DD216541A1 - Verfahren zur photometrischen messung mechanischer eigenschaften von biologischen partikeln - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der elastischen, plastischen und viskosen Verformbarkeitseigenschaften, Aenderung d. Groesse und Aggregation sowie der Osmolalitaet von biologischen Partikel, insbes. Zellen, mittels Photometrie. Ziel und Aufgabe der Erfindung ist es, die Messung verschiedener mechanischer Eigenschaften von biologischen Partikeln mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit an derselben Probe bei geringer Probenmenge und geringem Aufwand durchzufuehren. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass die separierten Partikel auf einer ebenen lichtdurchlaessigen Flaeche zur Sedimentation gebracht, an der Flaeche anhaften, und mit einer bestimmten, entsprechend des Untersuchungszieles, laminaren, in der Geschwindigkeit einstellbaren, Fluessigkeit ueberstroemt sowie, dass die Flaeche einschliesslich der zu untersuchenden Partikel mit Licht durchstrahlt wird und die Transmissionsaenderung bzw. Transmissionsaenderungsgeschwindigkeit sowie das mikroskopische Bild ein Mass fuer die jeweilige mechanische Eigenschaft ist. Die Erfindung ist vorzugsweise zur Untersuchung von Blutzellen anwendbar.

Description

Verfahren zur photometrischen Messung mechanischer Eigenschaften von biologischen Partikeln

Anwendungsgebiet^der^Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der elastischen, plastischen und viskosen Verformbarkeitseigenschaften, Änderung von Größe und Aggregation sowie der Osmolalität von biologischen Partikeln, insbesondere Zellen, mittels Photometrie.

Die Erfindung ist vorzugsweise zur Untersuchung von Blutzellen anwendbar.

Darüber hinaus ist sie auch geeignet zur Messung mechanischer Eigenschaften verschiedener nichtbiologischer Partikel.

Charakteristik^des^Standes^der^Technik

Zur Messung der Verformbarkeit von Erythrozyten ist ein Mikropipettenverfahren bekannt. Hierbei werden von Hand mittels eines Manipulators Blutzellen unter einem Mikroskop in eine Pipette, deren Durchmesser kleiner ist als der Erythrosytendurchmesser, eingesaugt bzw· hindurchgesaugt· Der aufzuwendende Druck ist dabei ein Maß für die

Verformbarkeit der Erythrozyten« Das Meßergebnis ist bei diesem Verfahren abhängig von der Form der Pipette sowie vom Geschick der Laborkraft· Desweiteren ist für die Untersuchung ein hoher Zeitaufwand erforderlich. Schließlich verstopfen die Pipetten relativ häufig, so daß sie ausgewechselt werden müssen· Vorrätig angefertigtePipetten wachsen außerdem häufig infolge Bakterienwuchses zu.

Bei einer abgewandelten Form des Pipettenverfahrens zur Messung der Verformbarkeit von Erythrozyten werden diese durch eitfie Pipette hindurchgesaugt und die Passagezeit über den sich ändernden elektrischen Widerstand einer Widerstandsmeßstrecke gemessen·

Ein anderes Verfahren verwendet Einlochfilter eines reproduzierbaren Durohmessers und einer reproduzierbaren Dicke· Nachteilig bei diesem Verfahren ist ebenfalls die relativ häufige Verstopfung der Pipetten bzw· der Einlochfilter und deren geringe mechanische Stabilität·

Es sind noch verschiedene Filtertechniken bekannt, wobei die Erythrozytensuspensionen durch Filter hindurohlaufen und die Durohlaufgesohwindigkeit einer bestimmten Suspensionsmenge gemessen wird· Infolge von Abweichungen in der Porenstruktur und in den verwendeten Filterchargen sind die Ergebnisse wenig reproduzierbar· Außerdem ist die Zähigkeit des Suspensionsmittels nicht vernachlässigbar und die Aussagekraft gering, da eine mittlere Durohlaufzeit bestimmt wird.

Weiterhin ist noch ein Verfahren unter Einsatz von Vollblut bzw· Blutzellensuspensionen bekannt, wobei die Verformbarkeit durch Viskositätsmessungen bestimmt wird.

Hierbei beeinflussen eine Reihe von Paktoren, wie u. a. Größe und Form der Blutzellen, verwendetes Suspensionsmittel sowie die Temperatur, das Meßergebnis·

Verfahren, die mittels einer Oouette-Strömung und Hoohgeschwindigkeitskameras.die Verformbarkeit von Erythrozyten bestimmen, sind apparativ nur sehr aufwendig zu realisieren» Gleiches trifft für die Laserbeugungsmethode (DE-PS 3121947) zu. Nachteilig ist ferner, daß bei Verwendung der Hoohgeschwindigkeitskameras die aufgenommenen Bilder für einzelne Erythrozyten ausgewertet werden müssen. Außerdem können Laserbeugungsbilder bei pathologischen Proben diffus und damit für differenzierte Aussagen kaum brauchbar sein.

Verfahren zur Messung der Osmolalität von Erythrozyten sind bekannt, in dem eine Erythrozytonsuspension in einer Probenkammer mit semipermeablen Wänden von einem hypotonen Medium umgeben wird. Es wird die Transmissions änderung von Licht als Punktion der Zeit gemessen. Nachteilig sind bei diesem Verfahren, daß die nötige Probenmenge und die Zeitdauer je Messung hoch ist, daß die Erythrozytensenkung während der Messung das Meßergebriis verfälscht und die Auswertung der gemessenen Diagramme umständlich ist·

I)K-Po 1948259 wird nach dem Prinzip der laufenden Verdünnung einer Erythrozytensuspension bei Messung der Liohtdurchlässigkeit gearbeitet.

Nach DE-PS 2733409 wird die optische Dichte der in einer Suspensionsflüssigkeit suspendierten Erythrozyten und in einer Kapillare strömenden Erythrozybansuspension gemessen· Das Herstellen einer reproduzierbar eingestellten Verdünnung ist problematisch· Außerdem wird eine realtiv hohe Probenmenge und eine lange Meßzeit benötigt·

Sowohl die Verfahren zur Bestimmung der Deformierbarkeit von Erythrozyten als auch der zur Bestimmung der osmotischen Resistenz sind ausschließlich nur für die Messung entweder der Deformierbarkeit oder der Osmolalität anwendbar und nicht geeignet für kombinierte Messungen beider Größen an derselben Probe nacheinander oder auch zusätzlicher Größen wie z· B. der Aggregation von Erythrozyten·

Weiterhin beschränken sich die bekannten Verfahren auf die Untersuchung von Erythrozyten und sind auf Grund geometrisöher und anderer Ursachen nicht universell auch für andere Zellen anwendbar.

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur photometrischen Messung mechanischer Eigenschaften von biologischen Partikeln zu sohaffen, wodurch die Messung der elastischen, plastischen und viskosen Verformbarkeitseigenschaften, Änderung der Größe und Aggregation sowie der Osmolalität von biologischen Partikeln, insbesondere. Zellen, mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit möglich ist und zudem die Änderung der gemessenen Größe als kontinuierliche Funktion der Zeit bestimmt werden kann·

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur photometrischen und/oder mikroskopischen Messung mechanischer Eigenschaften von biologischen Partikeln zu schaffen, welches die Messung unterschiedlicher mechanischer Eigenschaften von biologischen Partikeln an dergleichen Probe bei geringer Probenmenge, wenig

aufwendigen Vorbereitungsarbeiten sowie der Möglichkeit einer Dokumentation gestattet·

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die zu messenden biologischen Partikel, insbesondere Zellen, von anderen Partikeln sowie von der Flüssigkeit, in der die Partikel sich natürlicherweise befinden können, abgetrennt und in einer physiologischen oder in einer in der Zusammensetzung davon abweichenden Flüssigkeit je nach Untersuchungszweck aufgeschwemmt werden. Diese suspendierten Partikel sedimentieren auf einer ebenen lichtdurchlässigen Fläche, die sich in einer Meßkammer befindet. Die Partikel haften durch die Wirkung von Adhäsionskräften an der Fläche in der Meßkammer sowie dui?ch Zeil-Zeil-Kräfte auch untereinander.

Über die sedimentierten Partikel wird eine bezüglich der Volumenstromgesohwändigkeit von Null bis zur Grenzgeschwindigkeit, bei der die Partikel sich von der Haftfläche ablösen, einstellbare laminare Strömung erzeugt. Dadurch wird auf die Partikel eine Schubkraft ausgeübt, in deren Folge die Zell-Zell-Haftkräfte sowie die Haftkräfte zwischen Zellen und Kammerboden mit einer Gegenkraft beauflagt und die Partikel selbst entsprechend ihrer physiologisch oder pathologisch bedingten Verformbarkeit verformt werden.

Durch definierte Erhöhung der wirkenden Strömungskraft ist die Adhäsivität der Partikel untereinander und die stattfindenden Verformungen der Partikel an ein und derselben Probe analysierbar, indem die Meßkammer mit Licht (sichtbares Licht - Licht im UV-Bereioh entsprechend dem Absorptionsverhaltens der zu untersuchenden Partikel) durchstrahlt und die Transmissionsänderung gemessen wird.

Die Transmissionsänderung erfaßt zuerst die sich auflösenden Zell-Zell-Kräfte, indem.die abgelösten Zellen aus dem Meßfeld weggeschwemmt werden, wodurch eine Transmissionserhöhung verursacht wird. Die dann verbleibende einzellige Schicht von Zellen am Meßkammerboden weist danach bei der Volumenstromgesohwindigkeit Null eine konstante Transmission auf, die sich aber erhöht, sobald sich unter dem Einfluß der zugesöhalteten Strömung die Zellen verformen. Diese Transmissionsänderung steht in direkter Beziehung zum Grad der Verformbarkeit, korreliert mit der wirkenden'Schubkraft der strömenden Flüssigkeit und liefert reproduzierbare Ergebnisse. Nachdem die Zellen diesen Messungen unterzogen worden sind, sind an der verbleibenden Zellschioht noch weitere Untersuchungen durchführbar·

Der die Zellen überströmenden Flüssigkeit werden dann verschiedene Stoffe, wie z. B. Serumeiweiß, Pharmaka , usw. beigemischt und die Reaktion der Zellen, die sich unter anderem in Änderung der Morphologie, der Verformbarkeit, der Verformungsgesohwindigkeit sowie der Einwirkungszeiten ausdrücken kann, untersucht. Desweiteren ist die osmotische Schwellung der Zellen meßbar, wobei je nach der Osmolaltät der die Zellen überströmenden Flüssigkeit die Zellen zunächst quellen und dann platzen, wodurch sich die Transmission ändert und sich ein charakteristischer Verlauf der nach der Zeit differenzierten Transmissionsänderung ergibt· Maß für die osmotische Resistenz ist entweder die Zeitdauer bis zu der ein beliebig vorgegebener Anteil von Zellen geplatzt ist oder die nach Einwirken der Osmolalität der überströmenden Flüssigkeit verbleibende Zellmenge· Anstelle der Messung der Transmission kann auch die Intensitätsänderung von reflektiertem Licht ausgewertet werden.

Zur Erhöhung der Empfindlichkeit kann polarisiertes Licht eingesetzt werden·

Durch Mikroskopieren kann die Morphologie der Zellen beurteilt und mittels Fotografie eine Dokumentation in jedem Untersuchungsstadium durchgeführt werden.

Ausführungsbeisgiel

Dis Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Zur Verformbarkeitsmessung von Erythrozyten und zur Bestimmung der osmotischen Resistenz werden 0,1 ml Blut entnommen und dieses Blut zweimal hintereinander in 5 ml phosphatgepufferter NaCL-Lösüng bei 1000 U/min· zentrifugiert· Der Überstand wird abgesaugt und auf 1 ml Gesamtmenge resuspendiert. Davon wird ein Tropfen von 0,1 ml auf einen üblichen Objektträger, welcher vorher mit HCL-Alkohollösung und reinem Alkohol gereinigt wurde, aufgegeben· Der Objektträger wird so dann einschließlich der Probe 10 Minuten über einem verschlossenen Wasserbad abgelegt, damit die Partikel in der Probe sedimentieren. Der Objektträger wird nun in eine Durchflußkammer eingelegt, die Durchflußkammer geschlossen und entlüftet· Zur Erzeugung einer einzelligen Erythrozytenlage läßt man duroh die Durohflußkammer eine phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung eine Minute lang strömen, wobei die Schubkraft der Flüssigkeit auf die Erythrozyten kleiner als ihre Abreißkraft von der Glasfläche und größer als ihre Zell-Zell-Haftkräfte sein muß. Sodann wird, die Erythrozytenschicht fotogrfiert und die Extinktion derselben gemessen·

Nachdem wird eine Volumenstromgeschwindigkeit von 10 ml/min, eingestellt, wobei die Zuschaltung des Volumenstromes innerhalb einer Zeit von kleiner 0,5 s geschieht· Die Volumenstromgeschwindigkeit wird bis zum

Erreichen des Transmissionsendwertes aufrechterhalten. Gleichzeitig wird eine elektronische Differentation vorgenommen. Mittels Mehrkanalschreibers werden der zeitliche Verlauf der Transmissionserhöhung und die nach der Zeit differenzierte Transmissionserhöhung aufgezeichnet. Nach Abschalten der Überströmflüssigkeit wird die Erythrozytenschioht nochmals fotografiert. Aus der Transmissionsänderung ergibt sich der Grad der erzeugten Verformung und aus der differenzierten Transmiss iöns änderung sowie öus der Form der differenzierten Kurve ein Maß für die Verteilung der Verformungsgesohwindigkeit der Erythrozyten.

Die Probe wird anschließend mit einer Flüssigkeit, die aus destÜLierten Wasser besteht, überströmt. Dadurch erhöht sich die Transmission bis zur Transmission ohne Erythrozyten im Meßfeld. Nach Erreichen dieser maximalen Transmission wird der Flüssigkeitsstrom wieder abgeschaltet. Aus der nach der Zeit differenzierten Transmissionskurve ergibt sich die Zeit, die die Erythrozyten benötigen, um vollständig zu hämolysieren und ein Maß für die Verteilung der Hämolysegeschwindigkeit, die die osmotische Resistenz der untersuchten Partikel charakterisieren^ Durch Fotografieren wird das morphologische Bild der vorliegenden Erythrozytenpopulation dokumentiert.

Claims (5)

1· Verfahren zur photometrischen Messung mechanischer Eigenschaften von biologischen Partikeln unter Abtrennung der zu untersuchenden Partikel von anderen Partikeln und eventueller Flüssigkeit, Suspension der Partikel je nach Untersuchungsziel in einer physiologischen oder davon abweichenden Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension auf eine lichtdurchlässige ebene Fläche aufgebracht wird, die Partikel zur Sedimentation gebracht werden, wobei sie an der Fläche haften bleiben, und eine laminare, in ihrer Geschwindigkeit einstellbare, Überströmung mit einer Flüssigkeit hergestellt wird, wobei die maximale Geschwindigkeit der überströmenden Flüssigkeit duroh die Ablösekräfte der Partikel von der Fläche begrenzt ist sowie, daß durch ein Überströmen mit einer physiologischen Flüssigkeit die Wechselwirkungskräfte zwischen den Partikeln, die Adhäsivität der Partikel an der Haftflache und die Verformbarkeit der Partikel, duroh Überströmen mit einer physiologischen Flüssigkeit und Beimengungen die Reaktion der Partikel auf diese Beimengungen und durch Überströmen mit einer hypotonen Flüssigkeit die Osmolalität der Partikel durch mikroskopische Messung, Messung der Transmissionsänderung und der zeitlichen Ableitung davon ermittelt wird·

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das die Transmissionsänderung hervorrufende Licht, welches polarisiert sein kann, entsprechend des Absorptionsverhaltens der zu untersuchenden Partikel aus einer Wellenlänge des Bereiches des sichtbaren Lichtes bis zu einem Licht der Wellenlänge von 250 mm besteht·

3» Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Beimengungen zur Überströmenden Flüssigkeit ζ· Β· aus Serumeiweiß, Pharmaka, giftähnliohen Stoffen usw. bestehen«

4# Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Zweck der weiteren Auswertung sowie zur Dokumentation die Partikel fotografiert werden·

5· Verfahren nach Punkt -i_f daduroh gekennzeichnet, daß anstelle der Transmissionsänderung und der zeitlichen Ableitung davon die reflektierte Lichtintensität ausgewertet wird·