NL7904307A - Mengsel, inrichting en werkwijze voor het detecteren van urobilinogeen in te toetsen monsters, alsmede werkwijze voor het vervaardigen van een desbetreffende toetsingsinrichting. - Google Patents

Description

.1 & % ' — t — i, V-0* TT6l· --=--------!

Mies Laboratories, Inc. |

Elkhart i

Verenigde Staten, van Aaerika ' I i ‘ i • Mengsel, inrichting en -werkwijze voor het detecteren ran, urobilinogeen ; | in te toetsen monsters» alsmede werkwijze voo2*het vervaardigen van een ‘ i desbetreffende toetsingsinrichting ; ί ! ' ; ί De -uitvinding heeft betrekking op een. mengsel,, een inrichting

i .. I

| en een werkwijze vooir het detecteren van. urobilinogeen: in te toetsen j-monsters, alsmede op een werkwijze voor het vervaardigen, van een des— Ί betreffende toetsingsinrichting. j - 5 l Meer- in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een | verbeterd, toetsihgsmengsel, verbeterde- inrichting en verbeterde methode.' [ voor het. detecteren van urobilinogeen.

De analyse van urobilinogeensoorten in urine betreft een ; oude techniek» die teruggaat tot ongeveer de eeuwwisseling (1901), TO toen Ehrlich ontdekte» dat ps-dimethylaminobenzaldehyde in tegenwoor- 1 digheid. van een sterk; zuur» zoals HC1, met urobilinogeen reageert onder róodkleuring. Deze reactie werd in hetzelfde Jaar ook door Proes^cher ontdekt, vandaar, dat de proef zowel met "Ehrlich ."-reactie als met "Ehrlich-Proescher"-reactie wordt aangeduid. De chemie, waarop deze 1J gelijktijdige ontdekkingen berusten vormt nog steeds de basis van de huidige urobilinogeentoetsing.

niettegenstaande het feit, dat deze reactie op uitgebreide schaal bruikbaar is en voor medische diagnosen in wijde kring werd aanvaard,, werd spoedig gevonden, dat de basisreactie volgens 20 Ehrlic% onderhevig is aan een aantal in urine aanwezige storende stoffen. Xn het bijzonder werd gevonden, dat indool- en skatool-deri- vaten, pyrrool-verbindingen, sulfonamiden en andere stoffen de reactie storen door vorming van de rode kleur, die typisch is voor een positief proefresultaat. In 1925 vond Terwen, dat door toevoe- 25 ging van natriumacetaat niet alleen de urobilinogeenaldehyde-kleur werd versterkt, doch ook de vorming van de kleur, die aan indool- en skatoolderivaten te wijten was, werd geremd. Modificaties van deze 7904307 -- -2 - f. - * ι verbetering zijn. nog steeds in· gebruik,, zoals blijkt uit. het Amerikaanse octrooischrift 3 i ^7· 905» Meer recente, pogingen om extra . diagnostische middelen voor toepassing bij ur.obilinogeen-deteetie te verschaffen, resulteerden in systemen,, zoals. die,,, welke beschreven 5 zijn in het Amerikaanse, octrooischrift 3.630.680·., Tot op heden berustten de ontwikkelde significante urobilinogeenproeven. bijna uitsluitend op de toepassing van p-dialkylaminobenzaldehyde-indicatoren, t ' zoals: p-dimethylaminobenzaldehyde. Een. dergelijk.-produkt wordt door de Ames Division, van Miles laboratories,. Inc. in de'handel gebracht 10 als UROBILISTIX ® -reagensstroken..

De onderhavige uitvinding gaat in zoverre uit van de. stand van. de. techniek», dat zij, gericht is: op. een unieke verbetering, bij..de • Ehrlich-reactiev Het nieuwe mengsel verschaft een. kortere reactietijd,. ! een sterkere kleurvormingr en minder storing: door urine-bestanddelen ‘ T5* als: nitriet,, isoniCotinezuurhydrazide» p-aminosalicylzuur en indool.

Bovendien resulteert, het gebruik van het onderhavige mengsel bij het. vervaardigen van toetsinrichtingen. voor het meten van urobi— ‘ linogeen in. een sterk vereenvoudigde, procedure. Tot. nu toe werden, de zogenaamde "dompel en. lees-as,r-reagensstroken voor urohilinogeen ver-20 vaardigd. onder toepassing' van een werkwijze, waarbij 'tweemaal werd gedompeld. Zo werd een eerste reagensoplossing bereid door amino— azijnzuur en fluorboorzuur in alcoholisch water- op te lossen. Deze eerste oplossing werd. gebruikt om een drager-matrix bij voorbeeld papier, te impregneren,, waarna, deze werd gedroogd. Vervolgens werd een 25 tweede reagensoplossing bereid, die een stannichloride-dioxaan-camplex en p-dimethylaminobenzaldehyde in methanol bevatte» Het gedroogde geïmpregneerde papier werd daarna in deze tweede oplossing gedompeld en gedroogd.

Door de resulterende verhoogde stabiliteit van het onderhavige 30 reagens-systeem, kunnen toetsingsinrichtingen verrassenderwij ze worden vervaardigd onder toepassing van slechts êên enkele impregnering of van een methode- met éénmaal dompelen. Door de onverwachte stabiliteit van het onderhavige mengsel, kunnen alle ingrediënten in één enkele reagens oplossing werden opgelost, waarbij de kostbare en omslachtige 35 tweede dampeling achterwege wordt gelaten.

Een ander voordeel van de onderhavige uitvinding, is dat de nood- 790 4 3 0*7 ~3 - ί £ zaak. van. sterk zure canqaonenten, dier bij de inrichtingen. volgens de . stand van de techniek werden, toegepast en achteruitgang van papieren drager-matrices veroorzaakten, er door is komen te vervallen. De onderhavige stand van de techniek vereist hij. de reactie het gebruik 5 van verbindingen, zoals SnCl^-dioxaan-complex als HCl-bron- Door de betrekkelijk grote reactiviteit van deze component met papier in tegen--woordigheid van water, is de bereiding door tweemaal.dompelen noodza— ; ke-lijk, waarbij door de. eerste dompeling een geschikte buffering wordt bewerkstelligd en de dragermatrix voor het zuurvormende- complex wordt 10 bereid.. De onderhavige uitvinding vóórkant de noodzaak van een der gelijke eerste stap. . Het. eindprodukt waarbij het onderhavige mengsel : wordt gebruikt*, maakt eer kortere reactieduur met de ontwikkeling van : een veel sterkere kleur (geel. tot diep rood) dan tot nu. toe het geval waa mogelijk. Bovendien is. de kleurenreeks, die bij de onderhavige ' 15 uitvinding werd ontwikkeld, breder dan die bij de tot nu toe bekende stand- van- de techniek, waarbij het gebruik van meer kleurblokken dan . bij de stand. van. de techniek, ten. opzichte van een equivalente reeks van urobilinogeenconcentraties, mogelijk is.

De voordelen van de onderhavige uitvinding ten opzichte van de 20 stand, van de techniek kunnen als volgt worden samengevat: de reactiesnelheid is groter, zodat de wachtperiode voor' de kleur ontwikkeling of de ontwikkeling van een andere detecteerbare reactie sterk wordt verminderd; de kleur,, die bij de reactie wordt gevormd, is veel intensiever dan die volgens de stand van de techniek, waardoor het tot 25 stand brengen van een grotere gevoeligheid en nauwkeurigheid wordt vergemakkelijkt; en voor· het vervaardigen van de inrichting kan een werkwijze met éénmaal dompelen worden toegepast, in tegenstelling tot de werkwijze met tweemaal donkelen, die vereist was bij de vervaardiging van de reagensstroken volgens de stand van de techniek..

30 In het kort betreft de onderhavige uitvinding een mengsel, een toetsingsinrichting en een methode, waarbij het mengsel of de inrichting wordt toegepast voor het vaststellen van de aanwezigheid van urobilinogeen in een te toetsen monster. Het mengsel is een mengsel, dat bij aanwezigheid van urobilinogeen in staat is een detecteerbare 35 reactie teweeg te brengen en bestaat uit para-di(laag alkyl) aminobenzal-dehyde als indicatorverbinding, een bufferstof, die in staat is een 7904307 f· *f' ” * Λ ,- :.....

pH. van ongeveer 0,5 tot 3 te bewerkstelligen, en een: verbinding met de in formule 1 aangegeven struktuur, in welke formule X zuurstof of zwavel, voorstelt en.H en, R'die onderling gelijk, of verschillend kunnen zijn, onafhankelijk van elkaar een lage alkylgroep vertegen-5 woordigen of R. en R* tezamen, met,een lage· alkyleengroep of een groep -C(=OKCH2^OC=0)-,. waarin, n een geheel getal, is van 1 tot on-; geveer 6, vormen.. De onderhavige toetsingsinrichting bestaat uit een 1 dragermatrix, waarin het mengsel, is opgenomen^ De werkwijze bestaat uit. het· in aanraking brengen van het mengsel of de toetsingsinrichting 10 met' een te. toetsen, monster, waarvan vermoed, wordt,, dat het urobili- nogeea bevat,, en. het waarnemen, van, een. eventuele detecteerbare : reactie.·

Het mengsel volgens, de-uitvinding bevat, drie: hoofdcomponenten: een; indicator,, een buffer en een ureumderivaat, waarin, beide amido-15 . stikstofatomen zodanig zijn. gesubstitueerd, dat zij een acyclische of een cyclische: verbinding- vormen. De indicatorverbinding wordt gekozen uit een aantal, verschillende, para-di (laag a].,kyl)aminobenzalde-♦ hyden.· Deze- verbindingen zijn de gebruikelijke indicators van, het Ehrlich-reagens en hiertoe behoren onder meer p-dimethylaminobenzalde-20 hyde,. p-di-etbylaminobenzaldehyde, p-diisopropylaminobenzaldehyde en andere soortgelijke gesubstitueerde p-aminobenzaldehyden, waarin de lage alkylgroep 1 tot ongeveer 6 koolstof atomen bevat.

De in dit mengsel toegepaste· bufferverbinding. is een buffer-verbinding, die in staat is een pH van ongeveer 0,5 tot 3 tot stand 25 te brengen. Wanneer het mengsel voor het analyseren van een monster als zodanig wordt toegepast, behoort het dus. een pH in dit gebied te hebben. Indien het mengsel wordt gebruikt in. de vorm van een als reagensstrook werkende toetsingsinrichting, dan dient de gébruikte buffer bij bevochtiging van de dragermatrix een pH te leveren van on-30 geveer 0,5 tot 3. Enkele voorbeelden van buffers, die volgens de uitvinding: kunnen worden toegepast, zijn sulfosalicylzuur, cyclohexylsulfa-minezuur, oxaalzuur en fosforzuur.

De derde hoofdcomponent van het mengsel is een verbinding, waarvan de struktuur overeenkomt met de formule 1, waarin X zuurstof of 35 zwavel voorstelt en R en R’ een lage alkylgroep kan zijn, zoals methyl, ethyl, isopropyl, n-propyl, de verschillende butyl-isomeren en andere, 7904307 £ i -5 _ en. welke alkyigroep tot ongeveer 6 koolstofatomen. kan bevatten-. S en H' fannwi ook. tezamen een. lage alkyleengroep vormen met 1 tot ongeveer 6 koolstof at amen, zoals een methyleen— of een ethyleengroep of de groep -C(=Q)-fCEL·)- C(=0)-, waarin n. een geheel getal is van 1 tot ongeel n 5 veer 6, waardoor een gesloten ringsysteem wordt gevormd. Voorbeelden van geschikte verbindingen» die èarudeze eisen voldoen, zijnt ureum, 2-xmidazolidon,. malonylureum*. malonylthicureum en urinezuur.

De mengsels volgens de uitvinding kunnen behalve de bovengenoemde drie hoofdingrediënten ook: talrijke hulpccmponenten bevatten. Zo kun-10 nen bij voorbeeld in het mengsel verschillende van dergelijke verbin— . dingen., zoals: triëthanolamineboraat, cafeïne, ascorbinezuur en andere . ingrediënten zijn opgenomen. Zo werd. gevonden, dat de effekten van nitriet-renming, op significante wijze' kunnen worden verminderd, door in het mengsel ascorbinezuur op te nemen. De gevoeligheid, en de reactie— 15 snelheid, van de basisf ormulering volgens- Etelich kan verder worden j .verhoogd door de aanwezigheid van cafeïne. lEriethanolamineboraat verhoogt duidelijk de stabiliteit van het mengsel, zowel tijdens het sa-' menstellen ervan als tijdens opslag. Andere uit de stand van.de techniek bekende· ingrediënten, zoals oppervlakactieve verbindingen en. che— 20 laatvormende middelen,, kunnen worden toegepast cm solubilisatie van de componenten van de dcmpeloplossing te bevorderen en andere ongunstige effekten te verminderen^ De onderhavige uitvinding betreft dus mede urobilinogeengevoelige reagens-samenstellingen, die de bovenvermelde hoofdingrediënten bevatten met of zonder hulpccmponenten.

25 De hoeveelheid van elke hoofdccmponent van het urobilinogeen gevoelige mengsel kan binnen ruime grenzen variëren. Zo kan de indicator aanwezig zijn in een hoeveelheid van ongeveer 0,001 tot ongeveer 5,0 gew. %; de buffer in een hoeveelheid van ongeveer 1 tot ongeveer 20 gev.% en het ureumderivaat of derde ingrediënt in een hoe-30 veelheid van ongeveer 0,001 tot ongeveer 20 gew.$, berekend op totale ingrediënten van het mengsel.

De toetsingsinrichting volgens de uitvinding bevat een drager-matrix, waarin het bovengenoemde toetsmengsel is opgenemen. De drager-matrix kan vele vormen bezitten. Zo wordt in het Amerikaanse octrooi-35 schrift 3.846.2^7 de toepassing beschreven van vilt, poreuze keramische stroken en geweven of gevlochten glasvezels. Als vervangings- 7904307 '** Η _β _ middelen voor papier worden in het Amerikaanse octrooischrift 3 .-552.928 genoemd, stukjes hout,, -doek, sponsachtig· materiaal en kleiachtige stoffen- De'toepassing van uit. synthetische hars vervaardigde vellen en uit glasvezel vervaardigd, vilt. in plaats van, papier wordt.

5 in overweging gegeven in het Britse octrooischrift 1.369.139. In een ander Brits octrooischrift hr. 1.3^9.623, wordt het gebruik aanbevolen van. een. lichtdoorlat end. maaswerk van dunne draden als bedekking voor een daaronder liggende- papieren matrix.; In dit. octrooischrift. wordt ook voorgesteld het papier· te impregneren met een. deel van 10 het reagenssysteem en. het maaswerk, te impregneren met. andere eventueel niet verenigbare:, reagentia.. In het Franse, octrooischrift 2.170-397 wordt, de·, toepassing beschreven, van. drager-matrices, waarin meer dan 50%· polyamide-vezels. aanwezig· zijn.. log· een. andere benade— • ring: van. drager-matrices· is, vermeld in het: Amerikaanse octrooi— 15' schrift lt.Oké;. 513,- waarin het idee is genoemd, van. het drukken, van· reagentia op- een geschikte dragermatrix. In. het Amerikaanse octroorschrift k-0U6.51^·· is. beschreven het in een reactiesysteem dooreenweven of. -breien van reagens.-dragende draden vermeld. Al. dergelijke dragermatrix-ontwerpen kunnen evenals, andere bij de werkwijze volgens 20 de uitvinding worden toegepast.

De bij voorkeur-toegepaste werkwijze voor het vervaardigen van de onderhavige toetsingsinrichting omvat een aantal, stappen:,, beginnende met het impregneren van. een continue rol van uit filtreerpapier bestaand dragermatrix-materiaal door het papier te dompelen in een 25 reagensbad, dat het urobilinogeen-gevoelige reagenssysteem bevat..

Ia droging wordt het papier gelamineerd op een continu,, uit kunststof bestaand vel van steunlaag-materiaal, zoals een doorzichtige polystyreen?ilm, die door· Dow Chemical Co. in de. handel wordt gebracht (r) onder de naam Trycite . De bij voorkeur toegepaste methode voor het 30 bevestigen van de geïmpregneerde dragermatrix op de kunststof is via het aanbrengen van een tussenliggende, aan twee zijden klevende strook. Een dergelijke strook wordt door 3M Company onder de naam "Double Stick" in de handel gebracht. Wanneer het geïmpregneerde filtreerpapier aangebnacht is op het steunlaagmateriaal wordt de aldus ver-35 kregen samenstelling zodanig gesneden, dat het eindprodukt een langwerpige, uit kunststof vervaardigde strook is,, waarvan aan éên einde 7904307 ί * -τ - ' op een gedeelte ervan een rechthoekig stuk. geïmpregneerde drager— matrix is gelamineerd, waarbij de rest van de kunststof als een handgreep fungeert.

Bij de methode voor het gebruik van de onderhavige toetsings-5 inrichting wordt de dragermatrix, die het op urohilinogeen reagerende mengsel, bevat,. een ogenblik ondergedanpeld. in het te toetsen monster en vervolgens er weer uit gehaald- Fa verwijdering uit het te toetsen monster laat men het mengsel, dat in de dragermatrix: is opgenomen, tot kleurontwikkeling kamen, of op andere wijze een detecteerbare 10 reactie geven, waarna het wordt waargenomen. Methoden om. de reactie in of op de matrix te observeren zijn onder meer het meten van de : hoeveelheid geabsorbeerd-licht* zowel v6of alsuia de. onderdompeling . en onder- toepassing van een spectrometer of andere geschikte inrichting,, of het visueel vergelijken van een eventuele, kleurverandering in de 15 dragermatrix met standaard kleurblokken, overeenkomende-met te voren, bepaalde urobilinogeenconcentratie ♦

De uitvinding wordt aan, de band van de volgende voorbeelden . nader toegelicht-Voorbeelden

20 A. Bereiding van het mengsel en vervaardiging van de toetsingsinrichting Voorbeeld I

Het mengsel met 2-imidazolidon

Een voor urobilinogeen gevoelig mengsel werd uit de volgende ingrediënten bereid: 25 sulfosalicylzuur 520,0 g g-dimethylaminobenzaldehyde ^0,0 g triethanolamine-boraat 80,0 g

2-imidazolidon 160, 0 S

caffeine 320,0 g 30 Versene® (Dow Chemical Co.) 8,0 g aseorbinezuur 200,0 g oplossing van F; D- en C-blauw* k,0 ml *bereid door oplossen van 20,0 ml F-, D- en C-blauv in lj-,0 ml gedestilleerd water.

35 Het mengsel werd bereid door bovengenoemde ingrediënten in de aangegeven volgorde op te lossen in k liter gedestilleerd water.

7904307 ·*· ~8 - ; Hierbij werd er· voor zorg gedragen, dat elk ingrëdiënt volledig was opgelost voordat het volgendé wérd toegevoegd. De resulterende oplossing vertoonde een helder geel-groene kleur, die in tegenwoordigheid van. variërende hoeveelheden urohilinogeen overging in verschillende 5 tinten .rood'.

Voorbeeld II

I De toetsingsinrichting met 2—imidazolidon .I Een bad werd bereid, dat de oplossing volgens voorbeeld 1 bevatte en dat werd toegepast om ongeveer 70 meter1 filtreerpapier 10. van een. rol van 20 cm (Eaton and Dikemaa 237-filtreerpapier) te impregneren. Nadat, het filtreerpapier door het bad was gevoerd,, werd het. ongeveer 15" min. in. lucht. bij. een temperatuur: van ongeveer 80-82°C. i gedroogd. Aan één. zijde van het droge geïmpregneerde papier* werd een ’ laag kleefband aangebracht,, die onder de naam "Double Stick* in de 15 handel wordt gebracht, waarna de resterende onbedekt, gelaten zijde • van. de kleefband beschermd werd met niet^klevend papier, dat gemakken lijk van het kleefmiddel. kon worden afgetrokken. Het geïmpregneerde papier, waarop de. kleefband. nu was bevestigd, werd in stroken van ongeveer 5 inm: breedte gesneden. De daarbij verkregen, stroken werden 20 vervolgens aangebracht aan een zijde, van een. strook kunststof met de handelsnaam1 Trycite.®,.. waarvan de breedte ongeveer 70 mm bedroeg.

. Dit werd tot stand gebracht door het niet-klevende. beschermende papier van. de kleefband af te trekken en de· onbedekte kleefband. tegen het Trycite aan. te drukken. De Trycite-strook, die de daarop aangebrachte 25 strook van geïmpregneerd papier bevatte, werd. daarna in een richting loodrecht op haar lengte in stroken met een breedte van 5 am. gesneden, Hierbij werd een serie van urobilinogeen-gevoelige toetsstroken van 5 bij 70 mm verkregen,, welke stroken, aan êën einde een urobilinogeen-gevoelig reagensgebied van 5 bij 50 mm bevatte. Dit. resulteerde in' 30 een urobilinogeen-toetsingsinrichting, die gevoelig was . voor éên Ehrlich-eenheid urobilinogeen per deciliter urine.

Voorbeeld III

Het mengsel en de toetsingsinrichting met malonylureum

Een bad werd bereid, dat de volgende ingrediënten bevatte: 7904307 % 1 -9 - gedestilleerd water 80,0 ml tetrahydrofuran 20,0 ml snif os alicylzuur 11,6 g p^iethylaminobenzaldehyde 0,048 g 5 malonylureum 0,16 g triethanolamine-boraat 1,8 g caffeine 9,7 g- "Vèrsene,r 0,18 g ascorbinezuur 4,4 g 10 Het tetrahydrofuran en. bet gedestilleerde, water werden gemengd.

: en de vaste componenten, in der aangegeven volgorde toegevoegd,, waarbij: elke component op baar beurt gebeel werd .qpgelost voordat de volgende-werd toegevoegd- De resulterende licht-oranje- gekleurde oplossing-werd: ongeveer 30 min geroerd.

15" Stroken van Eaton and Dikeman. No.-. 23T—filtreerpapier werden met de oplossing geïmpregneerd en. 15 min. in een bete· lucbt-oven bij 80°C gedroogd, waarbij toetsingsinrichti-ngen volgens, de uitvinding met een licbt-oranje kleur werden verkregen.

Stukken van bet geïmpregneerde papier werden aangebracbt op 20 ïrycite® (Dow Chemical Co.,),, waarbij een ,fDouble Stick"-kleefband-van 3M. Company als beschreven in voorbeeld IX werd toegepast .

Voorbeeld 17

Het mengsel en de toetsingsinrichting met 2-thiomalonylureum

Een bad werd bereid, dat de volgende ingrediënten bevatte: 25 50% waterige metbanoloplossing 15 ml sulfos alicylzuur 3 g p-dimetbylaminobenzaldehyde 4,8 mg 2-tbiomalonylureum 4,8 mg caffeine 400 mg 30 50% waterige methanol aanvullen tot 20 ml

De vaste componenten werden in de aangegeven volgorde aan de waterige methanol toegevoegd. Na toevoeging van de vaste stoffen werd de oplossing door verdere toevoeging van waterige methanol op een volume van 20 ml gebracht.

35 Stroken van Eaton and Dikeman no. 237-filtreerpapier werden met deze oplossing geïmpregneerd en in een hete lucht oven bij onge- 7904307 * - * ~ 10 ~ _/_ - __________;___.________ _______

veer 75-Ö0°C gedroogd, martij toetsingsinrichtingen. -werden verkregen. Voorbeeld V

Toetsingsinrichting ter vergelijking

Een. voor* vergelijking bestemde toet sings inrichting· werd ver-5 vaardigd om te worden gebruikt voor het vaststellen van de verbeterde eigenschappen van de inrichting volgens de onderhavige uitvinding.

, j De voor vergelijking: bestemde inrichting: werd: vervaardigd onder- toe— i j' passing van de werkwijze, met. tweemaal, dompelen volgens de stand van de techniek.- , 10 Een eerste dompelvloeistof" werd vervaardigd door de volgende- ! ingrediënten te combineren:: i ethanol. - 1)-2.,.6 ml .

• dioctyl-natriumsulf osuccinaat- 1(25,5" W

| gedestilleerd water · 1,0 liter 15 . glycine 106, Ij· g fluorboorzuur 23,1)- ml..

De ingrediënten werden, gecombineerd door-eerst het dioctyl— natriumsulfosuccinaat onder roeren in de ethanol, te-mengen tot het was. opgelost - Het gedestilleerde water werd in. een' afzonderlijk vat 20 gebracht en het. glycine, toegevoegd, waarbi j, zo lang geroerd werd tot het was opgelost. Aan deze waterige oplossing werd de ethanolische dioctylnatriumsulfosuccinaatoplossing toegevoegd.,. Vervolgens, werd aan dit mengsel onder roeren het fluorboorzuur toegevoegd.

Door deze oplossing werd een strook filtreerpapier (Eaton and 25 Dikeman 237) gehaald, die vervolgens, in een luchttunnel ongeveer 15 min bij ongeveer 80-100°C werd gedroogd.

Een tweede dompeloplossing werd bereid door de volgende ingrediënten te- combineren: methanol 1,0 liter • 30 tris(hydroxymethyl)aminomethaan 12,5 g.

Stannichloride-dioxaan (gumner

Division, Miles Laboratories, Inc.) 375 g p-dimethylamlnobenzaldehyde 15,6 g

Het mengsel’werd bereid door aan. de methanol, elk van de andere 2^ drie ingrediënten onder roeren in dé boven vermelde volgorde toe te voegen.

7904307 -ii - % .β

Door deze oplossing werd het- bij. de eerste dompeling verkregen geïmpregneerde papier gehaald.

Het papier dat "bij de tweede dampeling werd verkregen, werd vervolgens in de droogtunnel hij ongeveer 80-100°C gedroogd. Na droging- werd het 5 geïmpregneerde papier aangebracht op een zijde van- het twee-zijdig klevende kleefband van 3M Company. De overblijvende klevende zijde r werd. in aanraking, gebracht met een vel Trycite® (Dow Chemical Co. Ine.).

De samenstelling geïmpregneerd papier/kleefband/Trycite werd daarna in stroken van ongeveer 10 bij 0,5 cm gesneden. De afmetingen van 10 _ het geïmpregneerde papier-gedeelte waren 0,5 tij 0,5 cm—

; B» Evaluering van de toetsingsinrichtingen Voorbeeld VI

Methode, waarbij gegevens van “blinde proeven* bijeen werden gebracht Blinde proeven werden uit gevoerd, om: vergelijkende gegevens > 15 te verschaffen voor de toetsingsinrlchting volgens voorbeeld IX. en volgens de stand van de techniek, (vergelijkingsinrichting volgens voorbeeld V).. Bij. deze proeven liet men een groep van vijf of meer personen reagensstroken in. urinemonsters dompelen en het urobilino-geengehalte van het monster beoordelen door vergelijking van een in 20 de strook eventueel tot ontwikkeling gekomen kleur met gestandaardiseerde kleur enblokken.

flan de kleurblokken werden arbitraire numerieke waarden van 0 tot 30 gegeven. Zo werd aan het kleurblok, dat 0,1 Ehrlich-eenheden urobilinogeen per deciliter urine (E.E./dl) aangeeft een arbitraire 25 waarde gegeven van. 0. Een tweede blok betrof de kleur van de reagensstrook bij 1 E.E./dl urobilinogeen en hieraan werd de waarde 10 gegeven. Aan een derde kleurblok, waaraan de waarde 20 werd gegeven, kwam overeen met de kleur van de reagensstrook in urine, die urobilinogeen in een concentratie van 2 E.E./dl bevatte. Tenslotte werd aan 30 het kleurblok voor een urobilinogeeneoncentratie van k E.E./dl een waarde gegeven van 30. Waar de kleur van de reagensstrook tussen twee kleurblokken in lag, werden interpolatieve waarden gegeven.

De aflezingen voor een bepaalde reagensstrook bij een bepaald urinemonster werden overeenkomstig het aantal personen, dat de aflezingen 35 verrichtte, gemiddeld teneinde subjectiviteit ten aanzien van persoonlijke kleur interpretatie zo veel mogelijk uit te sluiten.

7904307 -12 -

De bovenbes chr even blinde proef-methode: werd. gebruikt cm. de ·;' effekten. van. verschillende urine-parameters op de doeltreffendheid ‘ van. de toetsingsinricbtingen. volgens" voorbeeld II en de voor vergelijking bestemde inrichtingen of de inrichtingen volgens de stand 5 van de techniek, volgens voorbeeld V vast te stellen.. Die waargenomen parameters waren:, nitriet,. isonicotinezunr-hydr azide, p-aminosalicyl-: zuur* en indool·, f. Voorbeeld VII ·'

Het effëkt van- nitriet 10 . Een blinde proefals beschreven, in voorbeeld VI werd, uitge— voerd.om bij urobilinogeen-analyse. de- relatieve effekten van het ni-; triet—ion. in urine vast- t«r stellen,, waarbij’ de·; toetsingsinrichtingen.

; volgens de uitvinding- (voorbeeld II) en de inrichtingen, volgens, de stand, van de techniek-, (controle-stroken volgens, voorbeeld V) werden.

15 · gebruikt.

Vierr kleur blokken werden gemaakt als. referenties, voor de in • elk van. de twee. typen reagens stroken optredende kleurvorming..

; Zo werden, kleur-r.efêrentieblokken overeenkomende met. urobilinogeen-concentraties, van. 0, T;. ΐ,Ο;, Σ. en k E.EV/dl gemaakt, voor elk. strook— 20 type, terwijl aan elk blok. een arbitraire numerieke waarde van resp.. 0, 10, 20 en 30 werd gegeven.

Monsters van bijeengevoegde urine werden., getrokken en daaraan werdurobilinogeen toegevoegd om concentraties van 1,0; 2*0 en ^,0 E.E./dl tot stand te brengen. Aan deze monsters werden variërende 25 hoeveelheden nitriet toegevoegd en de twee typen toetsstroken werden in elke oplossing gedompeld. Aan de waargenomen kleurveranderingen werden numerieke waarden gegeven, die gebaseerd waren· op de standaard— kleurblokken. De resultaten zijn in tabel A samengevat.

7904307 -13 - ΐ. ^ > ti

Η Ο CVJ CO (M VOJ-O

(pi λ ft Λ ft ft Λ 5 lUOco^OUNH'J· 2 ,Q 1— <*1 u ο ο > σ · 1 ft _3~ Η * Μ- 'Ö Η -s- ο ο ο ο σ 0 ft ft (V « »* « Ο (Β σχ CD trv <Μ Ο CO CVJ ο ,α cvi οι ca αι. cvj 1— αι on u ο . ο >· ... .

IÖ VA ^ a ο» οι -f w.‘ -t ό νο ,_1 Λν» Λ- «Μ AV Λ1 ·► ft- ft· Η a co irx τ- w ei ca on- o 3 % ,<n & 8-.

S ^ - 0 o 0 **

bO CU H

<{ Ο H4 fi •H H Ό .3 -Η rr+ r-i \ OVOO-VO OCUO-S- {VT _Q · |H ft. ftv ft* ft' ft- a ” 'o 1¾ A Ox ΙΛ fc— cu CM on- O o.

CQ Jj · r— T— t— r— t— t— OJ

” 3 m O

«3! *—- O

0 f>

B H

H

£1) g-i O 5j > -P B Ό*

D >2f H

•Η H 0)

L, O (DJ'CMOCO

bg η ο η n ^ CJ

•no tjonxot-t- *- a ο o S3 s· >

cd H

> S ° o «

+3 O *- H

Λί a h

1 0 H

‘ <k 1-3 rri

^ {«I

0 ffl 0 CO o xo o O 0 « Λ « *

+3 p3 P Ο O Ox CO O

0 d k ^ a o £ 0 <d a CÖ Λ is ^ « S 'o .

3 r-cxjcniAxocoo g I ft ft ft ft ft Λ Λ J5 CM 000000*“ k § i 790 4 3 07 - lk-

De resultaatgegevens tonen aan, dat; nitriet een sterke uitwerking heeft: op da urobilinogeen-toetsingsinrichtingen volgens de stand van de techniek, terwijl het effekt veel geringer is in het geval van de toetsingsinrichtingen volgens: de uitvinding.'Bij een 5 urob ilinogeen-c oncentr at ie van 1,0 E.E. /dl geeft de vergelijkende toetsstrook af leesresultaten,, die- hij een nitrietconcentratie van slechts Q.,1 mg/dl ver beneden; die volgens, de onderhavige uitvinding liggen, terwijl de strook volgens voorbeeld ΙΓ geen invloed ondervond (af leeswaarden. 3,k» resp.. 10,8). Wanneer de nitrietconcentratie 10 r werd verhoogd, tot 0,31 en. 0,5, werden volgens de uitvinding af leeswaarden van 9,6 en 8,0 verkregen, die zeer· dicht lagen bij de waarde van 10.,0- overeenkomend. met. de werkelijke urobilinogeen-concentratie,, i terwijl, in die gevallen de: vergelijkende proef resulteerde in aflees— waarden van slechts 1,0,. resp, 1,8.. Wanneer de nitriateffekten op 15 de stroken volgens; de voorbeelden ΙΓ en V in ogenschouw worden genomen^ dan blijkt, dat de onderhavige uitvinding waarden oplevert, die slechts een weinig lager- zijn, dan. de werkelijke urobilinogeen— - — concentraties", terwijl de resultaten van: de vergelijkende proef foutieve negatieve waarden geven (0,1 EJS./dl,. vergeleken met de 20 de: werkelijke, concentratie van. 1 ,0' E.E. /dl) .

Wanneer soortgelijke experimenten werden uitgevoerd met hogere urobilinogeen-concentraties, dan bleek het resultaat, van. de vergelijkende proef zelfs nog ongunstiger te zijn beïnvloed, terwijl de samenstelling volgens de onderhavige uitvinding een veel geringere 25 verstoring door nitriet vertoonde.

Voorbeeld VIII

Eet effekt van isonicotinezuur-hydrazide

Een blinde proef , als beschreven in voorbeeld VT, werd uit— gevoerd, om de relatieve effekten van isonicotinezuur-hydrazide (ΠΓΗ) 30 in urine op urobilinogeen-toetsingsinrichtingen volgens de uitvinding (voorbeeld II) en volgens de stand van. de; techniek (voorbeeld V) vast te stellen.

Kleum eferent i e-blckken werden op de in voorbeeld VII beschreven wijze voor de beide typen reagensstrook gemaakt, overeenkomende met 35 dezelfde urobilinogeenconcentraties van 0,1; 1,0; 2,0 en 1+,0.

Opnieuw werden arbitraire numerieke waarden van resp. 0, 10, 20 en 30 7904307 -15- «; & a»- aan elk. kleurblok gegeven, om te worden gebruikt bij bet· evalueren van bet gedrag van reagensstroken.

Uit bijeengevoegde normale urine werden proefmonsters getrokken, waaraan variërende hoeveelheden USE waren toegevoegd. Daar bet 5 standaard Ehrlicb-r eagens door- ΠΕ ongunstig wordt beïnvloed, door dat bet een onjuist, positief resultaat wordt verkregen, werd 'dit experiment uitgevoerd cel na te gaan. of bij. da onderhavige uitvinding positief gereageerd wordt op de aanwezigheid van HE van bet proefmonster. De. resultaten zijn samengevat in tabel B.

10 STABEL B'

Het: effekt van HE op urobilinogeen proefstroken HE Kleurreactie-waarden (mg/dl) Stroken volgens voorbeeld. H Stroken volgens voor

beeld V

15 20 2,6 11,T

6o 2,5 ίο, σ 100 1(-,2 18,3 300 kj « 35,8 500 5r3 42,5 20' T00 6,8 . k6,6

De resultaten tonen aan, dat HE-concentraties tot T00 mg/dl geen ernstig misleidende- resultaten in de toetsingsinrichting volgens voorbeeld II (onderhavige uitvinding) opleverden, terwijl dezelfde concentraties bij de reagensstroken volgens de stand van de techniek 25 afleesresultaten opleverden, die equivalent waren aan zeer hoge urohilinogeen-concentraties (k6,6, dat is· meer dan 3,0 E.E./dl urobilinogeen). De stroken volgens de stand van de techniek blijken derhalve voor ΠΕ-verstoring veel gevoeliger te zijn dan de stroken, die gemaakt waren volgens de onderhavige werkwijze.

30 Voorbeeld IX

Het effekt van n-aminosalicylzuur

Een blinde proef allieschreven in voorbeeld VI werd uitgevoerd om de effekt en van de aanwezigheid van p-aminosali cylzuur (PAS) in urine-proefmonsters vast te stellen met urobilinogeentoetsingsinrichtingen 35 volgens de uitvinding (voorbeeld II) en met die volgens de stand van de techniek (voorbeeld V).

7904307 y- ·* ...

-16- ’ Op. de in voorbeeld VII beschreven, wijze werden kleurblokken gemaakt om. de kleurontwikkellng in de stroken, die bij dit experiment werden toegepast,, -vast te stellen.,. Reagens stroken volgens de voorbeelden. II. en V werden. In proefmonsters van: bijeengevoegde normale 5 urine,, waaraan variërende hoeveelheden. PAS waren toegevoegd,, gedompeld.

Geen urobilinogeen was toegevoegd.· Een positief af leesresultaat bij een strook, gaf een; positieve- reactie op; de aanwezigheid, van. PAS: aan, | ' : hetgeen en op: wees,, dat een waarschijnlijk, onjuist resultaat zou. zijn afgelezen wanneer in het. urinemonster urobilinogeen. aanwezig zou.

10 zijn. geweest.. De resultaten zijn. samengevat. in. tabel C.

I A b e: l. σ

Het. effekt van PAS. op urobilinogeen-proefstroken : EAS' Kleurreactie-waarden ;

• Stroken volgens voorbeeld II Stroken volgens voorbeeld: Y

15 O: S,5 if·, 2..

20. 16,0 25,0

IfO 16,0 28,0 6o: . 19,7 . 39,0 ' - 80 26,0 37,0 ‘ 20 ' . : ]

De. resultaatgegevens tonen aan, dat ofschoon enige verstoring door PAS in beide stellen reagensstroken plaatsvond, de stroken ...............volgens de stand van. de techniek.veel gevoeliger waren.

Voorbeeld X

Het effekt van indool

25 Soortgelijke experimenten als beschreven in de voorbeelden VTI-IX

werden uitgevoerd om de ongunstige effekten van variërende hoeveelheden indool in proefmonsters op het vermogen van reagensstroken volgens de voorbeelden II en V om urobilinogeen-concentraties in urine te bepalen, te bestuderen.

30 · Aan monsters van. bijeengevoegde, normale urine werden variërende hoeveelheden, indool toegevoegd. Geen urobilinogeen was toegevoegd.

Deze urinemonsters werden getoetst met toetsingsinrichtingen, die op de in de voorbeelden II en V beschreven wijze waren verkregen, van welke toetsing de resultaten zijn samengevat in tabel D.

7904307 — 1T —

TABEL· D

De eff efctH&ran indool op urobilinogeen-proefstroken.

IndooX Klaurreactie-waarden

(mg/dl) Stroken volgens voorbeeld II Stroken volgens voorbeeld V

0 0 3,0 5 1,0 0 10,0 2,0 . 2,0 21»-,0 1 3,0 6,6 30,0 0 5,0 3T, 0 5,0 . . 12,0 .. 1»2,0 10 6,0 12,0 kk,0 T, tti 11,2 1»2,0

De resultaatgegevens, tonen aan,, dat de to et sings inrichting volgens de· uitvinding slechts aan te verwaarlozen ongunstige effekten van indool. tot concentratie van li-,0 mg/dX onderhevig was. De inrich— 15" tingen volgens de stand van de techniek werden echter door dezelfde, hoeveelheden zeer ongunstig beinvloed. Zo werd. bij een strook volgens de stand van de techniek een urobilinogeen-afleesresultaat van lf-,0 E-E../dX verkregen waar in feite geen urobilinogeen was toegevoegd. Bij aanwezigheid, van indool in grotere hoeveelheden (5—T mg/dX indooX) , 20 was het ongunstige effekt van het indooX bij inrichtingen volgens de uitvinding sterk verkleind.

790 4307

Claims (12)

1- Verbeterd mengsel, waarmee in tegenwoordigheid van urobilino-geen in. een. proefmonster een detecteerbare- reactie: kan worden verkregen, welk mengsel, bestaat uit p-di(laag alkyl)aminobenzaldehyde als: indicator: en een bufferstofwaarmee, een pH van ongeveer 0,5- tot 5 3 kan worden bereikt,, waarbij de verbetering daarin bestaat,, dat ; het. mengsel verder nog; een verbinding bevat,, waarvan de struktuur overeenkomt met. de formule T, waarin. X zuurstof of zwavel voorstelt; • en. waarin R en R’ die onderling; gelijk, of verschillend, kunnen zijn, onafhankelijk, van elkaar een lage alkylgroep vertegenwoordigen, of 10. waarin R en R’ tezamen een. lage alkyleengroep of een. groep ; -c(=oHch2^c(=o)-„ waarin n. een geheel getal is van 1' tot ongeveer 6,. • voorstellen.

2. Mengsel volgens; conclusie T, met het kenmerk, dat in formule. 1' • de symbolen R en R* tezamen, de groep 4CH2·)^ vormen,, waarin n een geheel 15 getal van 1 tot ongeveer 6-

3. Werkwijze volgens conclusie T of 2, met het kenmerk,, dat de verbinding met. de struktuur volgens formule 1 2-imidazolidon. is-k.. Mengsel, volgens een der conclusies 1—3, met het kenmerk, dat de- indicatorverbinding p-dimethylb enz aldehyde is. 20 5· Mengsel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de verbin— ding met de struktuur volgens formule 1, malonylureum is.

6. Mengsel volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de indicator p-diethylaminobenzaldehyde is. * T. Mengsel, volgens een der conclusies 1-k, voor het bepalen van 25 de aanwezigheid Van. urobilinogeen in een proefmonster, met het kenmerk, dat het mengsel jS-imidazolidon, p-di* m et hy la mi nob enz aldehyde, sulfo— salicylzuur, triethanolamine-boraat, caffeine en ascorbinezuur bevat.

8. Mengsel volgens conclusie 6, voor het bepalen van de aanwezigheid van urobilinogeen in een proefmonster , met het kenmerk, dat 30 het mengsel malonylureum, p-diethylaminobenzaldehyde, sulfosalicyl-. zuur, caffeine, triethanolamine-boraat en ascorbinezuur bevat..

9· Inrichting voor het bepalen van de aanwezigheid van urobilinogeen in een proefmonster, bestaande uit een dragermatrix, waarin een proefmengsel volgens een der conclusies 1-8 is opgenomen. 790 43 07 -19 ~

10. Methode voor het bepalen van de aanwezigheid van urobilinogeen : in, een· proefmonster*, waarbij' drfr monster- in. aanraking wordt gebracht met een mengsel volgens een der conclusies 1-8, en daarbij een eventueel detecteerbare reactie wordt waargenomen.

11. Methode voor het bepalen van de aanwezigheid van urobilinogeen in een proefmonster, waarbij dit monster in aanraking wordt gebracht met een inrichting volgens conclusie 9S en daarbij·, een eventuele : detecteerbare reactie wordt waargenomen.

12. Werkwijze voor het vervaardigen van een toetsingsinrichting 10 . volgens conclusie 9,- waarbij in een dragermatrix een mengsel volgens ' een der conclusies 1-8 wordt, opgenomen.

1. Werkwijze volgens, conclusie. 12,. met het kenmerk, dat daarbij : i | een methode wordt- toegepast, waarbij êén maal wordt gedompeld en dé volgende stappen worden uit gevoerd: a) het bereiden van een oplossing* door in een geschikt oplos- ! middel op te lossen: p-di(laag* alkyl) aminobenzaldehyde als indicator,i • een bufferstof , waarmee· een pE van ongeveer 0,5 tot. 3 kan worden verkregen, en een verbinding, waarvan de struktuur overeenkomt met formule 1, waarin Γ zuurstof' of zwavel· voor stelt; en waarin R en Rr, 20 die onderling gelijk of verschillend kunnen zijn, onafhankelijk van elkaar een lage alkylgroep vertegenwoordigen, of. waarin R en Rr tezamen een lage alkyleengroep of een groep -C(=0(=0) -, waarin n een geheel getal is van 1 tot ongeveer 6, voorstellen;. b) het in kontakt brengen van een dragermatrix met de onder a) 25 genoemde oplossing; en c) het daarna drogen van de onder b) genoemde dragermatrix. 1U. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de verbinding, met de formule 1 een verbinding is, waarbij in die formule R en Rf tezamen de groep waarin n een geheel getal is van 30. tot ongeveer 6, vormen.

15. Werkwijze volgens conclusie 13 of ll·, met het kenmerk, dat de verbinding met de formule 1 2-imidazolidon is.

16. Werkwijze volgens een der conclusies 13-15, met het kenmerk, dat de indicator p-dimethylaminobenzaldehyde is. 35 17· Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de verbin ding met de formule 1 malonylureum is. 7904307 -v . i .. -20 T • 18'. Werkwijze volgens conclusie 17\- met het. kenmerk» dat de indica-: tor pf-diethylaminobenzaldehyde ia- ' ‘ 19> Werkwijze volgens een der- conclusies 13—16,. met het kenmerk, dat de. volgende stappen worden, uit gevoerd: 5 a) het. "bereiden van een impregneeroplossing door in een geschikt oplosmiddel op te lossen: sulfosalicylzuur, p-dimethylaminohenzaldehyde,. triethanolamine-boraat,„ 2-imidazolidon,. caffeine en. ascorbinezuur • - . b). het. impregneren, van. een dragermatrix met de- genoemde- oplossing door die matrix in die oplossing te dompelen, en, nadat de 10 . matrix uit die oplossing is· verwijderd., • c) het: drogen van de dragermatrix.. • 20- -Werkwijze volgens conclusie 18,„ met het kenmerk, dat achtereen— ; volgens· de volgende: stappen worden uitgevoerd:·. a) het- bereiden van een oplossing· door in een geschikt oplos— 13 middel op te. lossen,, sulf os ali cylzuur,. caffeine, as corbine zuur,., trietha— nolamine-boraat, p-di ethylaminobenzaldehyde en malonylureum;. b) het impregneren van een dragermatrix in de genoemde oplos— '----- sing· door deze. matrix in die oplossing te dompelen; en. c) het daarna, drogen van de genoemde dragermatrix.. 7904307