CN114641579A - 液体样品中细菌计数的方法和用于该方法的样品保持器 - Google Patents

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Abstract

公开了用于检测和/或定量液体样品，特别是水样中微生物的方法，该方法包括以下步骤：(a)以线性分布模式将液体样品分布成多个不同的离散体积部分，或通过线性分布模式的稀释因子将液体样品稀释成多个稀释样品；(b)允许微生物生长；和(c)将最可能数法应用于线性分布的体积部分或线性稀释的稀释样品，以检测和/或定量微生物。本发明还公开了用于检测和/或定量液体样品中的微生物的样品保持器，其中样品保持器被构造成将液体样品保持在多个不同的隔室中，其中不同的隔室分别限定线性体积分布。

Description

液体样品中细菌计数的方法和用于该方法的样品保持器
技术领域
本发明涉及一种用于检测和/或定量液体样品中微生物例如细菌的方法，优选水样，并且还涉及一种特别有用于该方法的样品保持器。
背景技术
微生物(例如细菌)的检测和定量是一系列不同工业领域的关键问题：饮用水领域、废水领域、沐浴水领域、化学工业(油漆、颜料、着色剂、浆料的生产)、食品工业、堆肥和制药工业，至少有两个主要原因形成两种相反的反作用力。一方面，所有这些工业领域都面临着微生物污染，这损害了其产品的质量并同时影响使用者的健康。另一方面，它们承受着强大的监管压力。在饮用水领域，例如，饮用水指令(98/83/EC)要求水样中不存在大肠杆菌、肠球菌和大肠菌群。对于瓶装水，瓶装水样中也不应存在铜绿假单胞菌。
用于检测和估算/定量液体样品中微生物的众所周知的方法是最可能数方法(MPN方法)。该方法基于将分散在初始限定的欧几里得体积的液体样品中的未知总数的细菌细胞随机分布到较小欧几里得体积的离散隔室中。到目前为止，在MPN方法中使用两个不同系列的统计事件(统计操作)作为标准。第一个是制备一系列2x或10x样品稀释液。然后将样品的所有稀释液以多次重复分布在相同体积的孔(空间)中。第二个是含有限定数量(或细菌细胞密度)的样品以10x或2x体积比分布在不同体积之间，并具有相同体积的多次重复。因此，隔室的组成存在多种可能性-所有隔室可以具有相同的体积，或者隔室可以遵循具有2×或10×体积比的不同体积的体积模式。每个不同的体积可以以多次重复存在。这两种情况都是随机几何过程的基础，其中初始未知数量的细菌细胞预先稀释或不稀释，并进一步随机分隔或分布在限定的较小欧几里德体积的几个隔室之间，所述隔室可以具有关于不同体积的数量和相同体积的重复次数的特定组成-例如微孔板的孔或其模型修改-并最终存在于新的抽象欧几里德空间中的新的随机空间分布。此统计过程由两个步骤组成：首先，分隔在新的限定的特定欧几里德体积的隔室中的上述分隔未知初始数量的细胞(或其稀释液)的所有可能结果可以用泊松分布来解释。细菌样品的泊松概率函数的等式(表示j个细菌细胞将在限定体积的孔中的概率)可以描述为：
Figure BDA0003620374800000021
其中j表示孔中细菌细胞的数量，d是稀释因子，V是孔的体积，μ是初始细菌浓度(每毫升样品中最可能的细菌数量)，乘积dVμ定义了细菌细胞的数量。每个细菌细胞是独立于所定义的欧几里德数学位置中的其他点的点。在新的孔(或限定的隔室)或新的欧几里德随机空间中检测到至少单个细菌被解释为阳性结果，从而表明在所讨论的隔室中存在微生物。根据泊松分布计算相应隔室中不存在细菌的情况为：
Figure BDA0003620374800000022
因此，在具有相应体积的隔室中存在至少单个细菌的概率与在所讨论的隔室中不存在细菌细胞的概率相对，并且其计算公式为：
ppresence＝1-e-dVμ
然而，具有初始未知数量的细菌细胞的样品分布在不同限定的欧几里德体积(通常遵循10x或2x体积比的特定体积模式)的多个隔室之间，其中每个不同的体积以多次重复存在。因此，统计过程中的第二步是计算检测在相同体积和/或稀释度的所有隔室和所有不同体积下的相同体积和/或稀释度的多个(限定数量的)孔(相同体积和/或稀释度的重复)中至少单个细菌(阳性结果)的概率。在相同限定的稀释度和/或体积的多次重复(从一次到所有重复)中检测到阳性结果(至少存在单个细菌)的概率可以通过二项分布进一步解释。因此，计算在限定的欧几里德体积的相应孔中检测到至少单个细菌的概率(来自泊松分布)为我们提供了进一步的二项分布的加权概率，并使我们能够从二项分布族中选择特定的二项分布。例如，让我们描述具有x个不同体积和y个相同体积重复的系统。二项分布将描述具有相同体积和/或稀释度的y个隔室中的r个阳性隔室的概率，并且ppresence将描述由上述泊松分布计算的加权概率，该泊松分布描述存在于具有限定体积的隔室中的至少单个细菌细胞的概率。其中pabsence将描述在特定体积的隔室中不存在细菌细胞的加权概率：
Figure BDA0003620374800000031
然而，该系统由x个不同的体积组成，同一体积有y个重复。结果或最终结果由所有不同体积(从i＝1到i＝x)上的相同体积i的yi个重复中的阳性(ri)的数量来定义。MPN方法的最终结果由似然函数(L)描述，并且计算为对于每个不同体积(i＝1至i＝x)获得相同体积i的yi个重复中的阳性隔室(ri)(至少存在单个细菌细胞的隔室)的数量的二项分布概率的乘积。根据似然函数，可以计算似然函数的自然对数。对于上述具有x个不同体积和同一体积的y次重复的系统，该似然函数的自然对数关于μ的一阶导数可以描述为：
Figure BDA0003620374800000032
其中r是相同稀释度和/或体积的重复中限定的阳性孔数。基于定义的结果(在所有不同体积(从i＝1到i＝x)中的相同体积i的yi个重复中的一定数量的阳性(ri))的最可能的细菌浓度将是似然函数的自然对数最大时的μ，即其对μ的一阶导数为零时。从方程导出的μ是每毫升样品的微生物的最可能数的估计值。如果对相同初始细菌浓度进行无限次分析，则每毫升样品的细菌细胞的最可能数的估计值将预测地遵循具有群体平均μp的正态分布-表明细菌细胞的确切(实际)数量和群体标准差σμp。从无限的测量群体中获取测量样品，测量样品预测地遵循具有样品平均值μs和样品标准差Sμs的t(t-student)分布。根据每个样品平均值和样品标准差，可以计算区间，其表明μ值的范围(在上限和下限之间)，在该范围内有95％的概率样品中的细菌细胞的实际数量存在，即95％置信区间。还从样品测量的群体中进行无限数量的样品测量；每个样品测量定义其自己的1)样品平均值μs，2)样本标准差Sμs和3)95％置信区间，95％置信区间中的95％将包含群体平均μp，因此细菌细胞的确切或实际数量。在通过使自然对数似然函数一阶导数相对于μ相等来计算最可能数的估计值后，MPN估计值的方差可以被计算为似然函数的自然对数的二阶导数相对于μ。从方差可以计算出MPN估计值的标准差估计值，并且可以通过将MPN估计值的标准差的估计值除以MPN估计值来计算MPN估计值的自然对数的标准差的估计值。根据MPN估计值的自然对数的标准差的估计值，95％置信区间计算为：
Figure BDA0003620374800000041
Figure BDA0003620374800000042
其中Slnμ是MPN估计值μ的自然对数的标准差的估计值。Ilower limit是95％置信区间的下限，Iupper limit是95％置信区间的上限。
每个先前描述的工业领域要么对检测存在的总细菌感兴趣，要么针对确定的细菌种类(例如大肠杆菌)或确定的细菌群(例如大肠菌群)的存在。通过选择性差异显色或荧光培养基可以获得针对目标细菌群的阳性结果。选择性差异显色组分是底物与发色团或荧光团的缀合物，所述底物靶向在所有细菌界、特定细菌群(如大肠菌群)或特定细菌种类(如大肠杆菌)中保守的酶。如果存在目标微生物群，则酶的存在会诱导利用和释放荧光团或发色团的底物的化学反应。因此，荧光团或发色团在酶反应期间积累。发色团在释放和积累时诱导培养基的颜色变化，而荧光团在释放和积累时诱导荧光强度的增加。已经开发了许多选择性差异显色培养基用于检测大肠杆菌和大肠菌群以及检测肠球菌，例如来自ChromAgar的AquaChromTMECC和AquaChromTMEnterococcus，来自Idexx的
Figure BDA0003620374800000043
和
Figure BDA0003620374800000051
或来自HyServe的EC BlueTM。这些选择性显色培养基含有选择性色原。选择性色原是底物类似物-与发色团相连的底物-其被仅存在于目标细菌群中的酶切割。如果样品中存在细菌群并因此存在酶，则发色团将被切割并积累。由于其特定的吸收/发射光谱，产生的未结合的发色团将使样品具有特定的颜色。
已经开发了许多将这种培养基用于MPN的不同方法。其中之一是IdexxOuanitrayTM系统(美国专利号5,753,456)。该系统基于两个不同的托盘，即具有相同体积大小的51个孔的托盘或具有两个不同体积大小的97个孔的托盘。此外，许多不同的专利文献涉及改造基于MPN的方法和相应的用于细菌检测的样品保持装置，例如US 2017/0240949Al；US 2017/0247737 Al；WO 2016/051167 Al；US 2013/0189770 Al；US 2010/0136608Al；US 2010/0273209 Al；US 2005/0048597 Al；US 6,509,168 B2；美国专利号6,696,286Bl；美国专利号6,365,368Bl；美国专利号6,492,133Bl；美国专利号6,190,878 Bl；美国专利号4,868,110；英国专利Ap.GB 2 106 539。
专利文献中的现有技术样品保持器的隔室包括例如：含有0.1-100μL样品和试剂的微孔板(美国专利号6,190,878Bl)；由一个50mL、五个10mL和五个1mL隔室组成的MPN条带(英国专利Ap.GB 2106 539)；由五个10mL体积的孔、五个1mL体积的孔和五个0.1mL体积的孔以及孔之间的样品分布系统组成的样品保持器(US2013/0189770Al)；样品保持器，其通过径向组织的毛细通道经由毛细流动将样品分隔到离散的隔室中(US 2005/0048597 Al)；样品保持器(也称为SimplateTM)由分成多个至少20个凹孔的圆形培养板组成(US 6,509,168 B2)；样品保持器，由体积大小为0.01μL-25μL的多组微隔室组成(美国专利号6,696,286Bl)。
上述所有发明都有一定的局限性。一个限制通常是实际使用的复杂性。基于过滤器的方法在样品过滤后需要额外的冲洗和分析步骤，以获得所需的最可能细菌浓度，即每mL样品中最可能的细菌数。基于CO2的检测方法需要安装多个装置用于样品中微生物的实际定量；并且单独的CO2不能表明微生物是原核生物还是真核生物，然而在一些情况下，需要鉴定特定的细菌群或种类。
就样品保持器而言，本发明人已经将MPN方法的统计性质确定为主要问题，特别是考虑到维护某个期望的置信区间(CI)，其优选应为95％CI。具体地，根据MPN方法的统计分析的似然函数-根据定义的浓度值(μ值)描述所有结果的概率-对于某个μ值，并非所有结果都具有相同的概率。在MPN方法的情况下，基本上可以用更大数量的可能结果(更宽的μ估计值范围)获得更高数量的μ值估计值，并且同样地，基本上可以用样品保持器更大数量的总隔室数的获得更大数量的可能结果(因为更大理论数量的结果是可能的)。理想地，如果进行无限数量的稀释或者如果样品被分布在无限数量的具有无限小体积的隔室中，则理论上将获得最准确的结果(然后MPN估计值将等于样品中细菌细胞的实际数量)，然而这实际上是不可能的，因为它需要的隔室体积实际上在细菌大小的范围内，并且结果将无法解释。因此，在冲突目标之间找到折衷方案是一项挑战，并因此提供一方面简单性和另一方面统计准确性及可预测性的平衡。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种用于检测和/或定量液体样品中微生物的方法，该方法允许容易操作和简单的检测系统以及相关的简化的样品保持器和处理(但是不会损害)以获得微生物检测和计数的可靠结果。
通过如权利要求1所述的用于检测和/或定量液体样品中的微生物的方法以及通过提供如权利要求11所述的样品保持器来解决该目的。优选实施例分别在权利要求1相应从属权利要求和11中阐述。本发明还提供了一种如权利要求21所限定的套件，以及如权利要求21所限定的系统。
在根据本发明的方法中，存在于样品保持器隔室中的不同体积遵循线性分布模式，也意味着表示线性回归模式。可替代地对于遵循线性分布模式的不同分布体积(但遵循相同线性回归原理)，该方法可以进行以下步骤：通过遵循线性分布(或线性回归)模式的稀释因子将液体样品稀释成多个不同稀释度的样品，并且原则上将不同的稀释度(遵循线性分布模式)引入具有相同稀释度的多次可能重复的样品保持器(在替代实施例中)。根据这一共同原则，实际上找到了一种最佳模型，其在统计相关性和结果解释的容易性之间取得了平衡——一种简化的方法，其在细菌可预测的浓度范围内提供统计学上有代表性的结果，最多可以在所讨论的典型液体样品中预期。该方法特别提供了在0CFU(菌落形成单位)/100mL样品和小于100CFU/100mL样品，优选至多60CFU/100mL样品的微生物相关浓度范围内的统计学代表性结果。例如，在分析饮用水时，该概念考虑了每100mL中10和100CFU之间的预期浓度范围，而在分析废水时，预期浓度范围是上述的10倍，每100mL中100-1000CFU，然而，该原始情况可以通过适当的制备步骤被容易地解决，例如，对饮用水进行分析方法不稀释，而在对废水或工业产生的水进行分析方法之前进行适当的稀释。
基于呈现线性分布模式的原则，本发明的样品保持器可以体现在各种实施方案中。对于样品保持器的多个实施方案，还存在将样品保持器用于MPN(最可能数)方法的多个实施例，所述MPN方法用于检测和计数体积不小于100mL，优选地约100mL的液体样品中的细菌。液体样品可以选自例如饮用水、废水、工业处理水、沐浴水、再循环废水和地表水或天然水。使用样品保持器的所有实施方案都基于原始液体样品。可以向其中加入选择性冻干培养基并溶解在样品中。然后将具有溶解培养基的原始样品(含有一定浓度和一定数量的细菌)分布在隔室之间。存在已知总数的隔室，其遵循线性回归方案。隔室具有已知的(限定的)体积，已知的(限定的)不同体积的数目，其遵循线性回归模式，在优选的实施方案中，其至少是五倍，在递增线性回归集合的五个不同的体积分别为x、2x、3x、4x和5x，更优选是八倍，其中在递增线性回归集合中的八个不同的体积分别为x、2x、3x、4x、5x、6x、7x和8x，最高可达二十倍，其中在递增线性回归集合中的二十个不同的体积分别为x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、11x、12x、13x、14x、15x、16x、17x、18x、19x和20x(其中体积x表示线性回归集合的最小体积)，以及相同体积的已知(限定的)重复次数，其中该重复次数至少为3，优选为3。基于限定的不同体积的数量和限定的相同体积的重复次数，可以在简化但足够准确的系统中推导出隔室的总数；因此，隔室的总数优选不小于15，更优选至少为24(对应于8x乘以3)且至多为60(对应于20x乘以3)。在特别优选的实施方案中，样品保持器由具有8个不同体积的24个隔室组成，所述8个体积遵循V1＝x、V2＝2x、V3＝3x、V4＝4x、V5＝5x、V6＝6x、V7＝7x和V8＝8x的线性回归模式，或者如果x被称为最小体积V1，V1＝V1、V2＝2V1、V3＝3V1、V4＝4V1、V5＝5V1、V6＝6V1、V7＝7V1和V8＝8V1。由于隔室的所有内部体积的总和不小于100mL或优选地约100mL，因此遵循线性分布模式的不同体积为V1＝0.926mL、V2＝1.852mL，V3＝2.778mL、V4＝3.704mL、V5＝4.63mL、V6＝5.556mL、V7＝6.481mL和V8＝7.407mL。此外，在优选实施方案中，样品保持器由疏水材料-疏水塑料材料或其他疏水材料制成，其能够根据表面张力定律保留液体样品的一部分，并且使得相邻隔室间不会发生水的入射和流动，或者由具有疏水涂层的塑料材料制成，该疏水涂层涂覆至少部分或全部面向保持器内部空间的表面。此外，在优选实施方案中，样品保持器为圆柱形，并且样品保持器的隔室也为圆柱形。在其他实施方案中，样品保持器的形状可以是矩形、球形或其他形状，和/或可以设计成在高度和/或宽度(或半径)方面具有各种尺寸。在其他实施方案中，隔室的形状也可以是矩形、球形或其他形状，和/或可以设计成在高度和/或宽度(或半径)方面具有各种尺寸，然而以这样的方式使得每个隔室的体积在所有不同的体积(遵循线性模式)和在相同体积的每个重复上保持不变。在优选的实施方案中，隔室以锥形螺旋顺序组织，具有限定的隔室之间的距离和限定的曲率(隔室之间的高度距离)。在优选的实施方案中，隔室被组织成以逆时针螺旋向下移动向样品保持器的中心。在图1、图2A、图2B和图3所示的优选实施方案中，体积被组织成三联体(triplicate)，最外面的三联体开始逆时针螺旋(体积V8三联体)。在体积三联体V4处，螺旋转为顺时针螺旋，再次向下朝向样品保持器的中心移动。在其他实施方案中，螺旋的曲率可以不同，并且相邻隔室可以在不同的高度差上。而且，在其他实施方案中，相邻隔室之间的距离可以不同。此外，在其他实施方案中，螺旋的流向可以逆时针或顺时针地朝向中心向下移动或从中心朝向样品保持器的边缘向下移动。在优选的实施方案中，隔室通过中央通道连接，使得液体样品的流量能够协调一致。在其他实施方案中，中央通道可以具有不同的尺寸(深度和/或宽度)。在另一个优选实施例中，模型中增加了一个额外的隔室以补偿100mL水样在测量和采样中的误差。在一个具体实施方案中，所有隔室的总内部体积(所有隔室的内部体积的总和)不小于100mL，优选为100mL。此外，锥形塑料模块可以连接到模型的第一隔室，以使得水流量更协调一致并进一步分布到随后的隔室中。每单位体积的细菌的最可能数(MPN)的估计值的统计计算源自相同体积的所有重复和所有不同体积上有多少相同体积的隔室为阳性的结果(相同体积的所有重复中有多少相同体积的隔室含有至少一种微生物)，并且计算基于使似然函数的自然对数的一阶导数等于零。同时，从似然函数的二阶导数和从MPN估计值的标准差的估计来计算MPN估计值的方差的估计值和MPN估计值的标准差的估计值，通过将MPN估计值的标准差的估计值除以MPN估计值来计算MPN估计值的自然对数的标准差的估计值。基于期望应用的95％置信度，然后从最可能数的估计值和MPN(最可能数)估计值的自然对数的标准差的估计值计算置信区间，显示每单位体积的实际微生物数的概率为95％的微生物浓度区间。举例来说：对于由具有遵循线性相关模式的八个不同体积的24个孔组成的优选实施方案，其中每个不同体积以三联体存在，在MPN估计值较低时，例如每100mL水样1个细胞，MPN估计值的自然对数的标准差的估计值限制为或实际上达到值1。随着MPN估计值的增加，在MPN估计值为10CFU/100mL时，MPN估计值的自然对数的标准差的估计值降低至值0.4，并且在MPN估计值为30CFU/100mL时降低至值0.3，然后稳定，并且在MPN估计值为40CFU/100mL样品时仍然在约0.3。随着MPN估计值的进一步增加，标准差的范围在0.3和0.35之间。计算95％置信区间的下限和上限；在MPN估计值为1CFU/100mL样品时，95％置信区间的下限为0.001CFU/mL，上限为0.07CFU/mL。这在实践中意味着，通过计算，相应的100mL水样中的细胞的实际数量应在每100mL水样1至8个细胞之间变化，其中最可能的细胞数量为每100mL水样1个。在MPN估计值为10CFU/100mL时，95％置信区间的下限约为0.04CFU/mL，95％置信区间的上限约为0.2CFU/mL。这在实践中意味着，通过计算，相应的100mL水样中的细胞的实际数量应在每100mL水样4至20个细胞之间变化，其中最可能的细胞数量为每100mL水样10个。在MPN估计值为30CFU/100mL时，95％置信区间的下限为0.16CFU/mL，并且95％置信区间的上限为0.55CFU/mL。这在实践中意味着，通过计算，相应的100mL水样中的细胞的实际数量应在每100mL水样16至55个细胞之间变化，其中最可能的细胞数量为每100mL水样30个。在MPN估计值为40CFU/100mL时，95％置信区间的下限为0.2，95％置信区间的上限为0.7。这在实践中意味着，通过计算，相应的100mL水样中的细胞的实际数量应在每100mL水样20至70个细胞之间变化，其中最可能的细胞数量为每100mL水样40个。然而，在确定样品中存在的细胞的最小可能数(下限)时，还应始终观察24个隔室中的阳性的总数，因为每个阳性隔室指示相应的阳性隔室中至少存在单个细胞。此外，在其他实施方案中，可以开发自动化形式的样品保持器，使得能够从限定体积的所有重复中和所有不同体积上自动检测限定体积的阳性隔室，从结果自动计算最可能数的估计值，以及进一步自动生成或计算95％置信区间的上限和下限。用于MPN方法或液体样品中细菌的检测和计数的样品保持器的使用依赖于微生物样品的最可能浓度(每毫升样品的微生物的最可能数)的统计计算的特征。在从由两个概率函数(即泊松分布函数和二项分布函数)定义的自然对数似然函数的最大值分隔之后，微生物的最可能数可以从相应样品等分试样的稀释度和体积的每种可能组合导出；当似然函数的自然对数的一阶导数等于零时，出现最大似然。体积之间的比率不需要是恒定的，因此它不需要是2也不需要是10。可以应用不同数量的隔室，其具有特定组合的稀释度和体积。本发明有益地依赖于在较少数量的微生物(分别小于100CFU/100mL或优选在0CFU/100mL和60CFU/100mL之间)的水样的置信区间方面的统计学的改进(在较小的MPN估计值时95％置信区间是窄的，例如从0CFU/100mL至10CFU/100mL，并且进一步随着MPN估计值的增加而线性增加，因此MPN值的统计学相关估计可以在0CFU/100mL至60CFU/100mL之间的微生物的实际数量下得出结论)，这意味着统计对于模型的精确应用是改进的。较小数量的微生物(<100CFU/100mL，优选0CFU/100mL至60CFU/100mL)的窄区间是优选的，因为该模型的优选实施方案是用于饮用水，其中通常存在非常低浓度的微生物(0CFU/100mL至60CFU/100mL)或其中仅需要确认阴性结果(不存在微生物)。这是因为相应样品保持器的隔室的不同体积遵循线性回归模式。MPN方法的基本原理以及相应地将具有相应数量的隔室的样品保持器结构化以遵循线性回归模式，允许在方法处理的简易和简单性、样品保持器结构化与获得的微生物检测和计数结果的可靠性之间始终应用最佳值。
附图的简要说明
在附图中：
图1以俯视立体图示出了根据本发明的一个实施方式的样品保持器；
图2A和2B以平面图(图2A)和剖视图(图2B)示出了根据图1的实施方式的样品保持器；以及
图3以部分剖切的立体侧视图示出了根据图1的实施方式的样品保持器。
图4示出了在根据本发明的MPN方法使用体积的线性分布时的置信区间的结果。横轴表示对某一结果的MPN估计值，纵轴表示每毫升样品中细菌数量的实际值。垂直线表示置信区间。
图5示出了体积的指数分布时的置信区间的结果用于比较。横轴表示对某一结果的MPN估计值，纵轴表示每毫升样品中细菌数量的实际值。垂直线表示置信区间。
图6示出了在实施例2中建立的细菌的实际数量与光密度之间的相关曲线。
图7示出了实施例3中使用的样品的稀释和制备，以及
图8示出了实施例4中使用的样品的稀释和制备。
具体实施方式
本发明涉及基于“最可能数”(MPN)的方法和样品保持器的多种实施方案，该样品保持器用于MPN以鉴定饮用和废水样品中的微生物。
本发明涉及一种样品保持器，其由不同数量的隔室构成，即至少15个，优选24个，最多60个。隔室具有遵循线性分布模式的不同体积。每个不同的体积可能会出现多次重复。
适当地，线性分布模式至少为5倍，即具有遵循x、2x、3x、4x和5x的递增线性分布集合的五个不同体积，优选地并且优选地提供高达20倍的线性分布模式，即具有遵循x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、11x、12x、13x、14x、15x、16x、17x、18x、19x和20x的线性分布的20个不同体积。
因此，样品保持器可以被构造成提供相应数量的不同隔室，不同隔室的尺寸被设计成分别限定线性分布模式。因此，样品保持器以及由此的方法可以有益地使用以下线性体积分布模式中的任一种，其中不同体积遵循线性集合的线性递增分布：
1x倍、2x倍、3x倍、4x倍和5x倍体积分布；
1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍和8x倍体积分布；
1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍、8x倍和9x倍体积分布；
和随后的线性体积分布相应地增加更多的数量，高达1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍、8x倍、9x倍、10x倍、11x倍、12x倍、13x倍、14x倍、15x倍、16x倍、17x倍、18x倍、19x倍和20x倍体积分布。优选地，线性分布模式由1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍和8x倍体积分布组成。
在实际应用中，当体积分布的数量根据原始样品的类型(例如饮用水、废水、工业处理水、沐浴水和地表水或天然水)适应预期微生物的数量时，它是有用的并提供更可靠的结果。因此，线性分布中集合中在例如至少5倍且至多12倍的范围内的相对少量的线性分布的不同体积，特别是在8倍线性分布体积比例的不同体积的情况下，适合于相对纯的液体，诸如饮用水。另一方面，如果要分析相对不纯的液体样品，例如废水或工业用水，则更优选在线性分布集合中在例如至少12倍和至多20倍的范围内的相对大量的线性分布的不同体积。
考虑可替代地或结合要分析的液体类型的这种适应，优选进行方法步骤(a)的液体样品包含小于100CFU微生物/100mL，优选至多60CFU微生物/100mL。因此，如果液体样品是饮用水，则在使饮用水样品进行步骤(a)之前，饮用水有利地不必被稀释。另一方面，如果液体样品从废水、工业处理用水和/或天然水获得，则所述液体样品优选在使所述水样品进行步骤(a)之前稀释一次，优选稀释至少1:10，更优选稀释1:100。
在与样品保持器的任何变型和实施方案共同的优选实施方案中，限定线性分布模式的每个体积的相应隔室以每个相同体积的三联体存在。因此，相同体积在不同体积的线性分布集合中的重复次数至少为三次，优选为三次。这导致显著增强且统计上更可靠的结果。因此，根据上述线性分布的数量，在分析方法期间存在相应的x倍体积稀释度，并且相应地以三倍总数存在于样品保持器中。这意味着，任选地，在不同体积的1x倍、2x倍、3x倍、4x倍和5x倍线性分布的情况下，总共形成15个隔室；在不同体积的1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍和8x倍线性分布的情况下，总共形成24个隔室；以此类推，随着线性回归数量相应增加，多达形成60个隔室，即在不同体积的1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍、8x倍、9x倍、10x倍、11x倍、12x倍、13x倍、14x倍、15x倍、16x倍、17x倍、18x倍、19x倍和20x倍线性分布的情况下。
在具体示例性的实施方案和相关变型中，样品保持器的外部形状可以选自优选的圆柱形外部形状到其他形状，例如球形、矩形外部形状或其他可能的形状和/或在高度和/或宽度(或半径)方面的其他尺寸。独立于这种外部形状，每个隔室的形状可以适当地选择，例如优选地选自圆柱形隔室、矩形隔室、球形隔室或其他形状和/或在高度和/或宽度(或半径)方面的其他尺寸，但是以一种方式使得每个隔室的体积在所有不同的体积(遵循线性模式)和相同体积的每个重复下保持不变。优选地，样品保持器包括圆柱形隔室作为隔室，其分别限定所述线性体积分布模式，更优选地与本身具有圆柱形外形的包括这种圆柱形隔室的样品保持器组合。
在一个具体实施方案中，样品保持器被布置成限定不小于、优选约100mL的特定总体积，用于保持液体样品。当用于保持样品的这种特定总体积被给出为V＝100％时，并且当根据上述优选实施方案，限定线性分布模式的每个体积的相应隔室以三联体存在时，则对于线性分布模式的三个隔室中的每一个，1x倍单位体积为V的0.926％，2x倍单位体积为V的1.852％，3x倍单位体积为V的2.778％，4x倍单位体积为V的3.704％，5x倍单位体积为V的4.63％，6x倍单位体积为V的5.556％，7x倍单位体积为V的6.481％，8x倍单位体积为V的7.407％，其中每个体积百分比指示包括±10％的体积容差范围，优选±5％的体积容差范围，更优选±1％的体积容差范围。如上所述，就标准化而言，优选的是，执行该方法中步骤(a)的液体样品，或相应地，保持器中样品的总体积保持容量，具有不小于100mL，更优选为100mL的体积，因此上述V＝100％为100mL。
在一个实施方案中，样品保持器优选地构造成由24个隔室组成，分成八个三联体，因此具有八个不同体积的三个重复。然后，遵循线性分布模式的体积包括：V1＝V1(最小三联体的体积)，V2＝2V1，V3＝3V1，V4＝4V1，V5＝5V1，V6＝6V1，V7＝7V1和V8＝8V1或x(最小三联体的体积)，2x，3x，4x，5x，6x，7x和8x。模型的体积优选为：V1＝0.926mL，V2＝1.852mL，V3＝2.778mL，V4＝3.704mL，V5＝4.63mL，V6＝5.556mL，V7＝6.481mL和V8＝7.407mL。所有隔室的总内部体积不小于100mL，优选约100mL，这符合ISO标准ISO 7899-1、ISO 9308-3和ISO9308-2。
在一个实施方案中，圆柱形柱形成样品保持器中的隔室。这种实施方案的示例在图1-3中示出。圆柱形隔室各自以三联体包括构成最小体积的V1、V2＝2V1，V3＝3V1，V4＝4V1，V5＝5V1，V6＝6V1，V7＝7V1和V8＝8V1，从而表示1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x和8x倍线性体积分布。在优选的实施方案中，圆柱形隔室以锥形螺旋顺序组织，具有限定的隔室之间具有限定的距离和限定的曲率(隔室之间的高度距离，其优选地可以为约5mm)。在优选实施方案中，隔室被组织成以逆时针螺旋朝向样品保持器的中心向下移动。体积被组织成三联体，其中最外面的三联体(图1、2A、2B和3)从体积V8三联体开始左手螺旋。在体积V4三联体处，螺旋转向顺时针螺旋，再次朝向样品保持器的中心向下移动。在其他实施方案中，螺旋的曲率可以不同，并且相邻隔室可以处于不同的高度差上。此外，在其他实施方案中，相邻隔室之间的距离可以不同。在其他实施方案中，螺旋的流动可以逆时针或顺时针地朝向中心向下移动或从中心朝向样品保持器的边缘向下移动。模型的总高度可以是例如约116mm，并且模型的总直径可以是例如120mm(图2A和2B)。在优选实施方案中，隔室经由中央通道连接，该中央通道优选地具有5mm宽度，从而能够使得液体样品的流动协调一致。在其他实施方案中，中央通道可以具有不同的尺寸(深度和/或宽度)。在优选实施方案中，模型中增加了额外的隔室以补偿100mL水样的测量和取样误差。
该模型的优选实施方案的概述涉及隔室中样品的协调分布，其中隔室的内容物彼此不接触。因此，在将样品填充到样品保持器期间，从体积为V8的第一隔室(图2)开始；当所述隔室被填满时；水连续地流动至下一个隔室。当第二隔室被填满时，水前进至第三隔室中，依此类推。最后，隔室的内容物不可能在不同隔室之间接触。
虽然模型定义了相对体积分布，但是在具有圆柱形隔室形状的样品保持器实施方案中，每个隔室的绝对体积取决于每个圆柱形隔室的半径或直径；相应地，每个圆柱形隔室的高度也遵循线性模式。
在非限制性实例中，直径等于或约为14mm，因此也遵循线性模式的高度分别为：h1＝6.01mm，h2＝12.03mm，h3＝18.05mm，h4＝24.06mm，h5＝30.08mm，h6＝36.09mm，h7＝42.10mm和h8＝48.12mm。相邻隔室之间的高度差优选为约5mm。模型的总高度为约116mm，模型的总直径为120mm。
在一个特定实施方案中，八个体积三联体中最小的体积(V1)可以计算为：3V1+3x2V1+3x3V1+3x4V1+3x5V1+3x6V1+3x7V1+3x8V1＝100mL。
然后，作为用于保持样品的总体积容量，存在108xV1＝100mL，V1＝0.926mL＝0.926cm3
在又一个方面，8个三联体的体积如下表1所示：
表1
Figure BDA0003620374800000161
Figure BDA0003620374800000171
此外，在样品保持器轮廓的优选实施方案中，隔室为圆柱形，具有相等的直径，优选约14mm，但高度对应于每个三联体的优选体积。
高度可以计算为：
Figure BDA0003620374800000172
其中h是每个隔室三联体的高度，并且r是每个隔室的半径。
然后高度优选地如下表2所示，其中高度值是近似值：
表2
Figure BDA0003620374800000173
此外，在优选实施方案中，样品保持器由疏水材料-疏水塑料材料或其他疏水材料制成，其能够根据表面张力定律保留液体样品的部分，并且使得相邻隔室之间不发生水的入射和流动，或者由具有疏水涂层的塑料材料制成，所述疏水涂层涂覆至少部分或全部面向保持器内部空间的表面。通过这种疏水性塑料材料或其他疏水性材料，可以根据表面张力定律有效地保留液体样品的部分，并且允许相邻隔室之间不发生水的入射和流动。
在优选实施方案的另一个方面，锥形塑料模块可以连接到模型的第一隔室，以使水流动更加协调并进一步分布到随后的隔室中。
在底物保持器的其他实施方案中，隔室的数量可以变化，保持线性模式和100mL总内部容积。隔室的数量可以在至少9至约60或更多之间变化。在总共9个隔室的情况下，客户将获得极低数量的细菌的最可能的粗略估计。另一个注意事项是60个隔室的最小隔室三联体的体积将为158μL(158.7μL)，这表明制造时体积的技术误差的概率更高。因此，总共24个隔室是特别优选的。
在改变的实施方案中，关于总直径、总高度、每个隔室的半径和高度、通道的宽度以及相邻隔室之间的高度差的底物保持器的其他尺寸可以变化。
在其它实施方案中，模型的外形不限于圆柱形，并且隔室的形状不限于圆柱形，尽管其是优选的，因为在填充隔室时水的流动协调。
在本发明的另一个实施方案中，样品保持器具有圆形、培养皿状结构。培养皿状结构由两部分组成。一部分是样品保持器的盖子。另一部分是盘状结构，以特定方式分成隔室。盘被分成角度为10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°和80°的多个圆形部分。每个圆形部分被两个圆环进一步分成三个隔室。在具有圆形、培养皿状结构的样品保持器的替代实施方案中，形成隔室的盘被分成角度为8°、16°、24°、32°、40°、48°、56°、64°和72°的多个圆形部分。
在样品保持器的这种外形构造中，每个隔室体积也以每个相同体积三联体存在。
在本发明的另一个实施方案中，样品保持器具有矩形外形，其隔室将样品保持器分成矩形部分，所述矩形部分具有分别限定线性体积分布的所述数量的隔室。同样，优选地，每个隔室体积以每个相同体积三联体存在。
在盘状结构和/或矩形外形结构的样品保持器的优选实施方案中，隔室的体积总和不小于100mL，更优选为100mL，这符合ISO标准。
在一个方面，包括相同圆形部分的隔室的体积是相等的。
在另一方面，包括八个圆形部分的每一个的每个隔室的相应体积遵循模式x、2x、3x、4x、5x、6x、7x和8x。
在优选的实施方案中，其中隔室的体积总和不小于100mL，隔室的体积如下：10°圆形部分的三个隔室中的每一个为0.925mL，20°圆形部分的三个隔室中的每一个为1.852mL，30°圆形部分的三个隔室中的每一个为2.778mL，40°圆形部分的三个隔室中的每一个为3.704mL，50°圆形部分的三个隔室中的每一个为4.63mL，60°圆形部分的三个隔室中的每一个为5.556mL，70°圆形部分的三个隔室中的每一个为6.481mL，和80°圆形部分的三个隔室中的每一个为7.407mL。
培养皿状样品保持器的高度不相关，形成每个隔室的边缘的厚度也不相关。
在优选实施方案中，样品保持器由适于根据表面张力物理学保持液体样品的等分试样的塑料材料制成。
在优选实施方案中，样品保持器涉及检测饮用水样品中微生物的MPN方法，因为在理想情况下，存在于水样中的细菌的平均总数在30-40CFU/100mL水样之间。该法规要求在36℃温育后，异养平板计数少于100CFU/mL的水样，并且在22℃下异养平板计数没有异常变化。在计算最可能的细菌浓度的每个统计评估的95％置信区间后，该方法对于高达60CFU/100mL饮用水样品的细菌总浓度非常准确。对于由具有遵循线性相关模式的八个不同体积的24个孔组成的优选实施方案，其中每个不同体积以三联体存在，在MPN估计值较低时，例如每100mL水样1个细胞，MPN估计值的自然对数的标准差的估计值限制为或实际上达到值1。随着MPN估计值的增加，在MPN估计值为10CFU/100mL时，MPN估计值的自然对数的标准差的估计值降低至值0.4，并且在MPN估计值为30CFU/100mL时降低至值0.3，然后稳定，并且在MPN估计值为40CFU/100mL样品时仍然在约0.3。随着MPN估计值的进一步增加，标准差的范围在0.3和0.35之间。计算95％置信区间的下限和上限；在MPN估计值为1CFU/100mL样品时，95％置信区间的下限为0.001CFU/mL，上限为0.07CFU/mL。这在实践中意味着，通过计算，相应的100mL水样中的细胞的实际数量应在每100mL水样1至8个细胞之间变化，其中细胞的最可能数为每100mL水样1个。在MPN估计值为10CFU/100mL时，95％置信区间的下限约为0.04CFU/mL，95％置信区间的上限约为0.2CFU/mL。这在实践中意味着，通过计算，相应的100mL水样中的细胞的实际数量应在每100mL水样4至20个细胞之间变化，其中细胞的最可能数为每100mL水样10个。在MPN估计值为30CFU/100mL时，95％置信区间的下限为0.16CFU/mL，并且95％置信区间的上限为0.55CFU/mL。这在实践中意味着，通过计算，相应的100mL水样中的细胞的实际数量应在每100mL水样16至55个细胞之间变化，其中细胞的最可能数为每100mL水样30个。在MPN估计值为40CFU/100mL时，95％置信区间的下限为0.2，95％置信区间的上限为0.7。这在实践中意味着，通过计算，相应的100mL水样中的细胞的实际数量应在每100mL水样20至70个细胞之间变化，其中细胞的最可能数为每100mL水样40个。然而，在确定样品中存在的细胞的最小可能数(下限)时，还应始终观察24个隔室中的阳性的总数，因为每个阳性隔室指示相应的阳性隔室中至少存在单个细胞。
因此，可以在MPN估计值增加时计算95％置信区间。95％置信区间的计算是根据MPN估计值的自然对数的标准差的估计值进行的。首先，在MPN估计值增加时进行MPN估计值的自然对数的标准差的估计值。根据MPN估计值的自然对数的标准差计算，通过将相应MPN估计值时的MPN估计值的自然对数的标准差值乘以相应MPN估计值来计算95％置信区间。MPN估计值的自然对数的标准差是函数，并且MPN估计值是函数。作为两个函数相乘的结果，95％区间随着MPN估计值的增加而线性增加。
同样在其他实施方案中，可以开发自动化形式的样品保持器，使得能够自动检测限定体积的所有重复和所有不同体积下的限定体积的阳性隔室，从结果自动计算最可能数的估计值，以及进一步自动生成或计算95％置信区间的上限和下限。
在优选的实施方案中，样品保持器涉及检测饮用水样品中微生物的MPN方法，因为在理想情况下，存在于水样中的细菌的平均总数在30-40CFU/100mL水样之间。法规要求在36℃温育后，水样中总细菌的异养平板计数少于100CFU/mL，并且在22℃下异养平板计数没有异常变化。在计算最可能的细菌浓度的每个统计评估的95％置信区间后，该方法对于高达60CFU/100mL饮用水样品的细菌总浓度非常准确。
在另一个方面，可以使用多种材料来构造所提到的样品保持器。
在优选的实施方案中，本发明涉及检测细菌的MPN方法，该方法包括将无菌冷冻干燥的粉末状培养基加入液体样品如饮用水中。培养基是用于检测大肠杆菌和其他大肠菌群细菌的选择性显色培养基，其含有两种不同的色原试剂，一种对大肠杆菌敏感，另一种对其他大肠菌群细菌敏感。对大肠杆菌具有选择性的色原靶向大肠杆菌特异性β-葡糖醛酸酶，并具有与β-D-葡糖苷酸连接的发色团。对其他大肠菌群细菌具有选择性的色原选择性地靶向β-半乳糖苷酶，并且具有与β-D-吡喃半乳糖苷连接的不同发色团。如果大肠杆菌以及除大肠杆菌以外的大肠菌群存在于所选隔室中，则在所述隔室中存在β-葡糖醛酸酶并且还存在β-半乳糖苷酶。β-葡糖醛酸酶将释放与β-D-葡糖苷酸相连的发色团，并且β-半乳糖苷酶将释放与β-D-吡喃半乳糖苷相连的不同发色团。释放的与β-D-葡糖苷酸相连的发色团在积累时将使培养基变为绿色，而与β-D-吡喃半乳糖苷相连的发色团在积累时将使培养基变为黄色。然而，存在大肠杆菌和大肠杆菌以外的大肠菌群的隔室中的绿色颜料将克服黄色颜料。如果在隔室中仅存在大肠杆菌，则在隔室中存在β-葡糖醛酸酶。β-葡糖醛酸酶将释放与β-D-葡糖苷酸相连的发色团，并且在发色团积累时隔室的颜色将变为绿色。如果隔室中存在除大肠杆菌以外的大肠菌群，则存在的β-半乳糖苷酶将释放与β-D-吡喃半乳糖苷相连的不同发色团。这将使培养基的颜色变为黄色。如果存在既不是大肠杆菌也不属于大肠菌群细菌的其他细菌，则培养基变为不透明。然后，该方法的输出由相同体积的所有重复和所有不同体积下的特定体积的黄色和绿色隔室的数量的组合来定义。
本发明的其它实施方案涉及用MPN方法检测饮用水样品中的大肠杆菌和其它大肠菌群细菌，任选地还涉及选择性显色培养基的其它选择。检测阳性的方法涉及样品的颜色变化，其基于游离发色团积累的结果，和样品的吸收/发射光谱的变化。
本发明的其它实施方案涉及用MPN方法检测饮用水样品中的大肠杆菌和其它大肠菌群细菌，可包括向水样中加入无菌冻干荧光(和显色)培养基。该培养基含有与荧光团连接的单糖和与发色团连接的单糖-两者靶向不同的细菌组，大肠杆菌或其他大肠菌群细菌。在这种情况下，由于荧光团的积累，检测阳性的方法包括在用UV光激发时发射特定波长的光。
此外，本发明的其它实施方案可涉及通过MPN方法检测饮用水样品中的肠球菌。
本发明的进一步实施方案涉及MPN方法检测饮用水样品中的肠球菌，可包括加入无菌的、冻干的选择性显色或荧光培养基，用于检测肠球菌，其中色原(或底物类似物)对肠球菌敏感。
本发明的进一步实施方案涉及通过MPN方法检测饮用水中的其它细菌种类，例如军团菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和其它细菌，所述MPN方法涉及选择合适的选择性培养基，显色或荧光。
本发明的进一步实施方案可涉及通过MPN方法检测饮用水中的总异养细菌或总细菌，其再次涉及选择含有检测微生物存在的试剂的合适培养基。
本发明的其它实施方案还可涉及检测废水样品、工业处理水样品、沐浴水、地表水或天然水样品、循环废水样品中微生物的MPN方法。在本文中，建议对样品进行适当的先前稀释以达到95％置信区间的最佳范围。
本发明的进一步实施方案可包括使用选择性荧光、显色或其他合适的培养基以与饮用水样品类似的方式检测废水样品中的大肠杆菌和/或其它大肠菌群细菌、肠球菌、总细菌或其它特定细菌群。
在进一步的方面，本发明提供了在任何上述实施方案中的本发明方法的自动化形式，其中通过从限定体积的所有重复以及所有不同体积下的限定体积中的阳性信号来检测细菌的存在。自动化检测优选地包括从阳性信号结果对最可能数的估计值的自动化计算。该方法可以可选地另外包括95％置信区间的上限和下限的进一步自动化生成或计算。在另一方面，本发明提供了一种自动化系统，其包括上述样品保持器，以及用于相应地检测细菌存在的检测器。用于检测阳性信号的合适手段是已知的。例如，该方法可以使用并且该系统可以包括适当数量的LED光发射器和对应数量的感测光或荧光发射的传感器。为了描述本发明方法和样品保持器的其他特征，参考以上描述。
本发明的所有描述的实施方案可以关联检测颜色变化或荧光强度的自动化方法，进一步计算实验结果最可能数的估计值，并从MPN估计值的自然对数的标准差的估计值和MPN估计值计算95％置信区间。
在所有描述的实施方案中，本发明的优点是在饮用水中微生物的浓度范围(高达60CFU/100mL)中提供了非常准确的统计结果，尽管隔室数量相对较少，因为体积的大小遵循线性回归。
实施例
实施例1证明更好的模型统计的概念，并根据隔室体积的线性分布提供更准确的结果
在该实施例中，考虑了两种分布的模型。第一个是体积呈线性分布，如下表3所示。
表3
Figure BDA0003620374800000231
Figure BDA0003620374800000241
其中V1＝V1，V2＝2V1，V3＝3V1，V4＝4V1，V5＝5V1，V6＝6V1，V7＝7V1，V8＝8V1
在对比例中，体积呈指数分布，伴随相邻的不同体积之间的恒定比率，如表4所示。
表4
Figure BDA0003620374800000242
其中V1＝V1，V2＝2V1，V3＝4V1，V4＝8V1，V5＝16V1，V6＝32V1，V7＝64V1，V8＝128V1
用Rstudio计算置信区间并绘制成线性图。原则上，在绘制置信区间的线性图时，置信区间应随着最可能数的估计值的增加而增加。
分别从图4和图5描绘体积的线性和指数分布的结果。在体积线性分布的情况下，高达0.6CFU/100mL水样或60CFU/100mL水样中可以观察到相对窄的置信区间，其线性增加(图4)。如果选择体积区间的线性分布，则关于隔室的数量可以相对更灵活，因为可以看出，在线性分布时，包含20个不同体积(遵循线性分布，以三联体存在)的模型的最小体积为130-150μL，在指数体积分布的情况下，当模型含有8个不同体积(以三联体存在)时，达到体积130μL，不同的体积遵循指数分布。因此，在线性分布的情况下，体积减小得更慢，并且样品保持器可以布置有比指数体积分布更多的隔室。
在用于比较的体积指数分布的情况中(参见图5)，可以观察到更宽的置信区间，其是不一致的并且不线性增加(与线性分布模型相比较)。然而，在不同体积的指数分布中，95％的置信区间在高达100CFU/100ml水样的更宽范围内是密集的。此外，置信区间并非完全线性增加，而是可以看到稍宽区间的带。
由此得出结论，体积的线性分布表现得更好(尽管在较窄的细菌浓度范围内)。
实施例2-创建大肠杆菌浓度与OD之间的相关曲线
构建实际细菌数与光密度之间的相关曲线。通过接种环将大肠杆菌引入无菌蒸馏水中，达到光密度(OD)1。此后，进行2倍系列稀释。使用Neubauer计数室对每个系列稀释液进行计数，同时测量其OD。下面的表3和图6中的图用趋势线表示了结果。
Figure BDA0003620374800000261
实施例3-确认线性曲线
在实施例3中，证实了实施例2中提供的相关曲线。为了证明MPN模型的概念，制备大肠杆菌的初始测试悬浮液，其浓度校准为108CFU/mL(实施例4)。在实施例3中，我们检查了OD为0.1还是为0.2是更好的初始OD，以制备校准为108CFU/mL的原始细菌悬液，用于后续实验(实施例4)，从而证实在实施例2中获得的线性相关曲线。在此实施例3中，通过接种环将大肠杆菌引入3mL无菌蒸馏水中，直至两种不同的光密度(OD)为0.1和0.2。然后，按照下面提供的方案中制备10倍系列稀释液，将300μL先前的稀释液转移到2700μL无菌蒸馏水中，如图7所示。在OD为0.2时，将10-6、10-7、10-8、10-9、10-10和10-11稀释液各1mL转移到99mL无菌蒸馏水(dH2O)中，并通过孔径0.45μm的过滤膜过滤。在OD为0.1时，将10-7、10-8、10-9、10-10、10-11在10-12的稀释液各1mL转移到99ml无菌蒸馏的水中，并通过孔径0.45μm的纤维素过滤器过滤。稀释度如图7所示。
下表6结果显示，在概念验证实验中，对原始悬浮液而言OD为0.1更好。
表6
Figure BDA0003620374800000271
基于找到的最佳OD 0.1用于将原始测试悬浮液校准到浓度108CFU/mL，将通过接种环将大肠杆菌细胞接种到6mL无菌蒸馏水中至终OD为0.1，得到原始细菌悬液。原始细菌悬浮液将如图8(实施例4)所示进行系列稀释，以达到最终预测的细菌浓度1CFU/mL、3CFU/mL、6CFU/mL、12-13CFU/mL、25CFU/mL、50CFU/mL和100CFU/mL。具有预测细菌浓度为lCFU/mL、3CFU/mL、6CFU/mL、12-13CFU/mL、25CFU/mL、50CFU/mL和100CFU/mL的1mL稀释液将被转移到99mL无菌蒸馏水，具有溶解的选择性差异显色培养基(用于选择性检测大肠杆菌)，以达到最终浓度1CFU/100mL、3CFU/100mL、6CFU/100mL、12-13CFU/100mL、25CFU/100mL、50CFU/100mL和100CFU/100mL。然后浓度为1CFU/100mL、3CFU/100mL、6CFU/100mL、12-13CFU/100mL、25CFU/100mL、50CFU/100mL和100CFU/100mL的选择性冻干显色培养基中的加标样品将被转移到单独的本发明的MPN样品保持器并在36℃孵育24小时。1mL无菌蒸馏水的阴性对照还将被添加到99mL的无菌蒸馏水中，具有溶解的选择性差异显色培养基(用于选择性检测大肠杆菌)。同时，预测细菌浓度lCFU/mL、3CFU/mL、6CFU/mL、12-13CFU/mL、25CFU/mL、50CFU/mL和100CFU/mL的lmL稀释液将被转移到99mL无菌蒸馏水以达到最终浓度1CFU/100mL、3CFU/100mL、6CFU/100mL、12-13CFU/100mL、25CFU/100mL、50CFU/100mL和100CFU/100mL。在无菌蒸馏水中浓度为lCFU/100mL、3CFU/100mL、6CFU/100mL、12-13CFU/100mL、25CFU/100mL、50CFU/100mL和100CFU/100mL的加标样品通过孔径为0.45μm的过滤膜过滤。1mL无菌蒸馏水的阴性对照还将被添加到99mL无菌蒸馏水中，并通过孔径为0.45μm的过滤膜进一步过滤。然后过滤器与过滤样品将被转移到固体差异显色琼脂培养基中，用1mL无菌蒸馏水再水化，固体差异显色琼脂培养基上的样品在36℃下孵育24小时。
实施例4-MPN模型概念证明
基于找到的最佳OD 0.1用于将原始测试悬浮液校准到浓度108CFU/mL，通过接种环将大肠杆菌细胞接种到6mL无菌蒸馏水中至终OD为0.1，得到原始细菌悬液。将原始细菌悬浮液如图8(实施例4)所示进行系列稀释，以达到最终预测的细菌浓度1CFU/mL、3CFU/mL、6CFU/mL、12-13CFU/mL、25CFU/mL、50CFU/mL和100CFU/mL。将具有预测细菌浓度为lCFU/mL、3CFU/mL、6CFU/mL、12-13CFU/mL、25CFU/mL、50CFU/mL和100CFU/mL的1mL稀释液转移到99mL无菌蒸馏水，具有溶解的选择性差异显色培养基(用于选择性检测大肠杆菌)，以达到最终浓度1CFU/100mL、3CFU/100mL、6CFU/100mL、12-13CFU/100mL、25CFU/100mL、50CFU/100mL和100CFU/100mL。然后将浓度为1CFU/100mL、3CFU/100mL、6CFU/100mL、12-13CFU/100mL、25CFU/100mL、50CFU/100mL和100CFU/100mL的选择性冻干显色培养基中的加标样品转移到单独的本发明的MPN样品保持器并在36℃孵育24小时。还将1mL无菌蒸馏水的阴性对照添加到99mL的无菌蒸馏水中，具有溶解的选择性差异显色培养基(用于选择性检测大肠杆菌)。同时，预测细菌浓度lCFU/mL、3CFU/mL、6CFU/mL、12-13CFU/mL、25CFU/mL、50CFU/mL和100CFU/mL的lmL稀释液被转移到99mL无菌蒸馏水以达到最终浓度1CFU/100mL、3CFU/100mL、6CFU/100mL、12-13CFU/100mL、25CFU/100mL、50CFU/100mL和100CFU/100mL。在无菌蒸馏水中浓度为lCFU/100mL、3CFU/100mL、6CFU/100mL、12-13CFU/100mL、25CFU/100mL、50CFU/100mL和100CFU/100mL的加标样品通过孔径为0.45μm的过滤膜过滤。还将1mL无菌蒸馏水的阴性对照添加到99mL无菌蒸馏水中，并通过孔径为0.45μm的过滤膜进一步过滤。然后将过滤器与过滤样品转移到固体差异显色琼脂培养基中，用1mL无菌蒸馏水再水化，固体差异显色琼脂培养基上的样品在36℃下孵育24小时。结果见下表7。
表7
Figure BDA0003620374800000301
显然，大肠杆菌的预测浓度、预测浓度下的MPN估计值和膜过滤的结果之间存在良好的一致性。在1CFU/mL的预测浓度下，MPN样品保持器预测100mL样品中细菌细胞的最可能数为1CFU。结合实际阳性孔总数的统计分析预测100mL水样中细菌的实际数量在1CFU和8CFU之间，并且膜过滤产生1CFU/100mL样品。在3CFU/mL的预测浓度下，MPN样品保持器预测100mL样品中细菌细胞的最可能数为3CFU。结合实际阳性孔总数的统计分析预测100mL水样中细菌的实际数量在3CFU和10CFU之间，并且膜过滤产生2CFU/100mL样品。在6CFU/mL的预测浓度下，MPN样品保持器预测100mL样品中细菌细胞的最可能数为6CFU。结合实际阳性孔总数的统计分析预测100mL水样中细菌的实际数量在5CFU和14CFU之间，并且膜过滤产生5CFU/100mL样品。在12-13CFU/mL的预测浓度下，MPN样品保持器预测100mL样品中细菌细胞的最可能数为13CFU。结合实际阳性孔总数的统计分析预测100mL水样中细菌的实际数量在10CFU和25CFU之间，并且膜过滤产生14CFU/100mL样品。在25CFU/mL的预测浓度下，MPN样品保持器预测100mL样品中细菌细胞的最可能数为19CFU。结合实际阳性孔总数的统计分析预测100mL水样品中细菌的实际数量在12CFU和35CFU之间，并且膜过滤产生28CFU/100mL样品。在50CFU/mL的预测浓度下，MPN样品保持器预测100mL样品中细菌细胞的最可能数为54CFU。结合实际阳性孔总数的统计分析预测100mL水样中细菌的实际数量在32CFU和93CFU之间，并且膜过滤产生56CFU/100mL样品。在100CFU/ml的预测浓度下，MPN样品保持器预测为100mL样品中细菌细胞的最可能数为93CFU。结合实际阳性孔总数的统计分析预测100mL水样中细菌的实际数量在47CFU和190CFU之间，并且膜过滤产生114CFU/100mL样品。如果所有隔室中有限定数量的隔室是阳性的，这可表明样品中存在的最小细胞数，因为每个阳性隔室肯定包含至少一个细胞。然而，与泊松分布一致每个隔室可包含多于一个细胞，取决于隔室的体积，包含多于一个细胞比包含仅一个细胞可能性可更大(根据泊松分布)。

Claims (22)

1.用于检测和/或定量液体样品，特别是水样中微生物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)以线性分布模式将液体样品分布成多个不同的离散体积部分，或通过线性分布模式的稀释因子将液体样品稀释成多个稀释样品；
(b)允许微生物生长；和
(c)将最可能数法应用于线性分布的体积部分或线性稀释的稀释样品，以检测和/或定量微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述不同体积的线性分布模式为至少5倍，优选地，所述不同体积的线性分布模式为8倍，不同体积的线性分布高达20倍。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，不同体积的递增线性分布模式选自以下线性体积分布模式中的任一种——不同体积遵循线性集合的递增线性分布：
1x倍、2x倍、3x倍、4x倍和5x倍体积分布；
1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍和8x倍体积分布；
1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍、8x倍和9x倍体积分布；
以及随后的线性体积分布相应地增加更多的数量，高达1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍、8x倍、9x倍、10x倍、11x倍、12x倍、13x倍、14x倍、15x倍、16x倍、17x倍、18x倍、19x倍和20x倍体积分布；
优选地，所述线性分布模式由1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍和8x倍体积分布组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述线性体积或稀释分布模式包括在不同离散体积部分的线性分布模式中每个不同体积部分的至少三联体重复，优选由三联体组成。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，进行步骤(a)的液体样品的体积不小于100mL，优选约100mL，和/或其中进行步骤(a)的液体样品包含小于100CFU微生物/100mL，优选至多60CFU微生物/100mL。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述液体样品选自：
饮用水，优选地其中在使饮用水样品进行步骤(a)之前不稀释饮用水，
地表水或天然水，
沐浴水，
工业处理水，
废水，以及
循环废水。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体样品从废水、工业处理用水、天然水、沐浴水、工业处理水和/或循环废水中获得，其中所述液体样品在使所述水样进行步骤(a)之前被稀释一次，优选稀释至少1:10，更优选稀释1:100。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法还包括，在步骤(a)之前，将限定的无菌冻干培养基与微生物特异性检测试剂悬浮在固定量的液体样品中，优选地在100mL中，然后将步骤(a)中的所述液体样品分布在样品保持器上，
其中优选地，所述方法使用如权利要求11至20中任一项所限定的样品保持器或根据权利要求21所述的套件，特别是其中所述方法在无菌条件下进行。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中95％置信区间的下限从MPN估计值为1CFU/100mL时的0.001CFU/mL线性增加到MPN估计值为10CFU/100mL时的0.04CFU/mL并且至MPN估计值为40CFU/mL时的0.2CFU/mL，95％置信区间的上限从MPN估计值为1CFU/100mL时的0.07CFU/mL线性增加到MPN估计值为10CFU/100mL时的0.2CFU/mL并且至MPN估计值为40CFU/mL时的0.7CFU/mL。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过限定体积的所有重复以及所有不同体积下的限定体积中的阳性信号来自动检测细菌的存在，优选地，其中所述自动检测包括从阳性信号结果自动计算最可能数的估计值，并且可选地另外包括进一步自动生成或计算95％置信区间的上限和下限。
11.用于检测和/或定量液体样品中微生物的样品保持器，
其中样品保持器被构造成将液体样品保持在多个不同的隔室中，其中不同的隔室分别限定线性体积分布。
12.根据权利要求11所述的样品保持器，其中所述不同隔室结构或尺寸被设计以分别限定线性分布模式，所述线性分布模式选自以下线性体积分布模式中的任一种，不同体积遵循线性集合的递增线性分布：
1x倍、2x倍、3x倍、4x倍和5x倍递增线性体积分布；
1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍和8x倍递增线性体积分布；
1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍、8x倍和9x倍递增线性体积分布；
以及随后的线性体积分布相应地增加了更多的数量，高达1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍、8x倍、9x倍、10x倍、11x倍、12x倍、13x倍、14x倍、15x倍、16x倍、17x倍、18x倍、19x倍和20x倍递增线性体积分布；
优选地，线性分布模式由1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍和8x倍递增线性体积分布组成。
13.根据权利要求11或12所述的样品保持器，其中限定每个相应线性分布模式的隔室以每个相同体积的三联体存在，从而可选地在1x倍、2x倍、3x倍、4x倍和5x倍递增线性体积分布的情况下形成总共15个隔室，在1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍和8x倍递增线性体积分布的情况下形成总共24个隔室；在1x倍、2x倍、3x倍、4x倍、5x倍、6x倍、7x倍、8x倍、9x倍、10x倍、11x倍、12x倍、13x倍、14x倍、15x倍、16x倍、17x倍、18x倍、19x倍和20x倍递增线性体积分布的情况下形成高达60个隔室。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的样品保持器，其中所述样品保持器具有选自圆柱形外形、球形外形、矩形外形或其他形状的外形，和/或其中所述样品保持器具有在高度、宽度和/或半径方面变化的尺寸。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的样品保持器，其中所述隔室以螺旋顺序组织，具有在所述隔室之间的限定的距离和限定的曲率，其中优选地，所述隔室被组织成以逆时针螺旋朝向样品保持器的中心向下移动。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的样品保持器，其中当保持样品的总体积设为V＝100％时，对于线性分布模式的三个隔室中的每一个，1x单位体积为V的0.926％，2x倍单位体积为V的1.852％，3x倍单位体积为V的2.778％，4x倍单位体积为V的3.704％，5x倍单位体积为V的4.63％，6x倍单位体积为V的5.556％，7x倍单位体积为V的6.481％，8x倍单位体积为V的7.407％，其中每个体积百分比指示包含±10％体积容差范围，优选为±5％的体积容差范围，更优选为±1％的体积容差范围，并且任选地其中V＝100％为100mL。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的样品保持器，
具有圆形外形，其隔室将圆形外形的样品保持器分成径向部分以限定所述数量的隔室，所述隔室分别限定线性体积分布，优选地，径向部分的角度为(i)10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°和80°，或(ii)8°、16°、24°、32°、40°、48°、56°、64°和72°的角度；或
具有矩形外形，其隔室将样品保持器分成矩形部分，具有所述数量的隔室，所述隔室分别限定线性体积分布，
其中优选地，每个隔室体积以每个相同体积的三联体存在。
18.根据权利要求11至17中任一项所述的样品保持器，其中所述保持器中样品的总体积保持容量不小于100mL，优选为约100mL，和/或其中每个隔室的内部体积的总和不小于100mL，优选为约100mL。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的样品保持器，其中所述保持器形成材料由疏水性材料制成，或者在面向所述保持器内部空间的表面的至少一部分或全部上提供有疏水性涂层。
20.根据前述权利要求11至19中任一项所述的样品保持器，所述样品保持器还包括盖，其中所述盖被布置用于防止流体蒸发，和/或被布置为防止所述样品保持器的隔室之间的流体交换。
21.一种套件，包括如权利要求11至20中任一项所限定的样品保持器，以及用以检测一种或多种特定微生物的试剂，优选允许检测大肠菌群细菌的试剂，所述试剂包括至少对大肠杆菌有选择性的试剂，任选地进一步对军团菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属有选择性的试剂，和进一步任选地其他微生物。
22.一种系统，包括：
如权利要求11至20中任一项所限定的样品保持器，以及
一种检测器，用于以自动形式通过限定体积的所有重复以及所有不同体积下的限定体积中的阳性信号来检测细菌的存在，优选地，其中系统适用于从阳性信号结果自动计算最可能数的估计值，并且可选地，系统进一步适用于自动生成或计算95％置信区间的上限和下限。
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