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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagens zur Zählung
von Retikulozyten mittels Durchfluß-Zytometrie, wobei eine
wäßrige Lösung eines Farbstoffs und eines Puffers enthalten
ist. Ein solches Reagens ist aus DE-A-35 44 867 bekannt.
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Unreife Erythrozyten im Blut werden Retikulozyten genannt und
machen normalerweise 0,7 bis 2,2% der Gesamtzählung von
Erythrozyten aus. Eine Bestimmung der Retikulozyten-Zahl
trägt zur Bestätigung der Diagnose solcher Krankheiten wie
akuter innerer Hämorrhage, hämolytischer Anämie, aplastischer
Anämie usw. und ebenfalls dazu bei, den Verlauf des Zustands
eines Patienten nach Verabreichung einer Arznei zu verfolgen.
Somit wird sie als sehr wichtig auf dem Gebiet klinischer
Labortestverfahren erachtet.
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Eine Methode, die zur Zählung genannter Retikulozyten
angewandt worden ist, wird wie folgt durchgeführt: Es werden
eine Schmierprobe von Blut, die mit einem basischen
Farbstoff, wie neuem Methylenblau, Brilliantkresylblau usw.
gefärbt ist, betrachtet und der Prozentsatz der Zahl der
gefärbten Retikulozyten, bezogen auf die
Gesamterythrozytenzahl, ermittelt.
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Diese Methode erfordert viel Zeit und beinhaltet einen
beträchtlichen Arbeitsaufwand zur Vorbehandlung von
Blutproben, z. B. Färbung usw., sowie zur visuellen Zählung
nach dem Färben und erweist sich als ungeeignet, wenn die
Probenzahl groß ist.
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Deshalb sind viele Verfahren vorgeschlagen worden, in denen
die Zählung der Retikulozyten durch die Anwendung von
Durchfluß-Zytometrie automatisiert ist. Beispielsweise sind
Verfahren, in denen ein fluorochromes Reagens, enthaltend
Auramin O, zur Zählung von Retikulozyten mittels Durchfluß-
Zytometrie verwendet wird, in JP 280565/1986 und JP
34058/1987 offenbart.
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Die hier auftretenden Erfinder führten die Zählung von
Retikulocyten mittels Durchfluß-Zytometrie auf folgende Weise
durch, wobei ein Reagens der unten als Beispiel angegebenen
Zusammensetzung einer Färbungslösung verwendet wurde, um die
Effekte von Auramin O zu untersuchen, welches in den
vorgenannten früheren Literaturstellen der JP-OS
280565/1986 und 34058/1987 beschrieben ist:
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Auramin O 500 ppm
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Ethylenglycol 2,5 V/V%
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HEPES-Natriumhydroxid 20 mM
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NaCl 120 mM
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Die Messung wurde 12mal kontinuierlich für jede Blutprobe
unter Einsatz einer Vorrichtung für die Durchfluß-Zytometrie
durchgeführt, welche gedreht wurde, um einen geeigneten
Empfindlichkeitsgrad aufzuweisen. Ca. 20 Sekunden vor jeder
Messung wurde das die Blutprobe enthaltende Blutprobengefäß
zum Zweck des Umrührens wiederholt mit der Oberseite nach
unten gedreht. Das Blutprobengefäß wurde geöffnet, und es
wurden 400 ul der Blutprobe im Inneren sofort nach jeder
Messung abgezogen.
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Fig. 1 zeigt die Meßergebnisse aus zwei Proben. Beide Proben
zeigten einen Abfall der Retikulozyten-Zählung (Ret-%), als
die Messungen wiederholt wurden. Unter solchen Bedingungen
ist eine akkurate Zählung der Retikulozyten nicht zu
erwarten.
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Bei den obigen Messungen betrug der jedesmal erforderliche
Mengenwert für das Blut so viel wie 400 ul, weil ein voll
automatisiertes Durchfluß-Zytometrie-Meßgerät verwendet
wurde. Wird allerdings die Blutprobe nach einer Färbung von
Hand einer Durchfluß-Zytometrie unterzogen, sind nur 10 ul
Blut notwendig. In Fällen, in denen Blut mit 10 ul abgezogen
wird, tritt eine merkbare Änderung bei der Retikulozyten-
Zählung (%), wie sie in Fig. 1 beobachtet wird, nicht auf.
Sogar wenn nicht-spezifische Färbung eintritt und die
Fluoreszenz-Intensität als Ganzes ansteigt, läßt sich eine
fast völlig akkurate Retikulozyten-Zählung (%) angeben,
solange die Empfindlichkeit des Gerätes in geeigneter Weise
für diese Bedingung gesteuert ist.
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Anders ausgedrückt, eine nicht-spezifische Färbung tritt nur
dann auf, wenn eine kontinuierliche Messung mit einer Probe
durchgeführt wird, wobei ein großes Volumen an Blut aus
derselben Probe jedesmal abgezogen wird.
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Fig. 1 zeigt die Ergebnisse einer kontinuierlichen Zählung
von Retikulozyten unter Verwendung eines Auramin O-
Färbungsreagens mit einer Zusammensetzung des Standes der
Technik; auf der Ordinate sind die Retikulozyten-Zählung (%)
und auf der Abszisse die Anzahl der Wiederholungsmessungen
angegeben.
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Fig. 2(a), 2(b) und 2(c) zeigen jeweils die Ergebnisse einer
Zählung von Retikulozyten mittels Durchfluß-Zytometrie unter
Verwendung einer Auramin O-Färbungslösung gemäß der
vorliegenden Erfindung mit den folgenden Blutproben, welche
über einen bestimmten Zeitraum vor der Messung in drei
verschiedenen Weisen aufbewahrt wurden: Eine Blutprobe wurde
in einem fest verschlossenen Probengefäß, eine weitere Probe
in einem unverschlossenen Probengefäß, das der Luft
ausgesetzt war, und eine dritte Probe in einem
unverschlossenen Probengefäß aufbewahrt, das einer CO&sub2;-
Atmosphäre ausgesetzt war. In den Figuren stellen A einen
Bereich, der Retikulozyten entspricht, B einen Bereich, der
reifen Erythrozyten entspricht, und C einen Bereich dar, der
Plättchen entspricht.
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Fig. 3 zeigt die Ergebnisse einer kontinuierlichen Zählung
von Retikulozyten unter Verwendung des Reagens (ii) von
Tabelle 1; Abszisse und Ordinate entsprechen denjenigen von
Fig. 1.
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Fig. 4 zeigt die Ergebnisse einer Zählung mit einer einer
CO&sub2;-Atmosphäre ausgesetzten Probe unter Verwendung der
Färbungslösung von Beispiel 2.
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Zur weiteren Klärung des oben erwähnten Problems einer
nichtspezifischen Färbung wurde der folgende Versuch durchgeführt.
Eine Einzelprobe wurde in drei Teile geteilt: Der erste Teil
der Probe wurde in einem Probengefäß aufbewahrt, das fest
verschlossen war; der zweite Teil der Probe wurde mit dem
unverschlossenen Gefäß der Luft ausgesetzt; und der dritte
Teil der Probe wurde einer CO&sub2;-Atmosphäre ausgesetzt, indem
man sie in einem offenen Gefäß in eine CO&sub2;-Umgebung stellte.
Nach Ablauf einer bestimmten Zeitdauer wurde die Zählung der
Retikulozyten an jedem Spezimen unter Verwendung der
genannten Auramin O-Färbungslösung mittels Durchfluß-
Zytometrie durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2(a),
2(b) und 2(c) angegeben.
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In jeder Figur stellen die Abszisse die relative Intensität
der Fluoreszenz, die Ordinate die relative Intensität des
vorderen Streulichts und jeder Punkt eine jeweils gezählte
Zelle dar. In den Figuren stellen A einen Bereich, der
Retikulozyten entspricht, B einen Bereich, der reifen
Erythrozyten entspricht,und C einen Bereich dar, der
Plättchen entspricht. Fig. 2(a) zeigt das Ergebnis, als die
Blutprobe in einem Probengefäß fest verschlossen war, Fig.
2(b)
zeigt das Ergebnis, als die Probe der Luft ausgesetzt
war, und Fig. 2(c) das Ergebnis, als die Probe einer CO&sub2;-
Atmosphäre ausgesetzt war. Die im den Retikulozyten
entsprechenden Bereich A gezählte Zahl der Zellen betrug 164
im Fall von Fig. 2(a), 145 im Fall von Fig. 2(b) und 2579 im
Fall von Fig. 2(c). Es ist ersichtlich, daß im Fall von Fig.
2(c) reife Erythrozyten ebenfalls gefärbt (nicht-spezifische
Färbung) und somit irrtümlich als Retikulozyten gezählt
werden.
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Die Ursachen der oben dargelegten Phänomene und Probleme
können wie folgt erklärt werden:
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Im allgemeinen sind HCO&sub3;&supmin; und CO&sub2; in Erythrozyten vorhanden.
Diese beiden Spezies von HCO&sub3;&supmin; und CO&sub2; stehen innerhalb der
Erythrozyten im Gleichgewicht mit negativen Ionen im Blut
(Plasma). Nachfolgend werden sowohl HCO&sub3;&supmin; als auch CO&sub2;
gemeinsam als CO&sub2; bezeichnet.
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Ändert sich die CO&sub2;-Konzentration im Plasma, verändert sich
die CO&sub2;-Konzentration in den Erythrozyten in derselben
Richtung. Die CO&sub2;-Konzentration im Plasma steht im
Gleichgewicht mit dem CO&sub2; in der Umgebung, in die das Blut
gestellt ist, und die CO&sub2;-Konzentration im Plasma ändert sich
in derselben Richtung wie die der CO&sub2;-Konzentration in der
Umgebung. Deshalb nehmen Erythrozyten, die an einer
CO&sub2;reichen Atmosphäre stehengelassen werden, reichlich CO&sub2; auf,
wohingegen das CO&sub2; in Erythrozyten einer Blutprobe, die fest
verschlossen unter Luft aufbewahrt ist, die wenig CO&sub2; enthält
(CO&sub2;-Konzentration: 0,03%), absinkt.
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In einer Färbungslösung vorhandene Erythrozyten unterliegen
einer Ionenaustauschreaktion, die ähnlich der oben
beschriebenen abläuft. Diese Sachlage kann wie folgt
analysiert werden:
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(A) Die Menge an in der Färbungslösung enthaltenem CO&sub2; ist
größer als die in Erythrozyten.
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In diesem Fall steigt die Menge an CO&sub2; in den Erythrozyten
an.
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(B) Die Menge an CO&sub2; in der Färbungslösung ist kleiner als
die der Erythrozyten.
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In diesem Fall sinkt die Menge an CO&sub2; in den Erythrozyten ab
und wird durch andere Anionen der Färbungslösung
ausgetauscht.
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Die obige Kategorie (B) kann in zwei Gruppen eingeteilt
werden:
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(B-1) Der Fall, wobei die Färbungslösung Halogenanionen
wie Cl&supmin; usw. enthält.
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In diesem Fall wird die Menge an Halogenionen in den
Erythrozyten ansteigen.
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(B-2) Der Fall, wobei die Färbungslösung keine
Halogenionen enthält.
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In diesem Fall wird sich die Menge an Halogenionen in den
Erythrozyten nicht verändern, und die Menge der weiteren
Anionen wird ansteigen.
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Die Menge an genannten Halogenionen wie Cl&supmin; in den
Erythrozyten hat einen großen Einfluß auf die Formen von
Erythrozyten und die Membranpermeabilität des Farbstoffs.
Daher werden sich im obigen Fall (B-1) die Tendenz zur
Aufnahme von Farbstoff sowie die Formen der Erythrozyten
verändern.
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Im allgemeinen ist die CO&sub2;-Konzentration in der Luft
niedriger als die in Blutkörperchen. Wird das Blut der
Atmosphäre ausgesetzt, wird sich daher CO&sub2; aus Erythrozyten
in die Luft bewegen. Wird das Blut in einem fest
verschlossenen Gefäß gehalten, wird sich CO&sub2; aus Erythrozyten
an die Luft bewegen, bis ein bestimmter Gleichgewichtszustand
erreicht ist. Ist das Gefäß während der Aufbewahrung
geöffnet, wird die Luft innerhalb des Gefäßes ausgetauscht,
und CO&sub2; wird sich erneut aus den Erythrozyten in die Luft
bewegen. Bei Abzug einer spezifizierten Menge an Blut wird
das Gefäß jedesmal geöffnet, wobei das Blutvolumen innerhalb
des Gefäßes entsprechend abgesenkt wird und die Menge an Luft
in dem Gefäß ansteigt, was zu Bedingungen führt, die im
wesentlichen denjenigen des Falles ähnlich sind, bei dem Blut
in einem zur Luft offenen Gefäß enthalten ist. Daher wird die
CO&sub2;-Konzentration in Erythrozyten auf die
Unterhaltsversorgung entsprechend dem Fall absinken, bei dem
das Blut Luft ausgesetzt ist.
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Im Fall eines in der vorgenannten Fig. 1 gezeigten Reagens
wurden jedesmal 400 ul Blut abgezogen, das fest verschlossene
Probengefäß geöffnet und mittels Durchfluß-Zytometrie
gezählt. Ca. 10 ml Blut, die zuerst im Probengefäß enthalten
waren, sanken rasch bei dieser Verfahrensweise ab, und von
der Menge an CO&sub2; in den Erythrozyten wird angenommen, daß sie
ebenfalls rasch abgenommen hat. Wird das Blut, worin die CO&sub2;-
Menge in den Erythrozyten wie oben beschrieben abgesunken
ist, mit der oben genannten Auramin O-Färbungslösung gefärbt,
bewegt sich CO&sub2; aus der Färbungslösung in die Erythrozyten,
aber es bewegen sich keine Halogenionen der Färbungslösung in
die Erythrozyten.
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Andererseits war jedoch die Menge an CO&sub2; in den Erythrozyten,
die in dem ursprünglichen Blut vorhanden waren, das in das
Probengefäß gegeben wurde, viel größer als die Menge des CO&sub2;
in der Färbungslösung, und falls die Körperchen in diesem
Blut mit der Auramin O-Färbungslösung gefärbt wurden, würde
sich das CO&sub2; aus den Erythrozyten in die Färbungslösung
bewegen. Zu diesem Zeitpunkt würden sich die Halogenionen der
Färbungslösung im Austausch mit CO&sub2; in die Erythrozyten
bewegen. Die Auramin O-Färbungslösung enthält Cl&supmin;-Ionen, und
diese Cl&supmin;-Ionen bewegen sich in die Erythrozyten.
Insbesondere entspricht dieser Vorgang dem oben dargestellten
Fall (B-1).
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Wie oben beschrieben, werden bei reichlichem Vorhandensein
von C&supmin;-Ionen in Erythrozyten reife Erythrozyten gefärbt
(nicht-spezifische Färbung), und zwar zusätzlich zu den
Retikulozyten, die spezifisch gefärbt werden sollen. Daher
werden einige der reifen Erythrozyten irrtümlich als
Retikulozyten bei der Durchfluß-Zytometrie gezählt. Aus
diesem Grund sind die Retikulozyt-Zahlen in zeitigeren
Messungen anormal hoch in Fig. 1. In dem Maße, wie die
Messungen wiederholt werden, stabilisieren sich die
ermittelten Retikulozyt-Zahlen und erreichen Normalwerte.
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Wie aus Fig. 2(c) hervorgeht, bewegt sich auch im Fall, bei
dem Blut einer CO&sub2;-Atmosphäre ausgesetzt ist, eine große
Menge CO&sub2; in die Erythrozyten. Werden die Erythrozyten mit
der Färbungslösung gefärbt, bewegen sich eine große Menge CO&sub2;
aus den Erythrozyten in die Färbelösung und eine große Menge
C&supmin;-Ionen aus der Färbelösung in die Erythrozyten. Das
Fluorochrom bewegt sich zu den Erythrozyten in
Übereinstimmung mit der Bewegung von Cl&supmin;. Deshalb tritt eine
nicht-spezifische Färbung von Erythrozyten intensiv auf, und
die Zahl von Erythrozyten, die irrtümlich als Retikulozyten
gezählt werden, steigt anormal an. Ferner wird die vordere
Streulichtverteilung in Fig. 2(c) verändert, und zwar wegen
der Veränderung bei den Erythrozytformen.
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Die vorgenannte nicht-spezifische Färbung ergibt sich aus der
Änderung der Menge an Fluorochrom, das in reife Erythrozyten
aufgenommen oder dessen Menge an die Erythrozytmembran
gebunden werden.
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Das Ausmaß an nicht-spezifischer Färbung ändert sich von
Spezimen zu Spezimen. Dies deshalb, weil die Menge an CO&sub2; in
Erythrozyten sich von Person zu Person unterscheidet und von
der Beibehaltung des Blut-pH (normalerweise 7,4) abhängt.
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Das oben dargelegte Problem wird nicht nur bei Auramin O-
Färbelösungen, sondern auch bei allen Farbstoffen beobachtet,
die für diesen Typ von biologischen Färbeverfahren eingesetzt
werden.
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Deshalb wird durch die vorliegende Erfindung ein Reagens zur
Zählung von Retikulozyten mittels Durchfluß-Zytometrie
bereitgestellt, welches eine wäßrige Lösung eines Farbstoffs
und eines Puffers umfaßt und dadurch gekennzeichnet ist, daß
es ein Carbonat-Salz enthält.
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Das Carbonat-Salz ist eines, das HCO&sub3;&supmin;
in einem wäßrigen
Medium und vorzugsweise NaHCO&sub3; ergeben kann.
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Die Konzentration des Carbonat-Salzes im Reagens beträgt
vorzugsweise 1 bis 300 mM.
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Indem man den CO&sub2;-Gehalt in einer Färbelösung auf einen
größeren Wert als den in Erythrozyten vorliegenden einstellt,
bewegt sich CO&sub2; aus der Färbelösung hin zu den Erythrozyten,
wenn Körperchen im Blut mit der Färbelösung gefärbt werden.
In diesem Fall bewegen sich keine Halogenionen der
Färbelösung in die Erythrozyten. Da sich zudem die
ursprünglich in den Erythrozyten vorhandenen Halogenionen zur
Färbelösung bewegen, tritt eine nicht-spezifische Färbung
nicht ein, deren Ausmaß stark von der Umgebung abhängt, in
welcher die Erythrozyten vor der Messung verweilt haben.
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Die vorliegende Erfindung wird des weiteren durch die
folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
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Es wurde eine Zählung mit Reagentien der sieben
verschiedenen, in Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzungen
durchgeführt.
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Das mit (i) bezeichnete Reagens ist ein herkömmliches. Im
Reagens (ii) wurde der NaCl-Gehalt auf die Hälfte von dem
eines herkömmlichen abgesenkt, und es wurde NaHCO&sub3; zugefügt.
Im Reagens (iii) wurde NaCl aus dem herkömmlichen Reagens
vollständig beseitigt, und es wurde NaHCO&sub3; zugefügt. Im
Reagens (iv) wurden NaCl vollständig entfernt und der Gehalt
an HEPES-Pufferlösung erhöht. Im Reagens (v) wurden NaCl
vollständig entfernt und NaBr zugefügt. Im Reagens (vi)
wurden NaCl vollständig entfernt und Na&sub2;SO&sub4; zugefügt. Im
Reagens (vii) wurden NaCl vollständig entfernt und
Zitronensäure zugefügt. In all diesen Reagentien betrug der
Gehalt an Auramin O 400 ppm, und der pH war 8,0.
Tabelle 1
Reagens Nr. Komposition des Reagens HEPES NaCl NaHCO sonstige Ergebnisse an Luft an CO&sub1; NaBr Na&sub2;SO&sub4; Zitronensäure
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In jedem dieser Reagentien betrugen der Gehalt von Auramin O
400 ppm und der pH 8,0.
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Die Blut-Spezimen wurden aus einer gewöhnlichen Probe
hergestellt; eine wurde Luft und eine andere einer CO&sub2;-
Atmosphäre ausgesetzt. Die Ergebnisse sind auf der rechten
Seite von Tabelle 1 angegeben. Mit MRBC in der Tabelle sind
reife (mature) rote Blutzellen, mit MFI die Durchschnitts -
(Mean)-Fluoreszenz-(Relativ)Intensität und mit FSc der Wert
für das vordere Streulicht (relative Intensität) bezeichnet.
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Bei Verwendung des Reagens (i) mit der herkömmlichen
Zusammensetzung zeigen die Ergebnisse mit den einer CO&sub2;-
Atmosphäre ausgesetzten Spezimen abnorm hohe Werte sowohl für
MRBC-MFI als auch für RET-%, und zwar wegen nicht-spezifischer
Färbung von Erythrozyten, wie bereits oben erläutert.
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, als das Reagens (v)
eingesetzt wurde. Die Beobachtung bestätigt, daß
nichtspezifische Färbung von Erythrozyten auftritt, wenn die
Färbelösung kein CO&sub2;, jedoch Halogenionen enthält.
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Wurden die Reagentien (iv), (vi) und (vii) verwendet, war die
Färbung nicht erfolgreich, und die Retikulozyten konnten
nicht gezählt werden. In Fällen mit den Reagentien (ii) und
(iii), in denen Carbonat-Ionen zugefügt waren, trat eine
nicht-spezifische Färbung von Erythrozyten nicht auf, und es
wurden normale Retikulozyt-Zählungen erhalten, sogar mit dem
Spezimen, das CO&sub2; ausgesetzt worden ist.
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Fig. 3 zeigt die Ergebnisse, die unter Verwendung des Reagens
(ii) mit einem einzelnen Spezimen erhalten wurden, welche
kontinuierlich wie im Fall der in Fig. 1 gezeigten Messung
ermittelt wurden. Die Retikulozyten-Zählung (%) ergab fast
konstante Werte.
Beispiel 2
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Fig. 4 zeigt die Ergebnisse einer Zählung mit einem Blut-
Spezimen, das einer CO&sub2;-Atmosphäre ausgesetzt und mit einer
Färbelösung mit der folgenden Zusammensetzung gefärbt wurde:
Zusammensetzung der Färbelösung
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Auramin O 400 ug/ml
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Tris-Puffer-Lösung 20 mM
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NaHCO&sub3; 0 - 60 mM
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NaCl 60 - 120 mM
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Ethylenglycol 2%
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pH 8,5
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(Tricin wurde zur Einstellung des pH verwendet.)
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Auf der Abszisse von Fig. 4 sind die Menge an zugefügtem
NaHCO&sub3; und auf der Ordinate RBC-MFI aufgetragen, d. h. die
rote Blutzellen-Durchschnitts(mean)-Fluoreszenz-(Relativ)-
Intensität. Wenn die Menge an zugefügtem NaHCO&sub3; 0 bis 2 mM
beträgt, tritt nicht-spezifische Erythrozyt-Färbung auf, und
die RBC-MFI zeigt hohe Werte. Beträgt die entsprechende Menge
4 mM, sind die Werte immer noch ein bißchen hoch, und beträgt
sie 8 bis 60 mM, sind die Werte nahezu konstant. Aus den
Ergebnissen ergibt sich, daß bei einer NaHCO&sub3;-Menge von nicht
weniger als 5 mM die nicht-spezifische Färbung von
Erythrozyten verhindert werden kann.
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Allerdings wurden die Ergebnisse von Beispiel 2 unter äußerst
harten Bedingungen erhalten, wobei das Blut an einer CO&sub2;-
Atmosphäre stehengelassen wurde. Wird eine Blutprobe an
gewöhnlicher Luft stehengelassen, kann eine nicht-spezifische
Färbung von Erythrozyten durch die Zugabe von nicht weniger
als 1 mM NaHCO&sub3; verhindert werden.
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Die Maximalmenge an NaHCO&sub3;, die zugefügt werden kann, ist die
Menge, die den osmotischen Druck der Färbelösung auf nicht
mehr als ca. den 2fachen osmotischen Druck einer
isotonischen Lösung einstellt, d. h. nicht mehr als 300 mM.