitev po naslednjih prekatih.

[35] Pri drugih izvedbah modela za porazdelitev vzorcev se lahko število prekatov razlikuje, pri čemer pa se ohrani linearen vzorec porazdelitve različnih prostornin in skupna notranja prostornina 100 ml. Število prekatov lahko znaša od vsaj 9 do največ 60. S skupaj 9 prekati stranke dobijo grobo oceno najverjetnejšega števila mikroorganizmov pri ekstremno nizkem številu bakterij. Poudariti velja tudi, daje pri izvedbi modela za porazdelitev vzorcev s 60 prekatiprostomina najmanjše trojice prekatov 158 μΐ, kar nakazuje na višjo veijetnost tehnične napake pri oblikovanju trojice prekatov z najmanjšo prostornino, ki nastane tekom proizvodnje. Skladno s tem prednostna izvedba predstavlja skupno 24 prekatov.

[36] Pri prilagojenih izvedbah so mogoče tudi druge oblike modela (pravokotne, okrogle ali druge) in/ali druge velikosti (dimenzije) modela za porazdelitev vzorcev v smislu višine modela in širine (oz. polmera ali premera) modela in/ali druge oblike posameznega prekata (pravokotne, okrogle ali druge) in/ali druge dimenzije posameznega prekata v smislu višine posameznega prekata in širine (oz. polmera ali premera) posameznega prekata (tako, da se ohranijo vrednosti volumnov pri danem številu različnih volumnov, ki sledijo shemi linearne porazdelitve in dani ponovitvi števila prekatov z istim volumnom), in/ali drugih dimenzij (širine in/ali globine) centralnega kanala med prekati in/ali višinske razlike med sosednjimi prekati.

[37] Pri drugih izvedbah zunanja oblika modela ni omejena na cilindrično obliko, oblika prekatov pa prav tako ni omejena na cilindrično, čeprav je preferirana zaradi enakomernega pretoka vode po napolnitvi prekatov.

[38] V drugi izvedbi tega izuma je model za porazdelitev vzorcev lahko okrogle oblike, podoben petrijevki. Struktura, podobna petrijevki, obsega dva dela. En del predstavlja pokrov. Drugi del je diskaste oblike in na specifičen način razdeljen na prekate. Disk je razdeljen v krožne izseke (osem krožnih izsekov) s koti 10°, 20°, 30°, 40°, 50°, 60°, 70° in 80°. Vsak krožni izsek je nadalje razdeljen na tri prekate z dvema obročema (krožnicama). Pri alternativni izvedbi modela za porazdelitev vzorcev z okroglo strukturo, podobno petrijevki, je disk, ki tvori prekate in je razdeljen na krožne izseke (devet krožnih izsekov) s koti 8°, 16°, 24°, 32°, 40°, 48°, 56°, 64° in 72°.

Pri tej zunanji obliki modela za porazdelitev vzorcev je vsaka različna prostornina prekata prisotna trikrat (v triplikatu).

[39] V drugi izvedbi tega izuma je nosilec vzorcev pravokotne zunanje oblike, njegovi prekati pa model za porazdelitev vzorcev delijo na pravokotne odseke z opredeljenim številom prekatov z definiranim številom prekatov z različnimi prostorninami, ki sledijo vzorcu linearne porazdelitve in definiranim številom ponovitev iste prostornine (prekati so organizirani v definirano število različnih prostornin pri čemer ima vsaka različna prostornina določeno število ponovitev)Po možnosti je tukaj prav tako vsaka različna prostornina prekata prisotna trikrat (v triplikatih) (opredeljeno število prekatov z različnimi prostorninami, pri čemer se vsaka različna prostornina ponovi trikrat).

[40] Pri prednostni izvedbi nosilca vzorcev z diskasto in/ali pravokotno zunanjo obliko vsota prostornin prekatov ni manjša od 100 ml oz. je približno lOOmL oz. še bolje je točno 100 ml, kar je skladno s standardi ISO.

[41] Pri enem vidiku so prostornine prekatov, ki tvorijo isti krožni izsek enake.

[42] Pri drugem vidiku posamezne prostornine vsakega tripleta prekatov, ki pripadajo vsakemu od osmih definiranih krožnih izsekov, sledijo linearnemu vzorcu prostornin x, 2x» 3x, 4x, 5x, 6x, 7x in 8x.

[43] Pri prednostni izvedbi, kjer vsota prostornin ni manjša od 100 ml oz. po možnosti približno 1 OOmL, so prostornine prekatov, kot sledi: 0,925 ml za vsakega od treh prekatov znotraj krožnega izseka 10°, 1,852 ml za vsakega od treh prekatov znotraj krožnega izseka 20°, 2,778 ml za vsakega od treh prekatov znotraj krožnega izseka 30°, 3,704 ml za vsakega od treh prekatov znotraj krožnega izseka 40°, 4,63 ml za vsakega od treh prekatov znotraj krožnega izseka 50°, 5,556 ml za vsakega od treh prekatov znotraj krožnega izseka 60°, 6,481 ml za vsakega od treh prekatov znotraj krožnega izseka 70°, in 7,407 ml za vsakega od treh prekatov znotraj krožnega izseka 80°.

[44] Višina petrijevki podobnega modela za porazdelitev vzorcev ni pomembna, enako velja za debelino robov, ki tvorijo vsak prekat.

[45] Pri prednostni izvedbi je model za porazdelitev vzorcev izdelan po možnosti iz hidrofobnega materiala - plastičnega hidrofobnega ali drugega hidrofobnega materiala, kije primeren za zadrževanje frakcij tekočega vzorca v skladu s fizikalnimi lastnostmi površinske napetosti ali pa plastičnega materiala s hidrofobnim premazom vsaj po delu površine ali po celotni površini, ki je obrnjena v notranjost modela za porazdelitev vzorcev.

[46] Pri prednostni izvedbi je model za porazdelitev vzorcev vezan na metodo MPN za zaznavanje mikroorganizmov v vzorcih pitne vode kot idealnem primeru, kjer je povprečno skupno število prisotnih bakterij med 30 in 40 CFU/100 ml vzorca vode. Zakonodaja zahteva manj kot 100 CFU/ml vzorca vode pri določanju celokupnega števila mikroorganizmov po inkubaciji pri 36 °C in brez neobičajnih sprememb pri določanju celokupnega števila kolonij mikroorganizmov pri 22 °C. Po izračunu 95odstotnih intervalov zaupanja za vsako statistično oceno najveijetnejše koncentracije bakterij je metoda zelo natančna za določanje celokupne koncentracije bakterij do 60 CFU/100 ml vzorca pitne vode.

[47] Pri drugem vidiku je mogoče uporabiti več materialov za izdelavo navedenega nosilca vzorcev, na primer polietilen tereftalat glikol (PETG).

[48] Pri prednostni izvedbi se predmetni izum nanaša na metodo MPN za zaznavanje mikroorganizmov, ki vključuje dodajanje sterilnega liofiliziranega gojišča v prahu v vzorec tekočine, na primer pitne vode. Gojišče je lahko selektivno kromogeno gojišče za zaznavanje E. coli in drugih koliformnih bakterij, ki vsebuje dva različna kromogena reagenta, enega specifičnega za E. coli in drugega specifičnega za druge koliformne bakterije. Kromogen, kije selektiven za ciljne bakterije E. coli, cilja na za E. coli specifično β-glukuronidazo in vsebuje kromofor, povezan z β-D-glukuronidom. Kromogen, selektiven za druge koliformne bakterije, alternativno cilja na za ostale koliformne bakterije specifično β-galaktozidazo in ima drug kromofor, priključen na β-D-galaktopiranozid.

[49] Druge izvedbe predmetnega izuma, ki se nanašajo na zaznavanje E. coli in drugih koliformnih bakterij, na osnovi metode MPN v vzorcu pitne vode lahko vključujejo tudi uporabo drugih možnih selektivnih kromogenih gojišč. Zaznavanje pozitivnih izidov vključuje spremembo barve vzorca zaradi akumulacije kromofora in spremembo absorpcijsko - emisijskega spektra vzorca.

[50] Druge izvedbe tega izuma, ki se nanašajo na zaznavanje E. coli in drugih koliformnih bakterij v vzorcu pitne vode z metodo MPN,lahko vključujejo dodajanje sterilnih liofiliziranih fluorogenih (in kromogenih) gojišč v vzorec vode. Fluorogeno gojišče lahko na primer vsebuje monosaharid, priključen na fluorofor, in monosaharid, priključen na kromofor - oba ciljata na različne skupine bakterij, tj. eden specifično cilja E. coli in drugi specifično cilja druge koliformne bakterije. V tem primeru metoda zaznavanja pozitivnih izidov vključuje emtiranje svetlobe s specifično valovno dolžino po vzbuditvi (ekscitaciji) s svetlobo specifične valovne dolžine znotraj UV spektra valovne dolžine na osnovi naraščanja intenzitete emitirane svetlobe s specifično valovno dolžino zaradi akumulacije fluorofora.

[51] Druge izvedbe tega izuma se lahko poleg tega nanašajo na zaznavanje enterokokov v vzorcu pitne vode z metodo MPN.

[52] Druge izvedbe tega izuma se nadalje nanašajo na metodo MPN za zaznavanje enterokokov v vzorcu pitne vode, ki lahko vključuje dodajanje sterilnih, liofiliziranih selektivnih kromogenih ali fluorogenih gojišč za zaznavanje enterokokov, ki vsebujejo s kromogene (ali fluorogene) substrate, specifične za enterokoke.

[53] Nadaljnje izvedbe tega izuma se nanašajo na zaznavanje drugih vrst bakterij, npr. Legionella sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp. in drugih v pitni vodi, z metodo MPN, ki vključuje izbiro primernih selektivnih gojišč, ki so lahko kromogena ali fluorogena.

[54] Nadaljnje izvedbe izuma lahko vključujejo zaznavanje celokupnih bakterij ali v pitni vodi z metodo MPN, ki znova vključuje izbiro primernega gojišča, ki vsebuje reagente za zaznavanja prisotnosti mikrobov.

[55] Druge izvedbe tega izuma se lahko poleg tega nanašajo na metodo MPN za zaznavanje mikroorganizmov v vzorcih odpadnih voda. Pri njih je predlagano primemo predhodno redčenje vzorca za doseganje koncentracijskega območja za optimalno, natančno in statistično relevantno opredelitev ocene najveijetnejšega števila mikroorganizmov z ozkimi 95-odstotnimi intervali zaupanja (statistično natančne rezultate) pri definirani strukturi (geometriji) modela za porazdelitev vzorcev.

[56] Nadaljnje izvedbe tega izuma lahko vključujejo zaznavanje E. coli in/ali drugih koliformnih bakterij, enterokokov, celokupnih bakterij ali drugih specifičnih skupin (ali vrst) bakterij v vzorcu odpadne vode s selektivnimi fluorogenimi, kromogenimi ali drugimi primernimi gojišči, podobno kot pri vzorcih pitne vode.

[57] Vse opisane izvedbe tega izuma so lahko povezane z avtomatizirano metodo zaznavanja, ki vključuje spremembo barve in/ali intenzivnosti fluorescence.

[58] Pri vseh opisanih izvedbah je prednost predmetnega izuma ta, da zagotavlja zelo natančne statistične rezultate v območju koncentracije mikroorganizmov v pitni vodi (do 60 CFU na 100 ml) kljub razmeroma nizkemu številu prekatov, saj prostornine sledijo linearni regresiji.

PRIMERI

Primer 1 - dokazovanje koncepta boljše statistike modela in zagotavljanje natančnejših

rezultatov po linearni porazdelitvi prostornine v prekatih V tem primeru sta bili upoštevani dve zasnovi modela. Prva je zasnova z linearno porazdelitvijo prostornin, tj.
Oznaka prostornine	Prostornina (ml ali cm³)	Število ponovitev iste prostornine
V!	0,926	3
v₂	1,852	3
V₃	2,778	3
v₄	3,704	3
v₅	4,63	3
v₆	5,556	3
v₇	6,481	3
v₈	7,407	3
kjer je Vi = V_b V₂ = 2V_b V₃ = 3V_b V₄ = 4Vi, V₅ = 5V_b V₆ = 6V_b V₇ = 7V_b V₈ = 8Vi V drugem primeru lahko imamo eksponentno porazdelitev prostornin s konstantnim razmerjem med sosednjimi različnimi prostorninami.
Oznaka prostornine	Prostornina (ml ali cm³)	Število ponovitev iste prostornine
Vj	0,131	3
V₂	0,262	3
v₃	0,524	3
V₄	1,048	3
V_s	2,096	3

^v« 4,192 3--------------------------- 8,384 ~ 3 ---------V« ~ ~ 16,768 3 ' “----------Intervali zaupanja so bili izračunani s programsko opremo RStudio in narisani z linearno funkcijo. Praviloma bi se morali intervali razširiti z večanjem ocene najveijetnejšega števila, če jih narišemo v obliki linearne funkcije intervalov zaupanja.

Rezultate za linearno in eksponentno porazdelitev prostornin so predstavljeni na Sliki 4 oz. 5.

Pri linearni porazdelitvi prostornine je mogoče opaziti razmeroma ozke intervale zaupanja do 0,6 CFU/ml ali 60 CFU/100 ml vzorca vode, ki se povečujejo (širijo) linearno (Slika 4). Če izberemo linearno porazdelitev intervalov prostornin, je mogoča razmeroma večja prilagodljivost glede števila prekatov, saj najmanjša prostornina prekata 130-150 μΐ pri linearni porazdelitvi, ki vsebuje 20 trojic (triplikatov) različnih prostornin, pri eksponentni porazdelitvi prostornine pa najmanjšo prostornino 130 μΐ dosežemo, ko model obsega 8 trojic (triplikatov) različnih prostornin, kot je razvidno iz slike. Pri linearni porazdelitvi prostornin se torej prostornine zmanjšujejo počasneje in je mogoče model za porazdelitev vzorcev opremiti z več prekati kot pri eksponentni porazdelitvi prostornin.

V primeru eksponentne porazdelitve prostornin za primerjavo (Slika 5) opazimo širše intervale zaupanja v primeijavi z linearno porazdelitvijo modela, vendar so gosti pri večjem razponu do 100 CFU/100 ml vzorca vode. Dodatno se pri eksponentni porazdelitvi intervali zaupanja ne povečujejo povsem linearno, ampak je mogoče opaziti pasove nekoliko širših intervalov.

Iz tega sklepamo, da se linearna porazdelitev prostornin obnaša ugodneje, čeprav v ožjem razponu koncentracije mikroorganizmov.

Primer 2 - vzpostavitev linearne umeritvene krivulje, ki prikazje razmerje med koncentracijo E. coli in optično gostoto (OG)

Ustvarili smo linamo umeritveno krivuljo E. coli, ki prikazuje razmerje med dejanskim številom bakterij in optično gostoto. E. coli smo z ezo dodali v sterilno destilirano vodo do optične gostote (OG) 1. Nato smo izvedli serijo 2-kratnih redčitev izvorne suspenzije. Pri vsaki redčitvi smo nato prešteli pripadajoče število celic z Neubaueijevo števno komoro in izmerili optično gostoto. Spodnja Preglednica 3 in graf na Sliki 6 predstavljata rezultate s trendnimi črtami (Slika 6).

Primer 3 - Potrditev linearne umeritvene krivulje E. coli

V Primeru 3 smo potrdili linearno umeritveno krivuljo E. coli iz Primera 2. Za dokaz koncepta MPN moramo pripraviti izvorno suspenzijo v koncentracijskem rangu nekje 10 ⁸ CFU/mL. Zato smo pri potrditvi umeritvene krivulje preverili, ali je za pripravo izvorne bakterijske suspenzije v koncentracijskem rangu nekje 10⁸ CFU/mL za kasnejše poskuse bolj primerna OG 0,1 ali 0,2.

V predmetnem Primeru 3 je bila E. coli z ezo nacepljena v 3 ml sterilne destilirane vode do dveh različnih optičnih gostot (OG) 0,1 in 0,2. Nato sta bili pripravljeni seriji 10-kratnih redčitev vzorcev kot v Sliki 7 (Slika 7) , pri čemer je bilo 300 μΐ predhodnega razredčenega vzorca (predhodne redčitve) prenesenih v 2700 μΐ sterilne destilirane vode (dH₂O).

Pri OG 0,2 je bilo 1 ml redčitev 10^, 10Λ ΙΟ⁸, ΙΟ⁹, ΙΟ’¹⁰ in 10¹¹, prenesenih k 99 ml sterilne destilirane dH2O, filtriranih skozi celulozni filter z velikostjo por 0,45 pm in nato nanešenih na rehidrirano, trdno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče, specifično za E. coli in koliformne bakterije. Pri OG 0,1 je bilo 1 ml redčitev 1(T⁷, ΙΟ-⁸, ΙΟ'⁹, ΚΓ’⁰, ΙΟ¹¹ in 10~¹², prenesenih v 99 ml sterilne destilirane dH2O, filtriranih skozi celulozni filter z velikostjo por 0,45 pm in nato nanešenih na rehidrirano, trdno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče, specifično za E. coli in koliformne bakterije. Po prekonočni inkubaciji je sledilo štetje kolonij. Postopek je prikazan na Sliki 7.

Rezultati so pokazali, daje 0,1 boljša OG izvorne suspenzije pri poskusih za dokazovanje koncepta.

_____________183________20_________3___________1___________0__________0__________/__________ —2^____s_____i__ p p p

Glede na ugotovljen optimalen OG izvorne suspenzije E. coli bomo nato pripravili ustrezno izvorno suspenzijo v koncentracijskem rangu nekje 10 ⁸ CFU/mL. Izvorno suspenzijo E. coli bomo pripravili z nacepljanjem kolonij E. coli na trdnem gojišču v sterilno destilirano dH₂O do ugotovljenega optimalnega OD. Na omenjeni izvorni suspenziji celic E. coli z znano koncentracijo bakterij bomo nato v sklopu dokazovanja koncepta v Primeru 4 v nadaljevanju naredili serijo redčitev izvorne suspenzije v dveh ponovitvah. ImL ene ponovitve serije redčitev izvorne suspenzije celic E. coli bomo dodali k 99mL sterilne destilirane dH₂O, nato bomo dodali liofilizirano, sterilno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče specifično za E. coli in koliformne bakterije in nanesli na model za porazdelitev vzorcev skupaj z negativno kontrolo, ki predstavlja zgolj lOOmL sterilne destilirane dH₂O z liofiliziranim, sterilnim, selektivnim, kromogenim, diferencialnim gojiščem, specifičnim za za E. coli in koliformne bakterije. Hkrati bomo 1 mL druge ponovitve serije razredčenih vzorcev dodali k 99mL sterilne destilirane dH₂O, filtrirali skozi celulozni filter z velikostjo por 0,45 pm in filter dodali na rehidrirano, trdno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče, specifično za E. coli in koliformne bakterije. Negativna kontrola v tem primeru predstavlja 100 mL sterilne destilirane dH₂O, ki jo filtriramo skozi celulozni filter z velikostjo por 0,45 pm in filter dodamo na rehidrirano, trdno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče, specifično za E. coli in koliformne bakterije (Primer 4).

Primer 4 - Dokaz koncepta modela MPN

V predmetnem Primeru 4 E. coli τ ezo nacepimo v 6 ml sterilne destilirane vode do primerne optične gostote. Nato izvedemo serijo redčitev na izvorni suspenziji celic E. coli v dveh ponovitvah, kot je navedeno na Sliki 8 (Slika 8). ImL ene ponovitve serije redčitev izvorne suspenzije celic E. coli bomo dodali k 99mL sterilne destilirane dH₂O, nato bomo dodali liofilizirano, sterilno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče specifično za E. coli in koliformne bakterije in nanesli na model za porazdelitev vzorcev skupaj z negativno kontrolo, ki predstavlja zgolj lOOmL sterilne destilirane dH₂O z liofiliziranim, sterilnim, selektivnim, kromogenim, diferencialnim gojiščem, specifičnim za za E. coli in koliformne bakterije. Hkrati bomo 1 mL druge ponovitve serije razredčenih vzorcev dodali k 99mL sterilne destilirane dH₂O, filtrirali skozi celulozni filter z velikostjo por 0,45 pm in filter dodali na rehidrirano, trdno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče, specifično za E. coli in koliformne bakterije. Negativna kontrola v tem primeru predstavlja 100 mL sterilne destilirane dH₂O, ki jo filtriramo skozi celulozni filter z velikostjo por 0,45 pm in filter dodamo na rehidrirano, trdno, selektivno, kromogeno, diferencialno gojišče, specifično za E. coli in koliformne bakterije (Primer 4).

Claims

ZAHTEVKI

1. Metoda za določitev najveijetnejšega števila bakterij v tekočih vzorcih, značilna po naslednjih korakih:

(a) porazdelitev tekočega vzorca na manjše prostornine, katerih vrednosti sledijovzorcu linearne porazdelitve ali redčenje tekočega vzorca, da dobimo več redčitev izvornega vzorca na podlagi faktoijev redčenja, katerih vrednosti sledijo vzorcu linearne porazdelitve;

(b) inkubacija; in (c) uporaba statistične metode najveijetnejšega števila na vzorcu, porazdeljenem na manjše prostornine, katerih vrednosti sledijo vzorcu linearne porazdelitve ali na redčitvah izvornega vzorca, katerih vrednosti sledijo vzorcu linearne porazdelitve za zaznavanje in/ali kvantifikacijo mikroorganizmov v izvornem vzorcu.
2. Metoda po zahtevku 1, pri čemer vzorec linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov zajema linearno porazdelitev prostornin prekatov na vsaj 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno in 5-kratno prostornino po možnosti pa na največ na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno, 8-kratno, 9-kratno, 10-kratno, 11-kratno, 12-kratno, 13-kratno, 14-kratno, 15-kratno, 16kratno, 17-kratno, 18-kratno, 19-kratno in 20-kratno prostornino.
3. Metoda po zahtevku 1 ali 2, pri čemer je vzorec linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov izbran med naslednjimi vzorci linearne porazdelitve različnih priostomin prekatov: linearna porazdelitev prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno in 5-kratno prostornino;

linearna porazdelitev prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6kratno, 7-kratno in 8-kratno prostornino;

linearna porazdelitev prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6kratno, 7-kratno, 8-kratno in 9-kratno prostornino;

in vzorci linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov, ki sledijo, ustrezno povečane za naslednjo vrednost do linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov na največ 1-kratno, 2kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno, 8-kratno, 9-kratno, 10-kratno, 11-kratno, 12kratno, 13-kratno, 14-kratno, 15-kratno, 16-kratno, 17-kratno, 18-kratno, 19-kratno in 20-kratno prostornino;

po možnosti vzorec linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov obsega linearno porazdelitev različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno in 8-kratno prostornino.
4. Metoda po katerem koli od zahtevkov od 1 do 3, pri čemer vzorec linearne porazdelitve vrednosti prostornine ali faktoija redčenja obsega vsaj tri oz. po možnosti tri ponovitve za vsako različno prostornino v vzorcu linearne porazdelitve različnih prostornin.
5. Metoda po katerem koli od predhodnih zahtevkov od 1 do 4, pri čemer prostornina tekočega vzorca iz koraka (a) ni manjša od 100 ml, po možnosti znaša pribl. 100 ml, in/ali pri čemer tekoči vzorec iz koraka (a) vsebuje manj kot 100 CFU mikroorganizmov na 100 ml, po možnosti največ 60 CFU mikroorganizmov na 100 ml.
6. Metoda po katerem koli od predhodnih zahtevkov, pri čemer je tekoči vzorec pitna voda, po možnosti pitna voda, katere vzorec pred korakom (a) ni razredčen.
7. Metoda po katerem koli od predhodnih zahtevkov, pri čemer je vzorec tekočine odpadna voda, industrijska procesna voda in/ali voda iz narave (površinska voda), ki ga enkrat razredčimo pred obdelavo po koraku (a), po možnosti v razmerju 1:10, še bolje v razmeiju 1 : 100.
8. Metoda po katerem koli od predhodnih zahtevkov od 1 do 7, ki nadalje obsega predhodno pripravo suspenzije opredeljenega sterilnega liofiliziranega gojišča z reagenti za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov v prostornini tekočega vodnega vzorca, ki ni manjša od lOOmL, po možnosti približno 100 ml, še pred izvedbo koraka (a), nato pa porazdelitev tega tekočega vzorca v koraku (a) po modelu za porazdelitev vzorcev,
9. Metoda po katerem koli od predhodnih zahtevkov od 1 do 8, pri čemer je 95-odstotni interval zaupanja kvantifikacije mikroorganizma med 0,02 in 0,15 za izvedbo s 24 prekati.
10. Model za porazdelitev vzorcev uporaben za metodo za določitev najverjetnejšega števila bakterij, strukturiran za zadrževanje tekočega vzorca v več prekatih z različnimi prostorninami, ki sledijo linearni porazdelitvi.
11. Model za porazdelitev vzorcev po zahtevku 10, pri čemer so različni prekati zgrajeni ali dimenzionirani tako, da sledijo vzorcu linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov, izbranemu med katerimkoli izmed naslednjih vzorcev linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov:

linearna porazdelitev različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno in 5kratno prostornino;

linearna porazdelitev različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5kratno, 6-kratno, 7-kratno in 8-kratno prostornino;

linearna porazdelitev različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5kratno, 6-kratno, 7-kratno, 8-kratno in 9-kratno prostornino in linearna porazdelitev različnih prostornin prekatov ki sledijo, ustrezno povečane za naslednjo vrednost do linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov na največ 1-kratno, 2-kratno, 323 kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno, 8-kratno, 9-kratno, 10-kratno, 11-kratno, 12-kratno, 13-kratno, 14-kratno, 15-kratno, 16-kratno, 17-kratno, 18-kratno, 19-kratno in 20-kratno prostornino; po možnosti vzorec linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov obsega porazdelitev različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno in 8kratno prostornino.
12. Model za porazdelitev vzorcev po zahtevku 10 ali 11, pri čemer je vsaka različna prostornina prekatov znotraj vzorca linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov prisotna v trojicah (triplikatih, se ponovi trikrat), zato je opcijsko skupno število prekatov 15 pri linearni porazdelitvi različnih prostornin prekatov na 1-kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno in 5-kratno prostornino; skupno število prekatov 24pri linearni porazdelitvi različnih prostornin prekatov na 1-kramo, 2kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno in 8-kratno prostornino; in tako naprej vse do skupnega števila prekatov 60 prekatov pri linearni porazdelitvi različnih prostornin prekatov na 1kratno, 2-kratno, 3-kratno, 4-kratno, 5-kratno, 6-kratno, 7-kratno, 8-kratno, 9-kratno, 10-kratno, 11kratno, 12-kratno, 13-kratno, 14-kratno, 15-kratno, 16-kratno, 17-kratno, 18-kratno, 19-kratno in 20kratno prostornino.
13. Model za porazdelitev vzorcev po katerem koli od zahtevkov od 10 do 12, pri čemer je zunanja oblika modela za porazdelitev vzorcev lahko cilindrična, okrogla ali pravokotna.
14. Model za porazdelitev vzorcev po katerem koli od zahtevkov od 10 do 13 po možnosti cilindrične lahko pa tudi druge - pravokotne, okrogle ali druge - oblike in/ali druge dimenzije v smislu višine in širine - oz. polmera ali premera -, s prekati po možnosti cilindrične oblike, ki opredeljujejo navedeni vzorec linearne porazdelitve različnih prostornin prekatov, lahko pa tudi s prekati druge oblike pravokotne, okrogle ali druge oblike in/ali druge dimenzije v smislu višine in širine - oz. polmera ali premera - tako, da se ohranijo vrednosti volumnov pri danem številu različnih volumnov, ki sledijo shemi linearne porazdelitve in dani ponovitvi števila prekatov z istim volumnom — sosednji prekati so med seboj na različnih višinskih razlikah in so med seboj povezani s centralnim kanalom, ki je v principu lahko različnih dimenzij oz. širine in/ali globine
15. Model za porazdelitev vzorcev po zahtevku 12, kjer celokupno prostornino vzorca izrazimo kot V = 100 %, za vsako od treh ponovitev različnih prostornin prekatov, ki sledijo vzorcu linearne porazdelitve 1-kratna enota prostornine znaša 0,926 % od V, 2-kratna enota prostornine 1,852 % od V, 3-kratna enota prostornine 2,778 % od V, 4-kratna enota prostornine 3,704 % od V, 5-kratna enota prostornine 4,63 % od V, 6-kratna enota prostornine 5,556 % od V, 7-kratna enota prostornine 6,481 % od V in 8-kratna enota prostornine 7,407 % od V, pri čemer vsak odstotek prostornine vključuje dovoljeno odstopanje v višini ±10 %, po možnosti dovoljeno odstopanje ±5 %, še bolje pa dovoljeno odstopanje ±1 % in izbirno, če V = 100 % znaša 100 ml.
16. Model za porazdelitev vzorcev po katerem koli od zahtevkov od 10 do 15, ki ima okroglo zunanjo obliko (disk), razdeljen na krožne izseke po možnosti s koti (i) 10°, 20°, 30°, 40°, 50°, 60°, 70° in 80° ali (ii) s koti 8°, 16°, 24°, 32°, 40°, 48°, 56°, 64° in 72, ki sledijo vzorcu linearne porazdelitve in so nadalje razdeljeni na prekate z dvema koncentričnima obročema na način da prekati, ki pripadajo različnim krožnim izsekom sledijo linearni porazdelitvi prostornine in so prekati znotraj istega krožnega izseka prisotni v treh ponovitvah; ali s pravokotno zunanjo obliko, njegovi prekati pa model za porazdelitev vzorcev delijo na pravokotne sekcije z opredeljenim celokupnim številom prekatov, opredeljenim številom ponovitev iste prostornine prekatov in opredeljenim številom različnih prostornin prekatov, ki sledijo linearni porazdelitvi prostornine, pri čemer je v tem primeru prav tako vsaka različna prostornina prekata znotraj linearne porazdelitve prisotna v treh ponovitvah.
17. Model za porazdelitev vzorcev po katerem koli od zahtevkov od 10 do 16, pri čemercelotna notranja prostornina v modelu za porazdelitev vzorcev za zadrževanje vzorca ni manjša od lOOmL ali jepribližno lOOml oz. še bolje je točno lOOmL in/ali pri čemer skupna vsota notranjih prostornin vseh prekatov ni manjša od 100 ml oz. je približno lOOmL oz. še bolje je točno lOOmL.
18. Model za porazdelitev vzorcev po katerem koli od zahtevkov od 10 do 17, ki je izdelan po možnosti iz hidrofobnega materiala - plastičnega hidrofobnega ali drugega hidrofobnega materiala - ki je primeren za zadrževanje frakcij tekočega vzorca v skladu s fizikalnimi lastnostmi površinske napetosti in preprečuje medsebojne vplive in pretakanje vode med sosednjimi prekati ali pa plastičnega materiala s hidrofobnim premazom vsaj po delu površine ali po celotni površini, ki je obrnjena v notranjost modela za porazdelitev vorcev.
19. Model za porazdelitev vzorcev po katerem koli od zahtevkov od 10 do 18, pri čemer model za porazdelitev vzorcev nadalje obsega pokrov za preprečevanje izhlapevanja tekočine in/ali izmenjave tekočine med sosednjimi prekati modela za porazdelitev vzorcev.
20. Komplet delov, ki obsega model za porazdelitev vzorcev, kot je opredeljen v katerem koli od zahtevkov od 10 do 18, in vse reagente za zaznavanje vsaj enega specifičnega mikroorganizma, po možnosti reagente za zaznavanje koliformnih bakterij, vsaj reagente, ki so selektivni za Escherichia coli, izbirno dodatne reagente, selektivne za mikroorganizme Legionella sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp. in nadalje izbirno druge mikroorganizme.