KR101704894B1 - 라이소자임을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)를 배양하여 그 배양물로부터 라이소자임을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

라이소자임을 제조하는 방법{The method for manufacturing lysozyme}

본 발명은 미생물로부터 라이소자임을 제조하는 방법에 관한 것으로, 특히 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)를 배양하여 그 배양물로부터 라이소자임을 제조하는 방법에 관한 것이다.

라이소자임은 난백에서 발견되는 효소로, 세균이 보호 목적으로 주변에 만든 피막의 구성 성분인 탄수화물 분해를 촉진한다. 구체적으로, 라이소자임은 그람양성균, 대장균, 살모넬라 등 그람음성균의 세포벽을 분해하는 기능을 가졌으며, 세포벽을 구성하고 있는 다당 N-아세틸글루코사민(NAG)과 N-아세틸뮤라믹산(N-Acetylmuramic acid: NAM)의 축합물인 β-1.4 -글루코시드 결합을 절단하는 역할을 한다.

이러한 라이소자임의 우수한 항균력과 안전성이 인정이 되어 천연 항균제 및 식품보존제로 식품, 농,축산, 의약품 소재로의 적용 방안에 대한 연구는 상당히 진행되어 왔으나, 현재까지 상업적으로 생산되거나 기능성 연구에 활용되는 라이소자임의 자원은 모두 난백이다. 라이소자임은 국내 의료용 효소 시장의 40%를 점유하고 있으며 연간 약 20톤을 수입하고 있는 실정이다. 현재 우리나라는 라이소자임을 고가로 수입하고 있어서 식품 산업체에서는 생산 원가를 상승시켜서 우수한 항균력을 보유한 라이소자임을 실제적으로 적용하지 못하고 있는 실정이다.

대한민국 공개특허 제 2003-0025969호 등에서, 유전자재조합 기술을 통하여 난백 라이소자임을 대량 생산하고자 하는 시도가 있었으나, 이와 같이 유전자재조합 균주에서 생산된 난백 라이소자임은 생산율이 현저히 낮을 뿐 아니라 기존 난백 라이소자임에 비해 현저히 낮은 활성도를 보유하는 문제가 있다. 더욱이, 유전자 재조합 식품에 대한 소비자 인식은 호의적이지 않아 상품화가 어려우며, 실제로 미국 식품의약품안전청(FDA)에서 모유 라이소자임을 함유한 유전자 변형된 쌀의 상업적 상품화에 대하여 승인을 불허가한 사례가 있다.

한편, 미생물은 우수한 효소 자원으로서 동, 식물체가 가지고 있는 여러 제약점을 극복할 수 있어서 식품, 의약품용 효소 외의 용도로도 미생물을 효소의 생산원으로 활발히 이용되고 있다. 그러나, 라이소자임의 경우, 세균의 세포벽을 구성하고 있는 NAG와 NAM 사이의 β-1,4-glycoside 결합을 절단하는 작용을 하여 세포를 용해하기 때문에, 미생물은 라이소자임의 자원이 될 수 없다는 것이 현재 지배적인 의견이다. 따라서, 유전자 재조합 기술을 활용 없이 미생물 자체로부터 라이소자임의 생산 방안에 대안 연구는 전무한 실정이다.

대한민국 공개특허 제 2003-0025969호

상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 기존에 시도되지 않은 미생물 등 다양한 생물자원을 이용하여 라이소자임을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)를 배양하여 그 배양물로부터 라이소자임을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 배양물은 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)를 pH 6 내지 8의 조건에서 10 내지 20 시간 동안 1차 배양하여 배양액을 제조한 후, 상기 배양액을 1 내지 5%의 농도로 배지에 접종하여 2차 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 1차 배양 및 2차 배양에 사용된 배지는 중영양(mesotrophy) 또는 빈영양(oligotrophy) 배지일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 라이소자임을 제공한다.

본 발명은 항균력이 우수한 효소인 라이소자임의 자원으로써 미생물을 이용함으로써 동, 식물체가 가지고 있는 여러 제약점을 극복할 수 있다. 또한, 본 발명은 난백이 라이소자임의 대량 생산을 위한 유일한 자원이라는 기존의 지식을 탈피하는 미생물 유래 라이소자임 제조 방법에 관한 것으로, 라이소자임의 생산 원가를 낮출 수가 있어 다양한 산업에 적용할 수 있으며, 종래의 난백유래 라이소자임에 비해 현저히 높은 활성도를 나타낼 뿐 아니라 현저히 우수한 항균활성을 나타낸다.

도 1은 기존 라이소자임(hen egg white lysozyme; HEWL)과 미생물 유래 라이소자임의 촉매 활성과 단백질을 비교하여 나타낸 표이다.
도 2는 기존 라이소자임(hen egg white lysozyme; HEWL)과 미생물 유래 라이소자임의 활성을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3 내지 8은 기존 라이소자임(hen egg white lysozyme; HEWL)과 미생물 유래 라이소자임의 미생물 증식 억제효과를 비교하여 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 미생물을 이용하여 라이소자임을 제조하는 방법 및 이에 따라 제조된 라이소자임에 대한 것이다. 구체적으로 본 발명은 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)를 배양하여 그 배양물로부터 라이소자임을 제조하는 방법에 대한 것이다.

앞서 설명한 바와 같이, 현재 식품, 의약품 업체에서 이용되고 있는 라이소자임은 모두 난백으로부터 분리한 것으로, 미생물을 이용한 라이소자임의 생산에 대한 연구는 전무한 실정이나, 본 발명자는 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540) 균주로부터 우수한 활성을 나타내는 라이소자임을 성공적으로 분리하고, 상기 라이소자임의 현저히 우수한 활성 및 미생물 증식 억제 효과를 실험적으로 확인하였다.

본 발명의 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)를 배양하여 그 배양물로부터 라이소자임을 제조하는 방법에서, 상기 배양물은 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)를 1차 배양 하여 배양액을 제조한 후, 그 배양액을 배지에 접종하여 2차 배양하는 단계를 포함하여 제조되는 것일 수 있다.

본 발명에서 1차 배양은 단일 콜로니 형태의 균을 활성화 하는 단계이며, 2차 배양에서는 본격적으로 더 많은 균체의 배양과 라이소자임의 획득을 목적으로 한다.

상기 1차 배양은 pH 6 내지 8의 조건에서 8 내지 24 시간 동안 배양하는 것일 수 있다.

또한, 상기 1차 배양은 10-55℃의 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.

상기 2차 배양은 상기 1차 배양에서 수득된 배양액을 1 내지 5%의 농도로 배지에 접종하여 2차 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것일 수 있다.

상기 2차 배양은 20 내지 120 시간 동안 배양하는 것일 수 있다.

상기 1차 배양 및 2차 배양에 사용된 배지는 중영양(mesotrophy) 또는 빈영양(oligotrophy) 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 R2A 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 1차 배양 및 2차 배양을 통해 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)의 배양물을 제조한 후, 이를 원심분리하여 라이소자임을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 라이소자임을 포함한다. 본 발명의 라이소자임은 식품 또는 약학 분야에 다양하게 활용 가능하다.

실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 하기의 실시예는 본 발명의 범위 내에서 당업자에 의해 적절히 수정, 변경될 수 있다.

실시예 1. 라이소자임 분비 균주의 배양물로부터 라이소자임 제조

미생물자원센터로부터 분양받은 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)의 한 개의 콜로니를 1ml의 R2A 배지(표 1, pH 7.2)에서 29℃에서 18시간 1차 배양한 후 상기 배양액을 2.5%가 되도록 R2A 배지에 2차 접종을 하여 29℃에서 24-36시간 2차 배양하였다. 배양액을 원심분리(6,000 rpm, 30분, 4℃) 한 후 상등액을 채취하였다. 하기 표 1은 R2A 배지 조성(g/L)을 나타낸다.

Proteose peptone	0.5
Yeast extract	0.5
Acid digest of casein	0.5
Glucose	0.5
Soluble starch	0.5
Dipotassium phosphate	0.3
Magnesium sulphate	0.024
Sodium pyruvate	0.3

실시예 2. 라이소자임 분비 균주의 배양물로부터 라이소자임 제조

상기 실시예 1에서, 배양액을 1%가 되도록 R2A 배지에 2차 접종한 것과, 2차 배양시간을 24시간으로 한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 라이소자임을 제조하였다.

실시예 3. 라이소자임 분비 균주의 배양물로부터 라이소자임 제조

상기 실시예 2에서, 2차 배양시간을 48시간으로 한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 라이소자임을 제조하였다.

실시예 4. 라이소자임 분비 균주의 배양물로부터 라이소자임 제조

상기 실시예 2에서, 2차 배양시간을 96시간으로 한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 라이소자임을 제조하였다.

비교예 1. 난백유래 라이소자임의 준비

난백유래 라이소자임(hen egg white lysozyme; HEWL, Sigma-Aldrich)을 준비하였다.

실험예 1. 실시예와 비교예의 라이소자임의 활성도 평가

(1) 단백질 함량 측정 (흡광도 측정)

상기 균주 상등액 100 ul에 1ml의 Coomassie Brilliant Blue G-250 시험액을 혼합한 후 실온에서 20-30분간 방치한 후 595 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 0.2 mg/ml의 bovine serum albumin을 희석하여 작성한 후 단백질 함량을 측정하여 도 1에 나타내었다.

(2) 라이소자임 활성도 측정

실시예 1과 비교예 각각의 라이소자임 활성도를 측정하기 위하여, 그람양성균인 미크로코쿠스 리소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus) 건조 세포를 사용하여 다음과 같이 실험하였다.

0.1M 인산 나트륨(sodium phosphate) (pH 6.0)에 미크로코쿠스 리소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus) 건조 세포를 0.2 mg/ml가 되도록 용해하여 기질 용액을 준비하였다. 상기 균주 상등액 0.2 ml를 기질 용액 1.8 ml에 혼합한 즉시 450 nm의 파장의 흡광도를 10 분 동안 2초 간격으로 실온에서 측정하였다. 흡광도 감소 곡선에서 직선적으로 감소하는 구간의 감소량을 시간으로 나누어 계산하여 라이소자임 활성도를 계산하였다. 라이소자임 단위로 1 unit은 0.1 M 인산 나트륨(sodium phosphate) (pH 6.0)에 용해되어 있는 미크로코쿠스 리소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus)를 분해하여 흡광도 감소(1분 당 0.001)를 일으키는 양을 말한다.

비특이적 활성도(specific activity)는 라이소자임 활성도(Unit)를 단백질량(mg)으로 나누어 계산하였다.

실시예 1(T. koreensis)과 비교예(HEWL) 각각의 라이소자임 비특이적 활성도를 도 2에 비교하여 나타내었다. 도 2를 참고하면, 본원 발명의 방법에 따라 미생물의 배양물로부터 제조된 라이소자임(실시예; T. koreensis)의 경우 종래기술인 난백으로부터 유래된 라이소자임(비교예; HEWL)에 비해 4배 이상의 현저히 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

실험예 2. 실시예와 비교예의 미생물 사멸 효과 평가

본 발명에 의해 제조된 라이소자임의 항균활성을 평가하기 위하여, 다음과 같이 Gram 양성 균 4종 및 Gram 음성 균 2종에 대하여 상기 비교예 및 실시예 2 내지 4의 라이소자임을 처리한 후 균 억제율을 측정하였다.

구체적으로, Micrococcus luteus, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Escherichia coli 및 Vibrio parahaemolyticus의 각각의 균주를 액체배지(Tryptic soy broth)에 1% 접종한 후, 비교예 1의 난백라이소자임(단백질 농도 10 mg/ml) 및 실시예 2 내지 4의 라이소자임이 각각 포함된 조효소액 1 내지 3(단백질 농도 0.02 mg/ml) 을 첨가하여 24시간동안 배양하였다. 그 후, 각 균주의 증식 억제율(%)을 표 2 및 도 3 내지 8에 나타내었다.

상기 표 2 및 도 3 내지 도 8의 실험결과를 참조하면, 본 발명의 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis)를 사용한 조효소액은 Micrococcus luteus와 Bacillus cereus에 대해서 각각 난백라이소자임보다 약 13배, 약 3배 높은 억제 활성을 보였다. Staphylococcus aureus에 대해서는 난백라이소자임과 유사하게 균의 성장을 저해하였으며, Escherichia coli에 대해서는 난백라이소자임의 약 2배 높은 활성을 나타내었다.

상기 실험 결과를 통해, 본 발명의 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis)로부터 제조된 라이소자임은 종래의 난백유래 라이소자임에 비해 현저히 높은 활성도를 나타낼 뿐 아니라 현저히 우수한 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

Claims (4)

1. 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)를 pH 6 내지 8의 조건에서 8 내지 24 시간 동안 1차 배양하여 배양액을 제조한 후, 상기 배양액을 1 내지 5%의 농도로 배지에 접종하여 2차 배양하는 단계를 포함하고, 상기 1차 배양 및 2차 배양에 사용된 배지는 R2A 배지인 서모모나스 코리엔시스(Thermomonas koreensis) (KCTC 12540)로부터 라이소자임을 제조하는 방법.
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