DE102004046326B4

DE102004046326B4 - Testvorrichtung zur schnellen Eiweißbestimmung in biologischen Flüssigkeiten

Info

Publication number: DE102004046326B4
Application number: DE102004046326A
Authority: DE
Inventors: Felix Levin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-07-15
Filing date: 2004-09-21
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2024-09-22
Also published as: DE102004046326A1

Abstract

Testvorrichtung zur schnellen Eiweißbestimmung in biologischen Flüssigkeiten mit einem durchsichtigen Gefäß (2) mit einer kleinen Öffnung (3), wobei sich in dem Gefäß ein Schwimmer (S) und eine Reagenzmischung (1) befinden, wobei die Reagenzmischung ein – ein Fällungsreagenz: 32,0–38,0 Gew.% – ein Polysaccharid: 1,4–3,3 Gew.% – ein wasserlösliches synthetisches Polymer: 0,6–1,7 Gew.% – einen Polyalkohol: 6,3–22,2 Gew.% – Wasser: 34,8–59,7 Gew.%

umfasst, und wobei
mit dem Gefäß eine Saugeinrichtung (4, 5) kombiniert ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Testvorrichtung zur schnellen Eiweißbestimmung in biologischen Flüssigkeiten, vorzugsweise im Urin, die gekennzeichnet ist durch ein durchsichtiges Gefäß mit einer kleinen Öffnung, wobei sich in dem Gefäß ein Schwimmer und eine neue Reagenzmischung befindet, und wobei das Gefäß mit einer Saugeinrichtung kombiniert ist. Der Schwimmer befindet sich bevorzugt auf dem Boden des Reagenzgefäßes und ist i.d.R. aus Kunststoff. Die neue Reagenzmischung umfasst ein Fällungsreagenz (32,0–38,0 Gew.%), ein Polysaccharid (1,4–3,3 Gew.%), ein wasserlösliches synthetisches Polymer (0,6–1,7 Gew.%), einen Polyalkohol (6,3–22,2 Gew.%) und Wasser (34,8–59,7 Gew.%). Sie ist bevorzugt halbflüssig und kann befestigt oder lose im Gefäß vorliegen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur schnellen Eiweißbestimmung in biologischen Flüssigkeiten, wobei die zu prüfende biologische Flüssigkeit durch die im Gefäß befindliche Öffnung in die Vorrichtung gesaugt wird. Das enthaltene Eiweiß reagiert mit dem Reagenzgemisch und die entstandene Trübung wird durch den auftauschenden Schwimmer durchgerührt und kann so nach 20–30 Sekunden direkt im Gefäß halbquantitativ unter Vergleich mit einer zuvor erstellten Fotoskala, oder mittels einer Standardskala oder quantitativ nephlometrisch bewertet werden. Die Trübung durch vorhandenes Eiweiß ist ohne wesentliche Veränderungen relativ lang anhaltend (ca. 2 Stunden) haltbar. Gleichzeitig kann in dieser Flüssigkeitsprobe ein eventuell vorliegender erhöhter Harnsäuregehalt bestimmt werden, wobei sich eine starke Trübung bildet, und nach ca. 60 Sekunden ein spezifischer Niederschlag auf dem Boden des Gefäßes entsteht.

Methoden zur Bestimmung von Proteinen (Gesamteiweiß) im Urin, im Serum und in anderen biologischen Flüssigkeiten sind zahlreich bekannt und diagnostisch relevant. Die Proteine können durch Fällungs- und Farbreaktionen nachgewiesen werden. Solche Methoden dienen dem Nachweis zahlreicher Krankheiten.

Der Nachweis einer Proteinurie (Eiweißausscheidung im Urin) dient vor allem zur Diagnose verschiedener Nierenerkrankungen.

Der Eiweißnachweis kann qualitativ und halbquantitativ mit Teststreifen erfolgen, die in der Regel ein Reagenz enthalten, das mit dem Eiweiß eine Farbreaktion bildet. Diese Teststreifen haben den Nachteil, dass sie durch Licht, Feuchtigkeit und hohe Temperaturen empfindlich und überständig sind. Außerdem sind sie ungenügend analytisch empfindlich. Weitere bekannte qualitative oder quantitative Methoden arbeiten z.B. unter Zugabe von Sulfosalicylsäure bzw. mit der Biuretreaktion, wonach ein Fällung mit Trichloressigsäure oder Perchlorsäure, ggf. unter Farbstoffzusätzen erfolgt. Weitere bekannte Fällungsreagentien sind neben Säuren u. a. auch Schwermetallsalze, Aceton, Alkohol, Ammoniumsalze und dergleichen.

Ein Testsystem zur Eiweißbestimmung im Urin ist in dem russischen Patent RU 2 077 060 C1 beschrieben. Dieses Testsystem, das zur Fällung des Eiweißes mit einem Reagenz, das ggf. mit einem in Wasser unlöslichen Bestandteil verbunden ist, eingesetzt wird, enthält ein Reagenz zur Eiweißfällung als ein dichtes, festes Granulat mit einem spezifischen Gewicht größer 1. Dieses bekannte Testsystem (Testgranulat) und seine Modifizierungen ( DE 100 30 193 A1 und DE 101 44 436 B4 ) haben jedoch sämtlich den Nachteil, dass die Testgranulate nicht dauerhaft haltbar sind, sie zu empfindlich gegenüber Nässe sind und deshalb beim Lagern oder Transportieren besonders bei feuchtem Wetter beschädigt und folglich unbrauchbar werden.

Bekannt ist auch ein Testkit zur schnellen Eiweißbestimmung ( DE 201 14 917 U1 ). 1 ml einer zu prüfenden Probe wird in ein Testreagenzglas mit Testformulierung gegossen und sofort ca. 5 Sekunden stark geschüttelt (um die Reagenzmischung zu lösen). Nach 40 Sekunden wird das erste Ergebnis anhand der entstandenen Trübung bestimmt. Nachteilig ist die unbequeme Prozedur der Analysendurchführung, denn man muss das Reagenzglas öffnen, dann mit der Pipette die Flüssigkeit, wie z.B. Urin hineingießen, das Reagenzglas verschließen, und danach Schütteln. Dabei muss das Röhrchen immer in der Hand gehalten werden.

Aus der DE 203 06 476 U1 ist auch eine Eintauchvorrichtung zur Eiweißbestimmung bekannt. Ein Gefäß mit einem Griff oder Henkel, wobei sich in dem Gefäß das Fällungsreagenz befindet, wird mit einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe in Kontakt gebracht. Eventuell vorliegendes Eiweiß im Urin bildet einen weißen Ring. Auch diese Vorrichtung ist nicht besonders bequem, weil durch das geöffnete Oberteil die Flüssigkeit herausfließen kann. Ein weiterer Nachteil dieser Testvorrichtung besteht darin, dass das Ergebnis erst nach 3 Minuten erhältlich ist. Das ist z. B. bei einer Urinanalyse in einem Notfall zu langsam. Außerdem ist dieser Test nur für eine visuelle halbquantitative Ergebnisbewertung verwendbar. Darüber hinaus ist das Analysenergebnis nicht lange haltbar.

Aufgabe der Erfindung war es, einen Eiweißtest bereitzustellen, der bequem, schnell und einfach durchführbar ist und mit einem minimalen Aufwand an Handarbeit auskommt. Der Eiweißtest sollte ein Analysenergebnis bereitstellen, das sowohl halbquantitativ (mit einer Foto- oder Standardskala), als auch quantitativ (nephelometrisch) ausgewertet werden kann und der ohne größeren technischen Aufwand und ohne Vorbereitungszeit einsetzbar ist.

Die Aufgabe der Erfindung wird mit einer Testvorrichtung zur schnellen Eiweißbestimmung in biologischen Flüssigkeiten gelöst, wobei sich in einem durchsichtigen Gefäß mit einer kleinen Öffnung ein Schwimmer und eine Reagenzmischung befinden und die Reagenzmischung ein Fällungsreagenz mit 32,0–38,0 Gew.%, ein Polysaccharid mit 1,4–3,3 Gew.%, ein wasserlösliches synthetisches Polymer mit 0,6–1,7 Gew.%, einen Polyalkohol mit 6,3–22,2 Gew.% und Wasser mit 34,8–59,7 Gew.% umfasst, und wobei mit dem Gefäß eine Saugeinrichtung kombiniert ist.

Das Gefäß ist in einer bevorzugten Ausführungsvariante ein zylindrisches Röhrchen aus Kunststoff mit einer Einhängvorrichtung, wie z.B. einem Henkel. Darüber hinaus sind weitere Formen, Materialien und Ausgestaltungen des Gefäßes einsetzbar. Als Saugeinrichtung dient bevorzugt ein Saugballon oder eine Pipette. Der Schwimmer ist bevorzugt aus Kunststoff und befindet sich i.d.R. lose auf dem Boden des Reagenzgefäßes.

In der EP 0 198 413 A2 , der WO 031027 222 A1 und der WO 02/42 175 A1 sind Testvorrichtungen beschrieben, die Reagenzien in einem Gefäß umfassen und mit einer Saugeinrichtung zum Ansaugen der Probe verbunden sind.

Die eingesetzte Reagenzmischung umfasst

– ein Fällungsreagenz:	32,0–38,0 Gew.%
– ein Polysaccharid:	1,4–3,3 Gew.%
– ein synthetisches Polymer:	0,6–1,7 Gew.%
– einen Polyalkohol:	6,3–22,2 Gew.% und
– Wasser:	34,8–59,7 Gew.%

Die Reagenzmischung liegt bevorzugt in halbflüssiger Form befestigt oder lose im Gefäß vor. Vorzugsweise kommt sie in elastischer Form, wie z.B. als Gel oder in dickflüssiger Form zum Einsatz. Aber auch andere Zustandsformen sind einsetzbar.
Das Gemisch ist im Gefäß bei 2 bis 35°C mindestens über einen Zeitraum von 2 Jahren lagerfähig.
Das verwendete Fällungsreagenz ist bevorzugt Sulfosalicylsäure, das Polysaccharid bevorzugt ein lösliches Dextran, als wasserlösliches synthetisches Polymer wird bevorzugt Polyvinylpyrrolidon eingesetzt und als Polyalkohol vorzugsweise ein Glycerin.
Das Verfahren zur schnellen Eiweißbestimmung unter Verwendung der beschriebenen Vorrichtung mit der angegeben Reagenzmischung wird so durchgeführt, dass eine biologische Flüssigkeit, vorzugsweise Urin, durch die sich im Gefäß befindliche Öffnung angesaugt wird. Dabei wird die eingesetzte Flüssigkeitsmenge so gewählt, dass sie sich unterhalb der im Gefäß befindlichen Öffnung befindet, so dass ein Herausfließen der Flüssigkeit vermieden werden kann. Das in der biologischen Flüssigkeit enthaltene Eiweiß reagiert mit der Reagenzmischung und die dadurch entstandene Trübung wird durch den auftauchenden Schwimmer durchgerührt und nach ca. 20–30 Sekunden direkt im Gefäß halbquantitativ unter Vergleich mit einer zuvor erstellten Fotoskala, oder mittels einer Standardskala oder quantitativ nephlometrisch bewertet.
Parallel kann mit der beschreibenen Vorrichtung mit der Reagenzmischung eine Harnsäurebestimmung in biologischen Flüssigkeiten, vorzugsweise in Urin erfolgen. Enthaltene Harnsäure in Konzentrationen > 700 mg/l reagiert ebenfalls mit dem Reagenzgemisch und nach 60 Sekunden entsteht auf dem Boden des Gefäßes ein Niederschlag.
Mit der Testvorrichtung kann man schnell und bequem insbesondere Urinuntersuchungen durchführen und einfach und schnell Mikroproteinurien nachweisen, wobei weder zusätzliche Transferpipetten, noch weitere Reagenzgläser, Stative u. a. Zubehörteile benötigt werden.
Der Eiweißtest ist einfach handhabbar, da die zu untersuchende Flüssigkeit, vorzugsweise Urin, nur durch einmaligen Druck und Entlastung automatisch angesaugt und analysiert werden kann. Das Verfahren ist damit so einfach wie das Messen der Körpertemperatur mit einem Thermometer. Dabei erlaubt der Test die Durchzuführung von mehr als 300 Analysen pro Stunde pro 1 Mitarbeiter (einschließlich quantitativer Bestimmungen) und ist so für Massenuntersuchungen geeignet. Die Trübung durch vorhandenes Eiweiß bleibt ohne wesentliche Veränderungen relativ lange (ca. 2 Stunden) stabil und kann in dieser Zeit bewertet werden.
Dieses einfach durchzuführende und kostengünstige Testsystem ist insbesondere zur in vitro Diagnostik in medizinischen Einrichtungen vor allem in Arztpraxen, für Notärzte und in kleinen Laboratorien einsetzbar und insbesondere zur Frühdiagnostik sowie zur Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen geeignet.
Anschließend wird die Testvorrichtung an Ausführungsbeispielen näher erläutet.
Bevorzugte Vorrichtungsvarianten sind den 1 und 2 zu entnehmen.
1 Testvorrichtung mit Gummi-Saugballon
2 Testvorrichtung mit Röhrchen als Saugballon und Henkel kombiniert als Saugballon aus Kunststoff (Plastik)

1: Reagenzmischung
2: Gefäß
3: Öffnung
4: Röhrchen zum Einhängen kombiniert als Saugballon
5: Saugballon
S: Schwimmer

Anwendungsbeispiele:
Beispiel 1
Untersuchungen mit wässrigen Eiweißlösungen (Herstellung von Trübungstandards)
Die verwendete Testformulierung hatte die folgende Zusammensetzung:

Sulfosalicylsäure 37 Gew.%

Dextran 3 Gew.%

Polyvinylpyrrolidon 1,5 Gew.%

Glycerin 20 Gew.%

Wasser 38,5 Gew.%
Es wurden eine Reihe von Lösungen mit menschlichem Albumin mit den Konzentrationen: 0, 20, 70, 200 und 500 mg/l vorbereitet. Alle Lösungen wurden mit der Testvorrichtung untersucht. Das Analysenergebnis – eine weiße Trübung – wurde direkt in der Testvorrichtung, die als Küvette diente, mit Hilfe des Nephelometers Densicheck gemessen.
Die durchschnittlichen Ergebnisse waren wie folgt:

Albuminkonzentration (mg/l) Optische Dichte

0,0 0,00–0,03

20 0,27

70 0,83

200 2,02

500 3,97
Die Kurve bis zum Eiweißgehalt von 200 mg/l zeigte genügend Linearität.
Anschließend wurden Trübungsstandards zur halbquantitativen Eiweißbestimmung hergestellt. Es wurde eine Reihe von Konzentrationen der stabilen Formazinsuspension, die visuell und nephelometrisch die gleiche optische Dichte (von einer Trübung) wie ein Reaktionprodukt zwischen Albumin und der Testreagenzmischung hat, vorbereitet. Diese Suspensionen wurden dann in ein bedecktes durchsichtiges (glasklares) Reagenzgefäß auf Plastikstreifen mit Konzentrationsdaten geklebt.
Beispiel 2
Untersuchungen mit Urinproben
Es wurden 12 Morgenurinproben von Diabetikern und 6 Proben von Gesunden mit der erfindungsgemäßen Testvorrichtung gemäß dem beschriebenen Verfahren und parallel mit Micraltest untersucht. Es wurden jeweils ca. 1 ml Urin in jede Vorrichtung gesaugt.
Ergebnisse:
Acht Proben von Diabetikern zeigten in 20–30 Sekunden nach dem Ansaugen des Urins im Sauggefäß eine deutliche Trübung. Nach dem Vergleich mit Trübungsstandards wurde gezeigt, dass drei Proben einen Eiweißgehalt zwischen 20 und 70 mg/l hatten, vier Proben – zwischen 70 und 200 mg/l und eine Probe mehr als 500 mg/l Eiweißgehalt.
Vier Urinproben von Diabetikern und alle Proben von Gesunden zeigten keine oder lediglich Spuren einer Trübung (d.h. weniger als 20 mg/l Eiweiß). Diese Ergebnisse wurden mit dem Mikraltest bestätigt.
Beispiel 3
Gleichzeitige Bestimmung von Gesamteiweiß und erhöhtem Harnsäuregehalt in einer Urinprobe
Es wurde 5 Modellproben aus gesundem Urin mit zugegebener Harnsäure mit Endkonzentrationen von 1000 mg/l (zweifach höher als der höchste Normalwert) vorbereitet. Diese Proben enthielten dabei menschliches Albumin mit den Konzentrationen (mg/l): 0, 20, 70, 200 und 500. Zwei Urinproben (Kontrolle) blieben ohne Zugaben. Alle Proben wurden mit erfindungsgemäßen Vorrichtungen gemäß dem beschriebenen Verfahren untersucht.
Ergebnis:
Alle Proben mit erhöhtem Harnsäuregehalt zeigten in ca. 20 Sekunden nach Ansaugen eine starke Trübung. Nach ca. 60 Sekunden vertikalem ruhigen Stehen bildete sich in der Probe ohne Albumin 0 und in den Proben mit 20 und 70 mg/l Albumingehalt ein deutlicher Niederschlag. Die 0-Probe zeigte eine fast klare nachstehende Flüssigkeit und entsprechende nachstehende Trübungen zeigten sich in den Proben mit 20 und 70 mg/l.
In der Probe mit 200 mg/l erschien der Niederschlag auch, aber nicht so deutlich. In der Probe mit 500 mg/l Albumin kann man wegen zu großer Eiweißtrübung einen erhöhten Harnsäuregehalt nicht bestimmen.
Die Kontrollprobe ohne Harnsäure und Eiweiß und eine Probe mit einem Harnsäuregehalt in Konzentrationen von weniger als 700 mg/l zeigten keine Trübung. Somit gibt es im Bereich von Mikroproteinurien eine Möglichkeit zur gleichzeitigen Bestimmung des Gesamteiweiß und einem erhöhten Harnsäuregehalt.

Claims

Testvorrichtung zur schnellen Eiweißbestimmung in biologischen Flüssigkeiten mit einem durchsichtigen Gefäß (2) mit einer kleinen Öffnung (3), wobei sich in dem Gefäß ein Schwimmer (S) und eine Reagenzmischung (1) befinden, wobei die Reagenzmischung ein – ein Fällungsreagenz: 32,0–38,0 Gew.% – ein Polysaccharid: 1,4–3,3 Gew.% – ein wasserlösliches synthetisches Polymer: 0,6–1,7 Gew.% – einen Polyalkohol: 6,3–22,2 Gew.% – Wasser: 34,8–59,7 Gew.%

umfasst, und wobei mit dem Gefäß eine Saugeinrichtung (4, 5) kombiniert ist.
Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Schwimmer (S) aus Kunststoff besteht und sich lose auf dem Boden des Gefäßes (2) befindet.
Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Saugeinrichtung (4, 5) ein Saugballon (5) aus Gummi ist oder aus Kunststoff als eingebaute Pipette verfertigt ist oder als zylindrisches Röhrchen (4) verfertigt ist, welches gleichzeitig eine Einhängevorrichtung umfasst.
Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die kleine Öffnung (3) in dem Gefäß (2) so angeordnet ist, dass sie höher liegt als der Stand der Flüssgkeit.
Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Fällungsreagenz Sulfosalicylsäure, das Polysaccharid ein lösliches Dextran, das synthetische Polymer Polyvinylpyrrolidon und der Polyalkohol ein Glycerin ist.
Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Reagenzmischung (1) in halbflüssiger Form befestigt oder lose vorliegt, vorzugsweise in elastischer oder dickflüssiger Form.
Verfahren zur schnellen Eiweißbestimmung in biologischen Flüssigkeiten, wobei die zu prüfende biologische Flüssigkeit durch eine in einem Gefäß befindliche Öffnung in eine Vorrichtung mit den Merkmalen eines der Ansprüche 1 bis 6 gesaugt wird, wobei das in der Flüssigkeit enthaltene Eiweiß mit dem Reagenzgemisch reagiert und die dadurch entstehende Trübung durch den auftauchenden Schwimmer durchmischt wird und wobei die Trübung nach 20–30 Sekunden direkt im Gefäß halbquantitativ unter Vergleich mit einer zuvor erstellten Fotoskala oder mittels einer Standardskala oder quantitativ nephlometrisch bewertet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei zusätzlich und parallel zur Eiweißbestimmung eine Harnsäurebestimmung in der biologischen Flüssigkeit durchgeführt wird, wobei die enthaltene Harnsäurekonzentration > 700 mg/l mit dem Reagenzgemisch reagiert und wobei nach 60 Sekunden auf dem Boden des Gefäßes ein Niederschlag entsteht.