DD218959A1

DD218959A1 - Vorrichtung zur photometrischen messung mechanischer eigenschaften von biologischen partikeln

Info

Publication number: DD218959A1
Application number: DD25270383A
Authority: DD
Inventors: Gerhard Artmann; Henner Krug
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-07-04
Filing date: 1983-07-04
Publication date: 1985-02-20

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung der elastischen, plastischen und viskosen Verformbarkeitseigenschaften, Aenderung der Groesse und Aggregation sowie der Osmolalitaet von biologischen Partikeln, insbesondere Zellen, mittels Photometrie. Ziel und Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung zu schaffen, welche die Messung unterschiedlicher Parameter an derselben Probe ohne Umbau der Vorrichtung mit geringer Probenmenge ermoeglicht. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass die aus zwei Teilen bestehende Vorrichtung im zusammengesetzten Zustand einen sehr flachen, im Querschnitt rechteckigen und von zwei lichtdurchlaessigen Flaechen begrenzten Stroemungskanal enthaelt. In den Stroemungskanal wird die zu untersuchende Probe eingebracht und von einer Fluessigkeit laminar ueberstroemt. Der Kanal ist nach dem Auseinandernehmen der Vorrichtung leicht zugaenglich und nach dem Zusammensetzen der Vorrichtung in seinen Massen genau reproduzierbar. Fig. 1

Description

Vorrichtung zur photometrischen Messung mechanischer Eigenschaften von biologischen Partikeln .

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung der elastischen, plastischen und viskosen Verformbarkeitseigenschaften, Änderung der Größe und Aggregation sowie der Qsmolalität von biologischen Partikeln, insbesondere Zellen, mittels Photometrie.

Mit gleicher Vorrichtung können ohne Umbau derselben auch mikroskopische Untersuchungen zur Ergänzung der photoinetrischen Ergebnisse angestellt werden.

Die Erfindung ist vorzugsweise zur Untersuchung von Blutzellen anwendbar·

Zur Messung der Ervthrozytenverformbarkeit ist eine Vorrichtung bekannt, in der eine Couette-Strömung in einem Ringspalt zwischen zwei rotierenden Zylindern, worin sich die Probe befindet, erzeugt wird» Durch Einsatz von Laserstrahlen werden Diffraktionsbilder erhalten· Weiterhin sind Vorrichtungen bekannt, die zwischen einer Platte.und einem flachen Kegel eine solche Strömung erzeugen, daß die Messung mittels visueller Beobachtung

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unter Zuhilfenahme von Kameras, oder Videotechnik möglich ist.

Desweiteren sind noch Vorrichtungen bekannt, die aus einer Kapillare bestehen und die von einem Lichtstrahl; zur'Analyse durchdrungen werden sowie Vorrichtungen, die aus Filterpapier oder Folien bestehen, durch deren Porenabmessungen die Erythrozytendeformation erzeugt wird., ^v

Zur Bestimmung; der osmotischen Resistenz sind Vorrichtungen bekannt, welche aus einer Kapillare bestehen, die \ mit Erythrozyten in ständig sich verdünnender Suspensionslösung durchströmt werden (DE-PS 2733409). Bei weiteren Vorrichtungen wird in einem wendeiförmigen Glasrohr durch eine Zentrifuge und unter Einwirkung eines Hämolysebeschleunigers eine hämatologische Verteilung ermittelt. (DE-PS 2808039).

indere, auf dem Coulter-Counter-Prinzip basierende, Vorrichtungen, bei denen die Proben in unterschiedliche , osmotische Drücke aufweisenden Suspensionslösungen eingebracht werden, nutzen die charakteristische Änderung des elektrischen Widerstandes. Alle genannten Vorrichtungen arbeiten mit frei in Flüssigkeiten schwebenden Blutzellen. Die Blutzellen gehen beim Meßprozeß verloren. Dadurch ist eine hohe Probenmenge notwendig. Die auf den Vorrichtungen basierenden Auswertetechniken, wie z. B. Filme, Beugungsbilder usw., sind zum Teil für Routineuntersuchungen ungeeignet. ^! Alle bekannten Vorrichtungen sind auf die Messung einer einzigen Meßgröße, wie Erythrozytendeformation oder nur osmotische Resistenz, beschränkt. Für verschiedene Parameter sind mehrere Vorrichtungen erforderlich. < Weiterhin arbeiten die Vorrichtungen zur Messung der Erythrozytendeformation zum Teil unter unphysiologisch hohen oder Undefinierten Belastungsbedingungen, wie z. B. die Filtertechniken, sowie haben zum Teil eine geringe

Genauigkeit und Meßempfindlichkeit. Bei Vorhandensein von Unterpopulationen verschiedener Verformbarkeit entstehen bei der Diffraktionsmethode diffuse, nicht aus- . wertbare Streubilder· Schließlich sind die Vorrichtungen, die mit Pipetten, Filtern oder Folien arbeiten, mechanisch empfindlich und verstopfen leicht während des Meßvorganges.

Ziel der Erfindung ist es_r eine Vorrichtung zur photometrischen Messung mechanischer Eigenschaften von biologischen Partikeln zu schaffen, womit die Messung unterschiedlicher Parameter an derselben Probe mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit möglich ist und die es gestattet, alle Möglichkeiten der mikroskopischen Technik zu nutzen, ohne daß dafür eine andere Vorrichtung, ein 'komplizierter Umbau der Vorrichtung oder überhaupt eine . ifeupräparation der photometrisch vermessenen Probe erforderlich wäre.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine solche Vorrichtung zur photometrischen Messung mechanischer Eigenschaften von biologischen Partikeln zu schaffen, womit unter Routinebedingungen und geringer Probenmenge das Ziel der Erfindung erreicht wird·

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß eine sowohl für photometrische als auch mikroskopische Messungen geeignete Vorrichtung geschaffen wird, deren wesentliches Element ein sehr flacher, im Querschnitt rechteckiger, von zwei lichtdurchlässigen Flächen begrenzter Strömungs-

kanal ist·,, der die zu untersuchende Probe aufnehmen und von einer Flüssigkeit laminar durchströmt werden kann.· Wesentlich-'dabei ist, daß die Vorrichtung, die den Kanal, enthält, so auseinandernehmbar und zusammensetzbar ist, daß der Kanal beim Öffnen, zuv Heupräparat!on und Reinigung vollständig zugängig und beim Schließen mittels routinefreundlichem Schnellverschluß.die -Höhe des Strömungskanal'es auf wenige hundertste 1 Millimeter genau . reproduziert werden kann, ohne daß ITachJustierungen oder Vermessungen erforderlich wären.

Die zusammengesetzte Vorrichtung wird senkrecht zum Strahlengang eines Photometers oder Mikroskopes angeordnet .. und mitirels Licht durchstrahlt,, welches, photometrisch, oder mikroskopisch gemessen, Träger der Information über die mechanischen Eigenschaften der zu untersuchenden Probe ist. Die Vorrichtung besitzt einen Zufluß- und, Abflußkanal sowie .einen Injektionskanal zur Injizierung von Zellsuspensionen .in die Vorrichtung. Sowohl die äußeren Abmessungen der Vorrichtung als auch .die Kanalhöhe sind so bemessen, daß eine laminare Strömung erzeugt wird, der Verbrauch an Suspensionslösung, die die Kammer durchströmt, gering ist, der Einsatz der Vorrichtung sowohl im Photometer als,auch auch unter dem Mikroskop bis zu 5OOfacher Vergrößerung möglich ist. Die Länge des Strömungskanales ist sehr viel größer als seine Höhe, und seine Breite ist kleiner als seine Länge und sehr viel größer als seine Höhe. , ·

Die obere und untere Begrenzung des Strömungskanales wird von durchsichtigen Scheiben gebildet, die wahlweise aus Glas oder einem anderen durchsichtigen Material bestehen. Für Untersuchungen mit sichtbarem Licht bestehen diese Scheiben aus Glas oder durchsichtigem Kunststoff. Für Untersuchungen mit UV-Licht wird Quarzglas verwendet. Für Routineuntersuchungen mit sichtbarem Licht kommen Objektträger und Deckgläser, wie sie in der Mikroskopie

verwendet werden, zum Einsatz. Dabei wirken,sich naturgemäße Schwankungen in der Dicke der verwendeten Gläser durch die Gestaltung der Vorrichtung nicht auf die Reproduzierbarkeit der Kanalhöhe aus, die über die gesamte,, Vorrichtungslänge genau eingehalten werden muß. Die seitliche Abdichtung des Kanales wird durch Dicht« ringe erzielt. Das Glas im Oberteil der Vorrichtung wird, mittels einer Lehre eingeklebt und bei Neupräparation nicht ausgewechselt. Die Reproduzierbarkeit der Kanalhohe wird dadurch erreicht, daß sich zwischen den äußeren Dichtringen und dem eingeklebten Glas ein plangeschliffener Steg befindet, auf den beim Sinkleben des Glases eine Lehre gedrückt wird, die so gestaltet ist,' daß sie,das Glas genau so tief in das Oberteil einklebt, daß der Abstand zwischen Steghöhe und Glas genau der gewünschten Kammerhöhe entspricht. Schwankungen in der Dicke des Glases werden durch die zwischen Oberteil und Glas befindliche Klebstoffschicht ausgeglichen. Das eingeklebte Glas und das Vorrichtungsoberteil sind so dimensioniert, daß ein Mikroskopobjektiv bis an die Glasfläche heranfahren kann und zusätzlich noch ausreichende horizontale Bewegungen des Objektivs parallel und senkrecht zur Strömungsrichtung der Flüssigkeit in der Vorrichtung möglich sind. Das in das Vorrichtungsoberteil eingeklebte Glas . ist kleiner als das im Vorrichtungsunterteil auf einer Gummiauflage freigelagerte zweite Glas der Vorrichtung, so daß der plangeschliffene Steg des Oberteiles der Vorrichtung und dessen Dichtring vollständig auf das lose gelagerte Glas des Unterteiles der Vorrichtung drücken.

Durch einen Schraubschnellverschluß werden dann beide Vorrichtungshälften so verspannt, daß der Dichtring des Oberteiles der Vorrichtung soweit zusammengedrückt wird, bis deren Steg auf der Glasfläche Im Vorrichtungsunterteil aufsitzt und somit das weitere Annähern der beiden Glasflächen exakt begrenzt.

Die zu untersuchenden Partikel, können je nach Meßaufgabe entweder außerhalb der. Meßkammer auf einem Objektträger aufgebracht werden, wobei ein Tropfen der die biologischen Partikel 'enthaltenden Suspension auf den Objektträger aufgetropft und dieser dann in das Meßkammerunterteil eingelegt wird oder in die geschlossene Meßkammer über den Injektionskanal injiziert werden. Im'Oberteil der Vorrichtung befinden sich Zu- und Abflußkanal für die die Probe übertrömende Flüssigkeit mit Austrittsöffnungen in das Innere des Strömungskanals· Unterteil und Oberteil der Vorrichtung besitzen an ihren seitlichen Rändern Rippen, die ein·Durchwölben von Unter-, und Oberteil unter den Einfluß der stirnseitigen Ver- ^! spannung und des zusammenzudrückenden Dichtgummis verhindert)· Der Deckel der Vorrichtung hat die Funktion, ' seitlich' durch die Kanäle eindringendes Fremdlicht auszuschalten· Bei der Probenpräparation wird der Deckel zur Kontrolle der Blasenfreiheit von.Zu- und Abflußkanal und bei der Mikroskopie zur Einstellung des nötigen Objektiv-Deckglas-Abstandes abgenommen.

Die Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden·' In der dazugehörigen Zeichnung zeigt

Pig. 1 Schnitt durch die Vorrichtung

Fig· 2 Elemente der Vorrichtung

Fig. 3 Meßanordnung im Einstrahlphotometer.

Die Vorrichtung 18 besteht aus einem Unterteil 1, einem Oberteil 2 sowie einem Deckel 3. Im Oberteil 2 befindet sich je ein Zufluß 13 und ein Abfluß 14 für Flüssigkeiten sowie ein Anschluß für Injektionen 12.. Außerdem ist im Oberteil 2 ein Durchbruch eingebracht, der mit einem Glas 11 verschlossen ist. Mittels einer Lehre wird dieses

Glas 11 so tief eingeklebt, daß es zu dem an der Unterseite des Oberteiles 2 befindlichen plangeschliffenen Steg in der'Höhe an allen Punkten einen 0,3 mm großen Abstand besitzt. Die Dicke des eingeklebten Glases beträgt 0,5 nan« .

Um das eingeklebte Glas 11 verläuft an der Unterseite des Oberteiles 2, der die Kammerhöhe bestimmende plangeschliffene Steg von 1 mm Breite und außerhalb davon eine Hut für die Aufnahme eines Dichtgummis * 10.

Im Unterteil 1 ist ebenfalls ein Durchbruch eingebracht, der eine Aussparung aufweist. Der Durchbruch mit der Aussparung ist so groß, daß ein üblicher Objektträger 4 eingelegt werden kann. Desweiteren befindet sich in einer separaten Aussparung eine Gummiau.flage 9· Die Vorrichtung 18 ist durch Übereinanderlegen des Unterteiles 1 einschließlich des Objektträgers 4 und des Ober- \ teiles 2 sowie durch Verschrauben mit zwei Rändelmuttern 7,8 mit Gewindebolzen 5,6 zusammensetzbar. Zum Verschrauben mit den Rändelmuttern 7,8 befinden sich im Unterteil T zwei Gewindelöcher und im Oberteil 2 zwei durchgehende Löcher.

Der Deckel 3 wird benötigt, wenn die Vorrichtung 18 zusammen mit einem Photometer 22 verwendet wird, um seitlichen Lichteinfall zu vermeiden· Als Photometer werden Einstrahlphotometer verwendet.

Desweitereri ist zwischen der Lichtquelle 23 und der Vorrichtung 18 ein Polarisationsfilter 16 anbringbar, um Messungen mit polarisierten Licht vornehmen zu können. Damit das.die Probe durchstrahlende Licht nur die Probe durchstrahlt, wird zwischen Lichtquelle 23 und Vorrichtung 18 eine dem Durchmesser der Probe angepaßte Lochkreisblende 17 zwischengeschaltet.

Die Vorrichtung befindet, sich einschließlich des Polarisationsfilters 16, der Blenden 17 und de3 Lichtempfängers in der optischen Achse des Strahlenganges eines Photometers 22. Diese Anordnung wird einmalig bezüglich des Ab-

Standes -jictitaustrittsspalt 15 zu Vorrichtung 18 und' der Blendenposition justiert. Transmissionsmessungen' an einem objektfreien Ort 21 der Vorrichtung, die für die Extinktionsbestimmung nötig sind, werden durch zur optischen Achse senkrechte.'Verschiebung der Vorrichtung ermöglicht. .

Claims

iSrfindungsansprüche

1, Vorrichtung zur Messung mechanischer Eigenschaften 'biologischer Partikel mittels Photometrie oder Mikroskopie, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung aus Oberteil und Unterteil besteht, wobei das Oberteil nach oben durch eine durchsichtige rechteckige Scheibe, die in einem'nach oben zu absatzartigen rechteckigen Durchbruch fixiert und von einem umlaufenden plangeschliffenen Steg sowie einem darum befindlichen Dichtstreifen umrandet ist sowie daß der Abstand der Scheibe zur Unterkante des Steges an allen Punkten gleich ist und daß der Dichtstreifen den Steg in der Höhe überragt, begrenzt ist und Zuführungen für Flüssigkeit von der Oberseite des Oberteiles her mittels Bohrungen in die Unterseite innerhalb des Steges, bezüglich der Längsachse der Scheibe in-maximaler .Entfernung, gegenüberliegend einmünden und daß das Unterteil einen nach unten absataartigen rechteckigen Durchbruch enthält, welcher größer als der Durchbruch des Oberteiles ist und in dem ein Dichtstreifen eingelegt ist, worauf eine durchsichtige rechteckige Scheibe, darauf sich die zu untersuchende Probe befindet, gelegt ist, so daß beim Zusammenfügen des Oberteiles und des Unterteiles zwischen der oberen und unteren Scheibe durch das Zusammenpressen des Dichtstreifens im Oberteil bis auf die Höhe des Steges ein reproduzierba-

, rerdichter. durch den Steg abgegrenzter", im Querschnitt rechteckiger Strömungskanal entsteht und ,daß die,Vorrichtung gegen 3?xemdlicht abdeckbar und bezüglich ihrer.Längsachse gegenüber der dazu senkrechten optischen Achse eines Mikroskopes oder Photometers verschiebbar ist.

2. Vorrichtung nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet ·, daß die ' .obere und untere Begrenzung der Vorrichtung aus durchsichtigen Scheiben gebildet werden, die je nach Untersuchungssweck aus Glas, Kunststoff oder Quarzglas bestehen·

3· Vorrichtung nach. Punkt 2, dad'ureh gekennzeichnet, daß die durchsichtige Scheibe, welche sich.im Oberteil befindet, in das Oberteil eingeklebt ist,

4·, Vorrichtung na&h Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in das Unterteil eingelegte durchsichtige Scheibe aus einem üblicherweise verwendeten Objektträger besteht,

5· Vorrichtung nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich Gummidichtungen zwischen Oberteil und Unterteil befinden·

6, Vorrichtung nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Oberteil und Unterteil der Vorrichtung mit einem Schnellspannverschluß verbindbar sind.

7. Vorrichtung nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß an den seitlichen Rändern des Oberteiles und Unterteiles Rippen angebracht sind.

8> Vorrichtung nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vorrichtung PiIter und/oder Lochkreisblenden vorgeordnet

.-sind. .

9. Vorrichtung nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Oberteil und Unterteil der Vorrichtung durch einen Deckel mit einer Lichtdurchtrittsöffnung abdeckbar ist.¹ ' .

-Hierzu 3 Blatt Zeichnungen -