KR102027632B1 - 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

고온성 미생물 배양용 고체배지조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 아가, 검류를 포함하는 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물 및 이의 제조방법을 제공하며, 상기 구성에 의하면 고온성 미생물을 배양 및 분리하기에 적정한 고온에서의 배양 조건에 맞는 젤 강도 및 탄력성을 부여하고, 미생물이 생성하는 산과 염기에 내산성, 내염기성을 지닌 고체 배지를 제공한다.

Description

고온성 미생물 배양용 고체배지조성물 및 그 제조방법{Solid medium composition for culturing thermophilic microbes and the method thereof}
본 발명은 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고온성 미생물을 배양 및 분리하기에 적정한 고온에서의 배양 조건에 맞는 젤 강도 및 탄력성을 부여하고, 미생물이 생성하는 산과 염기에 내산성, 내염기성을 지닌 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
해양의 열수공, 온천, 휴화산 등의 45℃ 이상에서 서식하는 고온성 미생물은 특이 항생물질, 생리활성물질, 항암물질, 유용 단백질 또는 효소 등과 다양한 유용한 물질 등을 생산하는 특성이 있기 때문에 신약, 진단키트, 항생제, 항암 소재 및 기능성 식품 소재로 활용하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다.
특히, 이와 같은 고온성 미생물들은 고온, 강산성, 강알칼리성 등과 같은 극한조건에서 생존하기 때문에 배양 및 분리가 매우 까다로운 문제점이 있다. 일반적으로 사용되고 있는 아가 고체 배지는 극한조건(고온, 강산성 및 강알칼리성 조건)에서 배양할 경우에 아가를 이용한 고체배지는 젤강도(gel strength)가 약해지고, 젤 구조의 파괴 및 이액현상(syneresis)으로 인한 수분 유실 등과 같은 다양한 문제점이 발생한다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 아가를 대체할 수 있는 바이오폴리머는 젤라틴, 펙틴, 젤란검 및 카라기난 등이 있는 것으로 여겨지고 있다.
젤라틴은 육상동물에서 유래되는 바이오폴리머로서 경제적으로 얻을 수 있으며, 저온에서 젤을 형성(cold-set-gelation)하고 미생물의 생육에 필요한 영양원으로 사용될 수 있는 특징이 있다. 그러나 미생물에 의하여 쉽게 가수분해가 되어 젤의 구조가 파괴되고 액상으로 되는 단점이 있다.
펙틴은 고메톡실펙틴(high methoxy pectin)과 저메톡실펙틴(low methoxyl pectin)으로 구분되어지며, 고메톡실펙틴은 50~70℃의 온도범위에서 젤이 형성되며, 70~100℃의 온도범위에서 젤이 녹기 때문에 고온 미생물을 배양하기에 적합한 온도 특성이 있다. 젤의 특징으로서 부서짐성(brittless), 탄력성(elasticity), 이액현상(syneresis)이 동시에 발생한다. 저메톡실펙틴은 이가 양이온(Ca2+)과 결합하여 젤을 형성하는 이온결합 젤을 형성한다. 젤의 특성으로서 부서짐성(brittless), 이액현상(syneresis)이 동시에 발생한다. 미국특허 제4,214,186호(Pectin culture and method)에서는 2.5%의 저메톡실펙틴 용액에 염화칼슘(CaCl2)을 첨가하여 미생물 배양을 위한 고체배지제조 기술을 제시하였다. 그러나 고온성 미생물 배양에 적합한 젤 강도와 이액현상을 억제하는 방법에 대하여서는 제시하지 못하였다.
젤란검은 아가를 대체하여 고온성 미생물을 배양하는데 가장 널리 사용되고 있는 바이오폴리머로서 젤라이트(gelrite)로 알려져 있다. 젤란검은 고아실젤란검과 저아실젤란검이 있으며, 고아실젤란검은 염화칼슘을 첨가할 경우에 65℃ 이하에서 부드러우며 탄력성이 있는 젤을 형성한다. 저아실젤란검은 염화캄슘을 첨가하여 25℃ 이하에서 강한 젤을 형성하며, 부서짐성이 있는 특징이 있다. Lin et al. (1984, Gelrite as a gelling agent in media for the growth of thermopholinc microorganism, Applied and Environment Microbiology, p427-429)은 0.1%의 염화칼슘을 첨가한 젤란검 고체배지에 고온성 미생물을 접종하여 70℃에서 48시간 동안 배양한 결과를 보고하였는데, 이와 같은 연구결과는 젤란검을 고온성 미생물 배양에 사용이 가능하다는 것을 알려준다. 하지만 젤란검은 고온성 미생물 배양에 적합한 바이오폴리머이긴 하나 쉽게 부서지며, 매우 고가에 유통되고 있기 때문에 저가의 바이오폴리머로 대체할 필요가 있다.
카라기난은 해양 홍조류에서 유래되는 바이오폴리머로서 칼슘이온을 첨가하고 40℃ 이하의 저온에서 젤을 형성한다. 카라기난은 강한 젤을 형성하고, 탄력성이 있으며 이액현상이 발생하지 않는 특징이 있기 때문에 기존의 바이오폴리머와 같이 배지로서 사용할 경우에 문제가 되는 이액현상을 방지할 수 있는 특징이 있다. 또한, 카라기난 젤은 산성에서 염기성의 광범위한 pH 범위와 냉동과 해동 등과 같은 극한의 온도범위에서도 안전한 특징이 있다.
플루란은 Aureobasidum pullulans을 이용하여 전분발효 중에 생산되는 바이오폴리머로서 매우 값싼 가격으로 생산할 수 있다. 또한 pH 3~8범위에서 안정하며 다른 물질과 화학반응을 하지 않는다. 탄력성이 있고 이액현상이 발생하지 않아 다양한 폴리머와 혼합하여 젤의 이화학적 구조를 안정화 시킬 수 있는 장점이 있다.
위와 같은 선행기술에 제시한 배지뿐만 아니라 현재 사용이 되고 있는 바이오폴리머를 이용한 고체배지는 광범위한 pH 범위, 고온에서 생존하는 미생물을 배양할 경우에 이액현상, 부서짐성, 젤의 강도 저하 등과 같은 문제점들을 해결하기 위한 기술은 제시되지 못하고 있다. 또한, 현재 고온성 미생물 배양을 위해 가장 일반적으로 사용되는 젤란검은 강산성 및 강알칼리성에서 사용이 어렵고, 매우 고가에 판매되고 있으므로 다양한 pH 범위에서 사용이 가능하며 저가의 바이오 폴리머로 대체할 필요가 있다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 고온성 미생물을 배양 및 분리하기에 적정한 고온에서의 배양 조건에 맞는 젤 강도 및 탄력성을 부여하고, 미생물이 생성하는 산과 염기에 내산성, 내염기성을 지닌 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물 및 이의 제조방법을 제공함에 있다.
상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.
(1) 펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 아가, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외)를 포함하는 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물.
(2) 상기 (1)에 있어서, 양이온을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물.
(3) 상기 (1)에 있어서, 양이온은 이가 양이온인 것을 특징으로 하는 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물.
(4) 상기 (3)에 있어서, 양이온은 칼슘 또는 마그네슘인 것을 특징으로 하는 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물.
(5) 펙틴 10~20중량%, 젤란검 10~20중량%, 카라기난 10~20중량%, 플루란 10~20중량%, 아가 10~20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 10~20중량% 및 이가 양이온 0.1~1.0중량%를 포함하는 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물.
(6) 펙틴 10~20중량%, 젤란검 10~20중량%, 카라기난 10~20중량%, 플루란 10~20중량%, 아가 10~20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 10~20중량% 및 이가 양이온 0.1~1.0중량%를 포함하는 겔화제를 첨가하여 고온성 미생물 배양용 고체배지를 제조하는 방법.
본 발명에 의하면 고온성 미생물을 배양 및 분리하기에 적정한 고온에서의 배양 조건에 맞는 젤 강도 및 탄력성을 부여하고, 미생물이 생성하는 산과 염기에 내산성, 내염기성을 지닌 고체 배지를 제공한다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
배지는 세균, 효모 또는 곰팡이 등의 미생물을 생육 및 번식시키는 영양물이고, 또한 이의 생육 장소이다. 통상적인 배지는 배지 성분으로서 미생물의 생육에 필요한 성분인 글루코스, 유당 등의 당류, 아미노산, 펩톤, 질산염, 암모늄염 등의 질소원, 칼륨, 인, 마그네슘 등의 무기염류, 비타민 등의 생육 인자를 함유하고 있다. 또한, 배지는 단순히 배지성분을 용해수에 용해시킨 액체 배지와 액체 배지에 겔화제를 첨가하여 고화시킨 고체 배지로 대별되어 있다. 본 발명은 고체 배지를 제공하는 것이고, 본 발명의 고체 배지란, 상기 정의한 바와 같이, 한천 등의 겔화제로 고화시킨 평판, 경사면 배지 등을 사용할 때에 고체형의 배지이다.
본 발명에서 겔화제로서는 펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 아가, 및 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외)를 포함한다. 바람직하게는 상기 고체배지조성물은 양이온을 더 포함하며, 보다 바람직하게는 이가 양이온, 예를 들면 칼슘 또는 마그네슘을 포함한다.
본 발명에 따른 고체배지조성물의 겔화제는 바람직하게는 펙틴 10~20중량%, 젤란검 10~20중량%, 카라기난 10~20중량%, 플루란 10~20중량%, 아가 10~20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 10~20중량% 및 이가 양이온 0.1~1.0중량%를 포함한다.
상기와 같이 펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 아가, 및 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외)는 각각 앞에서 설명한 바와 같이 고온성 미생물의 배양을 위한 고체배지의 겔화제 성분으로는 문제점을 갖고 있으나, 이를 혼합한 조성물은 저렴하게 제조가 가능하면서도 이액현상, 부서짐성, 젤의 강도 저하와 같은 문제가 발생하지 않는다.
본 발명에 따른 고체배지조성물은 상기와 같이 펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 아가, 및 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외)와 같은 바이오폴리머의 특정한 조합의 젤화 메카니즘(cold-set gelation, ionotropic gelation)을 이용하여, 개선된 젤화 온도, 젤의 녹는점, 젤의 pH 범위와 같은 물리화학적 특성을 이용하여 광범위한 온도 및 pH 범위에서 사용이 가능한 고온성 미생물 배양을 위한 고체 배지 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 고체배지의 제조방법에 관해서 설명한다.
본 발명의 고체 배지는 통상적인 고체 배지의 제조와 동일하게 고체 배지의 각 성분의 용해수에의 용해 및 고화를 실시하는 것에 의해 달성된다. 예를 들면, 각 배지 성분을 용해수에 용해시키고, 필요에 따라, pH를 조정하고, 상기 용해액에 겔화제를 첨가하여 가열 용해시키며, 멸균하여 샤레 등의 용기에 분주하고, 고화시키는 것을 들 수 있다.
겔화제의 첨가농도는 상기 용해수의 소정량을 100%로 하여, 이의 1.0 내지 10중량%로 하는 것이 바람직하다. 또한, 가열 용해는 겔화제를 충분하게 용해시켜야 하므로 100℃ 이상이 바람직하고, 121℃에서 15분 이상 가열하면 용해와 함께 멸균할 수 있다. 멸균은 통상적인 방법에 따라 고압 증기 멸균법 등에 의해 실시할 수 있다.
용기로서 샤레를 사용하는 경우에는 건조 제거 후의 고체 배지의 양이 10 내지 30ml의 범위인 양을 분주하는 것이 바람직하다. 배지로부터 물을 제거하기 위한 건조 제거방법으로서는 감압 건조법, 진공 건조법, 온풍 건조법, 적외선 건조법, 고주파 건조법 등을 예시할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명하고자 하나 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것으로 해석되어져서는 아니된다.
[실시예 1] 고체배지의 제조
효모 추출물 2.5g, 펩톤 5g 및 글루코스 1g을 용해수 12OOml에 용해시키고, 상기 용해액의 pH를 0.1mol/L 수산화나트륨 용액을 사용하여 7.2로 조정하고, 겔화제(펙틴 10중량%, 젤란검 10중량%, 카라기난 20중량%, 플루란 20중량%, 아가 20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 20중량%로 구성) 15g 및 칼슘이온 0.1g을 첨가하며, 오토클레이브를 사용하여 121℃에서 15분 동안 가열하고, 용해와 동시에 멸균하였다. 멸균 처리된 고체 배지를 무균실 내에서 직경 9cm의 플라스틱제 샤레에 1장당 18g 분주하고, 냉각 고화하였으며, 고화된 배지를 건조기를 사용하여 103 Pa의 압력으로 감압 건조법에 의해 건조시키고, 물 3ml를 제거한다. 그 결과, 배지량 15g의 고체 배지 평판이 수득되었다.
[실시예 2] 고체배지의 제조
겔화제로 펙틴 20중량%, 젤란검 10중량%, 카라기난 10중량%, 플루란 20중량%, 아가 20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 20중량%를 혼합하고 이가 양이온으로 마그네슘이온을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 과정에 의해 고체배지를 제조하였다.
[실시예 3] 고체배지의 제조
겔화제로 펙틴 20중량%, 젤란검 20중량%, 카라기난 10중량%, 플루란 10중량%, 아가 20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 20중량%를 혼합한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 과정에 의해 고체배지를 제조하였다.
[실시예 4] 고체배지의 제조
겔화제로 펙틴 20중량%, 젤란검 20중량%, 카라기난 10중량%, 플루란 10중량%, 아가 20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 20중량%를 혼합한 것을 제외하고 실시예 2과 동일한 과정에 의해 고체배지를 제조하였다.
[비교예 1]
겔화제로 젤란검 20중량%, 카라기난 20중량%, 플루란 20중량%, 아가 20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 20중량%를 혼합한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 과정에 의해 고체배지를 제조하였다.
[비교예 2]
겔화제로 펙틴 20중량%, 카라기난 20중량%, 플루란 20중량%, 아가 20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 20중량%를 혼합한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 과정에 의해 고체배지를 제조하였다.
[비교예 3]
겔화제로 펙틴 20중량%, 젤란검 20중량%, 플루란 20중량%, 아가 20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 20중량%를 혼합한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 과정에 의해 고체배지를 제조하였다.
[비교예 4]
겔화제로 펙틴 20중량%, 젤란검 20중량%, 카라기난 20중량%, 아가 20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 20중량%를 혼합한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 과정에 의해 고체배지를 제조하였다.
[비교예 5]
겔화제로 펙틴 20중량%, 젤란검 20중량%, 카라기난 20중량%, 플루란 20중량%, 검류(펙틴, 젤란검, 카라기난, 플루란, 및 아가는 제외) 20중량%를 혼합한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 과정에 의해 고체배지를 제조하였다.
[실시예 5]
겔화제로 펙틴 20중량%, 젤란검 20중량%, 카라기난 20중량%, 플루란 20중량%, 아가 20중량%를 혼합한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 과정에 의해 고체배지를 제조하였다.
[실험예 1] 물리적 특성
실시예와 비교예를 통해 제조한 고체배지를 대상으로 젤강도, 젤탄력성을 측정하고 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
샘플 젤강도 젤탄력성
경도(N) 부서짐성(N) 탄력성(mm) 응집성
실시예 1 5.1 3.2 1.2 0.6
실시예 2 5.0 3.1 1.2 0.5
실시예 3 5.1 3.0 1.1 0.6
실시예 4 5.0 3.1 1.2 0.5
비교예 1 3.2 1.5 0.7 0.2
비교예 2 3.1 1.6 0.6 0.3
비교예 3 3.2 1.5 0.5 0.3
비교예 4 3.1 1.4 0.7 0.3
비교예 5 3.0 1.5 0.6 0.3
실시예 5 3.1 1.6 0.6 0.2
젤강도와 젤탄력성은 물성분석기(texture analyzer)를 이용하여 측정하였으며, 최대 하중은 10 N, 실험에 사용한 프루브(probe)는 지름 10 cm (원형의 바닥이 평평한 모양)인 것을 사용하였다. 고체배지의 두께는 1 cm 이였으며 가로와 세로는 각각 2 cm 이였다. 측정은 TPA (texture profile analysis)을 이용하여 변형율(deforamtion ratio)은 50%로 조정하였다. 젤 강도는 경도(hardness)와 부서짐성(fracturability)을 젤탄력성은 탄력성(springiness)과 응집성( cohesiveness)을 각각 측정하여 비교하였다.
[실험예 2] 화학적 특정
실시예와 비교예를 통해 제조한 고체배지를 대상으로 공시된 방법에 따라 내산성, 내염기성을 측정하고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
샘플 pH 3 수용액 참지 pH 12 수용액 침지
실시예 1 2.8 2.9
실시예 2 2.8 2.8
실시예 3 2.9 2.8
실시예 4 2.8 2.8
비교예 1 1.0 0.9
비교예 2 0.9 0.9
비교예 3 0.9 0.8
비교예 4 0.8 0.8
비교예 5 1.0 0.9
실시예 5 1.0 0.9
내산성과 내염기성 조건은 염산과 수산화 나트륨을 이용하여 pH를 3, 12의 수용액을 제조하였다. 고체배지를 10 분간 pH 조정 수용액에 침지한 후 물성 분석기를 측정에 사용하였다. 산과 염기에 침지한 고체배지의 내산성과 내염기성 특성은 젤강도와 젤 탄력성을 측정함으로서 확인 하였다. 분석에 사용한 물성분석기(texture analyzer)의 작동조건은 최대 하중 10 N, 실험에 사용한 프루브(probe)는 지름 10 cm (원형의 바닥이 평평한 모양)인 것을 사용하였다. 고체배지의 두께는 1 cm 이였으며 가로와 세로는 각각 2 cm 이였다. 측정은 TPA (texture profile analysis)을 이용하여 변형율(deforamtion ratio)은 50%로 조정하였으며, 부서짐성(fracturability)을 측정하여 비교하였다.
[실험예]
시험균주로는 고온성 미생물인 브레비바실러스 보스테렌시스 BCS-1(Brevibacillus borstelensis BCS-1, KCTC 0673BP)를 분양받아 이용하였다. 상기 실시예 내지 비교예에서 제조한 각 시료의 1평판에 시험 균주의 희석액을 0.1ml 도말하고, 60℃에서 48시간 동안 배양하여 집락수를 육안으로 관찰하였다. 한편, 시험은 5회 실시하여 집락수의 평균치를 산출하였다. 본 시험의 결과는 표 3에 기재된 바와 같다. 표 3에서 명백한 바와 같이, 비교예의 시료와 본 발명 실시예의 시료를 비교하여 본 결과, 균주의 생육이 억제되지 않으면서, 파괴 및 이액현상이 발견되지 않아 고온성 미생물의 생육 배지로써 매우 적합함을 확인할 수 있다.
샘플 집락수 파괴 및 이액현상 유무
실시예 1 101 ×
실시예 2 103 ×
실시예 3 108 ×
실시예 4 107 ×
비교예 1 52 ○
비교예 2 48 ○
비교예 3 58 ○
비교예 4 63 ○
비교예 5 59 ○
실시예 5 71 ○

Claims (6)

  1. 효모추출물, 펩톤, 글루코스, 겔화제 및 양이온을 포함하되, 상기 겔화제는 펙틴 20중량%, 젤란검 20중량%, 카라기난 20중량%, 플루란 20중량%, 및 아가 20중량%로 이루어지고, 상기 양이온은 칼슘 또는 마그네슘인 것을 특징으로 하는 45℃이상의 고온성 미생물 배양용 고체배지조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
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