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Die Erfindung betrifft ein Reagenzgemisch zur
Albuminbestimmung in biologischen Flüssigkeiten, vorzugsweise im
Urin, auf der Basis einer Antigen-Antikörper-Komplexbildung. Das Reagenzgemisch
ist insbesondere für
einen Schnelltest geeignet. Der Nachweis des Albumins erfolgt durch
direkte Auswertung des zwischen Albumin und Antikörper (monoklonal
oder polyklonal) gebildeten Komplexes anhand der entstehenden Trübung bzw.
anhand des Fällungsproduktes.
Das Reagenzgemisch umfasst neben an sich bekannten Antikörpern, Zusatzstoffen und
Puffern mindestens ein Polysaccharid, mindestens ein Disaccharid
und Borsäure.
Das Reagenzgemisch kann in einem bedeckten Reagenzgefäß bei 2 bis
8°C über einen
längeren
Zeitraum aufbewahrt werden.
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Der Nachweis von Albumin erfolgt
durch Fällungsreaktionen
(mit Neutralsalz, Alkohol, Äther;
als Kochprobe, Heller* Ringprobe u.a.), Farbproben (z.B. nach Millon,
als Biuret-, Ninhydrin- u. Xanthoprotein-Reaktion); im Liquor erfolgt
ein Nachweis i.d.R. quantitativ immunchemisch (radiale Immundiffusion;
Nephelo- u. Fluorometrie); ein semiquantitativer Nachweis kann im
Harn z.B. mittels Tetrabromphenolblau erfolgen.
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Methoden zur Bestimmung von Albumin
im Urin, im Serum und in anderen biologischen Flüssigkeiten sind demzufolge
zahlreich bekannt und diagnostisch relevant. Eine Methode ist z.B.
unter Verwendung von spezifischen Antikörpern die Bewertung eines gebildeten
Antigen-Antikörper-Komplexes mittels
automatisierter nephelometrischer Messung. Diese Methode arbeitet
nach dem Prinzip der Dispersion von Licht. Die automatischen Systeme
sind jedoch kompliziert und kostenintensiv und vor allem für einen
Einsatz zur Massenanalyse geeignet. Darüber hinaus sind sie nicht für einen
Schnelltest anwendbar. Nachteilig ist weiterhin, dass bekannte Reagenzmischungen
nicht ausreichend lange die Produktbildung (Trübung) für die nephelometrische Messung stabil
erhalten. Somit sind diese Systeme für Arztpraxen oder zur Eigenanwendung,
die vor allem einen Schnelltest benötigen, ungeeignet.
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Weiterhin sind Teststreifen zur Albuminbestimmung
bekannt, auf denen markierte Albuminantikörper (mit Farbstoffen oder
Peroxidase) konjugiert sind. Diese Teststreifen haben wiederum den
Nachteil, dass die Analysendurchführung unbequem und ungenau
ist, denn i.d.R. muss der Teststreifen im engen Bereich zwischen
zwei Linien genau 5 Sekunden in die Urinprobe gehalten werden, er
darf dabei die feuchte Wand des Gefäßes mit der Testzone nicht berühren.
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Weitere Nachteile sind:
- a) kurze Verfügbarkeit
des Analysenergebnisses (maximal 5 Minuten) und
- b) ein enger Konzentrationsbereich an Albumin für den die
Analyse nur erfolgreich ist (bis 100 mg/l), anderenfalls muss die
Urinprobe vielfach verdünnt
werden.
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Darüber hinaus können Teststreifen
durch ständige
Anwendung bei Zimmertemperatur aufgrund häufig geöffneter Gefäße feucht und deshalb ungültig werden
(auch bei Lagerung im Kühlschrank).
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Aufgabe der Erfindung war es deshalb,
ein Reagenzgemisch zur Albuminbestimmung zu finden, das stabil ist,
eine einfache Anwendung gestattet und insbesondere für Schnelltests
ohne großen
technischen Aufwand geeignet ist. Weiterhin soll das Analysenergebnis
für eine
gewisse Zeit stabil bleiben. Dabei soll das System die Bestimmung
eines breiten Konzentrationsbereiches von Albumin in biologischen
Flüssigkeiten
erlauben.
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Die Aufgabe wird durch die Bereitstellung
eines flüssigen
Reagenzgemisches, das neben an sich bekannten mono- oder polyklonalen
Antikörpern,
Zusatzstoffen und Puffern mindestens ein Polysaccharid, mindestens
ein Disaccharid und Borsäure
umfasst. Dieses Reagenzgemisch ist zur Albuminbestimmung in biologischen
Flüssigkeiten,
vorzugsweise im Urin, geeignet und gewährt die direkte Beobachtung
und Bewertung eines gebildeten Albumin-Antikörper-Komplexes anhand der entstandenen Trübung. Als
Polysaccharide werden bevorzugt Stärke, Glykogen oder Dextrane
eingesetzt, besonders bevorzugt wird ein lösliches Dextran eingesetzt.
Disaccharide sind bevorzugt Maltose, Lactose, Trehalose und Saccharose,
besonders bevorzugt wird Saccharose verwendet.
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Ein besonders bevorzugtes Reagenzgemisch
ist durch die folgende Zusammensetzung gekennzeichnet: monoklonaler
oder polyklonaler Antikörper,
Natriumchlorid, Natriumazid, Dextran 64.000-76.000, Saccharose,
Borsäure
und Wasser.
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Die einzelnen Substanzen liegen mit
folgenden bevorzugten Gew.% in der Reagenzlösung vor.
| Antikörper (mAk
0,02-0,03; pAk 0,04-0,05) | 0,02–0,05
Gew.% |
| NaCl | 0,5–0,7
Gew.% |
| NaN3 | 0,1–0,15
Gew.% |
| Polysaccharid | 6,5–9,5
Gew.% |
| Disaccharid | 2,0–5,0
Gew.% |
| Borsäure | 0,12–0,4
Gew.% |
| Wasser | 84,2–90,76 Gew.% |
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Dieses Reagenzgemisch (normalerweise werden
ca. 40 bis 300 μl
für eine
Probe benötigt)
wird in einem durchsichtigen Reagenzgefäß aufbewahrt, welches vorzugsweise
aus Polystyrol ist. Es kann bei 2 bis 8°C aufbewahrt werden. Eventuell
vorhandene Feuchtigkeit bei der Lagerung beeinflusst das Analyseergebnis
nicht.
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Bei Kontakt mit einer albuminhaltigen
Flüssigkeit
entsteht innerhalb kurzer Zeit (nach ca. 30 Sekunden bis 2 Minuten)
ein Albumin-Antikörper-Komplex
und die Lösung
wird trübe.
Dieser Komplex ist stabil über
einen relativ langen Zeitraum von ca. 2–4 Stunden, so dass das Analysenergebnis
auch zu einem späteren
Zeitpunkt ausgewertet werden kann. Der Test ist bevorzugt bei Vorhandensein
einer Albuminkonzentration ab 20 mg/l Albumin in der biologischen
Flüssigkeit
einsetzbar.
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Die Albuminbestimmung erfolgt nach
an sich bekannten Methoden, vorzugsweise visuell oder nephelometrisch.
Man unterscheidet zwischen der Messung der durchgehenden Lichtstrahlung
(Durchlichtschwächung,
Transmissionsmessung) oder der Messung der im 90° Winkel gestreuten Strahlung (nephelometrische
Messung). Das primäre
Standardmaterial für
die Kalibrierung einer Trübungsmessung,
sowohl im Durchlichtverfahren als auch im nephelometrischen Verfahren
ist in der Regel eine wässrige
Standardsuspension von Formazin. Die Trübungsstandards (Formazinsuspensionen)
werden dabei so eingestellt, dass sie den Messbereich der Tests
abdecken.
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Die Albuminbestimmung unter Anwendung der
Reagenzmischung erfolgt wie folgt:
- a) Es wird
ein so genannter qualitativer Vortest durchgeführt, um festzustellen ob Albumin
in der zu prüfenden
Flüssigkeit
(z. B. im Urin) vorhanden ist. Dazu werden ca. 20 bis 150 μl der zu
untersuchenden Flüssigkeit
vorsichtig in die Reagenzgemischlösung gegossen. Entsteht nach
ca. 30 Sekunden ein Trübungsring,
kann davon ausgegangen werden, dass Albumin in einer Konzentration ≥ 20 mg/l vorhanden
ist. Niedrige Albuminkonzentrationen (z.B. zwischen 20 und 60 mg/l)
zeigen dabei einen wesentlich schmaleren Trübungsring (aufgrund ihrer geringeren
optischen Dichte) als eine Probe mit einem höheren Albumingehalt von ≥ 200 mg/l.
- b) Zur halbquantitativen Albuminbestimmung wird die biologische
Flüssigkeit
10-fach verdünnt,
die Analyse wird unter kurzem Schütteln (ca. 3 Sekunden) der
Probe in der Reagenzgemischlösung wiederholt.
Die Bewertung der entstandenen Trübung erfolgt dann halbquantitativ
unter Anwendung eines Trübungsstandards.
Es handelt sich z.B. um stabile Formazinsuspensionen in abgedeckten
durchsichtigen Reagenzgefäßen, die
visuell und nephelometrisch eine ca. gleiche optische Dichte besitzen,
und mit dem gebildeten Albumin-Antikörper-Komplex in den Albuminkonzentrationen:
0 20 60 200 bis 500 mg/l abgeglichen werden können.
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Das vorliegende Reagenzgemisch zur
Albuminbestimmung ist spezifisch und hochempfindlich. Es ist hervorragend
für einen
Schnelltest einsetzbar, insbesondere ist das Gemisch zur in vitro
Diagnostik in medizinischen (z.B. Notarztdienst) sowie tierärztlichen
Einrichtungen und Laboratorien einsetzbar und in erster Linie zur
Frühdiagnostik
bei Nierenerkrankungen, Diabetes, sowie Hypertonie geeignet. Dabei erlaubt
das Reagenzgemisch die Anwendung zusammen mit anderen Eiweißtests,
zur Unterscheidung einer Albuminurie von anderen Proteinurien und
ist somit auch zur Differentialdiagnostik von einigen Krankheiten
anwendbar.
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Anschließend wird die Erfindung an
Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
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Beispiel 1
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Es wird ein Reagenzgemisch mit folgender Zusammensetzung
eingesetzt:
| mAk | 0,02 Gew.% |
| NaCl | 0,5 Gew.% |
| NaN3 | 0,1 Gew.% |
| Dextran | 8,5 Gew.% |
| Saccharose | 3,0 Gew. % |
| Borsäure | 0,2 Gew.% |
| Wasser | 87,68 Gew.% |
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1) Untersuchung wässriger
Albuminlösungen
in vorgegebenen Konzentrationen mit obigem Reagenzgemisch
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100 μl Reagenzgemisch wurden in einem Gefäß vorgelegt.
Es wurden Vortests durchgeführt, wobei
50 ml Albuminlösungen
untersucht wurden, die Konzentrationen in Höhe von 0, 20, 60, 200, 500, 2500
und 5000 mg/l Albumin aufwiesen. Anschließend wurden in einer zweiten
Analyse verdünnte Proben
halbquantitativ mit Trübungsstandards
bewertet.
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Ergebnisse:
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Alle Proben mit Albuminlösungen (von
20 bis 5000 mg/l) zeigten bereits 30 Sekunden nach ihrer vorsichtigen Überführung in
das Reagenzgemisch einen weißen
Trübungsring.
D. h. das vorhandene Albumin konnte in allen diesen Proben mit einer
Konzentration ab 20 mg/l bestätigt
werden. Probe 0 blieb klar. Die Proben mit Albuminkonzentrationen
von 20 und 60 mg/l zeigten einen wesentlich schmaleren Trübungsring
(niedrige optische Dichte) als die Proben mit einem Albumingehalt
ab 200 mg/l.
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Anschließend wurden die Proben mit
den Konzentrationen 20 und 60 mg/l kurz geschüttet (ca. drei Sekunden), die
anderen Proben (200 bis 5000 mg/l) wurden 10-fach verdünnt, wieder
analysiert und geschüttelt.
Danach wurden die homogenen Trübungen
von allen Proben mit Trübungsstandards
bewertet, wobei die entsprechenden Werte von Albuminkonzentrationen
(ab 200 mg/l 10-fach
vermehrt) bestätigt
werden konnten.
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2) Untersuchungen von
Urinproben
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Es wurden 7 Morgenurinproben von
Diabetikern und 10 Proben von Gesunden mit dem Reagenzgemisch wie
oben beschrieben und parallel mittels Micraltest untersucht.
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Ergebnisse:
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Mit dem Vortest wurde gezeigt, dass
alle Proben von Diabetikern 30 Sekunden nach dem Zugeben einen Trübungsring
aufwiesen. D. h. in allen diesen Proben war Albumin mit einer Konzentration
ab 20 mg/l vorhanden. Drei Proben zeigten Konzentrationen ab 200
mg/l und wurden deshalb verdünnt
und erneut analysiert.
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Der Vergleich mit Trübungsstandards
ergab, dass zwei Proben Albumin in einer Konzentration von ca. 20
mg/l enthielten, zwei Proben wiesen Konzentrationen zwischen 20
und 60 mg/l auf, zwei Proben Konzentrationen zwischen 200 und 600
mg/l und eine Probe zwischen 600 und 2000 mg/l. Die Proben wurden
zusätzlich
durch einen Micraltest bewertet, welcher die Werte der Albuminkonzentrationen
bestätigte.
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Sechs Proben von Gesunden zeigten
auch eine schwache Trübung,
jedoch wiesen alle 10 Proben die gleichen Ergebnisse auf bzw. enthielten
weniger als 20 mg/l Albumin.
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Beispiel 2
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Unter Verwendung polyklonaler Antikörper wurden
Untersuchungen von Urinproben mit folgendem Reagenzgemisch durchgeführt.
| Polyklonaler
Antikörper | 0,04 Gew.% |
| NaCl | 0,6 Gew.% |
| NaN3 | 0,1 Gew.% |
| Dextran | 8,5 Gew.% |
| Saccharose | 3,0 Gew.% |
| Borsäure | 0,2 Gew.% |
| Wasser | 87,56 Gew.% |
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Es wurden analog zu Beispiel 1/2)
7 Urinproben von Diabetikern und 10 Proben von Gesunden untersucht.
Die Probe enthielt 80 μl
des Reagenzgemisches in einem Reagenzgefäß, in das 50 μl der zu prüfenden Urinlösung zugegeben
wurden.
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Das Ergebnis war analog wie im Beispiel
1 (mit monoklonalem Antikörper).