-
Die
Erfindung betrifft ein Testsystem zur schnellen Bestimmung von Albumin
in biologischen Flüssigkeiten
unter Verwendung von Antikörpern
auf der Basis von Antigen-Antikörperkomplexbildungen,
wobei ein sich bildender Präzipitäts-Komplex
zwischen Albumin und monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörpern direkt
beobachtet und bewertet wird. Das erfindungsgemäße Testsystem umfasst eine
Reagenzmischung, die neben an sich bekannten Antikörpern, Zusatzstoffen
und Puffern mindestens ein Polysaccharid, ein Disaccharid, ein Monosaccharid
und ein synthetisches wasserlösliches
Polymer aufweist. Die Reagenzmischung wird bevorzugt auf dem Boden
eines durchsichtigen Reagenzgefäßes deponiert,
das zylindrisch oder konisch ist und dessen Höhe größer als der durchschnittliche
Durchmesser ist und kommt so als bevorzugtes Testsystem zur Anwendung.
Der Test erfolgt, indem eine zu prüfende Probe vorsichtig, vorzugsweise
nach unten in das Gefäß hineingegeben
wird, wobei sich beim dynamischen Kontakt der Flüssigkeit mit der Reagenzmischung ein
Komplex zwischen Antikörpern
und Albumin in der flüssigen
Reagenzsäule
bildet, welcher eine spezifische ringartige Form in der Flüssigkeit
zeigt. Da das Albumin in der biologischen Flüssigkeit in unterschiedlichen Konzentrationen
(in bestimmten Konzentrationsbereichen) vorliegen kann, entsteht
der sich bildende Ringkomplex mit unterschiedlicher Geschwindigkeit
in jeweiliger spezifischer Art an optischer Dichte und Breite. Der
entstandene Ring besetzt in Abhängigkeit
von den jeweiligen Konzentrationsbereichen besondere Positionen
in der Flüssigkeitssäule. Für eine halbquantitative
Bewertung sind Konzentrationsbereiche an nachzuweisendem Albumin
mit Hilfe einer zuvor erstellten Fotoskala zuordenbar.
-
Methoden
zur Bestimmung von Albumin in biologischen Flüssigkeiten mittels Bewertung
von Antigen-Antikörper
Komplexen sind zahlreich bekannt und diagnostisch relevant. Eine
Methode unter Verwendung von spezifischen Antikörpern ist z.B. die Bewertung
eines Antigen-Antikörper-Komplexes
mittels automatisierter nephelometrischer Messung. Diese Methode
arbeitet nach dem Prinzip der Dispersion von Licht. Die automatischen
Systeme sind jedoch kompliziert und kostenintensiv und vor allem
für einen
Einsatz zur Massenanalyse geeignet. Darüber hinaus sind sie nicht als
Schnelltest anwendbar. Somit sind diese Systeme für Arztpraxen
oder zur Eigenanwendung, die vor allem einen unkomplizierten Schnelltest
benötigen,
ungeeignet.
-
Marktbekannte
Teststreifen zur Albuminbestimmung beruhen auf der Anwendung von
Albuminantikörpern,
die mit Farbstoffen oder dem Enzym Peroxidase konjugiert sind. Diese
Tests haben wiederum den Nachteil, dass die Analysendurchführung unbequem
und ungenau ist, denn i. d. R. muss der Teststreifen im engen Bereich
zwischen zwei Linien genau 5 Sekunden in eine Urinprobe gehalten
werden, er darf dabei die feuchte Wand des Gefäßes mit der Testzone nicht
berühren
usw.
-
Darüber hinaus
können
die Teststreifen durch ständige
Anwendung bei Zimmertemperatur aufgrund häufig geöffneter Gefäße feucht und deshalb ungültig werden
(auch bei Lagerung im Kühlschrank).
-
Einige
bekannte Gruppen von Immunotests verwenden Antikörper, die mit Latexteilchen
konjugiert sind. Diese Tests sind jedoch relativ kompliziert und
dauern lange (mehr als 3 Minuten). Testkarten, die der Bestimmung
von Rauschgiftstoffen dienen, erlauben nur eine qualitative ja oder
nein Bewertung des Analysenergebnisses.
-
Aus
DE 203 15 345.6 ist ein
Reagenzgemisch zur Albuminbestimmung in biologischen Flüssigkeiten bekannt,
mit dem ein trübungsartiger
Komplex, der zwischen Albumin und Antikörper gebildet wird, beobachtet und
bewertet werden kann und das neben an sich bekannten Antikörpern, Zusatzstoffen
und Puffern, mindestens ein Polysaccharid, ein Disaccharid und Borsäure umfasst.
Diese Methode hat aber den Nachteil, dass für kleine Mengen (40– 300 mkl)
eine Trübung
bei der Ergebnisbewertung in entsprechend kleinen Gefäßen und insbesondere
bei niedrigen Albuminkonzentration (z. B. im Bereich 20 – 60 mg/l)
vom Verbraucher schwierig bewertet werden kann. Weiterhin nachteilig
ist, dass man dieses kleine Gefäß immer
schütteln
muss. Das ist eine unbequeme Prozedur. Desweiteren muss bei jeder
Analyse ein so genannter Vortest durchgeführt werden, was die Analysendurchführung relativ
lang und kompliziert macht.
-
Aufgabe
der Erfindung war es deshalb, ein Testsystem zur Bestimmung von
Albumin in biologischen Flüssigkeiten
zu finden und so bereitzustellen, dass es ohne größeren technischen
Aufwand eine schnelle und bequeme Analysendurchführung gestattet. Das System
sollte für
die Verwendung in standardisierten Vorrichtungen (z. B. in Reagenzgefäßen) geeignet
sein und dabei unifizierte Herstellungstechnologien benutzen können.
-
Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe durch ein Testsystem gelöst,
das zur schnellen Bestimmung von Albumin in biologischen Flüssigkeiten
ein Reagenzgemisch umfasst, welches die direkte Beobachtung und
Bewertung eines Präzipitäts-Komplexes gestattet,
der sich zwischen Albumin und entsprechendem monoklonalen und/oder
polyklonalen Antikörper
bildet. Das Reagenzgemisch umfasst neben an sich bekannten Antikörpern, Zusatzstoffen
und Puffern mindestens ein Polysaccharid, ein Disaccharid, ein Monosaccharid
und ein synthetisches wasserlösliches
Polymer, jedoch keine Borsäure.
-
Die
Reagenzmischung (mit entsprechenden Antikörpern für das nachzuweisende Albumin)
wird bevorzugt auf dem Boden eines durchsichtigen Reagenzgefäßes deponiert,
das zylindrisch oder konisch ist und dessen Höhe größer als der durchschnittliche
Durchmesser ist und bildet so ein bevorzugtes Testsystem. Das Reagenzgemisch
kann in dem Reagenzgefäß bevorzugt
bei 2 bis 8° C über einen
langen Zeitraum (bis zu 12 Monaten) aufbewahrt werden. Die Durchführung eines
Tests erfolgt, indem eine Flüssigkeitsprobe
vorsichtig nach unten in die sich im Gefäß befindliche Reagenzmischung
hineingegeben wird. Beim dynamischen Kontakt der Flüssigkeit
mit der Reagenzmischung, die sich auflöst, entsteht in der Flüssigkeit
zwischen Albumin und Antikörper(n)
im Reagenzgemisch ein Präzipitäts-Komplex in der flüssigen Reagenzsäule, der
eine spezifische ringartige Form bildet.
-
Da
das Albumin in der biologischen Flüssigkeit in unterschiedlichen
Konzentrationen (in bestimmten Konzentrationsbereichen) vorliegen
kann, entsteht der sich bildende Ringkomplex mit unterschiedlicher
Geschwindigkeit in jeweiliger spezifischer Art an optischer Dichte
und Breite. Der entstandene Ring besetzt in Abhängigkeit von den jeweiligen
Konzentrationsbereichen besondere Positionen in der Flüssigsäule. Für eine halbquantitative
Bewertung sind Konzentrationsbereiche an nachzuweisendem Albumin
mit Hilfe einer zuvor erstellten Fotoskala zuordenbar.
-
Die
in der Reagenzmischung befindlichen Antikörper können Marker aufweisen, so können sie
z.B. mit Farbstoffen, Latexteilchen, Enzymen und anderen Markern
konjugiert sein. Die Substanzen werden in biologischen Flüssigkeiten
bestimmt, wie z.B. im Urin oder im Serum bzw. im Blutplasma oder
Liquor.
-
Das
Reagenzgemisch wird bevorzugt in einem bedeckten durchsichtigen
(glasklaren) Reagenzgefäß, das zylindrische
oder konische Form besitzt und dessen Höhe größer als der durchschnittliche
Durchmesser ist, eingesetzt. Der in der Flüssigkeitssäule schnell (in der Regel nach
1 bis 3 Minuten) entstehende Ringkomplex bleibt ca. 3 Stunden ohne
wesentliche Veränderung
bestehen und kann in diesem Zeitraum eindeutig bewertet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante
enthält
das Testsystem ein Reagenzgemisch mit monoklonalen und/oder polyklonalen
Antikörpern
gegen Albumin weiterhin Natriumchlorid, Natriumazid, ein Polysaccharid,
ein Disaccharid, ein Monosaccharid, ein synthetisches wasserlösliches
Polymer und Wasser.
-
Die
halbquantitative Bewertung des Analysenergebnisses wird durch den
Vergleich mit einer zuvor erstellten Fotoskala durchgeführt. Das
Analysenergebnis (z. B. im Konzentrationsbereich 15 – 150 mg/l
für Albumin)
ist auch quantitativ mittels nephelometrischer Messung der Trübung nach
kurzem Schütteln
des entstandenen Ringkomplexes bestimmbar.
-
Bevorzugt
kann Albumin unter Verwendung an sich bekannter Antikörper, die
in fachgemäßer Weise erhältlich sind,
nachgewiesen werden, bzw. auch Antikörper gegen diese Substanzen.
-
Gemäß der Erfindung
enthält
das Reagenzgemisch die Reagentien mit folgenden Gew. %:
mono-(poly)-klonale
Albumin-Antikörper | 0,02 – 0,06 Gew.% |
NaCl | 0,6 – 0,9 Gew.% |
NaN3 | 0,1 – 0,14Gew.% |
Polysaccharid | 6,0 – 12,0 Gew.% |
Disaccharid | 2,0 – 8,0 Gew.% |
Monosaccharid | 0,5 – 3,0 Gew.% |
Synthetisches
wasserlösliches
Polymer | 0,15 – 0,6 Gew.% |
Wasser | 67,74 – 90,63
Gew.% |
-
Als
Polisaccharid ist bevorzugt ein lösliches Dextran enthalten.
-
Als
Disaccharid wird bevorzugt eine Saccharose verwendet.
-
Das
Monosaccharid ist ausgewählt
aus Mannose, Galaktose und Glukose, bevorzugt Glukose.
-
Das
synthetische wasserlösliche
Polymer ist ausgewählt
aus Fikoll, PEG und Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylpyrrolidon ist
bevorzugt.
-
Prinzip der Testung
-
Eine
biologische Flüssigkeit
mit zu bestimmendem Albumin wird in ein Reagenzgefäß, welches
das Reagenzgemisch bereits enthält,
bevorzugt so hineingegeben, dass die Flüssigkeit von unten durch die
Testreagenzmischung nach oben fließt (2). Durch diese Fließbewegung (dynamischen Kontakt)
entstehen automatisch Gradienten der jeweilig vorliegenden Konzentrationen
an Albumin, die in optimalen Punkten miteinander reagieren und den
ringartigen Präzipitäts-Komplex
bilden. Ein Vorteil dieses ringartig entstehenden Komplexes im Vergleich
zu einer Trübung
ist seine vielfach verbesserte Sichtbarkeit.
-
Da
das Albumin in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen kann,
entsteht der Ringkomplex in Abhängigkeit
von der Konzentration mit einer bestimmten optischen Dichte und
Breite und wird mit unterschiedlicher Geschwindigkeit gebildet,
wobei er besondere zuordenbare Positionen in der Flüssigkeitssäule besetzt.
-
Je
höher der
zu prüfende
Gehalt (in bestimmten Konzentrationsbereichen, z. B. in der Reihe
15 – 150 mg/l)
desto höher
die optische Dichte und relative Breite des gebildeten Rings, desto
kürzer
die Zeit seiner Entstehung und desto niedriger seine Position in
der Flüssigkeitssäule. Letzteres
gilt praktisch bei jeder Konzentration bis ca. 10.000 mg/l. Ab einem
Gehalt von ca. 300 mg/l sollte die Probe verdünnt werden. Das Verfahren zur
Bestimmung von Albumin wird durchgeführt, indem man eine definierte
Menge (vorzugsweise 25 – 100
ml) von einer zu prüfenden
Flüssigkeit
(z. B. Urin) vorsichtig in das Gefäß, das die gleiche Menge an
Reagenzmischung (mit Antikörpern
s. o.) aufweist, hineingibt und dann (nach 1 – 3 Minuten – nicht
schütteln!)
die Komplexbildung beobachtet und diese dann anhand optischer Dichte
und Breite sowie anhand der Position des Ringkomplexes in der Flüssigkeitssäule bewertet.
Zuerst wird das Ergebnis qualitativ im Konzentrationsbereich (15 – 10.000
mg/l) bewertet. Wenn ein weißer
Ring in dieser Probe entsteht – liegt
auf jeden Fall Albumin in einer Konzentration ab 15 bis 10.000 mg/l
in dieser Probe vor. Entsteht dieser Ring im oberen Halbteil der Flüssigkeitssäule, ist
die Konzentration gering und liegt bei 15 – 150 mg/l nach der Fotoskala
ohne Verdünnung.
Sie kann ohne Verdünnung
halbquantitativ im Bereich von 15 – 150 mg/l bestimmt werden,
indem man sie mit einer zuvor erstellten Fotoskala vergleicht. Entsteht
dieser Ring im unteren Halbteil sitzt – beträgt der Gehalt mehr als 150
mg/l. Man muss in diesem Fall die biologische Flüssigkeit 10-fach mit 0, 9% NaCl verdünnen und
die Analyse wie oben geschrieben wiederholen. Das Analysenergebnis,
der Ringkomplex, bleibt ca. 3 Stunden ohne wesentliche Veränderung
bestehen und ist in diesem Zeitraum bewertbar.
-
Die
Konzentration kann man halbquantitativ visuell mit einer Fotoskala
bewerten. Die Fotoskala zur Bestimmung von Albumin wird individuell
hergestellt. Sie erfolgt, indem man in eine Reihe durchsichtiger
Reagenzgefäße eine
definierte Menge (50 ml) Antikörperreagenzmischung
vorgibt. Gleiche Mengen an Albumin-haltiger Flüssigkeit (in 0, 9% NaCl) mit
Konzentrationen (mg/l): 0 15 50 150 300 1.000 5.000 und 10.000 werden
eingebracht. Der entstehende ringartige Komplex wird beobachtet
und visuell bewertet, anschließend z.B.
mit einer Digitalkamera „Rigon-4" fotografiert und
schematisch dargestellt.
-
Das
spezifische, hochempfindliche, kostengünstige und einfach durchführbare Testsystem
ist insbesondere zur in vitro Diagnostik in medizinischen Einrichtungen
vor allem in Arztpraxen und kleinen Laboratorien einsetzbar und
in erste Linie zur Frühdiagnostik
sowie zur Verlaufskontrolle bei verschiedenen Erkrankungen geeignet.
Es wurde schon für
Nierenkrankheiten bestätigt.
-
Anschließend wird
die Erfindung an Ausführungsbeispielen
näher erläutert, ohne
dass sie darauf beschränkt
werden soll.
-
In
den 1 bis 4 sind Anwendungsmöglichkeiten
des bevorzugten Testsystems dargestellt.
-
1 Reagenzgefäß mit Antikörperreagenzmischung
zur Albuminbestimmung
-
2 Eintragung einer Probe
unter eine Reangenzmischung
-
3 Vorrichtung mit eingebauter
Pipettenspitze zur Eintragung einer Probe
-
4 Schema der Fotoskala zur
qualitativen und halbquantitativen Albuminbestimmung in Flüssigkeiten
in mg/l helle Streifen = ringartiger Komplex
-
Legende
zu den Abbildungen:
-
- 1
- Antikörpermischung
- 2
- Deckel
- 3
- eingebaute
Pipettenspitze
- 4
- Schutzfolie
-
Beispiel 1
-
Untersuchung
von wässrigen
Albuminlösungen
in vorgegebenen Konzentrationen mit in einem Gefäß unten befindlicher Reagenzmischung
zur Herstellung einer Fotoskala
-
Es
wird ein Reagenzgemisch mit folgender Zusammensetzung eingesetzt:
Polyklonaler
Antikörper
gegen Albumin | 0,04
Gew.% |
NaCl | 0,8
Gew.% |
NaN3 | 0,12
Gew.% |
Polysaccharid | 7,5
Gew.% |
Disaccharid | 3,5
Gew.% |
Monosaccharid | 1,2
Gew.% |
synthetisches
wasserlösliches
Polymer | 0,2Gew.% |
Wasser | 86,64
Gew.% |
-
Gebrauchanweisung
-
Man
gießt
oder gibt eine definierte Menge ( 25 – 100 mkl) von einer zu prüfenden Flüssigkeit
(z. B. Urin) vorsichtig nach unten in das Gefäß, das die gleiche Menge an
Reagenzmischung (mit Antikörpern
s. o.) aufweist, hinein und beobachtet dann (nach 1 – 3 Minuten – nicht
schütteln!)
die Komplexbildung und bewertet diese anhand optischer Dichte und
Breite sowie anhand der Position des Ringkomplexes in der Flüssigkeitssäule. Zuerst
bestimmt man das Ergebnis qualitativ im Konzentrationsbereich (15 – 10.000
mg/l ) und halbquantitativ im Bereich (15 – 150 mg/l) und vergleicht
mit der Fotoskala. Dabei entscheidet man ob diese Probe verdünnt werden
muss. Wenn ein weißer
Ring in dieser Probe entsteht – liegt
Albumin in einer Konzentration ab 15 bis 10.000 mg/l in dieser Probe
vor. Entsteht dieser Ring im oberen Halbteil der Flüssigkeitssäule, bestimmt
man den Albumingehalt im Bereich 15 – 150 mg/l nach der Fotoskala
ohne Verdünnung.
-
In
diesem Bereich hat der Komplex das Aussehen eines dünnen (engen)
Ringes, der sich verbreitet und dabei in der Reihe 15 – 50 – 150 mg/l
immer dichter wird.
-
Dabei
befindet sich der Komplex in oberen Halbteil (je weniger Albuminkonzentration
vorhanden, desto höher).
Es gibt verschiedene Zeiten der Komplexentstehung. Bei einer Konzentration
von 15 mg/l entsteht der Komplex in ca. 3 Minuten, bei 50 mg/l-
in ca. 1 Minute, bei 150 mg/l- in ca.15 – 20 Sekunden.
-
In
dieser Reihe kann man den Albumingehalt halbquantitativ ohne Verdünnung mit
Fotoskala v und zusäztlich
mit der Zeitberechnung bestimmen. Wenn dieser Ring im unteren Halbteil
sitzt – beträgt der Albumingehalt
mehr als 150 mg/l. Man muss in diesem Fall die zu prüfende Flüssigkeit
10-fach mit 0, 9% NaCl verdünnen
und die Analyse wie oben geschrieben wiederholen. Das Analysenergebnis,
der Ringkomplex, bleibt ca. 3 Stunden ohne wesentliche Veränderung
bestehen und ist in diesem Zeitraum bewertbar. Die Gebrauchanweisung
ist zur Bestimmung aller anderen Antigene/Antikörper ebenfalls gültig. Das
Analysenergebnis für Albumin
im Konzentrationsbereich von 15 – 150 mg/l ist dabei quantitativ
mittels nephelometrischer Messung der Trübung nach kurzem Schütteln des
Präzipitätskomplexes
bestimmbar.
-
Herstellung der Fotoskala
-
In
eine Reihe durchsichtiger Reagenzgefäße mit definierter Menge (50
mkl ) Antikörperreagenzmischung
wurden gleiche Mengen der Lösung
einer Albuminlösung
(in 0, 9% NaCl ) mit Konzentrationen ( mg/l): 0 15 50 150 300 1.000
5.000 und 10.000 eingebracht. Der entstehende ringartige Komplex
Albumin-Antikörper wurde
beobachtet und visuell bewertet, anschließend mit einer Digitalkamera „Rigon-4" fotografiert und
schematisch dargestellt (1 – 3 ).
-
Nephelometrische
Messungen von Ringkomplexen im Bereich des Albumingehaltes 0 – 15 – 300 mg/l.
-
Quantitative
Messungen der Trübung
(mit dem Nephelometer Densicheck) zeigten nach kurzem Schütteln des
Ringkomplexes folgende Ergebnisse:
Albuminkonzentration
( mg/l) | Optische
Dichte |
0 | 0 |
15 | 0,
18 |
50 | 0,
54 |
150 | 1,
32 |
300 | 1,
47 |
-
In
der Reihe 0 – 15 – 50 – 150 mg/l
ergab sich eine annehmbare Konzentrationskurve.
-
Beispiel
2
-
Untersuchungen
von Urinproben und Modellproben mit Albuminmischungen
-
Es
wurden 16 Urinproben von Diabetikern, 6 Proben von Gesunden und
2 Modellproben (normal Urin + Albumin bis zur Endkonzentration 5.000
und 10.000 mg/l) gemäß der Erfindung
wie oben geschrieben und parallel mit Micraltest untersucht.
-
Ergebnisse
-
Die
visuelle Beobachtung ergab, dass alle Proben von Diabetikern und
auch die Modellproben in 3 Minuten nach Probeneintragung einen Ringkomplex
zeigten. D. h. in allen diesen Proben gab es Albumin ab 15 mg/l.
Bei Vergleich mit der Fotoskala wurde zugeordnet, dass 6 Proben
zwischen 15 und 50 mg/l, 7 Proben zwischen 50 und 150 mg/l und 3
Proben von Diabetikern sowie die Modellproben ab 300 mg/l und mehr
Albumingehalt zeigten. Zwei Proben von Diabetikern zeigten nach
einer ersten Verdünnung
zwischen 150 und 500, die letzte Probe ca. 1500 mg/l. Die Modellproben
(bei 100-facher Verdünnung)
zeigten entsprechend 5.000 und 10.000 mg/l. Die Proben wurden (nach
Verdünnung)
mittels Micraltest bewertet, die entsprechenden Werte der Albuminkonzentrationen
konnten bestätigt
werden. 4 Proben von Gesunden zeigten keinen Albumingehalt und 2
Ringspuren, d. h. sie besaßen
weniger als 15 mg/l Albumingehalt (4).