JPH0752198B2 - 変色を示す組成物、アルブミンの存在及び／又は濃度の測定方法及び検出具 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規指示薬色素を利用することによってほぼ
中性〜アルカリ性のpHでアルブミンを分析する方法及び
組成物に関する。詳述すれば、本発明は、約６〜約８の
pH範囲でアルブミンと反応し、変色することができ、一
般式： 〔式中R₁及びR₂は芳香族基上に１個以上の電子吸引性官
能基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式
基であり、R₃は芳香族基上に１個以上の電子吸引性官能
基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基
であるか又はR₃は非芳香族電子吸引性基であり、R₄は準
芳香族キノン様環上に１個以上の電子吸引性官能基が存
在する置換準芳香族キノン様ヘテロ環式又は炭素同素環
式基であり、R₅は芳香族環上に、少なくとも１個のヒド
ロキシ基を含めて１個以上の電子吸引性官能基が存在す
る置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基である〕を
有する指示薬色素を、該pH範囲に緩衝剤された条件下で
尿又は血清中のアルブミンの存在を測定することに関す
る。

〔発明の背景及び従来技術〕

アルブミンは、一般に、哺乳動物の血漿中の総蛋白質の
半分を少し超える最も豊富な血漿蛋白質である。人体に
おいて、アルブミンは血液を組織との間の水分バランス
を調節し、種々の化合物、例えばビリルビン、脂肪酸、
ヒドロコルチゾン、チロキシン及びスルホンアミド類及
びバルビツレート類のように水に難溶性の薬剤の輸送分
子として作用する重要な役割を有する。個人におけるア
ルブミン欠乏症は、漿液の異常な蓄積又は浮腫によって
示され、アルブミン欠乏症は身体を通過する難溶性物質
の輸送を制限することがある。したがって、個人が血清
アルブミンの欠乏をきたしているか否かの測定は、臨床
的に重要である。

さらに、個人の尿中に比較的高濃度のアルブミンが存在
することは、病的状態を示す。例えば、尿中の蛋白質の
平均的正常濃度は、約2mg/dl〜約8mg/dlの範囲であり、
総尿蛋白質の約1/3が血清アルブミンである。しかしな
がら、大部分の病的状態では、尿蛋白質濃度はかなり増
加し、アルブミンは排泄された蛋白の約90％〜約90％を
占める。蛋白尿症として知られる、尿中に異常に増加し
た量の蛋白質が存在する状態は、腎臓病の最も顕著な指
標の一つであり、他の非腎臓性の各種疾患の指標でもあ
る。

したがって、個人がアルブミン欠乏症であるか否かを測
定するため及び／又は個人が過剰のアルブミンを排泄し
ているか否かを測定するため、及び治療の有効性の測定
のため医療の経過を監視するために、簡単で、正確で、
安価なアルブミン検出分析が開発された。さらに、尿及
び血清中のアルブミンの検出及び／又は測定のため開発
された数種の異なる分析方法のうち、色素結合技術に基
づく方法は、容易に自動化され、再現性ある正確な結果
を生じるので、特に有用であることが証明されている。

一般に、色素結合技術は、アルブミンのような蛋白質と
反応でき、pHを変えることなく蛋白質と反応したときに
色を変化しうるpH指示薬色素を利用する。pH指示薬色素
が、蛋白質と反応又は結合すると、指示薬色素の見掛け
のpka（酸解離定数）は変化し、いわゆる“蛋白誤差”
現象を生じて色素に変色が起こる。色素結合技術を利用
する方法では、適切な緩衝剤でpH指示薬色素を一定のpH
指示薬色素を一定のpHに維持してpHの実質的移動による
pH指示薬色素の変色を防止する。蛋白質と反応したとき
に、“蛋白誤差”現象により、pH指示薬色素がpHの変化
によって起こる変色と同一の変色を起こす。蛋白質と反
応又は結合し、“蛋白質誤差”の変色を示しうる蛋白質
の湿式化学分析に使用されるpH指示薬色素は、例えば、
メチルオレンジ、ブロモクレゾールパープル、ブロモフ
ェノールブルー及びブロモクレゾールグリーンである。
同様に、乾式化学試験ストリップは、pH指示薬色素とし
てテトラブロモフェノールブルー及びテトラクロロフェ
ノール−3,4,5,6−テトラブロモスルホンフタレインを
利用する。

pH指示薬色素は蛋白質分析に広く利用されてきたが、指
示薬色素を利用する蛋白質分析方法にはなお若干の問題
点及び欠点がある。例えば、pH指示薬色素は、狭いpH範
囲内でのみ有用である。色素の有用範囲外では、色素は
蛋白質と反応したときに変色しないか又は色素が早期に
変色してしまう。さらに重要で、克服しがたいことに、
pH指示薬色素を利用するアルブミン分析は、指示薬色素
とアルブミンとの反応を増加し、pKaの移動の結果とし
てプロモクレゾールグリーン及びブロモクレゾールパー
プルのような一層一般的に使用される色素に変色を起こ
させるために、一般に、比較的低いpH（例えば、約２〜
３のpHまで、通常約５以下のpH）で実施される。しかし
ながら、一層一般的に使用される色素の酸−塩基遷移、
したがって変色は酸性pH値値で起こるので、これらの色
素とアルブミン以外の蛋白質分子との非特異的反応が増
加する。この潜在的に不所望な副作用が起こるのは、酸
性pH値ではほとんどの蛋白質は陽イオン又は陽電荷を有
するためであるが、一般に使用される色素分子は負に帯
電した陰イオンとして存在する。したがって、正に帯電
した蛋白質陽イオンと負に帯電した陰イオン色素分子と
の間の反応が促進される。しかしながら、比較的高いpH
値では、ほとんどの蛋白質は中性又は負に帯電し、した
がって、指示薬色素との非特異的イオン反応は減少す
る。

尿中の総蛋白質含有量の測定には、若干の簡単な半定量
的試験及び若干の複合定量試験を利用しうる。これらの
分析方法の大部分は、簡単な比色試薬試験ストリップを
除いて、蛋白質を定量的に測定するために蛋白質を沈殿
させる必要がある。しかしながら、比色試薬試験ストリ
ップは、前記のように蛋白質が一定の酸−塩基指示薬と
反応し、pHを変えることなく指示薬を変色させる可能性
を利用する。例えば、指示薬であるテトラブロモフェノ
ールブルーを緩衝剤により約３の一定のpHに保持する
と、指示薬は蛋白質を含まない溶液を黄色に着色する。
しかし、蛋白質を含む溶液に対しては、緩衝化された色
素が蛋白質の存在により溶液中の蛋白質の濃度に応じて
溶液を緑色又は青色に着色する。

蛋白質分析に使用される若干の比色試験ストリップは、
テトラブロモフェノールブルーのような緩衝されたpH指
示薬色素で含浸した吸収性紙の小さい四角のパッドから
成る一つの試験領域を有する。他の比色試験ストリップ
は、前記のような蛋白質分析に関する一つの試験領域を
含み、さらに、同じストリップ上に数個の付加的試験領
域を含み、他の尿成分の同時分析を可能にする多測定因
子試薬ストリップである。両方の比色試験ストリップに
関して、尿中の蛋白質の分析は、良く混合した、遠心分
離してない尿試料中に比色試験ストリップを浸漬し、次
いで該試験ストリップの試験領域の生じた色を比色試験
ストリップボトルに与えられた標準カラーチャートと比
較することによって簡単に実施される。

指示薬色素として、pH3に緩衝されたテトラブロモフェ
ノールブルーを指示薬色素として利用する試験ストリッ
プについては、蛋白質の半分量分析を実施することがで
き、陰性、痕跡又は“十”から“＋＋＋＋”として報告
される。陰性又は黄色は、指示薬色素の変色の欠如によ
って示されるように、尿が蛋白質を含まないことを示
す。痕跡とは、尿中に約5mg/dl〜約20mg/dlの蛋白質を
検出したことを示す。緑色から徐々に暗色色相の青色に
なる変色によって示される。“＋”から“＋＋＋＋”
は、それぞれ30、100、300及び1000mg/dlの尿蛋白質濃
度にほぼ相当し、徐々に重症の信頼性ある指標として役
立つ。試験試料領域中の緩衝剤系が効力を失い、緩衝剤
のpHが実際に移動すると、高度に緩衝されたアルカリ尿
は、擬似陽性の結果を生じることがあることに注意すべ
きである。

蛋白質に結合する色素の技術に関する文献は、広範であ
り、蛋白質に鋭敏な色素が一般に酸性領域のかなり狭い
pH範囲で作用することを示している。したがって、サン
フォード（Sanford）の米国特許第4,568,647号明細書
は、アルカリ性pH領域で作用する蛋白質指示薬色素に関
する唯一の公知文献である。

サンフォードは、ビニル基又は炭素原子数７個以下の共
役ポリエン鎖をそれぞれ未端に有するヘテロ環又は炭素
同素環を有する色素を利用して、約５〜約11のpH範囲で
アルブミンに関して水性液体を分析する方法を開示して
いる。サンフォードによって開示された色素は、他の蛋
白質よりアルブミンに優先的に結合し、アルブミンに結
合すると、色素は分光吸収の検出可能な移動を示す。水
性試験試料中のアルブミンの量は、吸収最大での水性試
験試料のエネルギー吸収を測定し、吸収最大での既知ア
ルブミン濃度の溶液の吸収に相関させることによって定
量的に測定することができる。

従来技術及び現在入手しうる市販の試験ストリップとは
異なり、本発明の方法に有用な指示薬色素は、尿及び血
清の自然のpHに近いpH範囲でアルブミンと反応すること
ができ、その結果検出しうる変色を起こす。したがっ
て、本発明の重要な特徴によれば、酸性pHでの指示薬色
素の広範な緩衝は必要ではない。その結果、アルブミン
分析パッドの酸性成分による、マルチパッド試験ストリ
ップ上での他の分析パッド、例えば尿pH分析パッドの汚
染は低減又は排除され、これによりアルブミン分析が他
の尿成分の同時分析を妨害しないようにされる。

したがって、酸性pH領域に緩衝される分析と関係する潜
在的汚染及びこれにより生じる妨害因子を避けるため、
ほぼ中性〜アルカリ性pHで尿又は血清中のアルブミンを
分析する方法及び組成物を提供することは極めて有利で
ある。同様に、アルブミンの分析方法を尿又は血清中の
アルブミンの容易で、経済的な定性的及び／又は半定量
的測定のため、浸漬−読み取り方式でアルブミン分析方
法を利用できれば有利であろう。

さらに、尿又は血清中のアルブミンの分析方法は、アル
ブミン以外の蛋白質との優先的結合のような、競合する
化学的又は物理的反応の結果としてではなく、アルブミ
ンとの反応の結果として変色を起こす組成物を利用する
ことによって正確で信頼性及び再現性のある結果を生じ
るものでなければならない。さらに、アルブミンの分析
方法及び分析用組成物は、尿又は血清中のアルブミンの
迅速で、経済的で正確な測定のため湿式分析にも乾式試
験ストリップにも好適に使用できるものであるべきであ
る。また、アルブミンの分析に利用される方法及び組成
物は、マルチ試験パッドストリップに存在する他の試験
試料パッドに悪影響を与えたり、妨害したりしてはなら
ない。

本発明以前には、アルブミンについて尿又は血清を分析
する公知組成物又は方法は、ほぼ中性〜アルカリ性pHで
アルブミンと反応し、変色しうる３置換メタン及び／又
は置換フェノールフタレイン型化合物を指示薬色素とし
て含まなかった。本発明の方法及び組成物によれば、ほ
ぼ中性〜アルカリ性pHで緩衝された３置換メタン指示薬
色素及び／又は置換フェノールフタレイン型化合物指示
薬色素を利用することによってアルブミンに関する尿及
び血清の乾式試験ストリップ分析及び湿式分析で新規
で、予期できなかった結果が達成される。

〔発明の概要〕

要するに、本発明は、ほぼ中性〜アルカリ性pHでアルブ
ミンに関して尿又は血清を分析する組成物及び方法に関
する。約６〜約８のpH範囲で緩衝された３置換メタン指
示薬色素及び／又は置換フェノールフタレイン−型指示
薬色素が、アルブミンと反応し、変色してアルブミンの
存在を示すことができることが証明された。臨床的試験
方法に本発明の指示薬色素を利用することによって、尿
又は血清試料中のアルブミンの存在及び／又は半定量的
濃度を液体試験溶液又は乾式試験パッドの変色の強度に
よって測定することができる。

したがって、本発明の目的は、アルブミンに関して尿又
は血清を分析する簡単で、正確で信頼性及び再現性ある
方法を提供することである。

さらに、本発明は、ほぼ中性〜アルカリ性pHでアルブミ
ンに関して尿又は血清を分析する方法を提供することを
目的とする。

本発明の別の目的は、アルブミン以外の被分析物の同時
尿又は血清分析で妨害されないか又は間違った結果を生
じない、ほぼ中性〜アルカリ性pHで尿及び血清中のアル
ブミンを分析する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、約６〜約８のpH範囲に緩衝したと
きに、アルブミンと反応し、検出可能な変色を生じて尿
又は血清中のアルブミンの存在を示すことができる色素
組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、約６〜約８のpH範囲に緩衝したと
きに、アルブミンと反応し、肉眼で及び／又は機器で識
別しうる変色を生じて尿又は血清中のアルブミンの濃度
の半定量的測定を可能にする色素組成物を提供すること
である。

本発明の別の目的は、約６〜約８のpH範囲に緩衝したと
きに、アルブミンと反応し、変色することができる３置
換メタン色素化合物及び／又は置換フェノールフタレイ
ン型色素化合物を利用して尿又は血清中のアルブミンの
存在及び／又は半定量的濃度を分析する方法を提供する
ことである。

本発明の前記目的及び他の目的並びに利点は、本発明の
下記の詳細な説明から明らかになるであろう。

〔発明の詳細な説明〕

本発明の組成物及び方法によれば、３置換メタン指示薬
色素及び／又は置換フェノールフタレイン型指示薬色素
を利用することによって尿又は血清中のアルブミンの定
性及び／又は半定量的分析をほぼ中性〜アルカリ性pHで
実施することができる。本発明の指示薬色素は、約６〜
約８のpH範囲でアルブミンを反応し、検出可能な変色を
生じて尿又は血清中のアルブミンの存在及び／又は概略
の濃度を示すことができる。

本発明の下記の詳細な説明から、本発明の方法及び組成
物を、尿の分析とともに、血漿及び血清中のアルブミン
の存在及び半定量的濃度、及びさらに一般的には、他の
多くのアルブミン含有流体自体のアルブミン含有量の測
定にも使用しうることは明らかになるであろう。本発明
の別の重要な特徴によれば、この方法及び組成物を水性
液相分析にも、乾式試験パッド分析でも尿又は血清中の
アルブミンの存在及び／又は概略の濃度を測定するため
使用することができる。

意外にも、様々な３置換メタン及び置換フェノールフタ
レイン型化合物がほぼ中性〜アルカリ性pHでアルブミン
と反応し、検出可能な変色を生じて、尿又は血清試料中
のアルブミンの存在及び／又は概略の濃度を示しうるこ
とが証明された。アルブミンと反応し、変色する可能性
を示す３置換メタン及び置換フェノールフタレイン型化
合物は、それぞれ一般式（Ｉ）及び（II）： 〔式中R₁及びR₂は芳香族環上に１個以上の電子吸引性官
能基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式
基であり、R₃は芳香族基上に１個以上の電子吸引性官能
基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基
であるか又はR₃は非芳香族電子吸引性基であり、R₄は準
芳香族キノン様環上に１個以上の電子吸引性官能基が存
在する置換準芳香族キノン様ヘテロ環式又は炭素同素環
式基であり、R₅は芳香族環上に、少なくとも１個のヒド
ロキシ基を含めて１個以上の電子吸引性官能基が存在す
る置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基である〕を
有する。

本発明の方法に有用な一般式（Ｉ）の３置換メタン類
は、メタンの炭素原子に共有結合した少なくとも２個の
芳香族基を有し、各芳香族基はその芳香環上に少なくと
も１個の電子吸引性官能基を有するものであることが判
った。３置換メタンの第三の基は、その芳香環上に電子
吸引性官能基を有する芳香族基であるか又は第三の基は
非芳香族電子吸引性基であってよい。しかし、第三の基
の芳香族性にかかわらず、３置換メタンの第三の基は電
子吸引性でなければならない。

本発明の方法に有用な一般式（II）の置換フェノールフ
タレイン型化合物は、中心の炭素原子に共有結合した２
個の芳香族基を有し、各芳香族基にはその芳香環上に少
なくとも１個の電子吸引性官能基が存在するものである
ことも判った。さらに、中心炭素原子に結合した２個の
芳香族基の一方は、少なくとも１個の電子吸引性ヒドロ
キシ官能基を含んでいなければならない。一般式（II）
の置換フェノールフタレイン型化合物の第三の基は、そ
のキノン様環上に少なくとも電子吸引性官能基を有する
準芳香族キノン様基である。

以下にさらに詳述するとおり、一般式（Ｉ）の３置換メ
タン類の芳香環、該芳香環上に存在する電子吸引性官能
基及び、存在する場合、非芳香族電子吸引性基は、３置
換メタンの残りの水素原子がほぼ中性〜アルカリ性pHで
容易に除去されて３置換メタンを３置換メタンの陰イオ
ン性共役塩基に変えるのに充分に３置換メタンの酸性を
増加する。一般式（Ｉ）の３置換メタンの酸性を増加す
る誘導的電子吸引作用の他に、芳香環上の電子吸引性官
能基及び、もし存在する場合、いかなる非芳香族電子吸
引性官能基も、メタンの炭素原子上の負電荷の量を低減
することによって３置換メタンの陰イオン性共役塩基の
安定化を補助する。同様に、一般式（II）の置換フェノ
ールフタレイン型化合物の芳香環及び準芳香環上の電子
吸引性官能基は、R₅基のヒドロキシ官能基の酸素原子上
の負電荷の量を低減することによって化合物の酸性を増
加し、フェノールフタレイン型化合物の陰イオン性共役
塩基の安定化を補助する作用をする。

一般式（Ｉ）の３置換メタン及び一般式（II）の置換フ
ェノールフタレイン型化合物に少なくとも２個の芳香族
基が存在することは、陰イオン性共役塩基の負電荷を３
置換メタン色素又は置換フェノールフタレイン型色素分
子全体に分布させうる共鳴構造を生じることによって負
電荷の安定化を促進する。このような共鳴構造は、本発
明の好ましい実施態様の詳細な説明の項にさらに詳細に
述べる。

一般式（Ｉ）及び（II）を有する化合物の中心の炭素原
子に結合した置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基
及び（II）を有する化合物の中心の炭素原子に結合した
置換芳香族キノン様基は、その基が芳香族基又は準芳香
族基全体に陰イオン性共役塩基の負電荷を分布させる共
鳴構造を生じるのに充分な芳香族特性を有する限り、特
定の構造のものに限定されない。本発明の組成物及び方
法によれば、芳香族基は、炭素同素環式芳香族環系、例
えばベンゼン、及び炭素同素環式芳香族縮合環系、例え
ばナフタリンを包含する。さらに、芳香環系のヘテロ原
子が１個以上の窒素、酸素若しくは硫黄原子又はこれら
の混合物を包含する、縮合環系を含めてヘテロ環式芳香
族環系を本発明の方法及び組成物に利用することができ
る。同様に、炭素同素環式及びヘテロ環式芳香族環を含
む縮合芳香族環系を本発明により使用することができ
る。

本発明の利点を充分に達成するには、ベンゼン環を芳香
族基として利用する。ベンゼン環又はフェニル環は、そ
の豊富さ、価格及び特にフェニル環上に様々な電子吸引
性官能基を誘導する容易さ故に好ましい。本発明に使用
しうる好ましい炭素同素環式及びヘテロ環式芳香族基
は、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、ピリジ
ン、ピラジン、インドール、キノリン、カルバゾール及
びプリン又はこれらの組み合わせを包含する。同様に、
一般式（II）中に存在する準芳香族キノン様基R₄として
は、一般式（III）で表わされるキノン様基が好まし
い。

前記の芳香族及び準芳香族炭素同素環式及び芳香族ヘテ
ロ環式基は、単に、本発明の方法及び組成物により使用
しうる芳香族基及び準芳香族基の例として挙げたもので
あり、これらの例は、本発明の方法に使用しうる芳香族
基の範囲を制限するものではない。芳香族環又は準芳香
族環上に電子吸引性置換基が存在でき、芳香族基又は準
芳香族基全体に陰イオン性共役塩基の負電荷を分布させ
るのに充分な芳香族性を有する任意の芳香族基又は準芳
香族基を本発明により使用することができる。

本発明の別の重要な特徴によれば、芳香族基又は準芳香
族基はそれぞれ、芳香環に結合した電子吸引性官能基を
少なくとも１個含まなければならない。電子吸引性官能
基は、さらに一般式（Ｉ）の化合物のメタンの残りの水
素原子の酸性及び一般式（II）の化合物のヒドロキシ水
素原子の酸性を増加し、芳香族基又は準芳香族基全体に
陰イオン性共役塩基の負電荷を分布させる補助をする作
用をする。電子吸引性官能基は、一般式（Ｉ）及び（I
I）の化合物の酸性を増加し、陰イオン性共役塩基の安
定性を増加するのに充分な誘導性電子吸引効果を与える
限り、電子吸引性官能基が全く同一であることは特に重
要ではない。しかしながら、一般式（II）の化合物に関
しては、２個の置換芳香族基のうち少なくとも１個は、
芳香族基上に存在するヒドロキシ官能基を少なくとも１
個有しなければならない。

ヘテロ環式又は炭素同素環式芳香族又は準芳香族基に結
合しうる電子吸引性官能基は、アンモニウム（−N
H₃ ⁺）、アルキル及び／又はアリール置換アンモニウム
（−NH₂R⁺、−NHR₂ ⁺、−NR₃ ⁺）、ニトロ基（−NO₂）、
シアノ基（−CN）、ハロゲン（−Cl、−Br、−Ｆ、−
Ｉ）、ハロゲン置換メチル基（−CH₂X⁺、−CHX₂ ⁺、−CX
₃ ⁺、ここでＸは塩素、臭素、フッ素若しくは沃素又はこ
れらの混合物である）、ヒドロキシ基（−OH）、アルコ
キシ基又はアリールオキシ基（−OR）、ホルミル基（−
CHO）、カルボキシル基（−COOH）、アルコキシカルボ
ニル基又はアリールオキシカルボニル基（−COOR）、カ
ルバモイル基（−CONH₂）、アルキル及び／又はアリー
ル置換カルバモイル基（−CONHR、−CONR₂）、アリール
又はアルキルカルボニル基（−COR）、２−ニトロビニ
ル基（−CH＝CHNO₂）、アルキル又はアリールスルホニ
ル基（−SO₂R）、スルホ基（−SO₃H）、ホスホニウム
（−PH₃ ⁺）、アルキル及び／又はアリール置換ホスホニ
ウム基（−PH₂R⁺、−PHR₂ ⁺、−PR₃ ⁺）、スルホニウム基
（−SH₂ ⁺）又はアルキル及び／又はアリール置換スルホ
ニウム基（−SHR⁺、−SR₂ ⁺）、又はこれらの組み合わせ
である。前記の電子吸引性官能基のそれぞれに関して、
アルキル基は１〜約20個の炭素原子、好ましくは１〜約
10個の炭素原子を含んでいてもよい。アリール基は、任
意の置換又は非置換のヘテロ環式又は炭素同素環式芳香
族基であってもよい。

尿又は血清中のアルブミンの検出用指示薬として作用す
る一般式（Ｉ）の３置換メタンは、２個の置換ヘテロ環
式又は炭素同素環式芳香族基の他に第三の電子吸引性基
を有する。第三の電子吸引性基は、前記の芳香族基と同
一の芳香環上に１個以上の電子吸引性官能基が存在する
置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基であってよ
い。３置換メタンが３個の置換芳香族基を含む場合、３
個の芳香族基は芳香環上に存在する電子吸引性官能基の
種類及び／又は数に関して同一である必要はない。換言
すれば、３個の置換芳香族基は同一であってもよく、ま
た、２個は同一構造を有し、第三の基が独立の構造であ
るか又は３個の芳香族基がすべて独立の構造を有してい
てもよい。同様に、本発明方法により使用でき、置換芳
香族基を２個しか有しない一般式（Ｉ）の３置換メタン
及び一般式（II）のフェノールフタレイン様化合物は、
同一又は構造的に独立の芳香族基を有することができ
る。しかしながら、３置換メタン色素又はフェノールフ
タレイン様色素の合成の容易さを考慮すれば、一般式
（Ｉ）及び（II）の化合物が同一の置換芳香族基を有す
るのがしばしば望ましいことが判った。

本発明の別の特徴によれば、一般式（Ｉ）の３置換メタ
ンの第三の電子吸引性基は、非芳香族電子吸引性基であ
ってよい。２個の置換芳香族基は陰イオン性共役塩基の
負電荷を充分に非局在化し、分布させて共役塩基の陰イ
オンを充分に安定化することが判明した。したがって、
３置換メタンの第三の電子吸引性基は、一般式（Ｉ）の
３置換メタンの酸性を増加して３置換メタンのメタンの
残りの水素を約６〜約８のpH範囲で除去しうる電子吸引
性誘導効果を生じさえすればよい。

本発明の重要な特徴によれば、アルキルの水素のその酸
性を増加するいかなる電子吸引性基をも一般式（Ｉ）の
３置換メタンの第三の電子吸引性基として利用すること
ができる。しかし、特定の３置換メタンについて選択さ
れた特定の非芳香族基は、３置換メタンの２個の芳香族
基の同一性に少なくとも部分的に依存することを理解す
べきである。例えば、３置換メタンの特定の第三の非芳
香族基の選択は、合成の容易さ、非芳香族基と芳香族基
及び／又は芳香族基上に存在する電子吸引性官能基との
化学的適合性、色素の安定性、ほぼ中性〜アルカリ性pH
で酸−塩素反応をする能力、及び検出可能の変色を起こ
し、所望のpHで充分な時間の間その変色を保持する能力
を考慮して行う。

したがって、メタンの水素に酸性を増加する誘導作用を
及ぼし、場合により共鳴構造を生じて、３置換メタンの
共役塩基を生じる陰イオンの安定化を補助する非芳香族
電子吸引性基は、ニトロ基（−ON₂）、シアノ基（−C
O）、アルコキシ基（−OR（式中Ｒは１個〜約10個の炭
素原子を含むアルキル基である）〕、アリールオキシ基
〔−OR′（式中Ｒ′は置換又は非置換の炭素同素環式又
はヘテロ環式芳香環系である）〕、カルボニル基〔−CO
−Ｙ（式中Ｙは水素、１個〜約10個の炭素原子を含むア
ルキル基、アリール基、アルカリール基、１個〜約10個
の炭素原子を含むアルコキシ基、アリールオキシ基、ア
ルカリールオキシ基、アミノ基又はアルキル、アリール
及び／又はアルカリール置換アミノ基｛これらの基中の
アルキル基は１個〜約10個の炭素原子を含む｝であ
る）〕、ハロゲン（−Cl、−Br、−Ｉ、−Ｆ）又はハロ
ゲン置換メチル基〔−CH₂X、−CHX₂、−CX₃（式中、Ｘ
は塩素、臭素、沃素又かフッ素である）〕又はこれらの
組み合わせを包含する。本発明の利点を完全に達成する
には、アルブミンの検出に使用する一般式（Ｉ）の３置
換メタン色素に最も望ましい性質を与える非芳香族電子
吸引性基がニトロ基、シアノ基及びアルコキシ基である
ことが判明した。

本発明の方法により尿又は血清中のアルブミンの存在を
検出するための指示薬色素として一般式（Ｉ）の３置換
メタンを利用しうることを示すため、一般式（IV） で示される色素、シアノジ（ｐ−ニトロフェニル）メタ
ンを製造した。

以下にさらに詳細に説明するとおり、一般式（IV）の３
置換メタン色素は、約7.5〜約8.0の一定のpHで緩衝する
と、アルブミンと反応し、無色から青色に変色すること
が証明された。一般式（IV）の３置換メタンの３個の電
子吸引性基は、メタンの残りの水素の酸性を増加し、３
置換メタンの共役塩基の生じる陰イオンを述分に安定化
して３置換メタンが7.5〜8.0の範囲のpKaを有するよう
にする。したがって、一般式（IV）の３置換メタン色素
は、約7.5〜8.0の一定のpHで緩衝すると、アルブミンと
反応したときに、蛋白誤差現象により変色する。一般式
（Ｖ）の共役塩基の陰イオンの安定化は、下記の可能な
共鳴構造（VI〜VIII）によって表わされる。同様に、一
般式（VI）〜（VIII）と同時に他の数種の、共鳴混成体
を形成する構造体が存在し、一般式（Ｖ）の共役塩基を
安定化する作用をする。

及び他の若干の、共鳴混成体を形成する構造体。

同様に、一般式（IX）で示される置換フェノールフタレ
イン型色素、テトラブロモフェノールフタレインのデシ
ルエステル（TBDE）を、尿又は血清中のアルブミンを検
出するため本発明の方法に使用することができる。一般
式（IX）の置換フェノールフタレイン型色素は、２個の
置換芳香族基及び１個の置換準芳香族キノン様基を含
み、したがって、２個の置換芳香族基及び１個の非芳香
族基を含む一般式（III）の３置換メタン色素とは構造
上わずかに異なる。しかしながら、一般式（IV）の３置
換メタン色素と同様に、一般式（IX）の置換フェノール
フタレイン型色素（TBDE）は、約6.0〜7.0の一定のpHで
緩衝すると、アルブミンと反応し、黄色から青色へ変色
する。一般式（IX）のTBDEの共役塩基の陰イオン安定化
は、下記の一般式（Ｘ）〜（XII）の可能な共鳴構造の
例によって示される。

メタンの酸性水素原子を失そう一般式（IV）の３置換メ
タン色素とは異なり、一般式（II）及び（IX）の置換フ
ェノールフタレイン型色素は、“蛋白誤差”現象により
ヒドロキシの酸性水素原子を失って変色を生じることに
注目すべきである。したがって、一般式（II）の置換フ
ェノールフタレイン型色素は、その芳香環上に少なくと
も１個のヒドロキシ官能基が存在する組成物を含まなけ
ればならない。

一般式（IV）の３置換メタン色素及び一般式（IX）の置
換フェノールフタレイン型色素は、当業者に周知の合成
方法であるが、特別の合成順序によって製造された。さ
らに、本発明の方法に有用な他の３置換メタン色素及び
置換フェノールフタレイン型色素は、同様の合成方法及
び順序で製造できるか又は市場で入手しうる。

前記の３置換メタン色素及び置換フェノールフタレイン
型色素は、ほぼ中性〜アルカリ性pHで尿又は血清中のア
ルブミンの存在及び／又は半定量的濃度を測定する方法
に指示薬色素として使用される。本発明の３置換メタン
色素及び置換フェノールフタレイン型色素は、約６〜約
８の範囲の一定のpHに緩衝すると、アルブミンと反応
し、“蛋白誤差”現象により肉眼及び／又は機器で検出
可能な変色を生じうることが証明された。３置換メタン
色素及び／又は置換フェノールフタレイン型色素を充分
量の適切な緩衝剤と混合することによって色素はpH移動
により変色できなくなるが、生じる色素−緩衝剤組成物
はアルブミンと接触・反応すると、変色して溶液中のア
ルブミンの存在及び／又は半定量的濃度を正確に示すこ
とが判った。

さらに、本発明の組成物に任意の種々の公知緩衝剤を使
用できることが証明された。緩衝剤の機能は、アルブミ
ンの存在により３置換メタン色素及び／又は置換フェノ
ールフタレイン型色素に所望の変色を生じさせるため実
質的に一定のpHに組成物を保持し、アルブミン含有試験
試料のpHの変動による変色を本質的に排除することであ
る。そのため、使用する緩衝剤の量は、試験溶液の性質
に左右される。緩衝剤の量は、通常、約200ミリモル〜5
00ミリモルであるが、特定の場合にはこの範囲以上でも
以下でもよい。使用する緩衝剤の性質は、使用する３置
換メタン色素及び／又は置換フェノールフタレイン型色
素に依存し、それとともに変動する。しかしながら、一
般に、最適の結果を得るには、色素緩衝剤組成物のpHを
３置換メタン色素及び／又は置換フェノールフタレイン
型色素が変色するpH範囲よりほんの僅か低い値に保持す
べきであることが判明した。組成物中に使用される特定
の色素及び特定の緩衝剤に対して適切なpHの決定方法
は、ケストン（Keston）の米国特許第3,485,587号明細
書に見られる。

本発明の組成物には緩衝剤を使用するのが好ましいが、
これはすべての場合に必須とうわけではない。例えば、
特殊な場合には、試験試料が３置換メタン色素及び／又
は置換フェノールフタレイン型色素と接触する前に尿又
は血清試験試料に緩衝剤を添加することが望ましい。ま
た、試験試料がその系を一定のpHに保持するため適切な
緩衝剤を適切な量で既に含んでいてもよく、あるいは３
置換メタン色素及び／又は置換フェノールフタレイン型
色素がpHの変化に対して感受性を有しなくてもよい。こ
のような場合には、３置換メタン指示薬色素及び／又は
置換フェノールフタレイン型色素は、組成物中の唯一の
活性成分であってもよい。

３置換メタン色素及び／又は置換フェノールフタレイン
型色素の変色は、尿又は血清試料中のアルブミンの存在
を証明する。さらに、変色の強度及び深さを使用して、
試験試料によって生じる色を溶液中のアルブミンの既知
濃度によって生じる色と比較することによって尿又は血
清試験試料中のアルブミンの半定量的濃度を測定するこ
とができる。若干の３置換メタン色素及び／又は置換フ
ェノールフタレイン型色素に関しては、分光光度計及び
比色計のような色測定装置を使用することなく変色を容
易に検出しうることが証明された。しかしながら、この
ような装置は、試験試料と既知アルブミン濃度の溶液と
の色強度の差を判別するのに有用である。

本発明の重要な特徴によれば、アルブミン分析は約pH6
〜約pH8のほぼ中性〜アルカリ性pHで実施される。アル
ブミン分析を約pH6〜約pH8のほぼ中性〜アルカリ性pHで
実施しうることから、色素の変色を観察するのに２〜約
５の酸性pH領域での緩衝を必要とする従来のアルブミン
分析に比べて若干の利点が得られる。例えば、尿及び血
清の自然のpHに近いpHで分析することによって、一定の
pHを維持するための広範な緩衝を必要とせず、したがっ
て、尿分析試験パッド又は他の被分析物用の類似試験パ
ッドに対する緩衝剤の作用は極めて少ないか又は全く存
在しない。

同様に、臨床的精度の観点から言えば、６以上のpHレベ
ルで実施されるアルブミン分析は、アルブミン以外の蛋
白質と３置換メタン色素及び／又は置換フェノールフタ
レイン型色素分子との非特異的反応を減少させる。本発
明の方法に利用される比較的高いpHでは、競合蛋白質は
中性又は負に帯電した分子として存在し、低いpH値で存
在するような正に帯電した分子として存在するのではな
い。したがって、蛋白質と一般式（IV）のような中性３
置換メタン色素若しくは一般式（Ｖ）の負に帯電したそ
の共役塩基、又は一般式（IX）のような中性の置換フェ
ノールフタレイン型色素若しくは一般式（Ｘ）の負に帯
電したその共役塩基との非特異的反応の可能性を低減す
る。その結果、色素とアルブミンとの一層特異的反応
が、問題外の蛋白質によって生じる妨害を低減させ、尿
又は血清アルブミン分析の正確さ及び信頼性を増大す
る。

ほぼ中性〜アルカリ性pHで尿又は血清中のアルブミン分
析を実施することにより、アルブミン分析が尿又は血清
中の他の被分析物の同時分析を妨害する可能性が排除又
は低減される点で他の臨床的利点を得られる。アルブミ
ン分析と他の同時被分析物分析との間の妨害は、マルチ
パッド試験スティックで最もしばしば観察される。一つ
のスティック上に数個の試薬含有試験パッドが接近して
置かれているマルチパッド試験スティックを使用する場
合、一つのパッドに存在する試薬が隣接及び／又は他の
近くの試験パッドへはみだし、これを汚染し、隣接及び
／又は他の近くの試験パッドの被分析物分析を妨害し、
したがって間違った及び／又は信頼できない結果を生じ
ることがある。

例えば、現在市販されている尿用のマルチパッド試験ス
ティックは、pH分析及びアルブミン分析と、さらに若干
の他の被分析物分析、例えばグルコース、ケトン類、血
液、比重、亜硝酸塩、ビリルビン、白血球エステラーゼ
及びウロビリノーゲンの分析を含む。したがって、アル
ブミン分析が２〜３の酸性pH範囲で緩衝されたpH指示薬
色素を含む試験パッドである場合、アルブミン分析パッ
ドからpH分析パッへ試薬のはみだしが、尿に関して間違
って低い見掛けのpH値、例えば４〜５を生じるであろ
う。このような誤差は、通常の食事を摂取している患者
が新しく排泄した正常な尿は、約６のpHを有するので、
臨床的には重要である。一般に、尿のpHは約4.6〜約8.0
の範囲で変動し、したがって、尿のpHの正確で信頼性あ
る分析は、正確な臨床測定及びそれから得られる診断に
必要なことである。

したがって、ほぼ中性〜アルカリ性のpH、したがって尿
の自然のpHに近いpHで緩衝された指示薬色素を利用する
アルブミン分析は、マルチパッド試験スティックでの近
くのpH分析パッドをほとんど汚染せず、不正確なpH分析
の結果を生じない。全体として、マルチパッド試験ステ
ィックの種々の分析の精度は改善され、分析の信頼性及
び分析における医師の信頼も改善される。さらに、熟練
した医師又は研究室の技術者とは異なり、未熟な患者が
家庭で多数のアルブミン分析を実施するので、尿中のア
ルブミンの正確で、妨害のない分析方法を得ることが肝
要である。

本発明の方法に３置換メタン色素を利用することによっ
て新規で予期できない結果が得られることを証明するた
め、シアノジ（ｐ−ニトロフェニル）メタン（IV）をア
ルブミンの水性液相分析及びアルブミン乾式試験パッド
分析に使用した。水性液相分析では、アルブミンの存在
は、尿の１滴（約50μ）を約１×10^-M（モル）３置換
メタン色素（IV）を含み、１×10^-1Mピペラジン−N,N′
−ビス（２−ヒドロキシプロパン）スルホン酸（POPS
O）で約7.5のpHに緩衝した水溶液液2mlに加えることに
よって証明された。水溶液の色は無色から極めて薄い青
色〜青色に変色し、したがって、試料中にアルブミンが
存在することを示した。

一般に、アルブミンの水性液相分析では、３置換メタン
色素及び／又は置換フェノールフタレイン型色素は、変
色を肉眼及び／又は機器で検出できるように充分な量で
存在させる。３置換メタン指示薬色素及び／又は置換フ
ェノールフタレイン型色素の濃度、指示薬色素／緩衝剤
溶液の量及び尿の量は、著しく変動しうるものと理解す
べきである。上記の例は、濃度及び量の一般に使用され
る範囲を示すのである。しかし、アルブミン以外の蛋白
質との非特異性反応が本質的に排除されるように、大過
順剰の３置換メタン色素及び／又は置換フェノールフタ
レイン型色素は回避すべきである。通常、肉眼及び／又
は機器で検出可能な変色を生じ、非特性蛋白質結合よる
分析妨害を最少にするには、約５×10^-3M〜約５×10^-2M
の範囲の３置換メタン色素及び／又は置換フェノールフ
タレイン型色素の濃度で充分である。本発明の利点を充
分に達成するには、約８×10^-3M〜約1.2×10^-2Mの範囲
の３置換メタン色素及び／又は置換フェノールフタレイ
ン型色素が使用されることが判明した。本発明の方法に
よれば、前記の例に使用したPOPSO緩衝剤の他に、任意
の適当な緩衝剤、例えばＮ−２−ヒドロキシエチル−ピ
ペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（HEPES）、３
−Ｎ−（トリス−ヒドロキシメチル）メチルフミノ−２
−ヒドロキシプロパンスルホン酸（TAPSO）、２−
（〔トリス−（ヒドロキシメチル）メチル〕アミノ）−
エタンスルホン酸（TES）、リン酸塩、硼酸塩又はこの
分野で使用されている他の周知緩衝剤を使用することに
よって所望のpHをほぼ一定のレベルに保持しうることも
判った。

さらに、本発明の別の重要な特徴により、水性溶剤、３
置換メタン色素及び／又は置換フェノールフタレイン型
色素、緩衝剤及び尿試料の相対的量を変動して、既知ア
ルブミン濃度の溶液から得た色標準との対比ができるよ
うに肉眼及び／又は機器で検出可能で、判別可能な変色
を生じることによって尿又は血清中のアルブミンの半定
量的分析系を設計することは、当業者には容易である。

３置換メタン色素及び／又は置換フェノールフタレイン
型色素を利用するアルブミンの乾式試験パッド分析は、
従来周知の方法により実施される。一般に、アルブミン
分析は、３置換メタン色素及び／又は置換フェノールフ
タレイン型色素を含む被分析物検出具を尿又は血清試料
と接触させることによって実施される。被分析物検出具
を尿又は血清試料中に浸漬するか、又は尿又は血清試料
を被分析物検出具に滴下することができる。被分析物検
出具の変色は、アルブミンの存在及び、そのように構成
すれば、変色の強度及び深さをカラーチャートと比較し
て、尿又は血清試料中のアルブミンの濃度を半定量的に
測定することができる。

被分析物検出具は、単一パッド試験ストリップ（１種の
被分析物だけを分析する）又はマルチパッド試験ストリ
ップ（尿又は血清の数種の被分析物を同時に分析する）
として構成された試薬含浸試験ストリップであるのが典
型的である。いずれの型の試薬含浸試験ストリップにつ
いても、試験ストリップは、支持体ストリップ又は通常
疎水性プラスチックから作製された把持部及び吸水性マ
トリックス、例えば紙，スポンジ材料、親水性無機粉
末、ポリマーフィルム又はセルロースを含む、問題の分
析を行うのに必要な化学試薬で含浸した試薬試験パッド
を含む。把持部は、通常、酢酸セルロース、ポリエチレ
ンテレフタレート、ポリカーボネート又はポリスチレン
のような材料から形成され、吸収性マトリックスは、
紙又はポリマーフィルムから構成するのが最も有利であ
る。

本発明の方法により、アルブミンの乾式試験スティック
分析を実施するには、まず、２×10^-2Mのシアノジ（ｐ
−ニトロフェニル）メタン色素（IV）を含むジメチルホ
ルムアミド又はエタノール溶液を調製する。次に、紙
片を色素を含むジメチルホルムアミド又はエタノール溶
液で飽和する。約50℃で約15分〜約30分間オープン乾燥
よってジメチルホルムアミド又はエタノール溶剤を除去
した後、紙をpH7.5の250nM POPSO緩衝液で飽和する。
約50℃で約30分オーブン乾燥後、試薬を含浸した紙片
を適切な大きさ、例えば約0.25cm×0.5cm〜約0.5cm×約
1.0cmの寸法を有するパッドに切断する。試薬を含浸し
た紙パッドを次に両面接着材でプラスチック製把持部
に固定する。次に、試験スティックを新鮮な未遠心分離
尿試料中に、試験パッドを試料で飽和するのに充分な時
間浸漬した。尿試料による緩衝剤の抽出を回避するた
め、試験スティックを約３〜５秒より長く尿試料中に浸
漬すべきでない。尿試料から試験スティックを除去し、
所定時間、例えば15〜60秒待った後、試験ストリップの
応答を調べる。試験パッドがほぼ無色から青色へ変色す
ると、試料中のアルブミンの存在が証明される。

前記のようなアルブミンの水性液相分析と同様に、本発
明の方法及び組成物を利用するアルブミンの半定量分析
を計画するために試薬パッドの寸法、試薬含浸溶液の強
度、試験試料の量と試験スティックに試験試料を導入す
る方法、例えば浸漬よりむしろピペットによる導入方法
との適切なバランスを決定することは、試験具の製造分
野の熟練者には実験技術の範囲内で容易である。

多くの場合、試験ストリップの簡単な肉眼観察で、所望
の情報が得られる。さらに正確な情報を必要とする場合
には、種々の既知アルブミン濃度に対応するカラースポ
ットを有するカラーチャートを、試験ストリップに使用
した特定の３置換メタン指示薬色素及び／又は置換フェ
ノールフタレイン色素について製造することができる。
次に、試験ストリップの色をチャート上のカラースポッ
トと比較して試験試料のアルブミン濃度を測定すること
ができる。

さらに正確な測定を必要とするか、又は３置換メタンが
僅かしか変色しないような性質のものである場合は、分
光光度計又は比色計を使用して変色を測定することがで
きる。さらに、水性液相分析及び乾式試薬ストリップ分
析は、色形成の程度をより高い信頼性及び精度をもって
測定し、したがって、試験試料中のアルブミンの濃度を
さらに正確に測定するために、肉眼法ではなく、分光光
度法又は比色法を使用することによって半定量的とする
ことができる。

本発明の重要な特徴によれば、アルブミンの正確かつ信
頼性ある分析を、３置換メタン色素及び／又は置換フェ
ノールフタレイン型色素を使用することによって尿及び
血清試料についてほぼ中性〜アルカリ性pHで実施するこ
とができる。尿及び血清のほぼ自然のpHでアルブミン分
析を実施することによって、アルブミン分析の試薬によ
る他の被分析物の同時分析の汚染が低減又は排除され、
したがって、一層正確で信頼性ある被分析物分析が得ら
れる。

前記のような本発明は、その精神及び範囲を逸脱するこ
となく多数の変性及び変形をすることができ、したがっ
て、特許請求の範囲に示した発明によって制限されるだ
けであることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−95461（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−25490（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−78866（ＪＰ，Ａ) 特公 昭35−17197（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭42−1638（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭39−19858（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭45−1873（ＪＰ，Ｂ１) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，Ｖｏｌ．102 Ｎｏ．１（1985）Ｐ. 491 Ｎｏ．534ＯＶ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】６〜８のpH範囲でアルブミン含有液体試験
   試料と接触させたときに、試験試料中のアルブミンの存
   在及び／又は濃度を示すのに充分な変色を示すことがで
   き、式： 〔式中R₁及びR₂は芳香族基上に１個以上の電子吸引性官
   能基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式
   基であり、R₃は芳香族基上に１個以上の電子吸引性官能
   基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基
   であるか又はR₃は非芳香族電子吸引性基であり、R₄は準
   芳香族環上に１個以上の電子吸引性官能基が存在する置
   換準芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基であり、R₅は
   芳香族環上に、少なくとも１個のヒドロキシ基を含めて
   １個以上の電子吸引性官能基が存在する置換芳香族ヘテ
   ロ環式又は炭素同素環式基である〕を有する色素及び接
   触後、該試験試料を該pH範囲に保持する緩衝剤を含む組
   成物。
2. 【請求項２】（ａ）６〜８のpH範囲でアルブミン含有液
   体試験試料と接触させたときに、試験試料中のアルブミ
   ンの存在及び／又は濃度を示すのに充分な変色を示すこ
   とができ、式： 〔式中、R₁及びR₂は芳香族基上に１個以上の電子吸引性
   官能基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環
   式基であり、R₃は芳香族基上に１個以上の電子吸引性官
   能基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式
   基であるか又はR₃は非芳香族電子吸引性基であり、R₄は
   準芳香族環上に１個以上の電子吸引性官能基が存在する
   置換準芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基であり、R₅
   は芳香族環上に、少なくとも１個のヒドロキシ基を含め
   て１個以上の電子吸引性官能基が存在する置換芳香族ヘ
   テロ環式又は炭素同素環式基である〕を有する色素と試
   験試料を、該pH範囲に緩衝された条件下で接触させ、 （ｂ）色素の変色の強度及び／又は程度から該試験試料
   中のアルブミンの存在及び／又は濃度を測定する ことを特徴とする試験試料中のアルブミンの存在及び／
   又は濃度の測定方法。
3. 【請求項３】（ａ）６〜８のpH範囲でアルブミン含有液
   体試料と接触させたときに、試験試料中のアルブミンの
   存在及び／又は濃度を示すのに充分な変色を示すことが
   でき、式： 〔式中R₁及びR₂は芳香族基上に１個以上の電子吸引性官
   能基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式
   基であり、R₃は芳香族基上に１個以上の電子吸引性官能
   基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基
   であるか又はR₃は非芳香族電子吸引性基であり、R₄は準
   芳香族環上に１個以上の電子吸引性官能基が存在する置
   換準芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基であり、R₅は
   芳香族環上に、少なくとも１個のヒドロキシ基を含めて
   １個以上の電子吸引性官能基が存在する置換芳香族ヘテ
   ロ環式又は炭素同素環式基である〕を有する色素を含む
   試薬試験パッドを含む被分析検出具と試験試料を該pH範
   囲に緩衝された条件下で接触させ、 （ｂ）該被分析物検出具を液体試験試料のアルブミン含
   有量に応答した変色について試験する ことを特徴とする試験試料中のアルブミンの存在及び／
   又は濃度の測定方法。
4. 【請求項４】支持体ストリップ 試薬試験パッド、及び 試薬試験パッド中に混入された色素を含み、該色素が、
   ６〜８のpHでアルブミン含有液体試験試料と接触したと
   きに試験試料中のアルブミンの存在及び／又は濃度を示
   すのに充分な変色を示すことができ、 式： 〔式中R₁及びR₂は芳香族基上に１個以上の電子吸引性官
   能基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式
   基であり、R₃は芳香族基上に１個以上の電子吸引性官能
   基が存在する置換芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基
   であるか又はR₃は非芳香族電子吸引性基であり、R₄は準
   芳香族環上に１個以上の電子吸引性官能基が存在する置
   換準芳香族ヘテロ環式又は炭素同素環式基であり、R₅は
   芳香族環上に、少なくとも１個のヒドロキシ基を含めて
   １個以上の電子吸引性官能基が存在する置換芳香族ヘテ
   ロ環式又は炭素同素環式基である〕を有する染料及び接
   触後、該試験試料を該pH範囲に保持する緩衝剤を含む、
   試験試料中のアルブミンの存在及び／又は濃度を測定す
   る被分析検出具。