DE2134910C2

DE2134910C2 - Verfahren zur Blutanalyse

Info

Publication number: DE2134910C2
Application number: DE2134910A
Authority: DE
Inventors: Lawrence R. Shenorock N.Y. Adams; Louis A. Briarcliff Manor N.Y. Kamentsky
Original assignee: Bio-Physics Systems Inc Baldwin Place Ny Us
Current assignee: Bio-Physics Systems Inc Baldwin Place Ny Us
Priority date: 1970-07-13
Filing date: 1971-07-13
Publication date: 1982-05-13
Also published as: DE2134910A1; US3684377A; IE35449B1; IE35449L; GB1319710A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung und Klassifizierung von weißen Blutzellen im Blut

Weiße Blutzellen (weiße Blutkörperchen, Leukozyten) existieren normalerweise im Blut in verschiedenen Formen, die in Hauptgruppen eingeteilt werden können, wobei jede Gruppe einen prozentualen Anteil der Gesamtmenge innerhalb bekannter Grenzen bildet

Wesentliche Änderungen im Anteilsverhältnis der verschiedenen Arten von Leukozyten im Blut haben sich als charakteristische Merkmale für bestimmte Krankheiten erwiesen. Somit ist die differentielle Blutauszählung, eine Auszählung, bei der die relativen prozentualen Anteile der verschiedenen Arten von

Leukozyten im Blut festgestellt werden, ein äußerst

wertvolles diagnostisches und für die medizinische

Forschung geeignetes Verfahren. Das übliche Verfahren zur Erzielung einer Differen-

w tialanalyse von Leukozyten aus einer Blutprobe besteht in der optischen Untersuchung des Blutes durch ein Mikroskop mit dem menschlichen Auge.

Aus der Literaturstelle W. Kosenow,» Lebende Blutzellen im Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikro skop«, Basel und New York, 1956, Seiten 217 bis 237, ist auch schon die Differenzierung von normalen Blutzellen, darunter auch von Leukozyten, mit Hilfe der Acridinorange-Fluorochromierung bekannt. Die Blutproben werden unter dem Fluoeszenzmikroskop betrachtet und die Zellen auf Gniiid der Fluoreszenzintensität, ihrer Kerne und bestimmter Cytoplasmabereiche sowie auch auf Grund morphologischer Eigenschaften durch den Betrachter voneinander unterschieden. Aus der Literaturstelle G. Kortüm» Kolorimetrie, Photometric und Spektrometrie«, 4. Auflage, 1962, Seite 320 ist es bekannt, Fluoreszenzspektren einzelner Zellen mikrospektrometrisch, d. h. durch Kombination eines Mikroskops mit einem Spektrometer, aufzunehmen.

so Diese Verfahren sind aufwendig und zeitraubend und liefern zudem Ergebnisse von fragwürdiger Genauigkeit, da sie menschlichem Irrtum unterliegen.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines automatischen, maschinellen Verfahrens zur Differen tialanalyse von Leukozyten, das billig und rasch arbeitet und Ergebnisse mit einem hohen Genauigkeitsgrad liefert.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Blutanalyse, bei dem Leukozyten von anderen Teilchen in einer Blutprobe unterschieden werden, wobei man unter Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen eine frische Blutprobe mit einer Lösung von Acridinorange einer Anfärbung des Kerns und von Bereichen des Cytoplasmas unterzieht, die angefärbte Blutprobe mit einer Lichtquelle bestrahlt, die Spektralanteile enthält, die von dem angefärbten Kern- bzw. Cytoplas· mamaierial der Zellen absorbiert werden, und eine Klassifizierung der Zellen aufgrund der Intensitäten der

sich ergebenden unterschiedlich gefärbten Fluoreszenzstrahlungen vornimmt Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Leukozyten aus einem abgemessenen Volumen der Blutprobe auf der Grundlage der Bestimmung der grünen Fluoreszenz, die von dem angefärbten Kern jedes einzelnen Leukozyten emittiert wird, auszählt und die Klassifizierung der Zellen auf der Grundlage der Unterschiede in der Stärke der roten Fluoreszenz, die von dem angefärbten Cytoplasms, jeder einzelnen Zelle emittiert wird, ι ο vornimmt.

Physiologische Bedingungen werden aufrechterhalten, um die Blutzellen lebend zu erhalten. Der angewandte Farbstoff Acridinorange kann das Kernmaterial der Leukozyten anfärben und ist in der Lage, in diesem angefärbten Kernmaterial eine Fluoreszenz bei einer bestimmten Farbe hervorzurufen, die sich von der Fluoreszenz irgendeines anderen im Blut vorhandenen Teilchens unterscheidet Das verwendete Färbemittel besteht im wesentlichen aus einer wäßrigen Lösung von 2u Acridinorange in einer Konzentration zwischen 10-' und ΙΟ-⁵, insbesondere zwischen 8 ■ 10-' und 4 10-" g/cm³ Lösung. Die Lösung enthält noch Zusatzstoffe, um einen pH-Wert und eine Osmolalität innerhalb der normalen physiologischen Bereiche für menschliches Blutplasma aufrechtzuerhalten. Bei den bevorzugten Konzentrationen für die Acridinorangelösung ist das Gemisch keine echte Lösung, sondern eine kolloide Lösung oder kolloide Dispersion, in der äußerst kleine, nicht gelöste Teilchen in der Flüssigkeit suspendiert jo sind. Im folgenden wird jedoch diese kolloide Dispersion als Lösung und das Gemisch aus der Acridinorang«;-lösung mit einer Blutprobe als Suspension bezeichnet. Auf diese Weise wird die kolloide Dispersion des Farbstoffes besser von der flüssigen Suspension, die nach Zugabe der Blutprobe entsteht, unterschieden.

Der normale physiologische pH-Wert für menschliches Blut beträgt im allgemeinen 7,40 ± 0,05. Um eine physiologische Umgebung für die Blutprobe aufrechtzuerhalten, so daß die Zellen nicht geschädigt oder abgetötet werden, wird der pH-Wert der Lösung vorzugsweise und innerhalb praktischer Grenzen auf 7,4 ± 0,01 einreguliert Analog wird die Osomolalität, die eine Funktion der Konzentration von Salzen in der Lösung ist auf den physiologischen Wert von etwa 030 Osmolalitätseinheiten eingestellt Dies geschieht vorzugsweise mit Natriumchlorid, da natürliches Blutplasma selbst salzhaltig ist

Herstellung der Acridinorange-Lösung

50

Zur Herstellung eines bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Färbemittels ging man von einer wässerigen Lösung mit einer Konzentration von 10~⁶g Acridinorange je Kubikzentimeter aus, deren Osmolalität durch Zugabe von 0,85%iger Kochsalzlösung eingestellt war und die auf einen pH-Wert vor, 7,40 mit einem Phosphatpuffer, wie beispielsweise einer Kombination aus Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat mit einer kombinierten Phosphatmolalität von 0,0025 gepuffert war.

Die Reihenfolge der Herstellungsschritte kann dabei folgendermaßen sein: Ein Einliterbehälter wird teilweise mit destilliertem Wasser gefüllt wozu 83 g Natriumchlorid zusammen mit 0,090 g NaH₂PO4 · HjO und 0,496 g Na₂HPO₄ 7H₂O hinzugegeben werden. Das Gemisch wird danach gerührt oder bewegt bis dis Salze in Lösung gegangen sind, und der Behälter wird anschließend auf ein Gesamtvolumen von einem Liter mit destilliertem Wasser aufgefüllt In einem getrennten Behälter werden 100 Milligramm Acridinorangepuiver mit so viel destilliertem Wasser versetzt, daß 100 cm³ Acridinorangelösung erhalten werden. Das Ganze wird gerührt oder geschüttelt, bis sich das Acridinorange in dem Wasser gelöst hat Man erhält eine klare Lösung mit einem rötlich orangefarbenen Stich. Von den 100 cm³ Acridinorangelösung wird anschließend 1 cm¹ zu einem Liter der vorher gemischten Salz/Puffer-Lösung hinzugegeben, wobei die oben beschriebene Acridinorangefarblösung erhalten wird. Offeosichtlich führt die Kombination mit einem Salzpuffer zur Bildung einer kolloidalen Suspension aus einem Teil des Acridinorange.

Zweckmäßigerweise wird die fertige Lösung mit einem pH-Wert Meßgerät untersucht und, sofern eine weitere Einstellung erforderlich ist mit einem oder zwei Tropfen 0,1 η Salzsäure versetzt, um den pH-Wert zu senken, bzw. mit einem oder zwei Tropfen 0,1 η Natronlauge, um den pH-Wert zu erhöhen.

Die so erhaltene Farblösung --sferte sehr zufriedenstellende Ergebnisse. Man kann iuch anstelle des Phosphatpuffers einen Puffer aus N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure mit einer Molalität von 0.0C5 oder statt des Phosphatpuffers und Salzes einen Puffer verwenden, der aus 2-amino-2-(hydroxymethyl)-13-propandiol mit einer Molalität von 0,15 besteht.

Die Erfindung soil im folgenden an Hand von Beispielen sowie von Zeichnungen näher erläutert werden, worin

Fig. 1 ein Punktanhäufungsbild, das bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden kann,

F i g. 2 ein Histogramm, das bei der Durchführung des erfindungsgemäßer. Verfahrens erhalten werden kann, und

Fig.3 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann, darstellen.

Beispiel 1

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden 0,20 ml einer frischen Blutprobe zu 5 ml der oben beschriebenen Acridinoraiigelösung hinzugegeben. Die erhaltene Suspension wurde von Zeit zu Zeit leicht geschüttelt und etwa 10 min lang stehengelassen, um den Farbstoff von den Leukozyten der Blutprobe aufnehmen zu lassen. Anschließend wird die Probe in eine Vorrichtung mit einem Strömungssystem eingebracht daß die Blutprobe in einer äußerst dünnen Strömung durch eine optische Kammer treten läßt. Die dünne Strömung ist außerdem so schmal bemessen, daß sie den Durchfluß der einzelnen Zellen (sowohl Ei-yihrozyten als auch Leukozyten) derartig begrenzt, daß sie normalerweise einzeln hintereinander, also in einer Einerreiiie, strömen. In der optischen Kammer werden die Zellen durch ein gleichförmiges Lichtfeld treten gelassen, das von einem blauen Laserstrahl, vorzugsweise einem Argonionenlasser bei einer Wellenlänge von 4880 Ä, gebildet wird. Das gleichförmige Liehtfeld von dem Laser besitzt vorzugsweise eine sehr geringe Ausdehnung in der Richtunf! dsr Wanderung der Zellproben. Diese Ausdehnung ist von derselben Größenordnung wie die maximale Ausdehnung einer einzelnen Zelle, so daß die Zellen jeweils nur einzeln, d. h. zu einem Zeitpunkt immer nur eine Zelle, bestrahlt werden,

Die erüne Fluoreszenzstrahlung von den Leukozvten

in einem Wellenlängenbereich um etwa 5300 A, die von der optischen Anregung der Leukozyten durch den Argonlaserstrahl herrührt, wird dann bestimmt, und die Gesamtzahl der Leukozyten wird in Form von optischen Impulsen geringer Fluoreszenz ausgezählt. Diese Auszählung wird für ein sorgfältig abgemessenes Volumen der Suspension durchgeführt, so daß man je Volumeneinheit eine genaue Auszählung der Leukozyten erhält.

Es wurde gefunden, daß bei den oben erwähnten Acridinorangekonzentrationen von den Erythrozyten mit einer einzigen, weiter unten erwähnten Ausnahme praktisch keinerlei Acridinorange aufgenommen wird, so daß die roten Zellen bei der oben beschriebenen Bestimmungsmethode praktisch unsichtbar bleiben. Im Gegensatz dazu nimmt jeder Leukozytenkern Aeridinorangefarbstoff auf, was zu einer praktisch gleichförmigen, grünen Fluoreszenzemissionscharakteristik führt. Man erzielt auf diese Weise eine schnelle und genaue Auszählung der Leuko/.yien. unreife Eryihrti/.yien. M>g. Retikulozyten, nehmen zwar auch bedeutende Mengen Acridinorange auf, jedoch wird der Farbstoff in einer derartigen Weise aufgenommen, daß praktisch keinerlei grüne Fluoreszenzemission von den Retikulo/.ytcn ausgeht. Somit ist die grüne Fluoreszenzemission eine genaue Grundlage zur Unterscheidung von Leukozyten von allen anderen Blutteilchen.

Zusätzlich zur grünen Fluoreszenz wurde auch die rote Fluoreszenz von jeder Zelle bei einem Wellenlängenbereich von der Größenordnung von 6500 A bestimmt. Rote und grüne Signale wurden optisch mit Hilfe eines dichroitischen Spiegels und geeigneter Filter getrennt und durch besondere Photomultiplier-Röhren verstärkt. Die grünen Signale wurden danach zur Ermittlung der Gesamtzahl an Leukozyten und die roten Signale zur Herstellung eines Musters auf einer Kathodenstrahlröhre verwendet. Vorzugsweise werden die grünen Signale auch dazu verwendet, um den Kathodenstrahl zu verstärken, so daß für jede Zelle ein einzelner Bildpunkt erscheint, und um ein zugeordnetes Signal auf dem Kathodenstrahlröhrenbildschirm zu erzeugen. Auf diese Weise kann das grüne Signal als vertikale Verschiebungskoordinate und das rote Signal als horizontale Verschiebungskoordinate für einen einzelnen Bildpunkt auf der Kathodenstrahlröhre für jedes weiße Blutkörperchen verwendet werden. Somit werden auf der Kathodenstrahlröhre verschiedene Amplituden von roter Fluoreszenz von den verschiedenen Leukozyten abgebildet. Man nimmt an. daß die verschiedenen Amplituden der roten Fluoreszenz den unterschiedlichen Eigenschaften der verschiedenen Arten von Leukozyten zuzuschreiben sind, wobei diejenigen Leukozyten, die die größte Anzahl von Granula im Cytoplasma besitzen, das größte Rotfluoreszenzsignal ergeben. Es wurde gefunden, daß jede Blutprobe ein Bildmuster liefert das bestimmte Punktansammlungen besitzt die die Verteilung der verschiedenen Arten von Leukozyten wiedergeben. Durch Vergleich der Muster, die durch Blutproben normaler Individuen erzeugt werden, mit Mustern, die durch Blutproben von Individuen erzeugt werden, die an Krankheiten oder Infektionen leiden, die Abnormitäten in der Gieichgewichtsverteilung der Leukozyten verursachen, wurde ermittelt daß es sehr praktisch ist die Differenzen nachzuweisen und Zustände von Ungleichgewichten zwischen den verschiedenen Leukozyten, die für bestimmte Krankheiten oder Infektionen charakteristisch sind, schnell zu erkennen. Wenngleich das grüne Signal in weit geringerem Ausmaß Veränderungen unterworfen ist als das rote, so gibt es doch bestimmte individuelle Verschiedenheiten auch bei bei dem grünen Signal. Somit wird ein zwcidimensionales Bildmuster auf ·> dem Schirm der Kathodenstrahlröhre erzeugt, das eine qualitative Information über die Verteilung der weißen Blutzellen in der Probe liefert.

Das abgebildete Muster wird vorzugsweise fotografiert, um auf diese Weise eine dauerhafte Information /.u in erhalten, die analysiert und studiert werden und die mit früheren Versuchsaufnahmen von demselben Patienten vcrplichen werden kann.

Beispiel 2

r. Beispiel I wird mit der Abweichung wiederholt, daß Schwellenkreise angewandt werden, um Rotfluoreszenzsignale innerhalb individueller, schmaler Felder von Bildptinktsammlungen zu selektieren, und diese Signale werden individuell für eine vorgewählte Leukozytenge·

_■" SHiiii/iinipruuc liiiSgcZänii. Die mciuöuc V»irci anschließend für andere eingestellte Schwellenkreise wiederholt, um nacheinander verschiedene Piinktansammlungsbereiche entsprechend den verschiedenen l.eukozytenklassen auszuzählen. Auf diese Weise werden

:■ individuelle Zählungen der Mengen von Leukozyten aller unterschiedlichen Arten erhalten. Somit wird das Verhältnis von jeder Leukozytenart zur Gesamtzahl von Leukozyten erhalten. Derartige Verhältnisse werde!, vorzugsweise in Prozent ausgedrückt.

ι» Fig. I stellt ein Kathodenstrahlröhrenbild aus einer Signalgruppe aufgrund einer Leukozytenanalyse dar, die gemäß den beschriebenen Mothoden. insbesondere im Hinblick auf Beispiele 1 unu 2 erhalten wurde. In diesem Bild wurden die Signale für grüne Fluoreszenz

ti für die vertikale Verschiebung vom unteren Rand aus und die Rotfluoreszenzsignale für die horizontale Verschiebung nach rechts von der Ursprungslinie am linken Rand aus verwendet. Typische Ansammlungen heller Signalpunkte für Zählgruppcn sind bei 9, 11 und

ίο 13 zu sehen. Die Punktansammlung 9 mit dem niedrigsten Rotfluoreszenzwert stellt die Gruppe der Lymphozyten dar. Die Ansammlung 11 mit einem etwas höheren Rotsignalwert stellt die Zwischengruppe dar und die Ansammlung 13 mit dem höchsten Wert und

•ti breitesten Bereich für rote Fluoreszenz die polymorphonuklearen Leukozyten (Granulozyten). In bestimmten Fällen erwies es sich als möglich. Untergruppen innerhalb dieser Ansammlungen zu unterscheiden, insbesondere, wenn die horizontale Verstärkung der Oszilloskopverschiebungskreise erhöht wird.

Um die Möglichkeit der Registrierung falscher Signale zu vermeiden, wird der Signalkreis iür die Bestimmung der grünen Fluoreszenz vorzugsweise mit einem Schwellenkreis durchgeführt wie beispielsweise durch die horizontale Schwellenlinie 17 angedeutet so daß lediglich diejenigen Signale, die einen so hohen Wert für das grüne Fluoreszenzsignal besitzen, daß die Schwellenlinie 17 überschritten wird, registriert und in dem visuellen Bild angezeigt werden. Analog kann eine obere Schwelle eingerichtet werden, wie bei 19 gezeigt Durch Verwendung zusätzlicher Schwellenwerte an den Stellen der Linien 21, 23, 25 und 27 können bestimmte einzelne Punktanhäufungen herausgegriffen und allein dargestellt oder, wie in Beispiel 2 erwähnt ausgezählt werden. Beispielsweise kann die Punktansammlung 9 durch Festsetzen der oberen Grenze bei 23 und der unteren Grenze bei 21 herausgegriffen werden. Analog kann die Punktansammlung 11 durch Setzen der

Obergrenze bei 25 und der Untergrenze bei 23 ausgewählt werden.

Fig. 2 stellt ein Histogramm (Häufigkeitskurve) dar, das sich aus den gleichen Daten, wie sie in Fig.) dargestellt sind, ergibt. Die vertikale Koordinate gibt ein Maß für die Zellenzahl für jede der auf der horizontalen Achse aufeinanderfolgenden Positionen an. Die Amplitude der roten Fluoreszenz wird 'viederum auf der horizontalen Achse aufgetragen. Es e/gibt sich, daß der Peak der Kurve bei 9/4 den Mittelpunkt des Haufens 9 gemäß F i g. 1 entspricht. Die Tatsache, daß dieser Peak sehr hoch ist, zeigt an, daß in dieser Anhäufung innerhalb eines sehr engen Bereiches roter Fluoreszenz eine große Zahl einzelner Zellen abgebildet sind. Im Gegensatz dazu zeigt der Peak 11/4. der der Anhäufung 11 gemäß Fig. I entspricht, mit seinem niedrigeren Wert an, daß eine geringere Zellenzahl mit roter Fluoreszenz in den Mittelpunkt der Anhäufung 11 fällt. Der Peak 13,4 besitzt eine breite Form, was zeigt, daß eine verhältnismäßig große Zahl von Zellen in praktisch den gesamten Bereich der Anhäufung 13 fällt und praktisch die gesamte rote Fluoreszenz innerhalb dieser Anhäufung liegt. Das Histogramm gibt sehr wertvolle und einzigartige Informationen für jeden einzelnen, dessen Blut untersucht wird, wobei die Form des Histogramms für jeden einzelnen charakteristisch ist und individuelle physiologische Eigenheiten innerhalb des normalen Bereichs oder pathologische Abweichungen von der Norm für ein bestimmtes Individuum erkennen läßt.

Während bisher das Ziel der Unterscheidung der Leukozyten von allen anderen Blutteilchen und der Herleitung nützlicher Information über die Leukozyten betont wurde, wurde jedoch auch gefunden, daß gemäß der Erfindung andere wichtige Informationen über das Blut zu erhalten sind. Beispielsweise kann nach der Erfindung die Anzahl der Retikulozyten je Volumeneinheit Blut bestimmt werden. Retikulozyten sind rote Blutkörperchen, die ein Netzwerk aus Körnern oder Fäden enthalten, die einen unreifen Entwicklungszustand anzeigen. Retikulozyten machen normalerweise etwa 1% der Gesamtmenge der roten Blutkörperchen aus, doch kann der Prozentsatz an Retikulozyten unter abnormen Bedingungen dramatischen Veränderungen unterworfen sein, und eine derartige Veränderung kann für eine Krankheit symptomatisch sein.

Es wurde gefunden, daß die Retikulozyten Acridinorange unter den in den obigen Beispielen angegebenen Bedingungen zu einem weit größeren Ausmaß aufnehmen als die anderen roten Blutkörperchen. Die Aufnahme von Acridinorange durch die anderen roten Blutkörperchen ist unbedeutend, jedoch nehmen die Retikulozyten genug Farbe auf, daß sie ein Rotfluoreszenzsignal erzeugen, das praktisch die gleiche Größe hat wie das der Lymphozyten unter den weißen Zellen. Jedoch liefern die Retikulozyten keine bedeutenden Grünfluoreszenzsignale. Somit ist es möglich, Retikulozyten von allen anderen Blutteilchen durch Anfärben einer Blutprobe mit physiologischer Acridinorangelösung und anschließender Ausschließung sämtlicher grünfluoreszierender weißer Blutkörperchen von der Messung und Messung der übrigbleibenden Zellen, die eine bedeutende rote Fluoreszenz aufweisen, zu unterscheiden.

Eine bevorzugte Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere im Hinblick auf die optische Kammer, das Probenströmungssystem und das optische System ist in der DE-OS

21 01 358 beschrieben.

In Fig. 3 ist ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung dargestellt, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann. Die Vorrichtung besteht aus einer optischen Kammer 10, durch die ein Strom 12 aus in Suspension gehaltenen Zellen über ein Rohr 14 aus einem Reservoir 15 geleitet werden kann. Die Suspension ist vorzugsweise von einer Wasserhülle umgeben, um die Teilchen (Zellen) zu einem sehr dünnen Strom einzuengen, Wenn der Strom 12 aus Teilchen durch die Kammer 10 hindurchtritt, passiert er einen schmalen Lichtstrahl 20. der aus einer Lichtquelle 22 stammt. Die Lichtquelle 22 ist vorzugsweise ein Argonlaser und kann eine zylindrische Linse 224 zum Formen und Richten des Lichtbündels enthalten.

Unterschiedliche optische Reaktionen der einzelnen Blutzellen auf den Lichtstrahl 20 werden in Form von Fluoreszenzstrahlung aus jeder Zelle durch fotoclektrische Abtastelemente 24 und 26, die vorzugsweise Photomultiplierröhren sind, erfaßt. Die Signale, die von den lichtempfindlichen Abtastelementen 24 und 26 gegeben werden, werden von ihnen in elektrische Signalimpulse umgesetzt, die durch Verbindungsleitungen 30 und 32 an einen Auswertungskreis 34 weitergegeben werden. Das Abtastelement 24 ist so angeordnet, daß es auf die Rotfluoreszenzsignale, das Element 26 so, daß es auf die Grünfluoreszenzsignale anspricht. Die Übertragung der optischen Fluoreszenzsignale auf die Abtastelemente wird durch einen Reflektor 16 und eine Linse 18 begünstigt. Ein Filter 18/4 kann außerdem vorgesehen sein, der sämtliches Licht hindurchläßt, das Wellenlängen über etwa 5000 A besitzt. Auf diese Weise wird praktisch sämtliche Strahlung ausgeschlossen, die von dem Argonlaser bei der Wellenlänge 4880 Ä reflektiert wird. Das Filter 18-4 trägt somit dazu bei, sicherzustellen, daß sämtliche von den Abtasteinheiten 24 und 26 aufgenommene Strahlung aus der Fluoreszenzstrahlung der Zellen stammt. Ein dichroitischer Spiegel 28, der eine nominale Grenzwellenlänge für Licht bei etwa 5800 A besitzt, ist ebenfalls vorgesehen. Er reflektiert das Licht sämiicher Wellenlängen unterhalb dieser Grenze durch ein Filter 26/4 hindurch auf das Abtastelement 26. Sämtliche optischen Signale oberhalb 5800 A Wellenlänge werden durch den dichroitischen Spiegel 28 und durch ein optisches Filter 24/4 zu dem Abtastelement 24 hindurchgelassen. Das Abtastelement 24 empfängt die Rotfluoreszenzsignale, und das Filter 24/4 läßt ein rotes Strahlungsband um 6300 A hindurch. Analog läßt der Grünfilter 26/4 ein grünes optisches Signalband in dem Bereich um 5300 A durch.

Die Analyse der optischen Reaktionssignale im Kreis 34 veranlaßt, daß der Kreis zwei Zählwerke 36 und 38 erregt Das Zählwerk 36 gibt die Gesamtzahl an Teilchen in einer bestimmten Probe und das Zählwerk 38 die Anzahl von Teilchen innerhalb der Probe an, die eine bestimmte zu bestimmende Eigenschaft besitzen, wie beispielsweise einen bestimmten Amplitudenbereich für Rotfluoreszenzsignale. Der Kreis 34 ist außerdem vorzugsweise mit einem Kathodenstrahloszilloskop 40 verbunden, um Signale dorthin zu liefern.

Die flüssige Probe, die die zu analysierenden Teilchen enthält, kann aus einer Quelle 15 durch die Leitung 14 herangeführt werden. Um eine genaue Volumenabmessung für ein bestimmtes flüssiges Probenvolumen, das analysiert werden soll zu erhalten, sind Fotozellen 46 und 48 an voneinander beabstandeten Punkten längs des

Rohres 14 vorgesehen, das vorzugsweise aus Glas ist, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Flüssigkeit an den entsprechenden Stellen gegenüber den Fotozellem zu bestimmen. An den entsprechenden Fotozellen sind davon getrennte Lichtquellen 50 und 52 vorgesehen. Befindet sich Flüssigkeit in dem Rohrabschnitt zwischen Lichtquelle 50 und Fotozelle 46. so fokussiert die Flüssigkeit das Licht aus der Lichtquelle 50 auf die Fotozeile 46 und führt zu einem Signal von größerer Intensität. Wenn jedoch dieser Abschnitt des Rohres 14 leer und nur von Luft erfüllt ist, wird die Beleuchtung defokussiert und das optische Signal zur Fotozelle 46 hin entsprechend verringert. Der Wechsel in der Signalintensität bei der Fotozelle 46 wird innerhalb des Kreises 34 angezeigt. Die Fotozelle 48 reagiert in analoger Weise auf die Beleuchtung von der Lichtquelle 52. Der Abschnitt von Rohr 15 zwischen den Fotozellen 46 und 48 kann als länglicher Behälter aufgefaßt werden, der einen F.inlaß bei der Fotozelle 46 und einen Auslaß bei der Fotozelle 48 aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform veranlaßt der Kreis 34 dann, wenn die Fotozellen 46 und 48 beide die Anwesenheit von Flüssigkeit im Rohr 14 anzeigen, beide

'· Zählwerke 36 und 38 auf Nullstellung zurückzugehen. Wenn das Schwänzende der Teilchenprobe die obere Fotozelle 46 passiert, so daß die Anwesenheit von Luft statt Flüssigkeit angezeigt wird, wird die Zählung der Teilchen begonnen gelassen. Wenn das Schwanzende

πι der Flüssigkeitsprobe die untere Fotozelle 48 passiert, wird die Übertragung von weiteren Zählimpulsen zu den Zählwerken 36 und 38 gestoppt. Auf diese Weise sind die Zählergebnisse, die in den Zählwerken 36 und 38 gespeichert sind, auf ein Volumen an teilchenführen- < der Flüssigkeit bezogen, das genau dem Fliissigkeitsvolumen zwischen den entsprechenden Fotozellen 46 und 48 innerhalb der Röhre 14 vorhanden ist. entspricht.

F.inzelheiten über den Kreis 34 sind der DH-OS 21 34 937 zu entnehmen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Blutanalyse, bei dem Leukozyten von anderen Teilchen in einer Blutprobe unterschieden werden, wobei man unter Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen eine frische Blutprobe mit einer Lösung von Acridinorange einer Anfärbung des Kerns und von Bereichen des Cytoplasmas unterzieht, die angefärbte Blutprobe mit einer Lichtquelle bestrahlt, die Spektralanteile enthält, die von dem angefärbten Kern- bzw. Cytoplasmamaterial der Zellen absorbiert werden, und eine Klassifizierung der Zellen aufgrund der Intensitäten der sich ergebenden unterschiedlich gefärbten Fluoreszenzstrahlungen vornimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man die Leukozyten aus einem abgemessenen Volumen der Blutprobe auf der Grundlage der Bestimmung der grünen Fluoreszenz, die von dem angefärbten Kern jedes einzelnen Leukozyten emittiert wird, auszählt und die Klassifizierung der Zellen auf der Grundlage der Unterschiede in der Stärke der roten Fluoreszenz, die von dem angefärbten Cytoplasma jeder einzelnen Teile emittiert wird, vornimmt

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Umwandeln der Intensitäten der Fluoreszenzstrahluiigsemissionen der einzelnen Leukozyten im roten Anteil des sichtbaren Spektrums in elektrische Signale ein Histogramm erzeugt, wobei die Häufigkeit, mit der die Intensitäten der roten elektrischen Signale in einen bestimmten engen Bereich fallen, als vertikale Größe eines individuellen Histogramms angezeigt werden, bei dem die horizontale Verschiebung dem Wer: der Intensität der ro! ^n Strahlungsemission entspricht, deren Frequenz gemessen wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlungsemissionen jeder Zelle im roten Anteil des sichtbaren Spektrums durch Umwandlung der roten optischen Signale in elektrische Signale bestimmt und diese auf dem Schirm einer Kathodenstrahlröhre abbildet, wobei die Intensität der roten Sigirale durch Ablenkung des Kathodenstrahlröhrenstrahls längs einer Achse angezeigt wird, die grünen optischen Signale in elektrische Signale umgewandelt und zur Steuerung der Ablenkung des Kathodenstrahlröhrenstrahls längs der anderen Achse verwendet werden und die grünen Signale außerdem als elektrische Strahlaufhellungssignale verwendet werden.

4. Verfahret·, gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Spannungsschwellenwerte anwendet, um die Rotfluoreszenzsignale innerhalb eines engen Feldes auszuwählen, und die Signale aus dem engen Feld für ein bestimmtes Blutprobenvolumen einzeln gezählt werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die grünen Fluoreszenzsignale oberhalb einer bestimmten Schwelle zur Bestimmung des Durchtritts der Zahl der weißen Blutkörperchen entsprechend einem vorherbestimmten Zählwert bis zu diesem Zählwert auszählt, daß man Spannungsschwellen zur Auswahl roter Fluoreszenzsignale innerhalb eines engen Feldes anwendet und rote Fluoreszenzsignale aus dem engen Feld während der Dauer der Auszählung der grünen Fluoreszenz individuell auszählt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Retikulozyten von anderen roten Zellen und von allen anderen Teilchen in der Blutprobe dadurch unterscheidet, daß man die weißen Zellen, die die grüne Fluoreszenz ergeben, ausschließt und nur die übrigen Zellen, die eine rote Fluoreszenz ergeben, einschließt