CN116024114A - 一种肠源枯草芽孢杆菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肠源枯草芽孢杆菌株及其制备方法和应用，肠源枯草芽孢杆菌N65具备较好的抗逆性及抑菌、产酶等益生特性，具备开发为饲用抗生素替代类功能微生态制剂的潜力，为功能微生态制剂的差异化开发提供优良菌株资源。通过高温孵育、胆盐耐受及指示菌的对峙培养方法从健康猪肠道内容物中分离获得1株具有较强的产酶能力和广谱抑菌性能的菌株N65，形态学和16S rDNA分子鉴定确认其为枯草芽孢杆菌。其无菌发酵上清液的抑菌活性成分具备良好的温度、胆盐、pH及人工胃肠液的耐受性，溶血反应小，基本不具备溶血风险，展示了较为良好的生物学特性，为功能微生态制剂的差异化开发及应用提供了良好的菌株资源。

Description

一种肠源枯草芽孢杆菌株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及枯草芽孢杆菌的技术领域，具体涉及一种肠源枯草芽孢杆菌株及其制备方法和应用。

背景技术

抗生素作为20世纪最重要的发明之一，对治疗人类疾病发挥了历史性的贡献，不仅挽救了数百万人的生命，延长了预期寿命，而且被广泛用作牲畜的生长补充剂，改善动物的整体健康状况，提高产量和质量，在实现畜牧业快速发展方面也做出了巨大贡献。然而，随着养殖业的发展，滥用和过度使用抗生素及其不当处置导致了一系列重大的健康和环境问题。抗生素不仅在肉产品及粪污中残留，影响动物生产及生态环境，还通过食物链传递，威胁人类健康，特别是微生物对抗生素耐药性的兴起与传播，引发全球性健康危机。考虑到其危害，世界各国政府与组织在对饲用抗生素的规范使用进行一些列部署的同时，也一直鼓励抗生素替代品的科学研究与开发。鉴于抗生素的肠道作用特点，新型抗生素的替代品至少应具备以下几个重要特征：1)调整肠道共生物微生物群落结构；2)保证动物肠道结构完整，促进营养物质吸收；3)维护肠道免疫系统稳态，保持动物健康度。这些作用互相关联，并且都与肠道健康直接相关，只要把关键的注意点放到促进动物的肠道健康上，就可以在不牺牲动物生产性能和健康的基础上减少抗生素的使用。

功能型微生态制剂作为替抗产品的典型代表之一，不仅作为“活的”益生菌，竞争占位及生物夺氧等方式抑制肠道内的病原微生物，帮助动物建立有利于宿主的肠道微生态区系。而且其相关功能代谢产物或副生产物，也称为后生元，还能够在动物肠道发挥作用，提高动物的抗病能力，从而促进动物生长，改善生产性能。枯草芽孢杆菌作为我国饲料添加剂目录(2021版)中允许使用的微生物饲料添加剂的一种，其生产要求简单，能形成抗逆性强的芽孢，环境耐受性强，利于保存和运输，而且具备丰富的产酶体系，活性代谢产物丰富。不仅可以产生抗菌活性成分，抑制致病菌在肠道中定植、维持肠道微生物区系平衡，而且分泌多种水解酶，改善消化道内环境、提高饲料利用率，还可以维护动物肠道免疫，增强动物的防病能力，已作为功能微生态制剂广泛应用于畜禽及水产养殖领域。但是不同来源的枯草芽孢杆菌的定植能力、代谢产物功能以及抗逆性差异大，大大限制了其在生产实践中的功能发挥。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种肠源枯草芽孢杆菌株，具有耐温、耐胆盐的效果，且具备分泌多种酶和抑菌活性；本发明的目的之二在于提供一种肠源枯草芽孢杆菌株的应用，该菌株能用于制备微生态制剂，能作为高效抗生素替代品；本发明的目的之三在于提供一种肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，从健康猪肠道内容物中定向分离筛选耐温、耐胆盐，且具备分泌多种酶和抑菌活性物质的功能型芽孢杆菌菌株。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种肠源枯草芽孢杆菌株，所述肠源枯草芽孢杆菌株命名为枯草芽孢杆菌N65(Bacillus subtilis N65)，保藏号为GDMCC No:62369，保藏日期为2022年4月11日，保藏分类命名为枯草芽孢杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

具体地，所述枯草芽孢杆菌N65的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

上述的肠源枯草芽孢杆菌株的应用，所述肠源枯草芽孢杆菌株用于制备抑制致病菌的微生物态制剂。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

上述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，包括以下步骤：

1)样品采集：称取健康成年猪的肠道内容物，清洗灭菌后，在加热条件下孵育，加入溶剂稀释，得到不同稀释倍数的处理原液；

2)菌株的分离：将不同稀释倍数的处理原液分别涂布于胆盐耐受培养基上，进行培养至有明显的单菌落长出，选择单个、具备明显芽孢杆菌菌落特征的优势类型，在分离培养基上重新划线，进行培养，再选择不同菌落的分离株进行进一步筛选；

3)抑菌对峙初筛：以金黄色葡萄球菌为指示菌，首先通过斜面培养，制备指示菌悬液，再制备含有指示菌悬液的对峙平板，最后将划线分离的单菌落分别点植于对峙平板，进行对峙培养，然后选取有明显抑菌圈的菌株，并记录抑菌圈直径(B)与菌落直径(C)的比值；

4)产酶特性复筛：将对指示菌具备明显抑菌圈的菌株分别点植于不同的产酶筛选培养基进行培养，再分别加入刚果红或碘溶液，以测定纤维素酶、木聚糖酶或淀粉酶活性，蛋白酶平板无需染色即可观察，记录菌株透明圈直径(H)和菌落直径(C)的比值，得到具有抑菌和产酶特性的菌株；

5)菌株的分子鉴定：采用菌落PCR的方法扩增分离步骤4)获得的菌株的16S rDNA基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测并回收目标产物，并进行测序，测序结果与GenBank中的16SrRNA序列进行BLAST及系统发育分析；

6)菌株代谢产物生物学特性测试：对步骤4)所得的菌株进行菌株斜面活化，制备斜面菌株悬液，然后对菌悬液进行摇瓶发酵培养，培养结束后，离心收集发酵上清液，并将上清液进行除菌，收集无菌发酵上清液；使用上清液生物学特性测试，其中，生物学特性测试为温度耐受性检测、胆盐耐受性检测、人工胃肠液的稳定性、pH稳定性检测和溶血活性检测中的一种或两种以上组合测试；

7)菌株的分离和筛选：选取步骤6)中生物学特性测试中性能最优的菌株，筛选得到抑菌和产酶能力最好的枯草芽孢杆菌N65，并对枯草芽孢杆菌N65进行分子鉴定和基因测序的考察，最终获得肠源枯草芽孢杆菌株N65并进行保藏。

进一步，步骤1)中，健康成年猪十二指肠、空肠、回肠各部分5～6cm，剪断后两端分别用灭菌棉绳扎紧，并立即存放于冰盒中，并在无菌环境中将各肠段内容物挤出混合，称取4～6g的肠道内容物，加入带有灭菌玻璃珠、并且含有50mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)的三角瓶中，80℃水浴孵育10min，取1mL上清液用无菌的PBS进行10倍梯度稀释至10^-3、10^-4与10^-5三个浓度，得到不同稀释倍数的处理原液。

再进一步，步骤2)中，将步骤1)中稀释至10^-3、10^-4与10^-5三个浓度的处理原液分别涂布于胆盐耐受培养基上，37℃倒置培养48h，至有明显的单菌落长出。选择单个、具备明显芽孢杆菌菌落特征的优势类型，在分离培养基上重新划线，37℃培养24h，再选择不同菌落的分离株进行进一步筛选。

进一步，步骤3)中，以金黄色葡萄球菌为指示菌，通过斜面培养制备指示菌的浓度为(1～2)×10⁹CFU/mL的指示菌悬液，然后按照每100mL检菌培养基0.5mL的指示菌悬液比例，制备含有指示菌悬液的对峙平板，最后将划线分离的单菌落分别点植于对峙平板，37℃，对峙培养24h，然后选取有明显抑菌圈的菌株，并记录抑菌圈直径(B)与菌落直径(C)的比值。

再进一步，步骤4)中，将对指示菌具备明显抑菌圈的菌株分别点植于不同的产酶筛选培养基，37℃培养24h，再分别加入1.0％的刚果红或碘溶液，以测定纤维素酶、木聚糖酶或淀粉酶活性，蛋白酶平板无需染色即可观察，记录菌株透明圈直径(H)和菌落直径(C)的比值。

进一步，步骤5)中，采用菌落PCR的方法扩增分离获得的优良菌株的16SrDNA基因片段，PCR反应体系包括：2×Pfu PCR Mix(25μL)、27F(2μL)、1492R(2μL)、ddH₂O(21μL)、少许单菌落为模板；PCR条件为：98℃：2min、(95℃：45s，57℃：30s，72℃：1min30s)×30个循环、72℃：10min、4℃：∞；琼脂糖凝胶电泳检测并回收目标产物，并进行测序。

再进一步，步骤6)中，生物学特性测试为温度耐受性检测、胆盐耐受性检测、人工胃肠液的稳定性、pH稳定性检测和溶血活性检测中的组合测试；

抑菌谱测试：选取动物养殖过程中常见病原菌类型，包括革兰氏阳性菌(G+)：金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、无乳链球菌以及革兰氏阴性菌(G^-)：大肠杆菌和沙门氏菌等作为指示菌，采用琼脂扩散法考察菌株无菌发酵上清液对不同菌株的抑制情况：将检菌培养基加热后室温冷却至45～55℃，加入适量指示菌，混匀后倒平板，用无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50uL发酵液加入点样孔中，4℃静置约1h，后于37℃培养箱中培养24h，取出平板，游标卡尺测量抑菌圈直径，选取抑菌圈与菌落直径比大于特定数值的菌株；

温度耐受性：将经过无菌发酵上清液分别在60℃、80℃、100℃水浴以及120℃高温高压中处理30min；期间，水浴处理每隔5min摇匀一次，处理结束冷却至室温后，用琼脂扩撒法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，并以未处理清液(CK)的作为对照进行比较，指示菌为金黄色葡萄球菌，考察不同温度对无菌发酵上清液抑菌性能的影响；

胆盐耐受性测试：取0.5mL的无菌发酵上清液，分别加入含有4.5mL的0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％的猪胆盐溶液中，以无菌水替代上清液，配置同样浓度的胆盐溶液作为溶剂对照，37℃，100rpm水浴3h，以金黄色葡萄球菌为指示菌，琼脂扩撒法检测抑菌性能，测量抑菌圈直径，并核算无菌发酵上清液与溶剂抑菌圈的差值，选取抑菌圈与菌落直径比大于7的菌株；

人工胃肠液的稳定性测试：取0.5mL的无菌发酵上清液，分别加入含有4.5mL的人工胃液、人工肠液和灭菌蒸馏水中，37℃，100rpm水浴3h，然后再将调回至6.0～7.0，再同样用琼脂扩撒法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，指示菌为金黄色葡萄球菌，考察无菌发酵上清液对胃肠液的耐受性；

pH的稳定性：将无菌发酵上清液分别调节pH为2.0、4.0、6.0、8.0和10.0分别处理2h，然后再调回至6.5～7.0，再同样用琼脂扩撒法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，指示菌为金黄色葡萄球菌，考察不同pH值对无菌发酵上清液抑菌性能的影响；

溶血活性测试：采用紫外分光光度法测定无菌发酵上清液的溶血率，首先先用生理盐水配置2.0％的脱纤维绵阳血红细胞悬液，然后将上清液用生理盐水稀释5倍和10倍，再分别取原液和稀释液2.5ml，加入至含有2.5ml的2.0％红细胞悬液当中，37℃，孵育3h，2000rpm离心5min，取上清检测OD_576nm，同时设置无菌蒸馏水为阳性对照，无菌生理盐水为阴性对照；其中，溶血率(％)＝(样品管-阴性管-空白样品)/(阳性管-阴性管)×100％。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明所提供的肠源枯草芽孢杆菌N65具备较好的抗逆性及抑菌、产酶等益生特性，具备开发为饲用抗生素替代类功能微生态制剂的潜力，为功能微生态制剂的差异化开发提供优良菌株资源。

(2)本发明的肠源枯草芽孢杆菌株N65的制备方法，具体为：以热处理的健康猪肠道内容物为分离基质，金黄色葡萄球菌作为指示菌，通过对胆盐的耐受性分离，指示菌的对峙培养初筛和产酶能力复筛，综合形态特征及基于16SrDNA序列进行菌株鉴定。并通过琼脂扩散法，对无菌发酵上清液的抑菌谱以及对温度、胆盐、pH、人工胃肠液的耐受性及溶血活性进行了研究。分离获得对指示菌具备抑菌性能的细菌，而且同时具备蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和木聚糖酶的活性。基于16S rDNA序列的系统发育分析显示，该菌株与枯草芽孢杆菌的亲缘关系最近，并最终鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌N65。其无菌发酵上清液具备较为广谱的抑菌性能，而且抑菌活性成分具备良好的温度、胆盐、pH以及人工胃肠液的耐受性，并且溶血率低，无溶血风险，体现了较好的抑菌特性。

附图说明

图1为菌株的单菌落分离的示意图；

图2为菌株的对峙培养的示意图；

图3为N65菌株的单分菌落的示意图；

图4为N65菌株的菌体显微图(美兰染色，100×油镜)；

图5为N65菌株的16S rDNA片段的PCR扩增图；

图6为基于16S rDNA序列构建的N65菌株系统发育进化树；

图7为不同温度处理对上清液抑菌活性的影响的折线图；

图8为不同浓度胆盐处理对上清液抑菌活性的影响的折线图；

图9为人工胃液和人工肠液处理对上清液抑菌活性的影响的柱状图；

图10为不同pH值处理对上清液抑菌活性的影响的折线图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

一种肠源枯草芽孢杆菌株，所述肠源枯草芽孢杆菌株命名为枯草芽孢杆菌N65，保藏号为GDMCC No:62369，保藏日期为2022年4月11日，保藏分类命名为枯草芽孢杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。具体地，所述枯草芽孢杆菌N65的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品来源

健康成年猪肠道内容物，采集自福建宁德某规模化养猪场。

1.1.2主要试剂

Pfu PCR Mix、DNA胶回收试剂盒、琼脂糖、胃蛋白酶(1:1200)、胰蛋白酶(1:250)均购自于上海生工，高麦芽糖浆购自于济南鑫帅源化工有限公司，杆菌肽锌(USP级，70u/mg)、硫酸粘杆菌素(USP级，19000IU/mg)以及脱纤维绵羊血购自于上海源叶生物科技有限公司，其它试剂均购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

菌株16S rDNA的PCR扩增通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，由上海生工合成。

人工胃液：取稀盐酸(1.0mol/L)1.64mL，加水约80mL与胃蛋白酶1g(胃蛋白酶来自于猪胃液，酶活1:1200)，摇匀后，加水定容至100mL。

人工肠液：取磷酸二氢钾0.68g，加水50mL，用0.4％的氢氧化钠溶液调节pH至6.8，另取胰蛋白酶1.0g(来自于猪胰腺，酶活1:250)加入适量水溶解，两液混合后定容至100mL。

1.1.3培养基

分离培养基：胰蛋白胨12.0g，酵母膏8.0g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁0.1g，琼脂粉20.0g，去离子水1000mL，pH值7.0±0.2，121℃灭菌20min。

胆盐耐受培养基：在分离培养基的基础上，添加0.5％的猪胆盐。

产酶筛选培养基：在分离培养基的基础上，分别添加0.5％羧甲基纤维素钠(纤维素酶筛选)、0.5％木聚糖(木聚糖酶筛选)、1.0％的脱脂奶粉(蛋白酶筛选)，0.5％的可溶性淀粉(淀粉酶筛选)。

检菌培养基：LB培养基，组成包括胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠10.0g，去离子水1000mL，pH值7.0±0.2，121℃灭菌20min。若需要制作固体平板，额外添加琼脂粉2.0％。

摇瓶培养基：豆粕粉25.5g，高麦芽糖浆45.0g，玉米浆干粉5.0g，硫酸胺6.0g，磷酸二氢钾3.0，硫酸锰1.0，碳酸钙1.0g，pH值7.0±0.2，121℃灭菌20min。

1.1.4指示菌

革兰氏阳性菌(G+)，包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)GDMCC 1.2442、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)GDMCC1.307和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)GDMCC 1.408；革兰氏阴性菌(G-)，包括大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)GDMCC 1.355和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typhimurium)，均购自于广东省微生物菌种保藏中心。

1.2方法

1.2.1样品采集

分别取健康成年猪十二指肠、空肠、回肠各部分约5cm，剪断后两端分别用灭菌棉绳扎紧，并立即存放于冰盒中，并在无菌环境中将各肠段内容物挤出混合，称取5g左右的肠道内容物，加入带有灭菌玻璃珠、并且含有50mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)的三角瓶中，80℃水浴孵育10min，取1mL上清液用无菌的PBS进行10倍梯度稀释至10^-3、10^-4与10^-5三个浓度，得到不同稀释倍数的处理原液。

1.2.2菌株的分离与筛选

将上述稀释至10^-3、10^-4与10^-5的处理菌液分别涂布于胆盐耐受培养基上，37℃倒置培养48h，至有明显的单菌落长出。选择单个、具备明显芽孢杆菌菌落特征的优势类型，在分离培养基上重新划线，37℃培养24h，再选择不同菌落的分离株进行进一步筛选。

抑菌对峙初筛：以金黄色葡萄球菌为指示菌，首先，通过斜面培养，制备指示菌悬液(菌浓约1.0×10⁹CFU/mL)，然后，按照每100mL检菌培养基0.5mL的指示菌悬液比例，制备含有指示菌的对峙平板，最后将划线分离的单菌落分别点植于对峙平板，37℃，对峙培养24h，然后选取有明显抑菌圈的菌株，并记录抑菌圈直径(B)与菌落直径(C)的比值。

产酶特性复筛：将对指示菌具备明显抑菌圈的菌株分别点植于不同的产酶筛选培养基，37℃培养24h，再分别加入1.0％的刚果红或碘溶液，以测定纤维素酶、木聚糖酶或淀粉酶活性，蛋白酶平板无需染色即可观察，记录菌株透明圈直径(H)和菌落直径(C)的比值。

同时，挑取分离菌株在25.0％(v/v)甘油中保存于-80℃冰箱，备用。

1.2.3菌株的分子鉴定

采用菌落PCR的方法扩增分离获得的优良菌株的16S rDNA基因片段，PCR反应体系包括：2×Pfu PCR Mix(25μL)、27F(2μL)、1492R(2μL)、ddH2O(21μL)、少许单菌落为模板；PCR条件为：98℃：2min、(95℃：45s，57℃：30s，72℃：1min30s)×30个循环、72℃：10min、4℃：∞。琼脂糖凝胶电泳检测并回收目标产物，并送至上海生工测序，测序结果与GenBank中的16S rRNA序列进行BLAST及系统发育分析。

1.2.4菌株代谢产物生物学特性

首先，进行菌株斜面活化，制备斜面菌株悬液(菌浓约为1×10¹⁰CFU/mL)，然后，按照0.2％的接种量，将菌悬液接至含有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，220rpm，37℃培养48h。培养结束后，10000rpm离心5min收集发酵上清液，并将上清液采用0.22μm膜过滤除菌，收集无菌发酵上清液进行生物学特性的检测。

抑菌谱：选取几种动物养殖过程中常见病原菌类型，包括革兰氏阳性菌(G⁺)：金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、无乳链球菌，以及革兰氏阴性菌(G^-)：大肠杆菌和沙门氏菌等作为指示菌，采用琼脂扩散法考察菌株无菌发酵上清液对不同菌株的抑制情况：将检菌培养基加热后室温冷却至45-55℃，加入适量指示菌，混匀后倒平板，用直径6.0mm无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50uL发酵液加入点样孔中，4℃静置约1h，后于37℃培养箱中培养24h，取出平板，游标卡尺测量抑菌圈直径。

抑菌圈直径(mm)＝透明圈直径(mm)-6.0mm(孔径)

温度耐受性：将过无菌发酵上清液分别在60℃、80℃、100℃水浴以及120℃高温高压中处理30min。期间，水浴处理每隔5min摇匀一次，处理结束冷却至室温后，用琼脂扩撒法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，并以未处理清液(CK)的作为对照进行比较，指示菌为金黄色葡萄球菌，考察不同温度对无菌发酵上清液抑菌性能的影响。

胆盐耐受性：取0.5mL的无菌发酵上清液，分别加入含有4.5mL的0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％的猪胆盐溶液中，同时，考虑到高浓度胆盐本身可能对指示菌的抑制作用，以无菌水替代上清液，配置同样浓度的胆盐溶液作为溶剂对照，37℃，100rpm水浴3h，以金黄色葡萄球菌为指示菌，琼脂扩撒法检测抑菌性能，测量抑菌圈直径，并核算无菌发酵上清液与溶剂抑菌圈的差值。

人工胃肠液的稳定性：取0.5mL的无菌发酵上清液，分别加入含有4.5mL的人工胃液、人工肠液和灭菌蒸馏水中，37℃，100rpm水浴3h，然后再将调回至约中性，再同样用琼脂扩撒法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，指示菌为金黄色葡萄球菌，考察无菌发酵上清液对胃肠液的耐受性。

pH的稳定性：将无菌发酵上清液分别调节pH为2.0、4.0、6.0、8.0和10.0分别处理2h，然后再调回至约中性(发酵液上清液原始pH约为7.0)，再同样用琼脂扩撒法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，指示菌为金黄色葡萄球菌，考察不同pH值对无菌发酵上清液抑菌性能的影响。

溶血活性：采用紫外分光光度法测定无菌发酵上清液的溶血率。首先配置2.0％的脱纤维绵阳血红细胞悬液(生理盐水配置)，然后将上清液用生理盐水稀释5倍和10倍，再分别取原液和稀释液2.5ml，加入至含有2.5ml的2.0％红细胞悬液当中，37℃，孵育3h，2000rpm离心5min，取上清检测OD576nm。同时设置，无菌蒸馏水为阳性对照，无菌生理盐水为阴性对照。

溶血率(％)＝(样品管-阴性管-空白样品)/(阳性管-阴性管)×100％

2结果与分析

2.1菌株的分离与筛选

肠道内容物经加热处理，在分离培养基平板上培养48h，获得菌落大小不同的单菌落，如图1所示，多数菌落呈不规则圆形、淡黄色、中间形成白色小凸起、有褶皱、较粘稠、不透明、边缘整齐。其中，如图2所示，在以金黄色葡萄球菌为指示菌的对峙平板初筛中获得36株能形成明显抑菌圈的菌落，选取其中抑菌圈直径与菌落直径比(B/C)较大的(＞2)12株菌进行进一步的产酶特性复筛。

根据不同菌株酶解透明圈和菌落直径的比值(H/C)大小(表1)，可以看出，所有的12株菌都表现了较好的淀粉酶和蛋白酶活性，并且菌株间差异较大，其中N65菌株的蛋白酶和淀粉酶活性最好，N29菌株此之。有7株菌没有表现出纤维素酶活，6株菌没有表现出木聚糖酶酶活，其中有3株菌同时没有纤维素酶和木聚糖酶酶活。只有N65菌株(抑菌圈与菌落直径比为9.5)与N29菌株(抑菌圈与菌落直径比为6.5)能够同时表现出蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和木聚糖酶这四种酶活，体现了较为综合的产酶能力，尤其是N65菌株，不仅抑菌活性最好，其综合产酶能力也最为突出。

表1不同菌株产酶特性复筛

ND：代表未检测到或不明显。

2.2菌株的分子鉴定

如图3所示，N65菌株在分离培养基培养48h，菌落呈乳黄色，不透明，中间有凸起褶皱；如图4所示，革兰氏染色阳性，菌体呈长杆状，单生或对生，有明显椭圆形芽孢生成，芽孢中生几乎占满整个菌体，有芽孢杆菌的典型特征。

PCR扩增其16S rDNA基因片段，如图5所示，电泳结果显示有明显目的条带，割胶回收目的基因片段，并送交上海生工进行测序。

将测得的16S rDNA序列在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)序列库中BLAST，选取其中13条不同的芽孢杆菌及1条大肠杆菌的16S rDNA序列与N65菌株的测序序列用ClustalX1.83软件序列比对，采用MEGA4.0中的N-J法(Neighbor-Joining method)构建系统发育进化树，具体如图6，自举分析(bootstrap)进行置信度检测，自举数据集为1000次。

从图6中可以看出，N65与芽孢杆菌属的菌株聚为一大类，而且与枯草芽孢杆菌分支进化距离最近，表明N65与枯草芽孢杆菌两个菌种在进化上属于近缘物种。结合BLAST比对结果，其与菌株Bacillus subtilis NBRC13719(NR112629)亲缘关系最近，相似度达到99.79％。结合其菌落与形态特征，基本可确定N65菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

2.3 N65菌株代谢产物生物学特性

代谢产物作为功能型菌株发挥功能的重要组成部分，其生物学特性往往是由许多不同的机制所驱动，既能独立发挥功能，也可以联合菌株协同发挥功效。

2.3.1抑菌性能

由表2结果可知，N65菌株的无菌发酵上清液具备较为广谱的抑菌活性，但整体来说，对G+菌株的抑制活性强于G-菌株。其中，对无乳链球菌的抑制活性略好于金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌，对大肠杆菌的抑制活性也优于沙门氏菌。

表2 N65菌株发酵液上清对不同指示菌的抑菌活性

2.3.2温度耐受性

以金黄色葡萄球菌为检菌，检测N65菌株发酵培养48h后的上清液在不同温度处理后的抑菌性能变化，以未处理的原液抑菌圈直径为参照(相对活性100％)，根据抑菌圈直径的大小比值，计算相对活性，结果如图7。

由图7结果可知，较CK来说，随着温度的升高，抑菌相对活性逐渐降低，但活性下降幅度较小。100℃处理30分钟，无菌发酵上清液抑菌相对活性保持在90％以上，120℃高温高压处理，相对活性仍然保持75％以上，体现了非常好的温度耐受性。

2.3.3胆盐耐受性

由图8可知，0.5％胆盐处理上清液3h，相对活性保持在95％以上，说明上清液抑菌性能基本不受胆盐浓度的影响，体现了较强的胆盐耐受性，相较动物消化道内的胆盐浓度来说(消化道胆盐浓度约为0.03％-0.3％)，展现了较为理想消化液胆盐的耐受性。

2.3.4人工胃肠液的稳定性

由图9可知，在人工胃液和肠液中分别处理3h，相对活性保持在95％以上，体现了非常好的人工胃、肠液的稳定性，具备一定的动物胃肠道环境耐受潜力。

2.3.5pH的稳定性

由图10结果可知，上清液在酸性环境稳定性更好，pH值8.0以下，相对活性保持95％以上。pH值超过10，相对活性明显下降，但仍保持80％以上活性，展现了较为宽泛的pH值耐受性，具备适应动物胃肠道pH值动态变化的潜力。

2.3.6溶血活性

由表3结果可知，N65菌株的无菌发酵液上清液不管是原液还是稀释液对红细胞溶血率都在1.0％以下(溶血率＜5％，被认为是没有溶血活性)，可基本认为其对红细胞没有溶血反应，溶血风险小，具备较好的溶血安全性。

表3溶血率的检测

通过高温孵育、胆盐耐受及指示菌的对峙培养方法从健康猪肠道内容物中分离获得1株具有较强的产酶能力和广谱抑菌性能的菌株N65，形态学和16SrDNA分子鉴定确认其为枯草芽孢杆菌。其无菌发酵上清液的抑菌活性成分具备良好的温度、胆盐、pH及人工胃肠液的耐受性，溶血反应小，基本不具备溶血风险，展示了较为良好的生物学特性，为功能微生态制剂的差异化开发及应用提供了良好的菌株资源。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种肠源枯草芽孢杆菌株，其特征在于，所述肠源枯草芽孢杆菌株命名为枯草芽孢杆菌N65，保藏号为GDMCC No:62369，保藏日期为2022年4月11日，保藏分类命名为枯草芽孢杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.如权利要求1所述的肠源枯草芽孢杆菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌N65的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1或2所述的肠源枯草芽孢杆菌株的应用，其特征在于，所述肠源枯草芽孢杆菌株用于制备抑制致病菌的微生物态制剂。

4.权利要求1或2所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品采集：称取健康成年猪的肠道内容物，清洗灭菌后，在加热条件下孵育，加入溶剂稀释，得到不同稀释倍数的处理原液；

2)菌株的分离：将不同稀释倍数的处理原液分别涂布于胆盐耐受培养基上，进行培养至有明显的单菌落长出，选择单个、具备明显芽孢杆菌菌落特征的优势类型，在分离培养基上重新划线，进行培养，再选择不同菌落的分离株进行进一步筛选；

3)抑菌对峙初筛：以金黄色葡萄球菌为指示菌，首先通过斜面培养，制备指示菌悬液，再制备含有指示菌悬液的对峙平板，最后将划线分离的单菌落分别点植于对峙平板，进行对峙培养，然后选取有明显抑菌圈的菌株，并记录抑菌圈直径(B)与菌落直径(C)的比值；

4)产酶特性复筛：将对指示菌具备明显抑菌圈的菌株分别点植于不同的产酶筛选培养基进行培养，再分别加入刚果红或碘溶液，以测定纤维素酶、木聚糖酶或淀粉酶活性，蛋白酶平板无需染色即可观察，记录菌株透明圈直径(H)和菌落直径(C)的比值，得到具有抑菌和产酶特性的菌株；

5)菌株的分子鉴定：采用菌落PCR的方法扩增分离步骤4)获得的菌株的16S rDNA基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测并回收目标产物，并进行测序，测序结果与GenBank中的16SrRNA序列进行BLAST及系统发育分析；

6)菌株代谢产物生物学特性测试：对步骤4)所得的菌株进行菌株斜面活化，制备斜面菌株悬液，然后对菌悬液进行摇瓶发酵培养，培养结束后，离心收集发酵上清液，并将上清液进行除菌，收集无菌发酵上清液；使用上清液生物学特性测试，其中，生物学特性测试为温度耐受性检测、胆盐耐受性检测、人工胃肠液的稳定性、pH稳定性检测和溶血活性检测中的一种或两种以上组合测试；

7)菌株的分离和筛选：选取步骤6)中生物学特性测试中性能最优的菌株，筛选得到抑菌和产酶能力最好的枯草芽孢杆菌N65，并对枯草芽孢杆菌N65进行分子鉴定和基因测序的考察，最终获得肠源枯草芽孢杆菌株N65并进行保藏。

5.如权利要求4所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，步骤1)中，健康成年猪十二指肠、空肠、回肠各部分5～6cm，剪断后两端分别用灭菌棉绳扎紧，并立即存放于冰盒中，并在无菌环境中将各肠段内容物挤出混合，称取4～6g的肠道内容物，加入带有灭菌玻璃珠、并且含有50mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)的三角瓶中，80℃水浴孵育10min，取1mL上清液用无菌的PBS进行10倍梯度稀释至10^-3、10^-4与10^-5三个浓度，得到不同稀释倍数的处理原液。

6.如权利要求4所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，步骤2)中，将步骤1)中稀释至10^-3、10^-4与10^-5三个浓度的处理原液分别涂布于胆盐耐受培养基上，37℃倒置培养48h，至有明显的单菌落长出。选择单个、具备明显芽孢杆菌菌落特征的优势类型，在分离培养基上重新划线，37℃培养24h，再选择不同菌落的分离株进行进一步筛选。

7.如权利要求4所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，步骤3)中，以金黄色葡萄球菌为指示菌，通过斜面培养制备指示菌的浓度为(1～2)×10⁹CFU/mL的指示菌悬液，然后按照每100mL检菌培养基0.5mL的指示菌悬液比例，制备含有指示菌悬液的对峙平板，最后将划线分离的单菌落分别点植于对峙平板，37℃，对峙培养24h，然后选取有明显抑菌圈的菌株，并记录抑菌圈直径(B)与菌落直径(C)的比值。

8.如权利要求4所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，步骤4)中，将对指示菌具备明显抑菌圈的菌株分别点植于不同的产酶筛选培养基，37℃培养24h，再分别加入1.0％的刚果红或碘溶液，以测定纤维素酶、木聚糖酶或淀粉酶活性，蛋白酶平板无需染色即可观察，记录菌株透明圈直径(H)和菌落直径(C)的比值。

9.如权利要求4所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，步骤5)中，采用菌落PCR的方法扩增分离获得的优良菌株的16S rDNA基因片段，PCR反应体系包括：2×PfuPCR Mix(25μL)、27F(2μL)、1492R(2μL)、ddH₂O(21μL)、少许单菌落为模板；PCR条件为：98℃：2min、(95℃：45s，57℃：30s，72℃：1min30s)×30个循环、72℃：10min、4℃：∞；琼脂糖凝胶电泳检测并回收目标产物，并进行测序。

10.如权利要求4所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，步骤6)中，生物学特性测试为温度耐受性检测、胆盐耐受性检测、人工胃肠液的稳定性、pH稳定性检测和溶血活性检测中的组合测试；

抑菌谱测试：选取动物养殖过程中常见病原菌类型，包括革兰氏阳性菌(G+)：金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、无乳链球菌以及革兰氏阴性菌(G^-)：大肠杆菌和沙门氏菌等作为指示菌，采用琼脂扩散法考察菌株无菌发酵上清液对不同菌株的抑制情况：将检菌培养基加热后室温冷却至45～55℃，加入适量指示菌，混匀后倒平板，用无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50uL发酵液加入点样孔中，4℃静置约1h，后于37℃培养箱中培养24h，取出平板，游标卡尺测量抑菌圈直径，选取抑菌圈与菌落直径比大于特定数值的菌株；

温度耐受性：将经过无菌发酵上清液分别在60℃、80℃、100℃水浴以及120℃高温高压中处理30min；期间，水浴处理每隔5min摇匀一次，处理结束冷却至室温后，用琼脂扩撒法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，并以未处理清液(CK)的作为对照进行比较，指示菌为金黄色葡萄球菌，考察不同温度对无菌发酵上清液抑菌性能的影响；

胆盐耐受性测试：取0.5mL的无菌发酵上清液，分别加入含有4.5mL的0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％的猪胆盐溶液中，以无菌水替代上清液，配置同样浓度的胆盐溶液作为溶剂对照，37℃，100rpm水浴3h，以金黄色葡萄球菌为指示菌，琼脂扩撒法检测抑菌性能，测量抑菌圈直径，并核算无菌发酵上清液与溶剂抑菌圈的差值，选取抑菌圈与菌落直径比大于特定数值的菌株；

人工胃肠液的稳定性测试：取0.5mL的无菌发酵上清液，分别加入含有4.5mL的人工胃液、人工肠液和灭菌蒸馏水中，37℃，100rpm水浴3h，然后再将调回至6.0～7.0，再同样用琼脂扩撒法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，指示菌为金黄色葡萄球菌，考察无菌发酵上清液对胃肠液的耐受性；

pH的稳定性：将无菌发酵上清液分别调节pH为2.0、4.0、6.0、8.0和10.0分别处理2h，然后再调回至6.5～7.0，再同样用琼脂扩撒法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，指示菌为金黄色葡萄球菌，考察不同pH值对无菌发酵上清液抑菌性能的影响；

溶血活性测试：采用紫外分光光度法测定无菌发酵上清液的溶血率，首先先用生理盐水配置2.0％的脱纤维绵阳血红细胞悬液，然后将上清液用生理盐水稀释5倍和10倍，再分别取原液和稀释液2.5ml，加入至含有2.5ml的2.0％红细胞悬液当中，37℃，孵育3h，2000rpm离心5min，取上清检测OD_576nm，同时设置无菌蒸馏水为阳性对照，无菌生理盐水为阴性对照；其中，溶血率(％)＝(样品管-阴性管-空白样品)/(阳性管-阴性管)×100％。

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