DE1246281B - Trockene Indikatorzubereitung auf einem saugfaehigen Traeger zur Bestimmung von Protein in Fluessigkeiten - Google Patents
Trockene Indikatorzubereitung auf einem saugfaehigen Traeger zur Bestimmung von Protein in FluessigkeitenInfo
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Description
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. Cl.:
GOIn
Deutsche Kl.: 421 - 3/02
Nummer: 1 246 281
Aktenzeichen: E 13732IX b/421
Anmeldetag: 27. Februar 1957
Auslegetag: 3. August 1967
Die Bestimmung geringer Mengen an Protein in Flüssigkeiten, insbesondere Urin, spielt bei der ärztlichen
Diagnose von Nierenerkrankungen usw. eine große Rolle. In der Praxis wurden bisher meist
Fällungsreaktionen durchgeführt, wobei der Urin mit eiweißfällenden Reagenzien, wie Sulfosalicylsäure bzw.
Pikrinsäure, oder mit Essigsäure in der Hitze behandelt wird. Eine Prüfung des Urins zeigt dann die Gegenwart
von Proteinen an.
F e i g 1 und Anger (Microchim. Acta, II, 1937,
S. 107 bis 110) haben eine Tüpfelreaktion beschrieben, bei der die Farbänderung eines pH-Indikators
durch den sogenannten »Proteinfehler« in mit Essigsäure versetztem Urin ausgewertet wird. Nach
E. Dannenberg, Analytica Chim. Acta, Bd. 8 (1953), S. 310, sind ferner schwammartige Glassintersteinchen
bekannt, die mit Farbindikatoren imprägniert sind und für den Proteinnachweis in Urin
verwendet werden sollen. Auf dem Prinzip des Proteinfehlers beruht auch die von K e t ο m a a
et al. in Ann. Med. Exptl. et Biol. Fenniae, 30,
1952, S. 249 bis 253, beschriebene kolorimetrische Methode zur Bestimmung von Proteinen in Urin.
Hierbei werden zu 10 ecm eines mit Wasser im Verhältnis
100:1 stark verdünnten Urins 1 ecm 0,ln-Acetat
Pufferlösung pH 3,4 zugefügt und mit 1 ecm einer 0,05°/0igen alkoholischen Lösung des Kaliumsalzes
von Tetrabromphenolphthaleinäthylester versetzt. Die maximale Lichtäbsorption bei 610 ηιμ
wurde nach mindestens 10 Minuten, maximal 30 Minuten langem Stehenlassen spektrophotometrisch
bestimmt und der erhaltene Wert mit den Werten von Lösungen mit bekannten Proteinkonzentrationen verglichen.
Diese Methode ist umständlich und benötigt kostspielige Apparaturen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine einfache Schnell methode zu schaffen, bei der
ohne zusätzliche Vorrichtungen eine sichere Bestimmung von Proteinen in wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere
Urin, auch durch Personen ohne Spezialkenntnisse möglich ist. Gelöst wird diese Aufgabe
überraschenderweise durch eine trockene Indikatorzubereitung auf einem saugfähigen Träger, die einen
Farbindikator enthält, der mit Protein einen wahrnehmbaren Farbumschlag zeigt, wobei der Träger mit
einem auf den Farbindikator abzustimmenden Puffer imprägniert ist, der bei Berührung mit der Untersuchung'sflüssigkeit
nahezu konstant einen pH-Wert einstellt, der in einem engen pH-Bereich liegt, und
zwar innerhalb und dicht unterhalb des Umschlagsbereiches des Farbindikators, in dem dieser normalerweise
als pH-Indikator verwendet wird.
Trockene Indikatorzubereitung auf einem saugfähigen Träger zur Bestimmung von Protein
in Flüssigkeiten
Anmelder:
ίο Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. (V. St. A.)
ίο Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. (V. St. A.)
Vertreter:
Dr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Puls
und Dr. E. Frhr. v. Pechmann, Patentanwälte, München 9, Schweigerstr. 2
Als Erfinder benannt:
Albert S. Keston, Englewood, N. J. (V. St. A.)
Albert S. Keston, Englewood, N. J. (V. St. A.)
Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 29. Februar 1956 (568 437)
Es war auf Grund des Standes der Technik nicht zu erwarten, daß die Farbänderung, welche bei dem
kolorimetrischen Verfahren erst nach einer Standzeit von 10 Minuten bestimmt werden durfte, bei der
erfindungsgemäßen Indikatorzubereitung auf dem saugfähigen Träger praktisch unmittelbar eintritt und
auch hier je nach Intensität der Farbänderung eine quantitative Aussage über den Proteingehalt der
Lösung ermöglicht. Zwar kennt man schon seit längerer Zeit Papierstreifen, die mit einem pH-Indikator
imprägniert sind, z.B. Lakmuspapier oder Papierstreifen, die verschiedene Farbindikatoren mit
unterschiedlichem Farbumschlagsbereich aufweisen, um den pH-Wert von Lösungen genauer zu bestimmen.
Bei diesen Indikatorpapieren liegen aber andere Aufgaben vor, auch dürfen diese Papiere gerade keine
Puffersubstanzen aufweisen, da sie den pH-Wert der zu untersuchenden Lösungen ohne jede pH-Wert-Verschiebung
anzeigen sollen.
Die bei Anwesenheit von Proteinen mit der erfindungsgemäßen Indikatorzubereitung auftretende
Färbung beruht auf einem anderen Effekt als die bekannte, zum Nachweis von Proteinen bei der Papierchromatographie
oder -elektrophorese (vgl. F. Cra-
709 619/319
3 4
mer, »Papierchromatographie«, 1952, S. 34) durch- Der günstigste pH-Wert hängt nicht nur von der
geführte Anfärbung von Proteinen, bei der sich der Art des Farbindikators, sondern in geringerem Maße
Farbstoff mit den am Papier in begrenzten Flecken auch von der Art des verwendeten Puffers und seiner
oder Streifen adsorbierten Proteinen verbindet. Wie Ionenstärke ab und ist durch eine Versuchsreihe sehr
bei der bekannten Tüpfelreaktion und der spektral 5 einfach festzustellen. Beste Ergebnisse mit Brom-
kolorimetrischen Methode beruht beim erfindungs- phenolblau wurden mit vielen Puffern bei pH-Werten
gemäßen Indikator die Farbänderung auf den von zwischen 2 und 3 erhalten. Diese pH-Werte liegen
Kolthoffin »Säure-Basen-Indikatoren« schon 1932, also zweckmäßig außerhalb des pH-Bereichs, in dem
S. 357, beschriebenen Proteinfehler. Wenn auch die die Farbindikatoren normalerweise als pH-Indikatoren
einzelnen Merkmale der Indikatorzubereitung bekannt io verwendet werden, d.h. die vom pH-Wert abhängige
waren, so ist ihre Kombination neu und ermöglicht deutliche Farbänderungen zeigen. Ein geeignetes Ver-
überraschenderweise die Lösung der der Erfindung fahren zur Bestimmung des genauen pH-Wertes bei
zugrunde liegenden Aufgabe der einfachen Schnell- einer Zusammensetzung, die Bromphenolblau als
bestimmung von Protein in Flüssigkeiten wie Urin. . Farbindikator und einen Malonsäure-Malonat-Puffer
Die erfindungsgemäße trockene Indikatorzubereitung 15 enthält, ist wie folgt: Um die günstigsten Bedingungen
ist unbegrenzt stabil und zeigt bei Berührung mit einer für den Malonsäure-Malonat-Puffer zu ermitteln, wird
proteinhaltigen Flüssigkeit sogleich einen Färb- 1 g Malonsäure in 10 ecm einer 0,04%igen Bromumschlag,
der genau die Konzentration an Protein # phenolblaulösung unter Bildung einer zunächst gelben
in der Flüssigkeit wiedergibt, weil die Farbverände- Lösung aufgelöst. Dann wird ein geeignetes alkalisches
rungen des Farbindikators, die auf pH-Änderungen 20 Mittel, wie Natriumhydroxyd oder Natriumbicarbonat,
beruhen würden, durch den gleichzeitig vorhandenen zugegeben, bis die Lösung nach schwach Orange
Puffer ausgeschaltet sind. Das Protein ist also nicht umschlägt. Aus dieser Lösung werden Reagenzwie
bei den Anfärbeverfahren der Papierchromato- papierstreifen wie oben beschrieben hergestellt, und
graphie und -elektrophorese auf dem Papier vor- diese werden in Urinproben, die kein Protein enthanden,
sondern befindet sich gelöst in der Flüssigkeit. 25 halten, und solchen, die eine kleine bekannte Menge,
Als saugfähiges Trägermaterial für die Zubereitung z.B. 0,5% Albumin enthalten, eingetaucht. Wenn der
wird vorzugsweise poröses Papier verwendet. Durch eingetauchte Streifen bei der proteinfreien Probe
Vergleich mit einer Farbtafel kann z.B. die Menge merklich dunkler wird, so ist dies ein Zeichen dafür,
an pathologischem Albumin im menschlichen Urin daß ursprünglich zu viel Alkali zugefügt wurde und
in einfacher Weise festgestellt werden. 30 der pH-Wert der Lösung durch Säurezusatz etwas
Mit dem Mittel nach der Erfindung ist somit eine erniedrigt werden muß. Kein Farbumschlag oder eine
sehr einfache Schnellbestimmung von Proteinen in nur geringe Farbänderung bei der proteinhaltigen
Lösungen möglich, bei der gleichzeitig qualitative und Probe zeigt an, daß zu wenig Alkali zugefügt wurde
quantitative Aussagen erhalten werden können. Gegen- und daß der pH-Wert des Puffers etwas höher gewählt
über den in der Klinik bisher benutzten Methoden 35 werden muß. Zur Vereinfachung wird das oben
zum qualitativen Proteinnachweis im Urin, wie der beschriebene Verfahren in den Beispielen als »pH-Ein-
Essigsäurekochprobe und der Sulfosalicylprobe, zeich- stellung« bezeichnet.
net sich das erfindungsgemäße Mittel, abgesehen von Bei der Herstellung des Mittels nach der Erfindung
dem Wegfall von Laboratoriumsgeräten, auch da- werden der Farbindikator und der Puffer in an-
durch aus, daß es gleichzeitig eine quantitative Ab- 40 gemessener Konzentration in Wasser oder anderen
Schätzung der Proteinmenge ermöglicht. Im Gegen- passenden Lösungsmitteln gelöst. Aus der wäßrigen
satz zu allen bisher angewendeten Eiweißbestimmungs- Lösung wird durch Sättigen von porösem Papier und
methoden werden keine Geräte und Chemikalien Trocknen desselben die trockene Indikatorzubereitung
außer dem Indikatorstreifen selbst benötigt, und die in Form eines Reagenzpapiers hergestellt. Zwecks
Prüfung kann innerhalb von wenigen Sekunden auch 45 besserer Anwendung wird das Papier in lange Streifen
von gänzlich ungeschulten Kräften durchgeführt oder Bänder geschnitten. Auch kleinere Abschnitte
werden. können in üblicher Weise auf einen anderen Träger-
Es wurde gefunden, daß außer mit den Färb- streifen befestigt werden.
Indikatoren Bromphenolblau und Bromkresolgrün Zur Proteinbestimmung wird das so hergestellte
mit Tetrabromphenolblau besonders gute Ergebnisse 50 Indikatorpapier mit der proteinhaltigen Flüssigkeit
erzielt werden können. Als Puffer lassen sich die durch kurzes Eintauchen gesättigt und nach 15 bis
bekannten Puffersysteme verwenden. Die angewandte 60 Sekunden — um eine vollständige Farbentwicklung
Menge an Puffer hängt teilweise von der zu unter- zu gestatten — das Ausmaß des Farbumschlags besuchenden
Lösung ab. Für die Imprägnierung des stimmt. Eine quantitative Bestimmung wird ermöglicht
saugfähigen Trägers wird gewöhnlich eine Lösung 55 durch Vergleich der entstandenen Farbtönung auf dem
verwendet, die in bezug auf den Puffer zwischen 0,1- Reagenzpapier mit einer Reihe von Farbmustern, z.B.
und 2- bis 3 molar ist. Die Art des benutzten Puffers einer Skala, deren Farbproben verschiedenen bekannhängt
von der Art des benutzten Farbindikators ab. ten Proteinkonzentrationen entsprechen.
Wenn der Farbindikator gegenüber Proteinen inner- :
halb eines pH-Bereiches farbempfindlich ist, der 60 B e i s r> i e 1 1
durch einen basischen Puffer befriedigend aufrechterhalten werden kann, so können Borsäure-Natrium- 10 g Citronensäuremonohydrat und 800 g Natriumborat-Puffer verwendet werden. Wenn der verwendete citratdihydrat wurden in 100 ecm einer 0,04% igen wäß-Farbindikator bei einem niedrigeren bzw. sauren rigen Bromphenolblaulösung aufgelöst. Der UmschlagpH-Wert gegenüber dem Protein farbempfindlich ist, 65 bereich dieses Indikators liegt bei pH 3,0 bis 4,6. In kann ein saurer Puffer, z.B. Citronensäure-Natrium- diese Lösung mit pH-Wert 2,2 wurden Filtrierpapiercitrat- oder Weinsäure-Natriumtartrat-Puffer ver- streifen getaucht und an der Luft bei Raumtemperatur wendet werden. . getrocknet. Durch Auflösen verschiedener Mengen
Wenn der Farbindikator gegenüber Proteinen inner- :
halb eines pH-Bereiches farbempfindlich ist, der 60 B e i s r> i e 1 1
durch einen basischen Puffer befriedigend aufrechterhalten werden kann, so können Borsäure-Natrium- 10 g Citronensäuremonohydrat und 800 g Natriumborat-Puffer verwendet werden. Wenn der verwendete citratdihydrat wurden in 100 ecm einer 0,04% igen wäß-Farbindikator bei einem niedrigeren bzw. sauren rigen Bromphenolblaulösung aufgelöst. Der UmschlagpH-Wert gegenüber dem Protein farbempfindlich ist, 65 bereich dieses Indikators liegt bei pH 3,0 bis 4,6. In kann ein saurer Puffer, z.B. Citronensäure-Natrium- diese Lösung mit pH-Wert 2,2 wurden Filtrierpapiercitrat- oder Weinsäure-Natriumtartrat-Puffer ver- streifen getaucht und an der Luft bei Raumtemperatur wendet werden. . getrocknet. Durch Auflösen verschiedener Mengen
Rinderplasmaalbumin in normalen Urinproben wurde eine Reihe von Probelösungen hergestellt. Stücke des
wie oben hergestellten Reagenzpapiers wurden für einen Augenblick in die Ptobelösungen eingetaucht
und die nach 15 bis 20 Sekunden entstandenen Farbtönungen visuell bestimmt, wobei die nachstehend
aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden:
% Protein | Farbton des Papiers |
0 | Gelb |
0,05 | Grünlichgelb |
0,15 | Grün |
0,3 | Bläulichgrün |
0,6 | Grünlichblau |
2,5 | Blau |
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß das beschriebene Indikatorpapier sehr empfindlich
ist und genaue Angaben über das Vorliegen von Albumin in Urin liefert.
In den folgenden Beispielen werden Lösungen gezeigt, die zum Imprägnieren der Filtrierpapierstreifen
dienen.
Thymolblaulösung (0,04 %) (erster Umschlagsbereich pH 1,2 bis 2,8) 3 ecm
Sulfosalicylsäurelösung (41 g/100 ecm) 1 ecm
Kaliumcarbonatlösung (0,2 normal) 1 ecm
Die erhaltene Lösung zeigt einen pH-Wert von 2,3.
Thymolblaulösung(0,04 °/0) (zweiter Umschlagsbereich pH 8,0 bis 9,6) 1 ecm
7 g Borax und 7 g Waschsoda in 130 ecm
Wasser gelöst (pH-Wert 9,2) 1 ecm
Wasser gelöst (pH-Wert 9,2) 1 ecm
Bromphenolblaulösung (0,04 °/0) (Umschlagsbereich pH 3,0 bis 4,6) 6 ecm
Malonsäurelösung, enthaltend 1 g Malonsäure 6 ecm
3 n-Natriumhydroxydlösung wird zugesetzt, bis schwach orangerosa Farbe entsteht. Dann wpH-Einstellung«,
um einen pH-Wert von 2,lzu erhalten.
Bromkresolgrünlösung (0,1% in 30°/0igem
Alkohol) (Umschlagsbereich pH 3,8 bis
Alkohol) (Umschlagsbereich pH 3,8 bis
5,4) 10 ecm
Citronensäuremonohydrat 2,1 g
Natriumcitratdihydrat Ig
Wasser 16 ecm
Die erhaltene Lösung zeigte einen pH-Weit von 3,4.
Bromphenolblaulösung (0,05 %) (Umschlagsbereich pH 3,0 bis 4,6) 5 ecm
Weinsäurelösung (2molar) 9,8 ecm
Natriumtartratdihydratlösung (2molar).... 2,5 ecm
Diese Lösung mit pH-Wert von 2,3 wird vorzugsweise heiß auf das Papier aufgebracht, um eine
Kristallisation zu vermeiden.
Alizarinnatriumsulfonat (0,1%) (Umschlagsbereich pH 3,7 bis 5,2) 4 ecm
g Citronensäuremonohydrat und 8 g Na-
*5 triumcitratdihydrat in 500 ecm Wasser gelöst 3 ecm
*5 triumcitratdihydrat in 500 ecm Wasser gelöst 3 ecm
Natriumcitratlösung (lnormal) 6 ecm
Die erhaltene Lösung zeigte einen pH-Wert von 3,9.
Alizarinlösung (0,1% in Äthanol) (Umschlagsbereich pH 5,5 bis 6,8) 4 ecm
g Citronensäuremonohydrat und 8 g Natriumcitratdihydrat in 500 ecm Wasser gelöst 3 ecm
Natriumcitratlösung (lmolar) 16 ecm
Die erhaltene Lösung zeigte einen pH-Wert von
5,3.
Claims (3)
1. Trockene Indikatorzubereitung auf einem saugfähigen Träger zur Bestimmung von Protein
in Flüssigkeiten, die einen Farbindikator enthält, der mit Protein einen wahrnehmbaren Farbumschlag
zeigt, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einem auf den Farbindikator
abzustimmenden Puffer imprägniert ist, der bei Berührung mit der Untersuchungsflüssigkeit
nahezu konstant einen pH-Wert einstellt, der in einem engen pH-Bereich liegt, und zwar innerhalb
und dicht unterhalb des Umschlagsbereichs des Farbindikators, in dem der Farbindikator
normalerweise als pH-Indikator verwendet wird.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbindikator Bromphenolblau
oder Bromkresolgrün enthält.
3. Mittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als Puffer einen Citronensäure-Citrat-
oder einen Weinsäure-Tartrat-Puffer enthält.
In Betracht gezogene Druckschriften:
Microchemica Acta, II, 1937, S. 107 bis 110;
Analytica chimica Acta, 8, 1953, S. 310 und 315;
Microchemica Acta, II, 1937, S. 107 bis 110;
Analytica chimica Acta, 8, 1953, S. 310 und 315;
F. Cramer, »Papierchromatographie«, 1952,
S. 34;
S. 34;
W i 11 a r d und F u r m a η η, »Grundlagen der
qualitativen Analyse«, Wien, 1950, S. 104;
Holthoff, »Säure-Basen-Indikatoren«, 1932, S. 173, 174, 357, 376, 392;
Holthoff, »Säure-Basen-Indikatoren«, 1932, S. 173, 174, 357, 376, 392;
Ann. Med. Exptl. et Biol. Fenniae, Bd. 30, 1952,
S. 249 bis 253.
709 619/319 7. 67 Bundesdruckerei Berlin
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FR1235914A (fr) | 1960-11-10 |
GB814223A (en) | 1959-06-03 |
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