DE102004038726A1 - Testsystem und Verfahren zur schnellen Bestimmung von Bence Jones Protein in biologischen Flüssigkeiten - Google Patents

Testsystem und Verfahren zur schnellen Bestimmung von Bence Jones Protein in biologischen Flüssigkeiten Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein universell einsetzbares Testsystem und Verfahren zur schnellen Bestimmung von Bence Jones Protein (BJP) in biologischen Flüssigkeiten, vorzugsweise im Urin und Blutplasma, unter Verwendung von monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörpern gegen das Protein (kappa und lambda freie leichte Ketten). Ein sich zwischen BJP und monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörpern bildender Präzipitäts-Komplex wird direkt beobachtet und bewertet. Das erfindungsgemäße Testsystem umfasst eine Reagenzmischung, die neben an sich bekannten Antikörpern, Zusatzstoffen und Puffern mindestens ein Polysaccharid, ein Disaccharid, ein Monosaccharid und ein synthetisches wasserlösliches Polymer aufweist. Die Reagenzmischung wird bevorzugt auf dem Boden eines durchsichtigen Reagenzgefäßes deponiert, das zylindrisch oder konisch ist und dessen Höhe größer als der durchschnittliche Durchmesser ist, und kommt so als bevorzugtes Testsystem zur Anwendung. Das Verfahren zum schnellen Nachweis von BJP erfolgt, indem eine zu prüfende Probe, die gegebenenfalls BJP enhält, vorsichtig, vorzugsweise nach unten in das Gefäß hineingegeben wird, wobei sich beim dynamischen Kontakt der Flüssigkeit, die die Reagenzmischung durchströmt, ein Komplex zwischen Antikörpern und BJP in der flüssigen Reagenzsäule bildet, welcher eine spezifische ringartige Form in der Flüssigkeit zeigt. Da das BJP in der biologischen Flüssigkeit in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen kann, entsteht der ...

Description

  • Die Erfindung betrifft ein universell einsetzbares Testsystem und Verfahren zur schnellen Bestimmung von Bence Jones Protein (BJP) in biologischen Flüssigkeiten, vorzugsweise im Urin und Blutplasma unter Verwendung von monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörpern gegen das Protein (kappa und lambda freie leichte Ketten). Ein sich zwischen BJP und monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörpern bildender Präzipitäts-Komplex wird direkt beobachtet und bewertet. Das erfindungsgemäße Testsystem umfasst eine Reagenzmischung, die neben an sich bekannten Antikörpern, Zusatzstoffen und Puffern mindestens ein Polysaccharid, ein Disaccharid, ein Monosaccharid und ein synthetisches wasserlösliches Polymer aufweist. Die Reagenzmischung wird bevorzugt auf dem Boden eines durchsichtigen Reagenzgefäßes deponiert, das zylindrisch oder konisch ist und dessen Höhe größer als der durchschnittliche Durchmesser ist und kommt so als bevorzugtes Testsystem zur Anwendung. Das Verfahren zum schnellen Nachweis von BJP erfolgt, indem eine zu prüfende Probe, die gegebenenfalls BJP enthält, vorsichtig, vorzugsweise nach unten in das Gefäß hineingegeben wird, wobei sich beim dynamischen Kontakt der Flüssigkeit, die die Reagenzmischung durchströmt, ein Komplex zwischen Antikörpern und BJP in der flüssigen Reagenzsäule bildet, welcher eine spezifische ringartige Form in der Flüssigkeit zeigt. Da das BJP in der biologischen Flüssigkeit in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen kann, entsteht der sich bildende Ringkomplex mit unterschiedlicher Geschwindigkeit in bestimmten Konzentrationsbereichen in jeweiliger spezifischer Art an optischer Dichte und Breite. Der entstandene Ring besetzt in Abhängigkeit der Konzentration besondere Positionen in der Flüssigkeitssäule. Für eine halbquantitative Bewertung sind Konzentrationsbereiche an nachzuweisendem BJP (kappa und/oder lambda) mit Hilfe einer zuvor erstellten Fotoskala zuordenbar.
  • Im Allgemeinen bestehen Immunglobuline aus Paaren von Polypeptidketten unterschiedlicher Kettenlänge, die über verschiedene Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. In jedem Immunglobulinmolekül gibt es ein Paar schwerer Ketten, die entweder vom γ-, α-, μ-, δ- oder ε-Typ sein können, und ein Paar leichter Ketten vom κ- oder λ-Typ. Bei manchen Erkrankungen wie dem multiplen Myelom kommt es zur Proliferation Antikörper-produzierender Plasmazellen mit einer Überproduktion von Leichtketten einer bestimmten Art. Diese freien monoklonalen Leichtketten sind im Urin und Plasma nachweisbar. Sie wurden erstmals 1847 von Henry Bence-Jones isoliert und werden daher als Bence-Jones-Proteine (BJP) bezeichnet. Klassisches Beispiel für eine "Overflow"-Proteinurie ist die Bence-Jones-Proteinune, bei der erhöhte Konzentrationen niedermolekularer Proteine durch die Glomeruli filtriert werden und infolgedessen die tubuläre Reabsorptionskapazität in der Niere überschritten wird. BJP ist obligat erhöht bei Leichtkettenkrankheit (ca. 5% aller Myelome), wird aber gelegentlich auch bei anderen Gammopathien beobachtet. Entscheidend ist, dass eine Spezies von Leichtketten , kappa oder lambda (kappa etwas häufiger als lambda) stark vermehrt ist (der Quotient kappa/lambda < 1.0 oder > 5.2), da ein Gemisch von Leichtketten auch vom Gesunden mit dem Harn ausgeschieden wird. Die quantitative Bestimmung der Bence-Jones-Proteine und der Nachweis, dass es sich tatsächlich um monoklonale Immunglobuline handelt, unterstützen die Diagnostik bei multiplem Myelom (maligne Vermehrung der Plasmazellen), Makroglobulinämie Waldenström (vermehrte Produktion großer Immunglobuline durch Milz- und Knochenmarkzellen), Leukämie (Krebserkrankung der blutbildenden Organe) sowie beim Lymphom (Krebserkrankung des lymphatischen Gewebes). Bence-Jones-Proteine lassen sich normalerweise durch Urinprotein-Elektrophorese nachweisen. Ob die BJP aufkonzentriert werden müssen, hängt von der Sensitivität der Proteinfärbung sowie der Gesamtproteinkonzentration ab. Im Anschluss an die Elektrophorese, die das Vorliegen von Proteinbanden nachweist, erfolgt die Typisierung der Leichtketten der Paraproteine mittels Immunfixationselektrophorese.
  • Bei der Immunfixationselektrophorese (IFE) handelt es sich um einen zweistufigen Prozess, bei dem die Agarose-Gelelektrophorese (UPE oder SPE) mit der Immunpräzipitation kombiniert wird. Proteine werden elektrophoretisch in mehreren Spuren auf einem Gel getrennt. Jede Spur wird mit Antiseren getränkt, die für einzelne Klassen von Molekülen spezifisch sind. Bei Vorhandensein spezifischer Klassen von Leichtketten bilden sich mit den Antiseren unlösliche Komplexe, die man anschließend anfärben und auf diese Weise nachweisen kann. Auch liegen verschiedene Varianten von immunoelektro-phoretischen Verfahren zum Nachweis des BJP im Serum und im Urin (nach der Konzentrierung der Urinprobe) vor. Diese analytischen Systeme sind jedoch zu kompliziert und die Analysendurchführung dauert dabei einige Stunden.
  • AR Bradwell et al. (Clin Chem 47:6 supplement: 2001, pA43 No:142) stellen einen Assay für freie leichte Ketten im Serum vor, welcher die Bildung eines trübungsartigen Komplexes zwischen Antikörpern gegen freie leichte Ketten des BJP, die mit Latex konjugiert wurden, und entsprechendem BJP beschreibt. Anwendung findet eine nephelometrische Messung des Komplexes, die automatische Laborgeräte benutzt. Dieser Assay ist jedoch kompliziert und kostenintensiv und vor allem für einen Einsatz zur Massenanalyse in großen Labors oder Krankenhäusern geeignet. Zum Schnelltest ist er nicht geeignet, denn die visuelle Bestimmung der optische Dichte des trübungsartigen Ergebnisses ist zu schwierig. Somit ist dieses System als Schnelltest für Arztpraxen oder zur Eigenanwendung ungeeignet.
    •
  • Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein einfaches Testsystem und Verfahren zur schnellen Bestimmung von BJP in unterschiedlichen biologischen Flüssigkeiten zu finden und so bereitzustellen, dass es ohne größeren technischen Aufwand eine schnelle und bequeme Analysendurchführung gestattet, deren Ergebnis auch noch später bewertbar ist. Dabei soll das System zur Simultanbestimmung von kappa und lambda freie leichte Ketten geeignet sein und einfach durchführbar.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein universell einsetzbares Testsystem und Verfahren gelöst, das zur schnellen Bestimmung von BJP (kappa und/oder lambda freie leichte Ketten) in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere im Urin und Blutplasma geeignet ist und ein Reagenzgemisch umfasst, welches die direkte Beobachtung und Bewertung eines Präzipitäts-Komplexes gestattet, der sich zwischen BJP und entsprechenden monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörpern gegen kappa und/oder lambda freie leichte Ketten bildet. Das Reagenzgemisch umfasst neben an sich bekannten Antikörpern, Zusatzstoffen und Puffern mindestens ein Polysaccharid, ein Disaccharid, ein Monosaccharid und ein synthetisches wasserlösliches Polymer.
  • Die Reagenzmischung (mit den entsprechenden Antikörpern gegen BJP) wird bevorzugt auf dem Boden eines durchsichtigen Reagenzgefäßes deponiert, das zylindrisch oder konisch ist und dessen Höhe größer als der durchschnittliche Durchmesser ist und bildet so ein bevorzugtes Testsystem zum Nachweis von BJP. Das Reagenzgemisch kann in dem Reagenzgefäß bevorzugt bei 2 bis 8° C über einen langen Zeitraum (bis zu 12 Monaten) aufbewahrt werden. Das Nachweisverfahren erfolgt, indem eine Flüssigkeitsprobe vorsichtig in die sich im Gefäß befindliche Reagenzmischung hineingegeben wird, vorzugsweise mit einer Autopippette oder es wird ggf. hineingegossen. Die Mengen an Reagenzgemisch und zugegebener Flüssigkeit sind jeweils identisch. Beim dynamischen Kontakt der Flüssigkeit mit der Reagenzmischung wird diese gelöst und es entsteht zwischen anwesendem BJP und den jeweiligen Antikörpern ein Präzipitäts-Komplex in der flüssigen Reagenzsäule, der eine spezifische ringartige Form bildet.
  • Da das BJP in der biologischen Flüssigkeit in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen kann, entsteht der sich bildende Ringkomplex mit unterschiedlicher Geschwindigkeit in bestimmten Konzentrationsbereichen in jeweiliger spezifischer Art an optischer Dichte und Breite. Der entstandene Ring besetzt in Abhängigkeit der Konzentration besondere Positionen in der Flüssigkeitssäule. Für eine halbquantitative Bewertung sind Konzentrationsbereiche an nachzuweisendem BJP (kappa und/oder lambda) mit Hilfe einer zuvor erstellten Fotoskala zuordenbar. Die Reagenzmischung kann mehr als einen Antikörper enthalten. Die in der Reagenzmischung befindlichen Antikörper können Marker aufweisen, so können sie z.B. mit Farbstoffen, Latexteilchen, Enzymen und anderen Markern konjugiert sein.
  • Das Reagenzgemisch wird bevorzugt in einem bedeckten durchsichtigen (glasklaren) Reagenzgefäß aufbewahrt und eingesetzt. Dieses besitzt bevorzugt zylindrische oder konische Form und ist höher als der durchschnittliche Durchmesser. Das Nachweisverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass eine zu untersuchende Flüssigkeit (vorzugsweise Urin oder Blutplasma) vorsichtig in das Gefäß gegeben wird. Falls BJP in der biologischen Flüssigkeit vorhanden ist, entsteht in der Flüssigkeitssäule schnell ein Ringkomplex (nach ca. 1 bis 3 Minuten), der ca. 3 Stunden ohne wesentliche Veränderung bestehen bleibt und in diesem Zeitraum eindeutig bewertet werden kann (1-3).
  • In einer bevorzugten Ausführungsvariante enthält das Testsystem ein Reagenzgemisch mit den jeweiligen monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörpern gegen BJP, weiterhin Natriumchlorid, Natriumazid, ein Polysaccharid, ein Disaccharid, ein Monosaccharid, ein synthetisches wasserlösliches Polymer und Wasser. Eine halbquantitative Bewertung des Analysenergebnisses wird durch den Vergleich mit einer zuvor erstellten Fotoskala durchgeführt.
  • Gemäß der Erfindung enthält das Reagenzgemisch die Reagentien mit folgenden Gew.%
    mono-(poly)-klonale Antikörper gegen kappa und/oder lambda 0,02 – 0,06 Gew.%
    NaCl 0,6 – 0,9 Gew.%
    NaN3 0,1 – 0,14 Gew.%
    Polysaccharid 6,0 – 12,0 Gew.%
    Disaccharid 2,0 – 8,0 Gew.%
    Monosaccharid 0,5 – 3,0 Gew.%
    synthetisches wasserlösliches Polymer 0,15 – 0,6 Gew.%
    Wasser 67,74 – 90,63 Gew.%
  • Als Polisaccharid ist bevorzugt ein lösliches Dextran enthalten.
  • Als Disaccharid wird bevorzugt eine Saccharose verwendet.
  • Das Monosacchand ist ausgewählt aus Mannose, Galaktose und Glukose, bevorzugt Glukose.
  • Das synthetische wasserlösliche Polymer ist ausgewählt aus Fikoll, PEG und Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylpyrrolidon ist bevorzugt.
  • Dieser spezifische, hochempfindliche, kostengünstige Testsystem ist zum einfach durchführbaren Schnelltest, insbesondere zur in vitro Diagnostik in medizinischen Einrichtungen vor allem in Arztpraxen und kleinen Laboratorien einsetzbar und in erste Linie zur Diagnostik und Verlaufskontrolle bei multiplem Myelom, Amielloidose sowie bei einigen Arten von Leukämien geeignet. Weiterhin erlaubt der Test bei gleichzeitiger Anwendung mit anderen Eiweißtests die Unterscheidung von Bence-Jones-Proteiniurie von anderen Proteinurien und dient somit zur Differentialdiagnostik einiger Krankheiten.
  • Prinzip des Testverfahrens:
  • Eine biologische Flüssigkeit definierter Menge (vorzugsweise 25 – 100 mkl) wird in ein Reagenzgefäß, welches das Reagenzgemisch in gleicher Menge bereits enthält, hineingegeben, dann ca. 1 – 3 Minuten beobachtet (nicht schütteln) und anhand der Art und Position des entstehenden Ringkomplexes in der Flüssigkeitssäule bewertet. Als erstes wird das Ergebnis qualitativ im Bereich 15 – 5.000 mg/l bestimmt.
  • Wenn ein weißer Ring in der Flüssigkeitsprobe entsteht – liegt BJP (entsprechende freie leichte Ketten) ab 15 mg/l in dieser Probe vor. Entsteht dieser Ring im oberen Halbteil der Flüssigkeissäule, liegt der BJP Gehalt im Bereich von 15 – 150 mg/l. Befindet sich dieser Ring im unteren Halbteil – ist der BJP Gehalt hoch und liegt über 150 mg/l. In diesem Fall wird die zu prüfende Flüssigkeit 10-fach mit 0,9%iger NaCl verdünnt und die Analyse wird (wie oben geschrieben) wiederholt. Das Analysenergebnis (der Ringkomplex) bleibt ca. 3 Stunden ohne wesentliche Veränderung bestehen und ist somit in diesem Zeitraum auswertbar.
  • Eine halbquantitative Bestimmung kann im Bereich von 15 – 150 mg/l, indem man das Ergebnis mit einer zuvor erstellten Fotoskala vergleicht.
  • Die Fotoskala zur Bestimmung von BJP (freie leichte Ketten kappa oder lambda) im Urin wurde wie folgt hergestellt:
    In eine Reihe durchsichtiger (glasklarer) Reagenzgefäße wurde mit einer definierten Menge (50 mkl) einer Antikörperreagenzmischung die gleiche Menge der Lösung mit freie leichte Ketten Kappa oder Lambda mit den folgenden Konzentrationen eingebracht: 0 15 50 150 300 und 5.000 mg/l.
  • Es wurde zuerst gezeigt, dass ein Ringkomplex mit Konzentrationen von kappa (oder lambda) ab 300 bis 5.000 mg/l eine niedrigere Position in der Flüssigsäule besetzt mit fast gleichem (identischem) Fotobild für diesen Bereich.
  • Der entstandene ringartige Komplex von Antigen-Antikörper wurden mittels Digitalkamera „Rigon-4" fotografiert und auch schematisch vorgestellt (1- 3). Untersuchungen mit einigen Lösungen mit Lambda zeigten gleiche Ergebnisse, so dass diese Fotoskala zur Bestimmung von beiden – kappa und lambda – gilt.
    •
  • Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne dass sie darauf beschränkt werden soll.
  • In den 1 bis 3 sind Anwendungsmöglichkeiten des bevorzugten Testsystems dargestellt.
  • 1 Reagenzgefäß mit Antikörperreagenzmischung
  • 2 Eintragung einer Probe unter eine Reangenzmischung
  • 3 Schema der Fotoskala zur qualitativen und halbquantitativen Bestimmmung des BJP (kappa oder lambda freie leichte Ketten in mg/l
    helle Streifen = ringartiger Antigen-Antikörper Komplex
    • 1
    Antikörperreagenzmischung
    2
    Deckel
    3
    Pipettenspitze mit zu prüfender Flüssigkeit
  • Beispiel 1
  • Untersuchung von Urinproben von Patienten mit Bence Jones Proteinurien (freie leichte Ketten- kappa)
  • Herstellung der Fotoskala:
  • In eine Reihe durchsichtiger Reagenzgefäße mit definierter Menge (50 mkl) Antikörperreagenzmischung wurden gleiche Mengen der Lösung einer BJP-Lösung (in 0,9% NaCl) mit Konzentrationen (mg/l): 0 15 50 150 300 1.000 und 5.000 eingebracht. Der entstehende ringartige Komplex von Antigen-Antikörper wurde beobachtet und visuell bewertet, anschließend mit einer Digitalkamera „Rigon-4" fotografiert und schematisch dargestellt (1 – 3).
  • Die bevorzugte Reagenzmischung hat folgende Zusammensetzung:
    Polyklonaler Kappa-Antikörper 0,03 Gew.%
    NaCl 0,8 Gew.%
    NaN3 0,12 Gew.%
    Dextran 7,5 Gew.%
    Saccharose 3,5 Gew.%
    Glucose 1,2 Gew.%
    Polyvinylpyrollidon 0,2 Gew.%
    Wasser 86,65 Gew.%
  • 1) Untersuchung mit ungefärbtem Antikörper
  • Es wurden 21 Urinproben von 7 Patienten mit o.g. Proteinurien und 12 Urinproben von gesunden Personen untersucht und mit dem o.g. Reagenzgemisch getestet. Die Reagenzgefäße enthielten 50 mkl Reagenzmischung mit Kappaantikörper, 50 mkl einer Urinprobe wurde entsprechend zur Analysendurchführung zugegeben. Vor der erfindungsgemäßen Analyse waren die Urinproben im Labor mittels Standardmethoden (Immunofixation u.a.) untersucht worden.
  • Ergebnisse:
  • Alle 21 Urinproben zeigten typische ringartige Komplexe, das bedeutet in diesen Proben liegen Kappa freie leichte Ketten ab 15 mg/l vor. In 15 Proben befand sich der Ringkomplex im oberen Halbteil der Flüssigkeitssäule. Dieser wurde so (ohne Verdünnung) mit einer Fotoskala bestimmt. Der Kappagehalt für 6 von diesen Proben lag zwischen 15 und 50 mg/l, und für 9 Proben zwischen 50 und 150 mg/l. Die anderen 6 Proben (mit niedrigerer Position des Ringkomplexes) wurden 10-fach mit 0,9% NaCl verdünnt. Die verdünnten Proben wurden nach der zweiten Analyse mit der Fotoskala bewertet. Dabei zeigte sich, dass 5 Proben zwischen 150 und 500 mg/l Kappagehalt hatten und 1 Probe (Analyse nach der zweiten Verdünnung durchgeführt) zwischen 1.500 und 5.000 mg/l. Diese Daten waren mit den vorher durchgeführten Laboruntersuchungen in Übereinstimmung. Proben von gesunden Personen zeigten keinen Ringkomplex.
  • 2) Untersuchung mit fluoreszenz-konjugierten Antikörpern gegen leichte Ketten
  • Es wurden wie unter 1) polyklonaler Kaninchen anti-human Kappa leichte Ketten Antikörper, FITC konjugiert, angewandt. Dabei wurde die Konzentration der Antikörper so ausgewählt, dass die Reagenzmischung nur eine schwache Fluoreszenz zeigte. Es wurden 4 Urinproben mit Kappa leichte Ketten (von 138 bis 2.670 mg/l) untersucht.
  • Ergebnisse:
  • Bei der Fluoreszenzuntersuchung wurde beobachtet, dass in einer Urinprobe mit dem Kappagehalt der Ringkomplex eine spezifische FITC-Fluoreszenz zeigt. Die Intensität der Fluoreszenz hängt von der Kappa-Konzentration ab, und ist höher als die Fluoreszent der nebenliegenden Flüssigkeit.
  • Beispiel 2
  • Untersuchung von Urinproben von Patienten mit Bence Jones Proteinurie (freie leichte Ketten- lambda)
  • Es wurden 15 Urinprpoben von 5 Patienten mit o.g. Proteinurien untersucht. Die Reagenzgefäße enthielten 50 mkl Reagenzmischung wie oben (aber mit Lambdaantikörper) und 50 mkl von Urinproben wurden entsprechend zugegeben.
  • Vor der erfindungsgemäßen Analyse waren diese Urinproben im Labor wie oben untersucht worden.
  • Ergebnisse:
  • Alle 15 Urinproben zeigten den typischen ringartigen Komplex, das bedeutet in diesen Proben lagen Lambda freie leichte Ketten ab 15 mg/l vor. In 11 Proben war der Ringkomplex im oberen Halbteil der Flüssigkeitssäule und wurde so (ohne Verdünnung) mit der Fotoskala bestimmt. Der Lambdagehalt in 9 von diesen Proben lag zwischen 15 und 50 mg/l, für 2 Proben – zwischen 50 und 150 mg/l. Die anderen 4 Proben (mit niedrigerer Position des Ringkomplexes) wurden 10-fach mit 0,9% NaCl verdünnt. Nach einer zweiten Analyse wurden die verdünnten Proben mit der Fotoskala bewertet. Dabei zeigte sich, dass die Proben von diesen zwischen 500 und 1500 mg/l Lambdagehalt hatten und 2 Proben (Analyse nach der zweiten Verdünnung durchgeführt) zwischen 1500 und 5000 mg/l. Diese Daten waren mit den vorherigen Laboruntersuchungen in Übereinstimmung.
  • Beispiel 3
  • Untersuchung von Urinsproben von Patienten mit Bence Jones Proteinurien (freie leichte Ketten-kappa oder lambda mit einem gemischten Antikörperreagenz (Simultanbestimmung) gegen Kappa und gegen Lambda.
  • 1) Untersuchungen mit ungefärbten Antikörpern gegen freie leichte Ketten
  • Es wurde folgende Reagenzmischung angewandt:
  • Polyklonaler Antikörper gegen Kappa 0,03 Gew.%
    Polyklonaler Antikörper gegen Lambda 0,03 Gew.%
    NaCl 0,8 Gew.%
    NaN3 0,12 Gew.%
    Dextran 7,5 Gew.%
    Saccharose 3,5 Gew.%
  • Glucose 1,2 Gew.%
    Polyvinylpyrollidon 0,2 Gew.%
    Wasser 86,62 Gew.%
  • Die Analysen wurden mit o.g. Reagenzmischung parallel durchgeführt. Urinproben von 12 Patienten mit festgestellter Bence Jones Proteinurie (7 mit Kappa von 16 bis 2.670 mg/l und 5 mit Lambda von 20 bis 3.810 mg/l freie leichte Ketten) und 3 Urinproben von Diabetikern mit festgestellter Albuminurie (von ca. 100 bis 2000 mg/l) und ebenfalls 6 Modellmischungen mit Albumin (A): (A) + Kappa , (A)+ Lambda, (A)+ beide Kappa und Lambda wurden untersucht.
  • Ergebnisse:
  • Die Urinproben (einschließlich Mischungen mit Albumin), die freie leichte Ketten Kappa oder Lambda enthielten, zeigten den typischen Ringkomplex. Dabei erfolgte die Ergebnisbewertung in diese Fällen nur qualitativ. Die Urinproben von den Diabetikern (mit Albumingehalt) zeigten keinen Ringkomplex d.h. es war kein BJP in diesen Urinproben vorhanden.
  • 2) Untersuchungen mit durch zwei Farbreagenzien (fluoreszenz)konjugierten Antikörpern gegen leichte Ketten.
  • Es wurden in der Reagenzmischung ein polyklonaler Kaninchen Anti- Human Kappa, leichte Ketten Antikörper, FITC-konjugiert, sowie ein Lambda leichte Ketten Antikörper, RPE-konjugiert, angewandt. Dabei wurde die Konzentration der Antikörper so ausgewählt, dass die ganze Mischung nur eine schwache (leichte) Fluoreszenz zeigte. Es wurden 4 Urinproben mit Kappa leichte Ketten und 2 Urinproben mit Lambda leichte Ketten untersucht.
  • Ergebnisse
  • Bei der Fluoreszenzuntersuchung wurde beobachtet, dass in den Urinproben mit dem Kappagehalt der Ringkomplex eine spezifische FITC-Fluoreszenz zeigt. Dabei hängt die Intensität dieser Fluoreszenz von der Konzentration der Kappa ab und war in jedem Fall viel höher als die leichte Fluoreszenz der nebenliegenden Flüssigkeit. Das gleiche Ergebnis wurde bei Untersuchungen mit den Urinproben, die Lambda enthielten, erzielt. Hier war die rote Fluoreszenz von RPE wesentlich stärker als die in der nebenliegenden Flüssigkeit.
  • Dieses System erlaubt demzufolge gleichzeitig mit einem Reagenz jede vorliegende leichte Ketten (Kappa und/oder Lambda) festzustellen.
  • Beispiel 4
  • Untersuchungen mit einem Blutplasma-Modellsystem
  • Ein künstliches Modellsystem (wie durchschnittliches Blutplasma) enthielt Albumin (BSA- 70 mg/ml) in einer Lösung von 0,9 % NaCl. Es wurden 5 Lösungen des Modellsystems mit zugegebenem Kappa freie leichte Ketten in Konzentrationen von 0 15 50 und 150 mg/l vorbereitet und erfindungsgemäß (mit Kappa-Antikörpern) untersucht.
  • Ergebnisse:
  • Alle Proben des Modellplasmas mit Kappa freie leichte Ketten zeigten einen deutlichen Ringkomplex ähnlich wie eine Urinprobe mit entsprechendem Kappagehalt.

Claims (13)

  1. Testsystem zur schnellen Bestimmung von Bence-Jones-Protein, kappa und/oder lambda freie leichte Ketten, in biologischen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Reagenzgemisch, das neben an sich bekannten Antikörpern, Zusatzstoffen und Puffern mindestens ein Polysaccharid, Disaccharid, Monosaccharid und ein synthetisches wasserlösliches Polymer umfasst.
  2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es neben dem Reagenzgemisch ein durchsichtiges konisches oder zylindrisches Reagenzgefäß aufweist, dessen Höhe größer als der durchschnittliche Durchmesser ist, in welchem sich das Reagenzgemisch befindet.
  3. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenzgemisch Antikörper gegen kappa und/oder lambda freie leichte Ketten, Natriumchlorid, Natriumazid, ein Polysaccharid, ein Disaccharid, eine Monosaccharid, ein synthetisches wasserlösliches Polymer und Wasser enthält.
  4. Testsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es die Reagentien mit folgenden Gew.% enthält mono-(poly)-klonale Antikörper 0,02 – 0,06 Gew.% NaCl 0,6 – 0,9 Gew.% NaN3 0,1 – 0,14 Gew.% Polysaccharid 6,0 – 12,0 Gew.% Disaccharid 2,0 – 8,0 Gew.% Monosaccharid 0,5 – 3,0 Gew.% Polymer 0,15 – 0,6 Gew.% Wasser 67,74 – 90,63 Gew.%
  5. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polisaccharid ausgewählt aus Stärke, Glykogen oder Dextranen ist, bevorzugt ein lösliches Dextran.
  6. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Disaccharid ausgewählt aus Maltose, Lactose, Trehalose und Sacharose ist, bevorzugt Sacharose.
  7. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Monosaccharid ausgewählt aus Mannose, Galaktose und Glukose ist, bevorzugt Glukose.
  8. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das synthetische wasserlösliche Polymer ausgewählt aus Fikoll, PEG und Polyvinylpyrrolidon ist, bevorzugt Polyvinylpyrrolidon.
  9. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper konjugiert mit Farbstoffen, Latexteilchen, Enzymen und/oder anderen Markern vorliegen.
  10. Verfahren zur schnellen Bestimmung von Bence-Jones-Protein in biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung des Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Flüssigkeit in das Reagenzgemisch so gegeben wird, dass sie das Gemisch durchfließt und löst und anhand eines sich in der Flüssigkeitssäule bildenden ringartigen Präzipitäts-Komplexes zwischen Bence-Jones-Protein und Antikörpern im Reagenzgemisch nachgewiesen wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Ringkomplexbildung in Abhängigkeit von der Konzentration des anwesenden Bence-Jones-Proteins in unterschiedlicher Geschwindigkeit sowie in spezifischer Art optischer Dichte und Breite erfolgt und zuordenbare Positionen in der Flüssigkeitssäule besetzt, wobei bei Konzentrationen von 15 mg/l bis 150 mg/l der Ring im oberen Halbteil der Flüssigkeitssäule entsteht und bei Konzentrationen über 150 mg/l der Ring im unteren Teil der Flüssigkeitssäule entsteht.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinkonzentration im Bereich von (10?) 15 mg/l bis 150 mg halbquantitativ bestimmt wird, wobei zuvor eine Fotoskala unter Verwendung definierter Proteinkonzentrationen erstellt wird.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass bei Vorliegen von Konzentrationen über 150 mg/l Protein, die Flüssigkeitsproben zur halbquantitativen Auswertung mit 0,9%iger NaCl-Lösung 10-fach verdünnt werden.
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