AT510898B1 - Meniskus äquilibrationssystem für eine mikrotiterplatte - Google Patents

Abstract

Ein Einsatzelement für den Einsatz in eine Multiwellplatte, wobei das Einsatzelement mit einem Montageelement für die Montage an einer Vertiefung einer Multiwellplatte versehen ist, das gewährleistet, dass das Einsatzelement in eingesetztem Zustand in die Vertiefung ragt. Das Einsatzelement ist des Weiteren mit einem Meniskusausgleichselement versehen, das in eingesetztem Zustand einen Meniskus an der Oberfläche einer Flüssigkeit durch Verlagerung von Oberflächenanteilen der Flüssigkeit ausgleicht und gleichzeitig einen Gasaustauch an der Flüssigkeitsoberfläche gewährleistet.

Description

österreichisches Patentamt AT510 898B1 2014-11-15

Beschreibung

MENISKUS-ÄQUILIBRATIONSSYTEM FÜR EINE MULTIWELLPLATTE

[0001] Die Erfindung betrifft ein Einsatz-Element für eine Multiwellplatte.

[0002] Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Multiwellplattensystem.

[0003] Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Verwendung von Multiwellplattensystemen für Bildaufnahmen (Imaging) lebender Zellen.

[0004] Unter einer Multiwellplatte im Zusammenhang mit dieser Patentanmeldung werden flache Platten bestehend aus Kunststoff oder Glas verstanden. Sie enthalten voneinander isolierte Näpfchen/Vertiefungen (Kavitäten, engl, wells) in Reihen und Spalten, in beliebiger Anzahl die an die Stelle von kleinen Reagenzgläsern treten. Man findet handelsübliche Multiwellplatten beispielsweise unter den Bezeichnungen Multiwellplate, Multischalen, Mikrotiterplatte oder Mikroplatte. Multiwellplatten gehören zur Standardausrüstung analytischer Forschung und klinischer Diagnose. Ein Anwendungsbereich von Multiwellplatten sind Bildaufnahmen lebender Zellen. Eine Multiwellplatte kann 6, 24, 96, 384 oder mehr Vertiefungen aufweisen, die in einer Matrix angeordnet sind. Jede Vertiefung enthält normalerweise eine Flüssigkeitsmenge von wenigen Tausend bis zu wenigen Hundert Mikrolitern oder noch weniger.

[0005] US 6,25,911 beschreibt ein Zellkulturgefäß und Mikroskop, das ein breites Spektrum an günstigen Beobachtungen von Proben in mehreren Vertiefungen erlaubt, auch wenn im Kulturmedium ein negativer Brechwert entsteht. Dabei sind eine ringförmige Apertur, ein Kondensator, eine Linsenanordnung, eine Multiwellplatte, ein Objektiv und eine Phasenkontrastplatte in dieser Reihenfolge von der Lichtquellenseite aus angeordnet und bieten eine Aufnahmevorrichtung für eine Phasenkontrastschicht der Phasenkontrastplatte im Verbund zur Position zur Projektionsblende oder zur Projektionsblende des Objektivs. Das Zellkulturgefäß ist so aus der Linsenanordnung und der Multiwellplatte konstruiert, dass eine relative Disposition gegeben ist, in der die optische Achse jeder Linse koaxial mit der Mittelachse des Strahlengangs jeder Vertiefung steht. Die Apertur der ringförmigen Öffnung ist geringer als die Apertur jener ringförmigen Öffnung, die verwendet wird, wenn das Zellkulturgefäß nicht im Strahlengang liegt.

[0006] Alfred Bahnson et al. (in: ,Automated measurement of cell motility and proliferation', BMC Cell Bio. 2005, 6: 19) berichten, dass die optischen Eigenschaften der invertierten Lichtmikroskopie von 384-Well Platten im Zusammenhang mit der robusten Segmentation lebender Zellen problematisch ist. Der Meniskus verhindert den Phasenkontrast, Hellfeld-Mikroskop-Bilder weisen bei Meniskus-Einwirkung geringe Kontrastwerte auf und es erhöht sich der Verarbeitungsaufwand beträchtlich. In der Folge wird eine Reihe von Filtern verwendet, um die Unterschiede (Signal-Rausch-Verhältnis) zwischen dem Hintergrund und dem Vordergrund (zellähnliche Objekte) zu vergrößern, und es werden Schritte gesetzt, um zellähnliche Objekte vom Hintergrund deutlich abzutrennen. Heterogene Beleuchtung am Bild wird mittels lokaler Histo-gramm-Equalization erreicht. Helligkeitsabweichungen zwischen einzelnen Bildern (zeitlich betrachtet) werden mittels Histogramm-Matching ausgeglichen. Abweichungen im Bereich des Hintergrundes werden mittels anisotroper Filter und Median-Filterung gemindert, wobei Details und Textur der Zellen erhalten bleiben. Letztlich ergibt sich in der Hellfeld-Mikroskopie durch die zytoplasmatische Membran eine Verschmelzung der Zellgrenze mit dem Hintergrund, wodurch eine Reihe von aufwändigen Abstufungsvarianten und Texturfilter eingesetzt werden müssen, um die Zellgrenzen sichtbar zu machen.

[0007] Basics of Light Microscopy & Imaging, Special Edition of Light Microscopy & Imaging veröffentlicht von Olympus, Git Verlag (download über http://www.gitverlag.com/media/ downloads/Olympus_Sonderheft.pdf) berichtet auf Seite 25 davon, dass bei der Beobachtung von Zellen in einer Kammer, zum Beispiel einer 24-Well Platte, die Verwendung von speziellen Olympus PHC Kontrasteinsätzen notwendig ist, um einen besseren Kontrast in Multiwellplatten mit Meniskusproblematik zu erreichen. 1 /10 österreichisches Patentamt AT510 898B1 2014-11-15 [0008] US 4,599,315 beschreibt eine Vorrichtung zur Bestimmung des HLA Antigens durch Messung der Lymphozytenzytotoxizität. Bei dieser Vorrichtung taucht ein Stab aus Glas oder Plastik in die Testlösung. Durch Verdrängung der Lösung wird somit deren Tiefe und damit die Messstrecke, durch die der Lichtstrahl muss, reduziert. Weiters beschreibt diese Erfindung auch eine Bedeckung mit einer Versiegelungsvorrichtung („sealing arrangement"), um ein präzises Positionieren der Bedeckung zu ermöglichen.

[0009] US 5,048,957 beschreibt eine Probenhalterung, die vor allem die Nebensignaleffekte (crosstalk) von benachbarten Wells bei Messungen (z.B. Lumineszenz) verhindert und damit zu erhöhter Sensitivität der Messung führt.

[0010] Trotz der Anwendung derartiger Ausgleichsoperationen bleibt das Auslesen einzelner Vertiefungen einer Multiwellplatte mühselig, insbesondere, wenn Meniskusprobleme auftreten. Weiters ist es vor allem beim Beobachten von lebenden Zellen in der Zellkultur notwendig, dass trotz dieser Ausgleichsoperationen ein permanenter Gasaustausch stattfinden kann, um die Messung der Zellen auch über mehrere Tage zu ermöglichen.

[0011] Ziel der Erfindung ist ein Multiwellplattensystem, das mit ausreichender Genauigkeit auch beim Auftreten von Meniskusproblemen ausgelesen werden kann und das Beobachten von lebenden Zellen über mehrere Tage ermöglicht.

[0012] Um das obengenannte Ziel zu erreichen, wird ein Multiwellplattensystem, bestehend aus einem Einsatzelement für Multiwellplatten und einer Multiwellplatte für Bildaufnahmen von lebenden Zellen verwendet.

[0013] Anhand einer beispielhaften Vorrichtung der Erfindung wird ersichtlich, dass ein Einsatzelement für das Einfahren in die Vertiefung einer Multiwellplatte vorgesehen ist, wobei das Einsatzelement ein Montageelement (z.B. ein Verankerungselement) besitzt, mit welchem das Einsatzelement so an der Multiwellplatte befestigt werden kann, dass das Einsatzelement nach erfolgter Befestigung in die Vertiefungen ragt. Durch das Meniskusausgleichselement, das nach Einsetzen des Einsatzelementes das Verdrängen eines Meniskus an der Oberfläche einer Flüssigkeit in einer Vertiefung durch das Verlagern von Oberflächenanteilen der Flüssigkeit gewährleistet, kommt es zur Reduzierung oder zum völligen Ausgleich des Meniskus.

[0014] Entsprechend einer weiteren Vorrichtung der Erfindung ist ersichtlich, dass ein Multiwellplattensystem, bestehend aus einer Multiwellplatte (z. B. einer Mikrotiterplatte) und einem Einsatzelement mit den oben genannten Eigenschaften für das Einsetzen in Multiwellplatten möglich ist.

[0015] Eine weitere Vorrichtung der Erfindung sieht eine Methode zur Anwendung von Multiwellplattensystemen vor. Dieser Methode zufolge wird ein Einsatzelement in eine Vertiefung einer Multiwellplatte gesenkt, das Montageelement auf das Einsatzelement im Bereich der Vertiefung so montiert, dass nach erfolgter Befestigung an der Vertiefung ein Meniskus an der Oberfläche einer Flüssigkeit durch den Einsatz des Meniskusausgleichselements verdrängt wird, indem ein Oberflächenanteil der Flüssigkeit durch das Einsetzen des Systems verlagert wird.

[0016] In einerweiteren Vorrichtung der Erfindung wird die Anwendung des Multiwellplattensystems für Bildaufnahmen von lebenden Zellen möglich. Trotz des Einsatzelementes ist ein permanenter Gasaustausch an der Zelloberfläche gewährleistet. Somit können lebende Zellen auch über einen Zeitraum von mehreren Tagen beobachtet werden, ohne dass durch das Einsetzen des Einsatzelementes die Viabilität der Zellen beeinflusst wird.

[0017] Gemäß einer weiteren Vorrichtung der Erfindung besteht die Möglichkeit eines Einsatzelementes für das Einsenken in eine Vertiefung einer Multiwellplatte (z.B. einer Mikrotiterplatte), das, wenn es in eine probengefüllte Vertiefung eingesetzt wird, einen Oberflächenanteil der Flüssigkeit verlagert, und dabei einen Meniskus (d.h. die Oberflächenkrümmung einer Flüssigkeit, die durch die Wechselwirkung mit der Behälteroberfläche oder einem anderen an die Flüssigkeit angrenzenden Objekt entsteht, wobei diese Krümmung konvex oder konkav sein kann) 2/10 österreichisches Patentamt AT510 898B1 2014-11-15 an der Oberfläche einer Flüssigkeit glättet oder zur Gänze ausgleicht. Zwischen der Bodenfläche des Einsatzelementes und der Oberfläche der Flüssigkeit bildet sich ein planer Oberflächenanteil, der definierte Bedingungen ohne optische Beeinträchtigungen durch, auf den Meniskus zurückzuführende, Streuungs- oder Brecheffekte erzeugt. Somit ist ein genaues Auslesen von biochemischen Experimenten in einer Vertiefung möglich und das im Wesentlichen über die gesamte Vertiefungsweite. Weiters können definierte Messbedingungen für Parallel-Messungen an mehreren Proben in den einzelnen Vertiefungen der Multiwellplatte festgelegt werden. Messabweichungen, die aus unterschiedlichen Probenvolumina in verschiedenen Vertiefungen resultieren, können vermieden werden, da die Einsatzelemente beträchtliche Probenvolumina verlagern können, wobei identische wirksame Probenvolumina für die Messungen entstehen. Darüber hinaus wird auch das Messen an sehr kleinen Probevolumina möglich. Weiters können durch die Bedeckung der Oberfläche der flüssigen Proben durch das Einsatzelement Verdunstungseffekte bei den Proben verhindert werden wodurch sich die mögliche Beobachtungszeit erhöht.

[0018] In der Folge werden weitere Kombinationsmöglichkeiten der Einsatzelemente erläutert.

[0019] Das Montageelement (das als Flansch und/oder Anker fungieren kann) kann einen runden Teil enthalten (z.B. kreisförmig), der so vorgesehen ist, dass er auf einer planen Fläche der Multiwellplatte direkt rund um eine Vertiefung angebracht wird. Mittels Stützen zwischen der planen Fläche des Ringes des Montageelementes und der ringförmigen planen Fläche der Multiwellplatte kann eine exakte horizontale Ausrichtung des Einsatzelementes oder eine Ausrichtung relativ zur Vertiefung hergestellt werden. Daraus ergibt sich ein ausgeklügeltes räumliches Ausrichtungssystem ohne großen Aufwand.

[0020] Das Montageelement kann mit einem Einrastelement (das auch Verankerungselement bezeichnet wird) versehen werden, das mit einem Einrast-Gegenstück im Bereich einer Vertiefung an der Multiwellplatte mechanisch koppelt. Bei einer derartigen Kombination kann das Montageelement fest (aber demontierbar) durch zwei korrespondierend geformte Einrastmechanismen an Einsatzelement und Multiwellplatte befestigt werden, wodurch eine exakte geometrische Ausrichtung zwischen Einsatzelement und Multiwellplatte definiert werden kann.

[0021] Insbesondere kann das Einrastelement mindestens einen Stift enthalten, der in mindestens eine entsprechende komplementäre Nut rings um eine Vertiefung in einer Multiwellplatte einrastet. Alternativ kann das Einrast-Element mit mindestens einer Nut ausgestattet sein, in die mindestens ein Stift im Bereich einer Vertiefung einer Multiwellplatte einrastet. Bei der Verwendung von Stift-Nut-Konstruktionen können auch mehrere Stifte, zum Beispiel drei Stifte in gleichem Abstand zueinander entlang der Einrast-Konstruktion eines Einsatzelementes mit z.B. einem kreisförmigen Querschnitt angeordnet sein, um eine erhöhte Präzision der Veranke-rungs- oder Einrastmechanik zu erreichen.

[0022] Das Montageelement für die Montage des Einsatzelementes an einer Vertiefung einer Multiwellplatte kann so adaptiert werden, dass Rotations- oder Drehbewegungen des Einsatzelementes relativ zur Multiwellplatte in eingesetztem Zustand verhindert werden. Durch Definition einer winkelgenauen Geometrie kann einer ungewollten Rotation zwischen Einsatzelement und Multiwellplatte vorgebeugt werden. Dies ist in Kombinationen von Vorteil, in denen eine bestimmte Ausrichtung zwischen Einsatzelement und Multiwellplatte gefordert ist, zum Beispiel, wenn lotrecht ausgerichtete Polarisationsfilter in der Bodenplatte eines Einsatzelementes und in der Multiwellplatte angebracht sind, um ein geeignetes Kontrastverhältnis für die Beobachtung einer in die Vertiefung eingefügte Probe zu erhalten.

[0023] Das Meniskusausgleichselement kann einen planaren Bodenflächenanteil haben, der einer flüssigen (oder anderen) Probe in der Vertiefung zugewandt ist. Durch eine solche planare Fläche können optische Artefakte, die sich aus der Krümmung von Oberflächenanteilen einer Flüssigkeit ergeben, unterdrückt werden. Ein oder mehrere optische/optoelektronische Elemente können dem Meniskusausgleichselement angefügt werden. Dies können etwa Filter (z. B. Wellenlängenfilter oder Polarisationsfilter), elektromagnetische Strahlenquellen (z.B. lichtemittierende Dioden, Laserdioden usw.), elektromagnetische Strahlendetektoren (z.B. eine Photodi- 3/10 österreichisches Patentamt AT510 898B1 2014-11-15 ode), elektromagnetische Strahlungsverstärker (z.B. Pigmente fluoreszierender Partikel um die elektromagnetische Strahlung in einer speziellen Wellenlänge zu verstärken oder zu erzeugen), optische Fasern (um extern generierte elektromagnetische Strahlung in das Einsatzelement zu leiten) und/oder Offnungseigenschaften (z.B. durch einen optisch transparenten Anteil, der von einem optisch intransparenten Anteil umgeben ist) sein. Es können insbesondere optischen Elemente (die die optischen Eigenschaften eines Lichtstrahls, der sich durch das Einsatzelement verbreitet) oder optoelektronischen Elemente (die elektrische Signale in optische wandeln oder umgekehrt) in das Meniskusausgleichselement des Einsatzelementes integriert werden, die damit gleichzeitig Meniskus-verdrängende und optische/optoelektronische Funktionen haben.

[0024] Das Meniskusausgleichselement kann teilweise oder zur Gänze optisch transparent sein. Um die Beobachtung durchführen zu können kann Licht auf den oberen Teil des Meniskusausgleichselements des in die Vertiefungen einer Multiwellplatte eingesetzten Einsatzelements gerichtet werden. Das Licht kann den optisch transparenten Bereich des Meniskusausgleichselement und den Boden der Multiwellplatte durchqueren und mittels eines elektromagnetischen Strahlungsdetektors unterhalb der Multiwellplatte beobachtet werden.

[0025] Das Einsatzelement kann ein Verbindungselement enthalten, mit dem das Montageelement mit dem Meniskusausgleichselement verbunden (oder angeschlossen) ist. Ein solches Verbindungselement kann vertikale Wände und eine röhrenförmige Geometrie aufweisen um ein ringförmiges Verankerungselement mit scheibenförmigen Meniskusausgleichselementen zu verbinden.

[0026] Das Verbindungselement kann senkrecht zum Montageelement und zum Meniskusausgleichselement ausgerichtet sein. Das Verbindungselement kann einen optisch opaken Teil enthalten. So kann z.B. eine innere oder äußere Wand der Verbindungselemente in schwarzer Farbe ausgeführt oder mit einem opaken Abdeckelement versehen werden, um unerwünschte Einflüsse umgebender elektromagnetischer Strahlung auf die Vorgänge im Bereich von Einsatz und Vertiefung auszuschließen. Ebenso kann die Wand des Verbindungselements teilweise oder zur Gänze aus einem optisch diffus streuenden Material hergestellt sein (entweder durch entsprechende Beschichtung oder Oberflächenbehandlung der Wand, z.B. durch Sandstrahlen oder Aufrauen).

[0027] Das Einsatzelement kann insbesondere aus Polycarbonat und/oder Polymethylmethac-rylate (PMMA) hergestellt werden. Diese oder andere polymere Materialen können von Vorteil sein, da sie kostengünstig produziert werden können, günstige optische Transparenzwerte aufweisen und mechanisch und chemisch widerstandsfähig sind. Es können aber auch andere Materialien wie z.B. Glas verwendet werden.

[0028] Das Einsatzelement kann im Spritzgussverfahren hergestellt werden. Demzufolge kann das Einsatzelement aus einem Stück oder zur Gänze aus einem Material gefertigt sein. Somit ist gewährleistet, dass die Einsatzelemente kostengünstig produziert werden können. Die Einsatzelemente können auch aus verschiedenen Komponenten zusammengesetzt werden. Es kann ein Einsatzelement z.B. aus einer Scheibe mit der Funktion des Meniskus-Ausgleichs und einem röhrenförmigen Körper mit ringförmigem Befestigungskranz als Befestigungs- und Verbindungsteil gefertigt sein. Diese beiden Komponenten (jede für sich mit optimalen Eigenschaften ausgestattet) können dann miteinander verklebt (z.B. mittels UV-Kleber), verschweißt oder verlötet werden. Die Bodenplatte des Einsatzelements kann z.B. mit einem röhrenförmigen Verbindungselement verklebt werden. Das Einsatzelement kann ebenso aus einem einzigen Material gefertigt sein.

[0029] In der Folge werden weitere Möglichkeiten der Anwendung an Multiwellplatten erläutert. Diese Kombinationsmöglichkeiten beziehen sich gleichermaßen auch auf die Einsatzelemente und die Methoden.

[0030] Die Vertiefungen einer Multiwellplatte können linear angeordnet sein. Somit kann die Multiwellplatte ein streifenförmiges Raster aufweisen, in der alle Vertiefungen entlang einer 4/10 österreichisches Patentamt AT510 898B1 2014-11-15

Linie angeordnet sind. Des Weiteren kann eine Vielzahl von Vertiefungen in einer Matrix-artigen Anordnung die Form einer zweidimensionalen Multiwellplatte annehmen. So können 6, 12, 24, 96, 384 oder mehr Vertiefungen in einer solchen ein- oder zweidimensionalen Matrix angeordnet werden.

[0031] Ebenso können ein- oder zweidimensionale Vertiefungs-Platten gefertigt werden, die zwischen den einzelnen Vertiefungen Perforationen oder andere Soll-Bruchstellen aufweisen und dem Anwender ein Abbrechen eben der für die spezielle Versuchssituation gewünschte Größe des Streifens oder der Matrix ermöglichen. Größere zweidimensionale Anordnungen können in kleine zweidimensionale oder nulldimensionale Anordnungen (d.h. eine einzige Vertiefung) geteilt werden, um benutzerdefiniert die benötigte Anzahl von Vertiefungen abzuteilen oder zu isolieren, gerade so wie eine Schokoladetafel in einzelne Rippen und Stücke zerteilt werden kann.

[0032] Ein oder mehrere Einsatzelemente sowie eine oder die Mehrzahl von Vertiefungen können so geformt und dimensioniert sein, dass, das Einsetzen des Einsatzelementes in die Vertiefungen möglich ist. Dabei können Größe, Abmessungen und Form der Vertiefungen und der Einsatzelemente einander angepasst und aufeinander abgestimmt werden. Dabei kann das Einsatzelement so dimensioniert werden, dass es entweder mit Spiel oder streng in die Vertiefung passt und eine genau definierte Distanz zwischen Vertiefungswand und Einsatzelement einhält. Der Gasaustausch an der Flüssigkeitsoberfläche bleibt auch beim genauen Einpassen in eine Vertiefung gewährleistet, indem das Einsatzelement entweder einen ovalen Querschnitt aufweist, sodass beim Einpassen in eine kreisrunde Vertiefung an zwei Seiten eine Öffnung bleibt, oder über eine Distanz-Stütze, die den Abstand zwischen Einsatzelement und einer Wand der Multiwellplatte festlegt.

[0033] Jegliches polymeres Material kann zur Erzeugung von Multiwellplatten herangezogen werden, so z.B. Polystyrol und/oder Polymethylmethacrylat (PMMA). Derartige Materialien verfügen über gute optische Transmissionseigenschaften, sind umweltverträglich und kostengünstig.

[0034] Gemäß einer beispielhaften Vorrichtung kann ein Multiwellplattensytem für die Beobachtung lebender Zellen erzeugt werden, das Schwierigkeiten reduzieren oder eliminieren kann, die gewöhnlich im Zusammenhang mit Meniskusbildungen an der Oberfläche flüssiger Proben aufgrund von Oberflächenspannungen der Flüssigkeiten entstehen. Diese Problematik verstärkt sich mit abnehmendem Vertiefungsdurchmesser. Somit kann es ein besonderes Anliegen sein, gerade bei Beobachtungen mit hoher Durchsatzrate (z.B. in der pharmazeutischen Wissenschaft) die Meniskusproblematik in den Griff zu bekommen, ohne dadurch die Viabilität von lebenden Zellen zu beeinträchtigen. Die Erfindung bietet Möglichkeiten für einfache und zugleich hocheffiziente Methoden zur Vermeidung der Meniskusproblematik. Dadurch kann die Beobachtung am Gesamtquerschnitt aller Vertiefungen einer Multiwellplatte ermöglicht werden, da keine unauslesbaren Anteile der Multiwellplatte verbleiben.

[0035] Beobachtung in Transmission sind möglich, dabei kann eine Lichtquelle oberhalb (oder unterhalb) der Multiwellplatte und der Detektor unterhalb (oder oberhalb) angeordnet sein. Genauso ist es möglich, dieses System in Reflektionsgeometrie zu betreiben, wobei sowohl Lichtquelle als auch der Detektor auf derselben Seite von Multiwellplatte und Einsatzelement angeordnet sind (also beide oberhalb oder beide unterhalb). Es sind auch Detektionsmethoden für Fluoreszenzlicht möglich.

[0036] Die Beobachtung von lebenden Zellen, spektrophotometrische Messungen, aber auch andere Anwendungen im Bereich der Biochemie und anderer Gebiete können mittels der, mit dieser Erfindung ermöglichten Methoden durchgeführt werden. Es ist möglich, eine Oberflä-chenfunktionalisierung am Boden des Einsatzelements und/oder am Boden einer Multiwellplatte vorzunehmen (z.B. Beschichtung der Oberfläche mit Kollagen, um die Verbindung von Zellen in einer Flüssigkeit zu begünstigen).

[0037] Das Einsatzelement kann steril verpackt geliefert werden, um direkt vor der Verwendung 5/10 österreichisches Patentamt AT510 898B1 2014-11-15 ausgepackt zu werden.

[0038] Die Multiwellplatte und das Einsatzelement können als zusammenpassendes Set (z.B. als Bausatz), aufeinander abgestimmt sein.

[0039] Der Boden des Einsatzelementes kann optisch transparent sein, während die Seitenwände diffus brechend oder opak sein können. Dies kann durch Beschichtung, Sandstrahlung, Einfärben/Streichen o.ä. erfolgen.

[0040] In einer 6 Well Platte kann das Probenvolumen 4 ml bis 5 ml betragen. In einer 96 Well Platte kann das Probenvolumen 300 μΙ bis 400 μΙ betragen. Andere Volumina im Picoliter-, Nanoliter-, Microliter- oder Milliliter-Bereich sind ebenso möglich.

[0041] Die Stärke der Bodenplatte des Einsatzelementes kann 170 pm betragen. Diese Dimensionen können an die Linseneigenschaften eines optischen Systems angepasst werden.

[0042] Eine Vorrichtungsmöglichkeit der Erfindung bewirkt die Korrektur optischer Artefakte, die durch die Lichtbrechung an Menisken in der Phasenkontrastmikroskopie entstehen. In der Phasenkontrastmikroskopie werden gewöhnlich bei Versuchssituationen, in denen an der Luft-Medium-Schnittsteile Menisken in einer Krümmung auftreten, Anomalien sichtbar. Brechungen an dieser Grenzfläche resultieren aus einer Beugung des Lichts weg vom Phasenring und führen in der Phasenkontrastmikroskopie zu Kontrastarmut oder dem Verlust des Bildes. Der Ausgleich dieser Beugung erfordert eine Veränderung an der Grenzfläche (Interface) dahingehend, dass sie parallel zum Probenträger ausgerichtet werden muss. Eine Konstruktion bestehend aus einem Deckglas in paralleler Ausrichtung zum Probenträger-Sichtfenster ermöglicht die Beobachtung der Probe aus größerer Entfernung von der Mitte der Vertiefung, ohne zu Verzerrungen oder einem Verlust des Bildes zu führen.

[0043] In einer beispielhaften Vorrichtung wird ein optisches Einsatzelement für Multiwellplatten verwendet. Damit wird das Betrachtungsfeld bei der mikroskopischen Auswertung von Multiwellplatten vergrößert und werden Meniskusverzerrungen wirksam korrigiert.

[0044] Eine Vorrichtung der Erfindung ist für Untersuchungen, die die Beobachtung kurzlebiger Zellen erfordern, konzipiert, die Beobachtungen über einen Zeitraum von drei oder mehr Tagen ermöglicht. Dafür kann der Einsatz von Kammern mit Kohlendioxid-Atmosphäre nötig sein. Eine solche Vorrichtung kann für sechs, zwölf oder mehr Kammern hergestellt werden.

[0045] Ein Einsatzelement kann gemäß einer beispielhaften Vorrichtung ein verbessertes Betrachtungsfeld in einer Vertiefung erzeugen, so dass das Mikroskopieren (z.B. mittels Phasenkontrast) bei Monitoring-Versuchen ohne die störenden Einflüsse von Meniskus- Krümmungen geschehen kann. Der Meniskus-Effekt kann durch optische Platten in einer Ebene parallel zum Boden der Vertiefung unterdrückt oder verhindert werden. Dabei können sehr kleine Vertiefungen verwendet werden und somit eine große Anzahl von Betrachtungsfeldern auf einer Multiwellplatte oder auch in einer einzigen Vertiefung ermöglicht werden. Das kann den Vorteil haben, dass von einer Platte eine höhere Informationsgewinnung möglich ist. Durch Veränderungen der optischen Eigenschaften der optischen Platte ist es möglich, definierte Versuchsbedingungen zu gewährleisten, z.B. bezüglich Brechungsindex, Gaspermeabilität, Filtereigenschaften.

[0046] Spezielle Vorrichtungen der Erfindung können für die Beobachtung lebender Zellen verwendet werden, z.B. bei der Verwendung von zwölf oder mehr Kulturvertiefungen. Einsatzelemente gemäß beispielhaften Vorrichtungen der Erfindung sind kostengünstig und einfach und leicht an nahezu jedes System oder Experiment anpassbar.

[0047] Vorrichtungen der Erfindung können mit Roboter-Systemen kombiniert werden und Beobachtungen von oben oder von unten ermöglichen.

[0048] Die Erfindung wird bezugnehmend auf die beispielhaften Vorrichtungen genauer im Folgenden erklärt, wobei sich die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt. 6/10 österreichisches Patentamt AT510 898B1 2014-11-15 [0049] Fig. 1 stellt ein Multiwellplattensystem gemäß beispielhaften Vorrichtungen der Erfin dung dar.

[0050] Fig. 2 zeigt Aufnahmen von Beobachtungen an lebenden Zellen.

[0051] Die Darstellung in den Abbildungen ist schematisch.

[0052] Fig. 1 stellt ein Multiwellplattensystem (100) entsprechend einer beispielhaften Vorrichtung der Erfindung dar.

[0053] Das Multiwellplattensystem (100) besteht aus einer Multiwellplatte (102) mit einer Anzahl von Vertiefungen (104, 106 usw.) aus gewöhnlichem Plastik-Substrat. Die Multiwellplatte (102) kann aus Polystyrol hergestellt sein.

[0054] Jede Vertiefung (104, 106) enthält ein eigenes Einsatzelement (108, 110) das in die entsprechende Vertiefung (104, 106) der Multiwellplatte (102) eingesetzt ist.

[0055] Die Multiwellplatte (102) ist als Mikrotiterplatte geformt. Wie aus Fig. 1 ersichtlich, sind die Vertiefungen (104, 106) so geformt und dimensioniert, dass sie der Form und Dimension der Einsatzelemente (108, 110) entsprechen und so das Einsetzen der Einsatzelemente (108, 110) in die entsprechenden Vertiefungen (104, 106) ermöglichen.

[0056] Eine bewegliche (für das Abfragen der Multiwellplatte 102 siehe Pfeile 112) Lichtquelle (114) z.B. eine licht-emittierende Diode oder ein Laser, bewirkt elektromagnetische Strahlung, die auf die Einsatzelemente (108, 110) gerichtet ist. Ein Detektor (116) ist unterhalb der Multiwellplatte (102) zur Beobachtung der elektromagnetischen Strahlung nach ihrer Verbreitung durch das entsprechende Einsatzelement (108, 110) durch die Vertiefung (104, 106) durch die flüssige Probe (118) in jeder Vertiefung (104, 106) angebracht. Ein abgestimmtes Detektorelement (116) beobachtet den elektromagnetischen Strahlungsstrahl.

[0057] Im Folgenden ist das Einsatzelement (108) genauer beschrieben. Die Bauart von Einsatzelement (110) ist ähnlich oder gleich.

[0058] Das Einsatzelement (108) ist für das Einsetzen in die Vertiefung (104) in der Multiwellplatte (102) vorgerichtet und besteht aus einem Befestigungselement (120) in Form eines Ringes mit vorstehenden Teilen (122) für das Befestigen in entsprechend geformten Nutrillen in der Oberfläche der Multiwellplatte (102). Durch die Einrastvorrichtungen (122) mit den korrespondierenden Nutrillen wird die Rotation des Einsatzelementes (108) verhindert und eine fixe räumliche Anordnung der beiden Teile zueinander gewährleistet. Das Befestigungselement (120) ist so gerichtet, dass das Einsatzelement (108) so an der Vertiefung (104) montiert werden kann, dass es nach Montage in die Vertiefung (104) hineinragt.

[0059] Ein Meniskusausgleichselement (124) ist Teil des Bodens des Einsatzelementes (108) und so konstruiert, dass es einen Meniskus an der Oberfläche einer Flüssigkeit (118) in einer Vertiefung (104) so verdrängt in dem es einen Oberflächenanteil der Flüssigkeit (118) verlagert, sobald es in die Vertiefung (104) eingesetzt ist. Aus Fig. 1 ist ersichtlich, dass die Bodenfläche (126) des Meniskusausgleichselementes (124) planar ist. Das Meniskusausgleichselement (124) ist optisch transparent. Eine lotrechte Verbindungswand (130) verbindet das Meniskusausgleichselement (124) mit dem Befestigungselement (120). Die Verbindungswand (130) kann optisch diffus oder schwarz gefärbt sein, um gegenseitige störende Beeinflussungen zwischen angrenzenden Vertiefungen (106, 108) zu vermeiden.

[0060] Das Einsatzelement (108) ist mittels Spritzgussverfahren aus einem Teil gefertigt und besteht aus Polycarbonat.

[0061] In Fig. 2 sind die Darstellungen (400) ersichtlich.

[0062] Zellen, die in und auf einem Gel im Phasenkontrast kultiviert werden, sind in 96 Well Platten schwer zu analysieren (vgl. A, C). Die Vertiefung ist klein und der Meniskus wirkt sich über das gesamte Beobachtungsfeld störend auf den Phasenkontrast aus (vgl. A, C). Bei Verwendung der Vorrichtung aus Fig. 3 kann eine Ausweitung des Beobachtungsfelds bewirkt werden, wodurch fast der gesamte Vertiefungsquerschnitt für Phasenkontrast-Untersuchungen 7/10 österreichisches Patentamt AT510 898B1 2014-11-15 genützt werden kann (vgl. B, D).

[0063] Multiwell Platten können verschiedene Größen haben, z.B. 6, 12, 24, 96 wells etc. Aufgrund der Meniskusbildung an der Oberfläche von Flüssigkeiten ist der auslesbare Bereich des Beobachtungsfelds, z.B. bei Phasenkontrast-Mikroskopie reduziert.

[0064] Tabelle 1 stellt die maximal brauchbaren Durchmesser von Beobachtungsfeldern im Verhältnis zu den Durchmessern der Vertiefungen (Wells) einer Multiwellplatte mit und ohne Verwendung des Einsatzelements (108, 110) aus Fig. 1 dar.

Anzahl der Vertiefungen Durchmesser Vertiefung (mm) BF ohne Einsatzelement (mm) BF mit Einsatzelement (mm) Anstieg (%) 12 22 12, 6 20 59 24 15,6 6,2 13, 6 119 96 6,1 3,7 370 [0065] Tabelle 1: Anstieg des brauchbaren Beobachtungsfeldes bei verschiedenen Vertiefungsdurchmessern.

[0066] Der Anstieg im Beobachtungsfeld (BF) wird einmal mit und einmal ohne Verwendung eines Einsatzelements (Fig. 1) dargestellt, wobei die Verwendung des Einsatzelements das Beobachtungsfeld beträchtlich vergrößert und bei einer 24 Well Platte zur Verdopplung des Beobachtungsfelds führt. Die Konstruktion des Einsatzelements (Fig. 1, 108, 110) ermöglicht einen ständigen Gasaustausch mit dem Kulturmedium, sodass auch während der Beobachtung der Gasaustausch gewährleistet ist. 8/10

Claims (6)

1. österreichisches Patentamt AT510 898B1 2014-11-15 Patentansprüche: 1. Ein Einsatzelement (108, 110) für den Einsatz in eine Vertiefung (104, 106) einer Multiwellplatte (104), das einen permanenten Gasaustausch an der Flüssigkeitsoberfläche (118) nicht behindert und dadurch die mikroskopische Beobachtung von lebenden Zellen über mehrere Tage ermöglicht, bestehend aus einem Befestigungselement (120) in der Form eines Ringes, einem Meniskusausgleichselement (124), welches für den Ausgleich eines Meniskus an der Oberfläche einer Flüssigkeit in einer Vertiefung durch das Verlagern von Oberflächenanteilen der Flüssigkeit sorgt, wenn das Einsatzelement (108, 110) in eine Vertiefung (104) eingesetzt ist und einer lotrechten Verbindungswand (130), dadurch gekennzeichnet, dass das Einsatzelement (108, 110) ein Befestigungselement (120) mit einer Einrastvorrichtung (122) für das Befestigen in entsprechend geformte Nutrillen in der Oberfläche einer Multiwellplatte (102) aufweist.
2. 2. Das Einsatzelement (108, 110) aus Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass, das Befestigungselement (120) einen ringförmigen Bereich aufweist, der für die Befestigung auf einem planaren Bereich der Multiwellplatte rund um eine Vertiefung (104) gerichtet ist.
3. 3. Das Einsatzelement (108, 110) aus Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Befestigungselement (120) eine Einrastvorrichtung für die Montage an der entsprechenden Einrastvorrichtung (122) auf der Multiwellplatte rund um eine Vertiefung (104) enthält.
4. 4. Das Einsatzelement (108, 110) aus Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrastvorrichtung (122) mindestens einen Stift enthält, der in der entsprechenden Nutrille einer Multiwellplatte im Bereich um eine Vertiefung (104) geführt werden kann.
5. 5. Das Einsatzelement (108, 110) aus Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Befestigungselement (120) so in Nutrillen (122) einer Multiwellplatte einrastet und dadurch Rotationsbewegungen des Einsatzelementes (108, 110) relativ zur Multiwellplatte in eingesetztem Zustand verhindert.
6. 6. Das Einsatzelement (108, 110) aus Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungswand (130) aus einem optisch opaken Anteil oder einem diffus streuenden Material besteht, um unerwünschte Einflüsse umgebender Strahlung auf die Vorgänge im Bereich der Vertiefung (104) auszuschließen. Hierzu 1 Blatt Zeichnungen 9/10