DE2451409C2

DE2451409C2 - Verfahren zur Bestimmung spezieller weißer Blutkörperchen

Info

Publication number: DE2451409C2
Application number: DE2451409A
Authority: DE
Inventors: Lawrence Richards Mahopac N.Y. Adams
Original assignee: Biophysics Systems Inc Mahopac Ny Us
Current assignee: Biophysics Systems Inc Mahopac Ny Us
Priority date: 1973-10-30
Filing date: 1974-10-29
Publication date: 1983-11-24
Also published as: DE2451409A1; US3883247A; GB1492556A

Description

dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung des Farbstoffs verwendet, die eine für menschliche Blutzellen hypotonische Osmolarität besitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Acridin-orange-Lösung mit einer Osmolarität von 0,3 bis 0,7, bezogen auf den isotonischen Wert, verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Saiz-Konzentration der Acridinorange-Lösung weniger als 7,5 g/l Lösung beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa einen Teil Blut mit 5 Teilen einer gepufferten Lösung von 4 χ 10~⁴ bis 4 χ ΙΟ-² g Acridin-orange pro Liter Lösung zusammenbringt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Blutprobe nicht verdünntes und nicht behandeltes frisches peripheres Blut verwendet.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung und Unterscheidung spezieller weißer Blutkörperchen und anderer Teilchen in einer Blutprobe gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Es ist bekannt, daß reife weiße Blutkörperchen normalerweise im Blut in verschiedenen Formen vorliegen, die in Hauptgruppen eingeteilt werden können. Jede Gruppe stellt einen Prozentsalz der Gesamtzellen dar, deren allgemeine Grenzen für normales Blut in der folgenden Tabelle angegeben sind:

Polymorphkernige Lcukocyten
Neutrophile
Eosinophile
Basophilc

Einkernige Leukocytcn
Lymphocyten
Monocyten

38 bis 70%
I bis 5%

0 bis 2%

15 bis 45%

1 bis 8%

Die polymorphkernigen Leukocyten besitzen nicht nur geteilte Kerne, sondern sind auch dadurch charakterisiert, daß sie Granula in dem Cytoplasma enthalten. Sie werden daher manchmal als Granulocyten bezeichnet Granulocyten entwickeln sich in; Knochenmark aus Zellen, die Myeloblaste genannt werden, die undifferenziert sind und entweder zu Neutrophilen, Eosinophilen oder Basophilen reifen. Die Entwicklungsstufen der unreifen Granulocyten wurden

ίο eingeteilt und ihr Auftreten charakterisiert Obwohl unreife Granulocyten in geringer Anzahl in normalem Blut vorhanden sind, ist ihr Auftreten in deutlicher Menge ein Zeichen für eine Infektion oder Leukämie. Eine detailliertere Beschreibung der verschiedenen Arten der Blutzellen, die für ein genaueres Verständnis der Grundlage der vorliegenden Erfindung ausreicht, findet sich in LW. Diggs et al., The Morphology of Human Blood Cells, herausgegeben von Abbott Laboratories, und in M.M. Wintrobe, Clinical Hematology, 224 - 94 (6. Ausg. 1967).

Die Zählung der gesamten weißen Zellen (d. h. die Zählung der Gesamtzahl der weißen Zellen in einem bestimmten Blutvolumen) und eine differenzierende Blutanalyse (d. h. eine Zählung, die den relativen Prozentsatz der verschiedenen Arten weißer Zellen im Blut ergibt) außerordentlich wichtige diagnostische und medizinische Untersuchungsverfahren.

Das übliche medizinische Laborverfahren zur quantitativen Bestimmung oder Bestimmung der Gesamtzahl der weißen Zellen besteht darin, daß man ein genaues Volumen einer Blutprobe mit einem genauen Volumen einer Lösung (Lysemittel) vermischt, das die roten Zellen zerstört, und dann einen Teil der Probe in ein »Zählkammer«-Mikroskopierglas gibt und die Anzahl der in verschiedenen Quadraten der Zählkammer auftretenden weißen Zellen auszählt. Das Ergebnis wird üblicherweise ausgedrückt als Anzahl weißer Zellen/mm^ Das ist ein sehr mühsames Verfahren und es ist erforderlich, die Zählung an einer so kleinen Probe vorzunehmen, daß Ungenauigkeiten sehr leicht auftreten. Außerdem ist die Erfahrung ein sehr wichtiger Faktor, um genaue Ergebnisse zu erhalten.

Bei den üblichen Verfahren im medizinischen Labor zur Unterscheidungs-Analyse spezieller weißer Zellen in einer Blutprobe, wird ein Blutausstrich auf einem sauberen Objektträger getrocknet und dann mit einem geeigneten Reagens, das üblicherweise ein Fixativ enthält, wie Methylalkohol in Kombination mit einem Gemisch von Färbemitteln behandelt. Wahlweise kann das Präparat in einer getrennten Stufe mit dem Fixativ behandelt werden. Der behandelte Blutausstrich wird dann durch ein Mikroskop unter Öl untersucht. Es werden visuell in verschiedenen Bereichen des Ausstrichs Zählungen vorgenommen und notiert. Eine

>5 gleichmäßige Verteilung der weißen Zellen ist schwierig zu erhalten und daher wird empfohlen, daß sowohl an den Rändern des Blutausstrichs als auch in dem Mittelbereich Zählungen vorgenommen werden und daß mindestens 200 Zellen ausgezählt werden. Eine

w> differenzierende Analyse der weißen Blutzellen wird üblicherweise auf diese Weise durchgeführt. Ungünstigerweise treten bei diesen Verfahren viele Schwierigkeiten und Begrenzungen auf, die die Genauigkeit sehr negativ beeinflussen, wie die mangelnde Gleichmäßig-

^b5 keil des Blutausstrichs, die extrem kleine Größe der ausgezählten Probe, die Mühsamkeit des Verfahrens (die den Laboranten dazu verleitet, es sich einfach zu machen und nur geringe Mengen auszuzählen) und die

unterschiedliche Erfahrung verschiedener Laboranten bei der Erkennung und genauen Notierung aller speziellen Arten von Zellen.

Da die oben erwähnten manuellen Verfahren selbst für einen sehr erfahrenen Fachmann zeitraubend sind, sind die Kosten jeder Analyse notwendigerweise hoch und die Geschwindigkeit, mit der eilige Untersuchungen durchgeführt werden können, ist begrenzt.

Aufgrund der erwähnten Probleme, die mit manuellen Verfahren zur Zählung weißer Blutzellen und zur Unterscheidung der verschiedenen Arten von Zellen verbunden sind, wurden Vorrichtungen oder instrumentelle Verfahren entwickelt, um diese Tests automatisch und an lebendem Blut durchführen zu können.

Vorrichtungen zur Durchführung von Differential-Analysen von lebenden (vitalen) weißen Blutzellen sind beschrieben in folgenden Literaturstellen: M. Ingram et al. Scientific American, November, 1970, Seiten 72 — 82; MR. Melamed et aL European J. Cancer, 9, 181-184 (Pergamon Press, 1973); M.R. Melamed et al., Am. J. Clinical Pathology, 57(1), 95-102 (Januar 1972); M.R. Melamed et al.. Cancer, 29(5), 1361 -68 (Mai 1972); und LR. Adams et al, Acta Cytologica, 15(3), 289 - 91 (1971).

Die DE-OS 21 34 910 (US 36 84 377) beschreibt zum ersten Mal ein Verfahren und eine Vorrichtung zur instrumentellen Differenzierung von weißen Blutzellen und zwar zwischen Lymphocyten, Monocyten und der allgemeinen Klasse von polymorphkernigen Leukocyten (Granulocyten). Dabei wird eine Blutprobe mit Acridin-orange angefärbt, die angefärbte Blutprobe nvit einer Lichtquelle bestrahlt, die einen Spektralanteil enthält, der von dem angefärbten Kernmaterial absorbiert wird, und die sich ergebende Fluoreszenzstrahlung bei der Farbe des angefärbten Kernmaterials bestimmt. Auch mit Hilfe dieses Verfahrens ist es jedoch bisher nicht möglich gewesen, instrumenten weiter zwischen den verschiedenen Formen der Granulocyten (z. B. Basophilen, Eosinophilen und Neutrophilen) zu unterscheiden, sowie zwischen reifen und unreifen Formen von weißen Blutzellen und besonders die unreifen Formen von Granulocyten, soweit solche vorhanden sind, zu unterscheiden.

Nach den oben angegebenen Veröffentlichungen von Abbott Laboratories und Wintrobe umfassen die unreifen Formen von Granulocyten als allgemeine Gruppe die sogenannten Myelocyten.

Die Möglichkeit, lebende weiße Blutzellen quantitativ zu bestimmen und die sechs Hauptgruppen zu unterscheiden (das heißt die Lymphocyten, Monocyten, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen und unreifen Granulocyten (Myelocyten), ist wichtig zur Diagnose vieler Krankheiten, die sich in abnormen Verhältnissen der oben erwähnten sechs Gruppen von Leukocyten äußern. Daher würde ein Verfahren zur schnellen und genauen Zählung und Unterscheidung der oben erwähnten weißen Blutzellen ein wertvolles diagnostisches und prognostisches Hilfsmittel zur Behandlung des Patienten in die Hand geben.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Durchführung einer Differential-Analyse spezieller weißer Blutzellen zu entwickeln, das durch eine große Genauigkeit und geringe Kosten gekennzeichnet ist. Mit diesem Verfahren soll eine schnelle Zählung der Zellen möglich sein (weniger als 1 Minute, verglichen mit 10 Minuten oder mehr nach dem bekannten Verfahren).

Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Hauptanspruch gekennzeichnete Verfahren. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben.

Erfindungsgemäß wird die Differenzierung und Zähhing der weißen Blutzellen unter Bedingungen durchgeführt, bei denen die Zelien »geschockt« sind, indem sie während des Anfärbens einem nicht-physiologischen Medium ausgesetzt werden. Die Zählung und Differenzierung der weißen Blutzellen beruht auf der Ausnutzung von Eigenschaften, die von der Geschwindigkeit abhängen, mit der die Leukocyten fluoreszieren, wenn sie einem nicht-physiologischen Medium ausgesetzt werden. Die Zellen senden Signale aus, die es ermöglichen, weiße Zellen von allen anderen Blutkörperchen, wie roten Zellen oder Blutplättchen zu unterscheiden. Die Wahrnehmung und Unterscheidung aller weißen Zellen ist wesentlich für die Einteilung der Zellen, um die gewünschte Differential-Analyse zu erhalten. Die weißen Blutzellen werden angefärbt und senden ein Signal aus, das durch eine Vorrichtung zur Erkennung und Unterscheidung aller weißen Zellen in einer Blutprobe aufgenommen werden kann, um eine Differential-Analyse der weißen Zellen zu erhalten.

Eine hierfür geeignete Vorrichtung ist in Fig. 1 als schematisches Diagramm angegeben.

F i g. 2 zeigt eine Ansammlung von Punktsignalen der sechs Arten von weißen Blutzellen, die mit einer solchen Vorrichtung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden kann.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandte Färbemittel umfaßt eine wäßrige Lösung eines metachromatischen fluorochromen Farbstoffs, das heißt eines Farbstoffs, der bei einer Vielzahl von Wellenlängen als Reaktion auf die Anregung durch Strahlung im Bereich seiner Absorption fluoresziert (wie Acridinorange). Diese Lösung wird so zubereitet, daß ihr pH-Wert in dem normalen physiologischen Bereich von ungefähr 7,4 liegt. Die Lösung wird jedoch hypotonisch gemacht, wobei die Osmolarität oder der Salzgehalt im allgemeinen niedriger liegt als bei menschlichem Blut.

Auf diese Weise erleiden die weißen Zellen in Proben von lebendem Blut, das mit dem oben erwähnten Färbemittel behandelt ist, einen »Schock«, bleiben aber trotzdem intakt und das Zellmaterial wird, während die Blutanalyse durchgeführt wird, nicht denaturiert. Bei Erreichung dieses Zustands hat es sich gezeigt, daß die sich ergebenden Intensitäten oder Amplituden der metachromatischen Fluorescenz, bei zwei verschiedenen vorher ausgewählten Wellenbereichen (rot und grün im Falle von Acridin-orange) zu jedem gegebenen Zeitpunkt, innerhalb einer Zeit von ungefähr 10 Sekunden bis zu einigen Minuten nach der Zugabe des Färbemittels zu der Blutprobe von der Art der einzelnen weißen Zellenabhängen, die fluoreszieren, d. h. davon ob es Lymphocyten, Monocyten. Basophile, Neutrophile, Eosinophile oder unreife Granulocyten sind. Es wird angenommen, daß dieses Phänomen von der Hypotonie des Färbemittels herrührt, die unerwarteterweise dazu führt, daß sich die Geschwindigkeit der Farbstoffaufnahme der weißen Zellen bei den einzelnen Zellorganen der oben erwähnten sechs Arten unterscheidet. In anderen Worten, die unterschiedlichen Amplituden der Fluoi jscenzen bei den verschiedenen Zellarten werden bestimmt durch den geschwindigkeitsbestimmten Grad der Farbstoffaufnahme, der sich von Zelltyp zu Zelltyp unterscheidet.

Allgemein ist das Färbemittel in dem Maß hypotonisch, daß die Konzentration des NaCI zwischen ungefähr 2,5 und 7,5 g/1 Lösung liegt. Es ist bcorzugt

4,25 g/1-Lösung anzuwenden. Wahlweise können andere bekannte Äquivalente für Natriumchlorid z. B. Natriumcitrat, für diesen Zweck angewandt werden.

Wenn Acridin-orange als Farbstoff-Komponente des Färbemittels verwendet wird, wird es im allgemeinen in einer Konzentration in der Größenordnung des 4-fachen der in der erwähnten US-PS 36 84 377 angegebenen Menge angewandt. In anderen Worten ist die Konzentration von Acridin-orange in einem frisch hergestellten Färbemittel ausreichendem eine Konzentration des Farbstoffs in der zu untersuchenden Blutprobe-Suspension von ungefähr 4 χ 10-⁴ bis ungefähr 4xl0~²g/l Suspension zu ergeben. Es hat sich gezeigt, daß die Anwendung so ungewöhnlich hoher Farbstoff-Konzentrationen aus nicht ganz geklärten Gründen die Geschwindigkeits-Abhängigkeit der Farbstoffaufnahme von verschiedenen Arten weißer Blutzellen erhöht.

Bei einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine frische Blutprobe in der oben erwähnten hypotonischen wäßrigen Acridin-orange-Lösung suspendiert und die entstehende Suspension vorzugsweise bis zu ungefähr 30 bis 100 Sekunden, vorzugsweise unter leichtem Rühren, stehengelassen. Die Suspension wird anschließend der Strahlung eines blauen Lasers (488 nm) ausgesetzt und die Zellen werden auf der Grundlage der unterschiedlichen Stärke der roten und grünen Fluorescenzen, die von den einzelnen Zellen als Reaktion auf die Anregung durch die blaue Laser-Strahlung emittiert wird, unterschieden.

Der Farbstoff Acridin-orange oder Euchrysin, der ein wesentlicher Bestandteil des bevorzugten erfindungsgemäßen Färbemittels ist, wird manchmal in abgekürzter Form einfach als »AO« bezeichnet. Seine Eignung für das erfindungsgemäße Verfahren rührt von der Tatsache, daß er die Eigenschaften eines metachromatischen fluorochromen Farbstoffs besitzt. Diese Substanz ist 3,6-Bis-(dimethylamino)acridiniumchlorid und hat die Strukturformel

(CHj)₂N

N(CHj)₂

■ HCl

Acridin-orange ist auch angegeben in der Farbindex-Beschreibung 46.005 der Veröffentlichung »COLOR IN DEX«, 2. Aufl. von 1956 und 1957, herausgegeben von der Society of Dyers and Colorists of Great Britain und von der American Association of Textile Chemists and Colorists of Lowell, Mass. Acridin-orange ist im Handel erhältlich. Acridin-orange ist seit einiger Zeit bekannt als Fluorescenz-Farbstoff, der Nucleinsäuren wie Ribonucleinsäure (RNS) und Deoxyribonucleinsäure (DNS) anfärben kann. (s. z. B. Rudolf Rigler's Artikel »Microfluorometric Characterization of Intracellular Nucleic Acids and Nucleoproteins by Acridine Orange« in Band 67, Supplementum 267 der Acta Physilogica Scandanavica (Stockholm, 1966) und »Acridine Orange in Nucleic Acid Analysis« in Band 157, Article 1 in Annals of the New York Academy of Sciences 31. März, 1969, Seiten 211-224). Die Anwendung von Acridinorange zum Anfärben von Zellen ist auch in der US-PS 34 97 690 (DE-OS 21 34 910) angegeben. Da Acridinorange in erster Linie als roter Fluorescenz-Farbstoff für RNS angesehen wird und da die Menge RNS in weißen Blutzellen im allgemeinen vernachlässigbar ist, war nicht zu erwarten, daß Acridin-orange eine wichtige Information über die oben erwähnten sechs Gruppen von Leukocyten liefern würde. Es hat sich jedoch gezeigt, daß bei der erfindungsgemäßen Verfahrensweise Acridin-orange besonders geeignet ist und eine automatische maschinelle Unterscheidung von weißen Blutzellen von allen anderen Blutteilchen und die Differenzierung von Leukocyten in Lymphocyten, ίο Monophile, Basophile, Neutrophile, Eosinophile und Myelocyten (unreife Granulocyten) ermöglicht.

Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren unter besonderem Hinweis auf die Anwendung von Euchrysin oder Acridin-orange beschrieben wird, können auch andere geeignete Fluorochrome, (d. h. Farbstoffe, die metachromatisch und fluorochrom sind) erfindungsgemäß angewandt werden.

Wie oben erwähnt, enthält das bevorzugte Färbemittel Acridin-orange in einer hypotonischen wäßrigen Lösung in einer Konzentration von 4xlO-⁴ bis 4 χ 10-² g Acridin-orange/l Lösung. Die Lösung enthält auch andere Zusätze, um eine Osmolarität unter dem normalen physiologischen Bereich von menschlichen Blutplasmen zu erhalten. Bei den bevorzugten Konzentrationen der Acridin-orange-Lösung kann das Gemisch eine nicht echte Lösung sein, sondern teilweise eine Suspension von Aggregaten der Farbstoff-Moleküle oder vielleicht eher eine kolloidale Dispersion, in der die außerordentlich kleinen ungelösten Teilchen der Flüssigkeit suspendiert sind. Das Mittel wird jedoch im Rahmen dieser Beschreibung als Lösung bezeichnet. Das Gemisch der Acridin-orange-Lösung mit der Blutprobe wird dann als Suspension bezeichnet. Obwohl die Acridin-orange-»Lösung« keine echte Lösung sein muß, dient der Ausdruck zur Unterscheidung des Färbemittels selbst von der flüssigen Suspension, die nach der Zugabe der Blutprobe entsteht.

Der normale physiologische pH-Wert für menschliches Blut wird im allgemeinen zu 7,4 + 0,05 pH-Einheiten angesehen und der pH-Wert der Färbelösung wird ebenfalls vorzugsweise in den praktischen Grenzen von 7,4 ±1 pH-Einheit eingestellt. Andererseits wird die Osmolarität, die eine Funktion der Konzentration der Salze in der Lösung ist, unter dem physiologischen Wert von ungefähr 8,5 g Natriumchlorid/l Lösung eingestellt, und/zwar vorzugsweise unter 7,5 g/l, wodurch das Medium für die Blutzellen »traumatisch« wird.

Bei der Beschreibung des Beispiels 1 wird ein Verfahren angewandt, bei dem getrennte Lösungen von Acridin-orange und der Salz-Puffer-Kombination hergestellt und dann zusammengegeben werden. Die vereinigte Lösung neigt dazu kolloidale Teilchen zu bilden, die offensichtlich den Acridin-orange-Farbstoff einschließen. Es wurde beobachtet, daß die Lösung, enthaltend die kolloidalen Teilchen, eine verhältnismäßig kurze Lebenszeit besitzt Die Kolloide scheinen sich an den Wänden und dem Boden des Behälters abzuscheiden. Folglich ist es bevorzugt, die Lösungen getrennt zu lagern, eine Lösung die nur Acridin-orange enthält, und eine andere Lösung, die nur die die Salz-Puffer-Kombination enthält Die beiden Lösungen werden dann in geeigneten Mengenverhältnissen, an dem Tag, an dem sie angewandt werden, zusammengegeben.

Unabhängig davon, ob die beiden Lösungen getrennt oder in einer einheitlichen Lösung aufbewahrt werden, hat es sich gezeigt, daß ein Alterungsprozeß eintritt, so daß höhere Acridin-orange-Konzentrationen erforder-

lieh sein können, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten bei älteren Lösungen, verglichen mit verhältnismäßig frischen Lösungen.

Es wird angenommen, daß die hohe Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens damit zusammenhängt, daß eine Konkurrenz um den Farbstoff zwischen den drei Komponenten, Lösung, Granula und Kernen eintritt. Die Geschwindigkeit der Farbstoffaufnahme kann auch mittelbar beeinflußt werden durch die Zellmembran. Die erfindungsgemäß angewandte Färbelösung führt zu großen Unterschieden zwischen den verschiedenen Arten von Leukocyten in der Menge der Farbstoffaufnahme durch die Zellkerne und Granula. Weitere Faktoren können Abschirmeffekte der Granula auf den Kern und unterschiede in der Chemie der Granula und ihrer Anzahl in jedem Zelltyp umfassen.

Ferner wird angenommen, daß der Grund für die unterschiedliche Fluorescenz (grün), die die weißen Zellen von anderen Blutteilchen wie Erythrocyten unterscheidet, darin besteht, daß der Farbstoff mit der DNS (Deoxyribonucleinsäure) des Zellkerns sich in unterschiedlicher Weise kombiniert, so daß eine grüne Fluorescenz ausgesandt werden kann durch Anregung mit blauer Laser-Strahlung. Der Hauptteil der Farbstoffaufnahme durch jede Zelle, der nicht mit der Kern DNS zusammenkommt, scheint das Cytoplasma zu färben und äst besonders konzentriert in den cytopiastischen Organellen, die als Granula bekannt sind. Es wird angenommen, daß das der Grund ist, weshalb die Granulocyten, die weißen Zellen, die besonders unterschiede!, sind durch das Vorhandensein von Granula in dem Cytoplasma, offensichtlich mehr Acridin-orange-Farbstoff in dem Cytoplasma aufnehmen und damit ein stärkeres rotes Fluorescenz-Signal ergeben. Der gesamte von dem Cytoplasma aufgenommene Acridin-orange-Farbstoff (im Unterschied zu dem von den Kernen aufgenommenen), scheint eine rote Fluorescenz zu ergeben, als Reaktion auf das blaue Laser-Licht. Obwohl die grüne Fluorescenz von der Färbung der DNS im Gleichgewicht herrührt, können erfindungsgemäß die Zellen gemessen werden, bevor das Gleichgewicht erreicht ist, wobei die Unterschiede in der grünen Fluorescenz von der Farbstoffverarmung durch die Granula oder Abschirmung des Lichts durch diese herrühren. Die oberen und unteren Populationen der Granulocyten verschmelzen bei längeren Anfärbezeiten.

Eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, besonders in Beziehung auf den Probenfluß und die optischen Systeme geeignete Vorrichtung ist in der US-PS 37 05 771 beschrieben. Andere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, besonders bezüglich der Anordnung der Zählvorrichtung der Kathoden-Strahl-Oszilloskop-Vorrichtung und der damit verbundenen Kreise, geeignete Vorrichtungen sind in der US-PS 36 62 176 sowie der oben erwähnten US-PS 36 84 377 beschrieben.

In der F i g. 1 ist ein Schema einer geeigneten bekannten Vorrichtung gezeigt. Eine optische Kammer 10 enthält eine Mikrocuvetie 11, durch die eine Strömung 12 aus in Suspension gehaltenen Zellen strömt, die aus einem Probenrohr 14 von einem Vorratsbehälter (nicht gezeigt) zugeführt wird. Die Suspension wird vorzugsweise von einem Wassermantel 15 zur Begrenzung der Teilchen (Zellen) in einem sehr feinen Strahl umgeben. Bei Durchgang der Strömung 12 durch die Kammer 10 gelangt die Strömung 12 durch einen dünnen Lichtstrahl 20 aus einer Lichtquelle 22. Die Lichtquelle 22 ist vorzugsweise ein Argonlaser und kann eine zylindrische Linse 23 für die Bündelung und Richtung des Lichtstrahls aufweisen. Verschiedene optische Reaktionen der einzelnen Blutzellen durch den Lichtstrahl 20 in Form einer Fluorescenz-Strahlung jeder Zelle werden durch photoelektrische Empfänger 24, 26, welche Photomultiplier sein können, aufgenommen. Die von den Photoempfängern 24, 26 aufgenommenen Signale, werden durch diese in elektrische Impulse umgewandelt, die über Leitungen 30, 32, Verstärkern 34 bzw. 36 zugeführt werden. Der Empfänger 24 spricht auf die rote Fluorescenz und der Empfänger 26 auf die grüne Fluorescenz an. Die Übermittlung der Fluorescenz-Signaie zu den Empfängern wird durch eine Sammellinse 16 verbessert. Ein dichroitischer Spiegel 18 ist vorgesehen, der eine nominelle Abschneidewellenlänge von 580 nm hat, d. h. er reflektiert Strahlung mit einer Wellenlänge unter diesem Grenzwert durch ein Filter 18/4 auf den Empfänger 26. Optische Signale mit einer Wellenlänge über 580 nm werden durch den dichroitischen Spiegel 18 durchgelassen, treten durch das Filter 18ß und gelangen auf den Empfänger 24. Der Empfänger 24 empfängt die roten Fluorescenz-Signale und der Filter 18/? läßt eine rote Bande um etwa 630 nm Wellenlänge durch. In ähnlicher Weise empfängt der Empfänger 26 grüne Fluorescenz und der Filter 18ß läßt eine grüne Bande um etwa 530 nm Wellenlänge durch.

Die Photomultiplier-Signale für rot und grün werden nach Verstärkung in den Verstärkern 34 bzw. 36 abgetastet und Verstärkerschaltungen 38 bzw. 40 zum Halten der Signale zugeführt, in denen sie zwei elektrische Impulse ergeben, deren Amplitude der Intensität der beiden Fluorescenz-Amplituden proportional ist. Eine Schwellenschaltung 42 ist bei 43 an das grüne Photomultiplier-Signal angeschlossen und führt zu einem Steuerimpuls, wenn die Grünfluorescenz über einen bestimmten Wert liegt, der einen Leukocyt anzeigt und aktiviert die Verstärkerschaltungen 38, 40, sowie Zeitsteuersignale für Analog-digital-Konverter 44,45 und einen Computer 46. Die beiden Fluorescenz-Impulse werden durch die beiden Analog-digital-Konverter 44,45 in eine Digitaldarstellung der Fluorescenzwerte umgewandelt, die zwei 8-Bit-Bestandteile in 2 Digitalregistern 48 und 50 ergeben. Die Digital-Register 48,50 sind ihrerseits an den Dateneingangsanschluß des Computers 46 gelegt. Ein Oszillograph 52 zeigt die Ausgänge der Verstärkerschaltungen 38, 40 durch ein entsprechendes Bild auf dem Schirm 54 an. Ein zweiter (nicht gezeigter) durch den Computer 46 gesteuerter Oszillograph kann verwendet werden, um eine Computer-gesteuerte Anzeige darzustellen.

Der Computer 46 verarbeitet die Signale aus den Analog-digital-Konvertern 44, 45 sowie Eingangssigna-Ie eines Operators über den Fernschreiber 56 und erzeugt ein Ausgangssignal, das unterschiedliche Zählungen darstellt.

F i g. 2 zeigt eine typische Kathoden-Strahl-Anzeige einer Analyse weißer Zellen, insbesondere im Sinne der Beispiele 11 und 12. Bei dieser Anzeige wurden die Signale der Grünfluorescenz für eine vertikale Ablenkung vom unteren Rand (anfänglich) und die Signale der Rotfluorescenz für eine horizontale Ablenkung nach rechts vom linken Rand her (anfänglich) verwendet Typische Ansammlungen heller Punktsignale für Zellgruppen sind mit 60, 70, 80,90,100,110 angedeutet und entsprechend Lymphocyten (L), Monocyten (M), Neutrophilen (N), Basophilen (B), Eosinophilen (E) und

unreifen Granulocyten (IG).

Um das Feststellen von Fehlsignalen zu vermeiden, wird die Signalschaltung für das Feststellen der Grün-Fluorescenz vorzugsweise mit einer Schwellenschaltung betrieben, wie beispielsweise durch die horizontale Schwellenlinie Vo angedeutet, so daß nur Signale mit einem ausreichenden Wert für Grün-Fluorescenz, der über der Schwellenlinie VO liegt, tatsächlich registriert werden und visuell erscheinen. In ähnlicher Weise kann man einen oberen Grenzwert, wie durch V₂ angedeutet, vorsehen. Werden weitere Grenzwerte, z. B. an den Linien X₀, Xu Xl X3, Xa, Xs vorgesehen, so kann man einzelne Punktansammlungen speziell darstellen oder auszählen, wie noch in Beispiel 12 ausgeführt wird. So kann beispielsweise die Punktgruppe 70 herausgewählt werden, indem die oberen Grenzen V₂ und Xr und die unteren Grenzen Xi und ΥΊ gewählt werden.

Unter Verwendung der Vorrichtung nach F i g. 1 für eine Kathoden-Strahl-Röhren-Anzeige der F i g. 2 zeigt der Computer 46 zuerst die Werte der Grün-Fluorescenz X innerhalb des Bereichs der Rot-Fluorescenz X=X-i bis X=Xs an, wenn die Zellen unmittelbar nach dem Anfärben gemessen werden.

Steigt die Grün-Fluorescenz an, wird die mittlere Neutrophil-Grün-Fluorescenz berechnet, um eine bestimmte Zeit zu erzeugen, um Daten für ein Zelldifferenzierungsprogramm zu erhalten. Wenn < Y> - Y_s für X₃ < X < X₅ führt das Programm zu dem Datenreduktionsmode.

Der Computer baut ein zwei-dimensionales Histogramm, d. h. die Anzahl der Zellen für jeden der beiden Werte der Fluorescenz. Der erste Parameter dieses Histogramms wird proportional zur grünen Fluorescenz gemacht. Der zweite Parameter ist entweder der roten Fluorescenz oder dem Verhältnis von roter/grüner Fluorescenz proportional. Das Histogramm der beiden Parameter, wird — wie in Tabelle I angegeben — eingeteilt. Die Werte für X, und V/ sind vom Operator festgelegt. Das Programm zählt die Anzahl der Zellen in jedem Bereich und druckt diese Zählungen aus.

Tabelle I

Zeil-Art	A"-Grenzen	^-Grenzen	: obere
	untere obere	untere	Yl
Lymphocyten	0 X\	Yi	Yl
Monocyten	Xi Xi	Yi	Yl
Neutrophile	X-$ X§	Yl	Yl
Basophile	0 X₂	Yo	Yi
Eosinophile	X₁ Xa		Yi
Unreife	Xa Xs
Granulocyten
	Beispiel 1

NaH₂PO₄ ■ H₂O und 250 mg Na₂HPO₄ · 7 H₂O/! Lösung.

Dieses Mittel kann durch die folgenden Stufen hergestellt werden:

Ein 1-Liter-Gefäß wird teilweise mit destilliertem Wasser gefüllt und 4,25 g Natriumchlorid können zusammen mit 0,045 g NaH₂PO₄ · H₂O und 0,25 g Na₂HPO₄ · 7 H₂O zugegeben werden. Das Gemisch wird gerührt, bis die Salze in Lösung gehen und das Gefäß dann durch Zugabe von weiterem destillierten Wasser auf ein Gesamtvolumen von 11 aufgefüllt. In einem getrennnten Gefäß werden 400 mg Acridin-orange-Pulver mit ausreichend destilliertem Wasser zusammengegeben, das man 100 cm³ Acridin-orange-Lösung erhält. Dieses Gemisch wird gerührt bis das Acridinorange in dem Wasser gelöst ist. Man erhält eine klare Lösung mit rot-orangem Farbton, lern³ der 100cm³ Acridin-orange-Lösung wird dann zu dem vorher hergestellten 1 I der Salz-Puffer-Lösung gegeben, um das oben angegebene Acridin-orange-Mittel zu erhalten. Die Kombination mit dem Salz-Puffer scheint dazu zu führen, daß ein Teil des Acridin-orange eine kolloidale Suspension ergibt. Vorzugsweise wird der pH-Wert des Mittels überprüft und, wenn eine weitere Einstellung erforderlich ist, ein oder zwei Tropfen einer Vio normalen Salzsäure-Lösung zugegeben, um den pH-Wert zu erniedrigen, oder 1 oder 2 Tropfen einer Vio normalen Natriumhydroxidlösung, um den pH-Wert zu erhöhen.

Mit diesem Färbemittel erhält man sehr zufriedenstellende Ergebnisse.

Beispiel 2

Das Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man anstelle des Phosphatpuffers, einen üblicherweise als »H EPES« (d. h.

N-2-Hydroxy-äthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure) bezeichneten Puffer mit einer Molarität von 0,005 verwendet.

Beispiel 3

Das Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man anstelle des Phosphat-Puffers einen üblicherweise als »Tris« (d.h. 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-l,3-propandiol) bezeichnen Puffer in einer Molarität von 0,15 verwendet. 45

Beispiel 4

Das Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme,

daß die Menge des Acridin-orange vervierfacht wird,

wobei man eine Konzentration von 1,6 χ 10~² g/l erhält.

r»_: j: ν_Αη·.πΗ«ι·η<ίΛη -TiaiiTf pe Qlfh HaR HlP

DCi UlCaCI IVUIItVIHlUUWii *-■-.£,·■ ■ '

Ergebnisse sehr gut sind.

Beispiel 5

Es wurde ein Färbemittel der folgenden Zusammensetzung hergestellt: Eine wäßrige Lösung, enthaltend 4xlO-³g AO/1 wurde auf eine Osmolorität von ungefähr dem halben normalen physiologischen (isotonischen) Wert eingestellt durch Zugabe von 4,25 g Natriumchlorid/l Lösung und auf einen pH-Wert von ungefähr 7,4 abgepuffert Ein solches Abpuffern kann erzielt werden mit Natriumphosphat mit einer Phosphatmolarität von 0,00125 durch Zugabe von 45 mg Das Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß die Konzentration von Acridin-orange auf 4 χ 10'² Acridin-orange/1 Lösung erhöht wird, alle anderen Bedingungen jedoch wie in Beispiel 1 bleiben. Dieses

Mittel ergibt Ergebnisse, die zufriedenstellend sind, die jedoch nicht so gut sind, wie bei den niedrigeren Konzentrationen von Acridin-orange, wie sie in den vorhergehenden Beispielen angegeben sind. Es wird folglich angenommen, daß dieses ungefähr die obere

Grenze für die Acridin-orange-Konzentration ist, die angewandt werden kann. Die Färbewirkung scheint zu groß zu sein, um eine gute Differenzierung zwischen den unterschiedlichen Gruppen weißer Zellen zu ergeben.

Beispiel 6

Das Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß die Acridin-orange-Konzentration auf 3xl0~³g Acridin-orange/1 Lösung herabgesetzt wird, alle anderen Bedingungen jedoch wie in Beispiel 1 beibehalten werden.

Das Mittel ergibt Ergebnisse, die zufriedenstellend «ind. So erhält man eine deutliche Unterscheidung zwischen den weißen Zellen und anderen Blutteilchen. Die Ergebnisse bezüglich der Unterscheidung einer Gruppe von weißen Zellen von einer anderen, scheinen jedoch etwas weniger günstig zu sein als in Beispiel 1. Folglich wird angenommen, daß diese Acridin-orange-Konzentration die untere Grenze für den bevorzugten Konzentrations-Bereich darstellt.

Beispiel 7

Das Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß die Acridin-orange-Konzentration auf 4x10-⁴ Acridin-orange/1 Lösung herabgesetzt wird, alle anderen Bedingungen jedoch wie in Beispiel 1 bleiben.

Dieses Mittel führt zu Ergebnissen, die für einige Zwecke geeignet sind. So sind sie ausreichend, um eine deutliche Unterscheidung zwischen weißen Zellen und anderen Blutteilchen zu ergeben. Die Ergebnisse zur Unterscheidung der weißen Zellen untereinander, sind jedoch wesentlich schlechter. So scheint es, daß diese Konzentration die minimale Konzentration von Acridin-orange ist, die für die Differenzierung weißer Zellen geeignet ist.

Bei den Beispielen 2 bis 7, kann das Acridin-orange mindestens zum Teil ein Kolloid bilden, wenn es zu der Salz-Puffer-Lösung gegeben wird, wie bei Beispiel 1 beschrieben.

Beispiele

Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß das Färbemittel so hergestellt wird, daß man eine Osmolarität erhält, die ungefähr 0,3 isotonisch ist, durch die Zugabe von 2,55 g Natriumchlorid/I Lösung. Alle anderen Bedingungen bleiben wie in Beispiel 1.

Das Mittel führt dazu, daß einige der weißen Zellen absterben, bevor sie analysiert werden können. Daher wird angenommen, daß eine Osmolarität, die dem 0,3-fachen Isotonischen entspricht, die untere Grenze der Hypotonität darstellt, die erfindungsgemäß angewandt werden kann.

Beispiel 9

Das Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß das Färbemittel so hergestellt wird, daß es eine Osmolarität besitzt, die ungefähr dem 0,7-fachen der isotonischen entspricht durch Zugabe von 5,95 g Natriumchlorid/l-Lösung. Alle anderen Bedingungen sind wie in Beispiel 1.

Das Mittel führt zu Ergebnissen, die nicht befriedigend sind, da die Ansammlungen von hellen Fluorescenz-Signalen nicht genügend getrennt sind. Daher wird angenommen, daß eine Osmolarität, die den 0,7-fachen des Isotonischen entspricht, die obere Grenze für die Hypotonie ist, die erfindungsgemäß geeignet ist.

Beispiel 10

0,10 ml einer frischen Blutprobe werden zu 1 ml des Acridin-orange-Färbemittels nach Beispiel 1 zugegeben. Die entstehende Suspension wird von Zeit zu Zeit leicht bewegt und eine Zeit zwischen 10 Sekunden und einigen Minuten stehengelassen, damit der Farbstoff von den weißen Zellen in der Blutprobe aufgenommen werden kann. Die Suspension wird dann in eine Vorrichtung gegeben, die ein flüssiges Sy:tem besitzt, das einen Durchfluß der flüssigen Probe in außerordentlich dünnem Strom durch eine optische Kammer ermöglicht. Der Strom ist so dünn, daß die einzelnen Zellen (sowohl rote als auch weiße Zellen) im allgemeinen eine nach der anderen einzeln hindurchfließen. In der optischen Kammer werden die Zellen durch ein gleichmäßiges Lichtfeld, von einem blauen Laser-Strahl vorzugsweise einem Argon-Laser-Strahl mit einer Wellenlänge von 488 nm (4880 Ä) hindurchgeleitet. Das gleichmäßige Lichtfeld von dem Laser ist vorzugsweise sehr kurz in der Bewegungsrichtung des Zellstroms. Diese Dimension ist in der gleichen Größenordnung wie die maximale Dimension einer einzelnen Zelle, so daß die Zellen eine nach der anderen der Strahlung ausgesetzt werden.

Es wird dann eine grüne Fluorescenz-Strahlung mit einem Wellenlängenbereich mit einem Zentrum bei ungefähr 530 nm beobachtet, die durch die optische Anregung der weißen Zellen durch den Argon-Laser-Strahl erzeugt wird und die Gesamtzahl der weißen Zellen wird in Werten für die optischen grünen Fluorescenzimpulse gezählt. Die Zählung wird für ein sorgfältig abgemessenes Volumen der Suspensionsprobe durchgeführt, um eine genaue Zählung der weißen Zellen/Volumeneinheit zu erhalten.

JO Es hat sich gezeigt, daß bei der oben angegebenen Acridin-orange-Konzentration keine wesentliche Aufnahme des Acridin-orange-Farbstoffs durch rote Zellen auftritt, die daher im wesentlichen bei der beschriebenen Nachweismethode unsichtbar bleiben (von dieser Feststellung gibt es jedoch eine Ausnahme, die später erläutert wird). Im Gegensatz dazu nimmt jede weiße Zelle eine Konzentration des Acridin-orange-Farbstoffs auf, die zu einer grünen Fluorescenz führt. So erhält man eine schnelle und genaue Zählung der weißen Zellen.

Unreife rote Zellen, die als Reticulocyten bezeichnet werden, nehmen etwas Acridin-orange-Farbstoff auf, aber der Farbstoff wird auf solche Art aufgenommen, daß von den Reticulocyten im wesentlichen keine grüne Fluorescenz ausgeht. So ist die grüne Fluorescenz eine genaue Grundlage zur Unterscheidung weißer Zellen von allen anderen Blutteilchen.

Beispiel 11

Das in Beispiel 10 angegebene Verfahren wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß neben der grünen Fluorescenz die rote Fluorescenz jeder Zeile bei einem Wellenlängen-Bereich in der Größenordnung von 650 nm festgestellt wird. Die roten und grünen Signale werden optisch getrennt durch einen dichroitischen Spiegel und geeignete Filter und durch getrennte Photomultiplier-Röhren, verstärkt. Die grünen Signale werden angewandt, um die Gesamtzahl der weißen Zellen zu erhalten, während die grünen und roten Signale kombiniert werden, um ein Anzeigemuster auf einer Kathoden-Strahl-Röhre zu erhalten. So können die grünen Signale als vertikale Verschiebungs-Coordinate und die roten Signale als horizontale Verschiebungs-Coordinate für ein einzelnes Anzeigenmuster auf der Kathoden-Strahl-Röhre für jede weiße Zelle verwendet werden. Verschiedene Amplituden der roten und grünen Fluorescenz von den verschiedenen weißen Zellen werden so auf der Kathoden-Strahl-Röhre abgebildet. Es wird angenommen, daß die unterschiedli-

chen grünen und roten Fluorescent-Amplituden auf die unterschiedlichen Eigenschaften der verschiedenen weißen Zeilarten zurückzuführen sind, wobei die weißen Zellen mit der großen Anzahl von Granula in dem Cytoplasma im allgemeinen die stärksten Fluorescenz-Signale aussenden. Die chemische Zusammensetzung verschiedener Granula in den Granulocyten ist jedoch charakteristisch unterschiedlich und führt zu Unterschieden in der Intensität der roten Fluorescenz und obwohl die weißen Zellen alle die gleiche Menge DNS enthalten, kann die Intensität der grünen Fluorescenz der Zellkerne auf charakteristische Weise durch die Unterschiede der Anziehungskraft bzw. des Festhaltevermögens gegenüber dem Farbstoff in den Zellen durch die Granuia verschiedener Zellen moduliert, werden wodurch unterschiedliche grüne Fluorescenz-Signale erhalten werden. Es hat sich gezeigt, daß jede Blutprobe ein Muster ergibt mit unterschiedlichen Punktanordnungen, die die Verteilung verschiedener Arten weißer Zellen angibt. So wird ein zweidimensionales Muster auf der Anzeigefläche der Kathoden-Strahl-Röhre erzeugt, das qualitative Informationen über die Verteilung der weißen Zellen in der Probe ergibt. Durch Vergleich der durch Blutproben von gesunden Personen (normalen Individuen), mit Mustern, die von Blutproben von Personen die Infektionskrankheiten haben, die zu Annomalien im Gleichgewicht der weißen Zellen führen, erhalten worden sind, ist es einfach, die Unterschiede festzustellen und schnell qualitativ ein Ungleichgewicht bei den weißen Zellen zu erkennen, die für bestimmte Krankheiten oder Infektionen charakteristisch sind.

Das bei dem letzten Beispiel erhaltene Muster wird vorzugsweise photographiert, um ein beständiges Dokument zu erhalten, das analysiert und untersucht und mit späteren Untersuchungen bei dem gleichen Patienten verglichen werden kann.

Beispiel 12

Das Beispiel 11 wird wiederholt und es werden Schwellenschaltungen angewandt, um grüne und rote Fluorescenz-Signale in den einzelnen engen Feldern der Flecken auszuwählen und solche Signale werden einzeln für eine vorher ausgewählte Gesamtzahl weißer Zellen ausgewählt. Das Verfahren wird dann für andere Einstellungen der Schwellenschaltungen wiederholt, um nacheinander getrennte Clusterbereiche der Anzeige zu zählen, die unterschiedlichen Arten weißer Zellen entsprechen. Auf diese Weise erhält man einzelne Zählungen für die Mengen der weißen Zellen jeder verschiedenen Art. So kann das Verhältnis der Menge jeder Art von weißen Zellen zu der Gesamtzahl weißer Zellen erhalten werden. Diese Verhältnisse werden vorzugsweise in Prozentsätzen angegeben.

Verschiedene Schwellenschaltungen können angewandt werden, um verschiedene enge Felder der Flecken auf einmal auszuzählen.

Da die Vorrichtung sehr schnell arbeitet, sind so hohe Zählgeschwindigkeiten wie 1000 Zellen/s erreichbar. Bisher unerreichte Genauigkeiten können durch Zählung tausender weißer Zellen jeder Art von jeder Probe erreicht werden, im Gegensatz mit dem üblichen manuellen Mikroskop-Verfahren zur Zählung einer sehr kleinen Menge in der Größenordnung von 100 einzelnen Zellen. Da die Zellen zur Zeit ihrer Zählung noch leben und da sie nicht durch Anwendung irgendeines Verfahrens zur Zerstörung der roten Zellen ebenfalls zerstört worden sind, entspricht die gemessene Zellenpopulation sehr genau der Zellenpopulation in dem lebenden Blutstrom des Patienten.Es hat sich gezeigt daß das erfindungsgemäße Verfahren außerordentlich wirksam ist zur Bestimmung und zur Zählung weißer Zellen, zur Unterscheidung weißer Zellen von roten Zellen auf der Grundlage der grünen Fluorescenz (wobei das Vorhandensein roter Zellen im wesentlichen keine Rolle spielt) und besonders zur Unterscheidung der einzelnen Arten weißer Zellen. Die verschiedenen

ίο Arten sind mit Hilfe der Darstellung auf einer Kathoden-Strahl-Röhre unterscheidbar durch Bildung einer diskreten Ansammlung von Punkten für jede unterschiedliche Art Es wurde bisher bestimmt daß sechs Gruppen weißer Zellen, nämlich die Lymphocyten, Monocyten_y Neutrophilen, Basophilen, Eosinophilen und unreifen Formen der Granulocyten auf diese Weise unterscheidbar sind.

Beispiel 13

Das Beispiel 1J wird wiederholt, wobei ein Helium-Cadmium-Laser anstaue eines Argon-Lasers angewandt wird. Die Ergebnisse sind zufriedenstellend, obwohl die Unterscheidung einiger der Oszilloskopanhäufungen von Flecken nicht ^o gut erhalten werden kann wie mit dem Argon-Ionen-Laser, vermutlich aufgrund der Qualität des angewandten Helium-Cadmium-Lasers.

Beispiel 14

Bisher wurde besonders die Aufgabe der Unterscheidung weißer Zellen von allen anderen Teilchen im Blut und der Gewinnung geeigneter Informationen über die weißen Zellen betont. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch auch geeignet zur Gewinnung anderer wichtiger Informationen über das Blut. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden, um die Anzahl der Reticulocyten/Volumeneinheit Blut zu bestimmen. Reticulocyten sind rote Blutzellen, die ein Netzwerk von Granula oder Fäden enthalten, die einen unreifen Entwicklungszustand repräsentieren. Reticulocyten machen normalerweise ungefähr 1% der gesamten roten Blutzellen aus, aber dieser Prozentsatz der Reticulocyten kann sich unter annomalen Bedingungen drastisch ändern und eine solche Änderung kann ein Symptom für eine Erkrankungsein.

Es wurde beobachtet, daß die Reticulocyten Acridinorange-Farbstoff unter den in den oben angegebenen Beispielen allgemein angegebenen Bedingungen im wesentlichen stärkerem Maße aufnehmen, als die übrigen roten Zellen. Die Aufnahme von Acridin-orange durch die anderen roten Blutzellen ist unbedeutend aber die Reticulocyten nehmen ausreichend Farbstofl auf, um ein rotes Fluorescenz-Signal zu ergeben, das irr wesentlichen von der gleichen Größenordnung ist, wi« bei der Lymphocytengruppe der weißen Zellen. Di( Reticulocyten ergeben jedoch kein deutliches grünei Fluorescenz-Signal. So ist es möglich, Reticulocyten voi allen anderen Blutteilchen zu unterscheiden, indem mai die Blutprobe mit dem hypotonischen Acridin-orange Färbemittel anfärbt und dann die Reticulocytei bestimmt, indem man alle grünfluoreszierenden weißei Zellen ausschließt und die verbleibenden Zellen mi einer deutlichen roten Fluorescenz bestimmt. Da folgende Beispiel erläutert diese Verfahrensweise.

Das Verfahren des Beispiels 10 wird wiederholt mi der Ausnahme, daß die Farbstoff-Konzentration auf de: in Beispiel 5 angegebenen Wert erhöht wird und di grüne Fluorescenz-Stahlung von den weißen Zellen al

Unterscheidungsmerkmal angewandt wird, um die Zählung der weißen Zellen auszuschließen, und mit der weiteren Ausnahme, daß neben dem Nachweis der grünen Fluorescenz die rote Fluorescenz jeder Zelle in einem Wellenlängen-Bereich in der Größenordnung von 650 nm aufgenommen wird und dadurch alle solchen Zellen mit einem deutlichen roten Fluorescenz-Signal ausgewählt werden, die gleichzeitig kein grünes Fluorescenz-Signal liefern. Wie bei Beispiel 11 beschrieben, kann das grüne Signal als vertikale Verschiebungs-Coordinate verwendet werden und das rote Signal als horizontale Verschiebungs-Coordinate, als Grundlage zur Festlegung einer unteren grünen Fluorescenz-Schwelle, bei der alle weißen Zellen ausgeschlossen werden und zur Bestimmung der roten Fluorescenz-Schwellen, durch die besonders die Reticulocyten ausgezählt werden.

Beispiel 15

Das Verfahren gemäß Beispiel 11 wird wiederholt, wobei eine Vorrichtung der in F i g. 1 schematisch dargestellten Art verwendet wird. Die roten und grünen Photomultiplier-Signale werden nach Verstärkung aufgenommen und gehalten, um zwei Impulse zu erzeugen, deren Amplituden proportional zu den Größen der beiden Fluorescenz-Amplituden sind. An das Signal des grünen Photomultipliers wird eine Schwellenschaltung angeschlossen, die einen Steuersignalimpuls erzeugt, wenn die grüne Fluorescenz über einem festen Wert liegt, der Leukocyten anzeigt, und jo aktiviert die Aufnahme-Halte-Verstärkerschaltungen und die Zeitsignale für die Analog-Digital-Konverter und den Computer. Die beiden gehaltenen Fluorescenz-Impulse werden jeder in eine digitale Darstellung der Fluorescenz-Werte mittels zwei Analog-Digital-Konvertern umgewandelt, die zwei acht-bit-Zahlen in zwei Digital-Registern erzeugen. Die Register sind wiederum an den Eingangs-Datenanschluß eines Computers angeschlossen, wie beispielsweise einen »Data-General«. Der Computer verarbeitet die Signale so wie Eingangsdaten, die von einem Operator über einen Fernschreiber eingegeben werden und erzeugt am Fernschreiber ein Ausgangssignal, das die differentielle Zählung darstellt.

Der Computer zeigt zuerst die Werte der Grün-Fluorescenz Y innerhalb des Bereiches der Rot-Fluorescenz X= Λ~3 bis X=X₅ an, wenn die Zellen unmittelbar nach dem Anfärben gemessen werden. Wenn die grüne Fluorescenz ansteigt, wird die mittlere neutrophile grüne Fluorescenz berechnet, um eine spezielle Zeit zu erzeugen, um Daten für das Zeil-Differenzierprogramm zu erhalten. Wenn < Y> = Y₅ für Χ₃<Χ<Χϋ. gilt, schaltet das Programm auf den Daten-Reduktions-Mode.

Der Computer baut im Speicher ein zweidimensionales Histogramm, das heißt die Anzahl der Zellen für jede der beiden möglichen Fluorescenz-Werte. In unserem System hat dieser Gitter einen Umfang von 64 χ 64. Der erste Parameter des Histogramms wird proportional zur Grün-Fluorescenz gemacht. Der zweite Parameter wird proportional zur Rot-Fluorescenz oder zum Verhältnis der roten zur grünen Fluorescenz gemacht.

Bei einem einfachen Differentiations-Programm werden 10 000 Zellen eingelesen, nachdem < Y> = V₅, um das Histogramm von Grün-gegen Rot-Fluorescenz oder grün gegen das Verhältnis von Rot- zu Grün-Fluorescenz zu bilden. Das zweitparametrige Programm wird, wie oben in Tabelle 1 gezeigt, eingeteilt. Die Werte von X, und V, werden vom Operateur festgelegt. Das Programm zählt die Anzahl Zellen in jeder Fläche und druckt diese Zählungen aus. Die ersten drei statistischen Momente der Daten in jeder Fläche, werden bezüglich beider Parameter ebenfalls berechnet, um Anzeigen herzuleiten, die mit speziellen Krankheiten korreliert werden können.

In einem komplizierteren Programm sind die Linien, die Populationen trennen, nicht fest, sondern werden vom Programm eingerichtet. Um beispielsweise den geeigneten Wert für ΛΊ zu finden, werden die Daten zwischen Vi und V2 verdichtet, um ein eindimensionales Histogramm der Werte der roten oder Verhältnis-F!uorescenz innerhalb des grünen Fluorescenzbereiches zwischen Vi und Yi zu erzeugen. Zwischen der Lymphocyten- und der Monocyten-Population wird es einen Fluorescenz-Wert geben, für den die Zellenzahl minimal ist. Dieses Minimum kann auf verschiedene Arten festgestellt werden, beispielsweise durch Regressions-Analyse mit einer parabolischen Funktion.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung und Unterscheidung spezieller weißer Blutkörperchen und anderer Teilchen in einer Blutprobe durch

a) Herstellung einer wäßrigen Lösung eines metachromatischen fluorochromen Farbstoffs, mit einem physiologischen pH-Wert, die imstande ist, das Kernmaterial weißer Zellen so anzufärben, daß sich eine Fiuorescenz ergibt, die von der Fiuorescenz aller anderen Blutteilchen verschieden ist,

b) Anfärben der vitalen weißen Zellen einer Blutprobe durch Suspendieren der Blutprobe in der Farbstofflösung,

c) Bestrahlen der entstandenen Suspension, bevor das Gleichgewicht der Farbaufnahme erreicht ist, durch eine Lichtquelle, die eine Wellenlänge besitzt, die von dem angefärbten Zellmaterial aufgenommen werden kann und

d) Unterscheidung der verschiedenen weißen Blutkörperchen durch die Stärke ihrer Fiuorescenz,