CN113288919A - 解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用。本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株BA40，该菌株能够抑制常见的猪肠道病原菌大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，并且具有耐酸、耐胆盐和胰酶的能力。将所述解淀粉芽孢杆菌活化后，使其活菌数达到10⁸‑10⁹ CFU/mL，经口灌胃6日龄哺乳仔猪，连续灌胃1mL至24天断奶。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌能够提高猪的仔猪的断奶增重以及肠道菌群的多样性，减少断奶仔猪腹泻，降低腹泻率，并且可以降低炎症因子，促进营养吸收，提高机体的抗氧化能力和抗病能力，为无抗养殖下的营养调控提供一条新的途径。

Description

解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用。

背景技术

畜牧业是我国农业经济产业中的支柱产业，过去很长一段时间，抗生素在推动畜牧业的的发展也发挥了重要作用：促进生长，提高饲料报酬，降低发病率，给生产者带来了丰厚的生产效益；另一方面抗生素也带来了食品安全和生态安全等问题，比如会导致动物肠道菌群失衡、抑制肠道屏障发功能，以及残留的抗生素通过食物链到达人体，可能会严重损害人类健康，同时引发土地环境恶化等一系列问题。

生猪养殖是我国畜牧业养殖中占比最大的养殖种类，同时猪的生产性能直接关系到养殖场的经济效益，导致猪生长性能下降的主要原因是由于仔猪断奶时所引发的腹泻。导致仔猪腹泻的方式主要有病原性腹泻和非病原性腹泻，病原性腹泻包括病毒性腹泻、细菌性腹泻和螺旋体、寄生虫性腹泻等；非病原性腹泻的病因主要是由于仔猪抵抗力较差、对外界刺激较为敏感，如断奶、换料、天气化等原因会发生营养不良、消化不良以及过敏性腹泻。其中病原性腹泻和非病原性腹泻互相作用，易交叠发生，使仔猪腹泻情况进一步恶化，一般来说，断奶应激对仔猪腹泻的影响最大，较易导致仔猪死亡，降低猪场效益，是当今猪场最为重视的疾病之一。

解淀粉芽孢杆菌是与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制细菌和真菌活性的代谢产物，如抑菌蛋白、脂肽类物质，其在农业生产中有较多应用，可以抑制植物病原菌的生长，具有良好的拮抗植物病原菌的作用。解淀粉芽孢杆菌广泛存在于土壤、空气和水质资源环境中，大部分关于解淀粉芽孢杆菌的研究，都是从土壤中分离得到该菌菌株。近些年来，有研究发现，解淀粉芽孢杆菌可以从某些特定的动物肠道中分离得到，比如CN112239736A“解淀粉芽孢杆菌、菌剂、筛选方法及应用”，该解淀粉芽孢杆菌就是从克氏原螯虾肠道中分离获得；CN103966118A“解淀粉芽孢杆菌及其应用”，该解淀粉芽孢杆菌就是从牙鲆鱼消化道中分离获得，但还未有报道将解淀粉芽孢杆菌应用到猪的养殖生产上，也没有研究分离到合适用在猪养殖生产上的解淀粉芽孢杆菌。

发明内容

为本发明的目的在于提供了一株解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用，将所述的解淀粉芽孢杆菌以新鲜菌液的形式灌喂哺乳仔猪，连续灌胃至仔猪断奶；所述的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株BA40，于2021年5月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为：CCTCC NO:M2021535。

所述的解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用，将所述的解淀粉芽孢杆菌新鲜菌液活菌含量10⁸-10⁹ CFU/mL。

所述新鲜菌液的制备方法为：将所述解淀粉芽孢杆菌菌株BA40按照体积百分比1%接种到LB液体培养基中，在摇床中37℃培养12h，获得新鲜菌液。

所述哺乳仔猪为5日龄仔猪，断奶日龄为24日龄。

所述解淀粉芽孢杆菌BA40新鲜菌液以1mL/头/天的标准经口灌服。

所述解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用，用于提高新生仔猪生产性能和降低腹泻率，具体如下：

仔猪出生第5天，经口灌服1mL 解淀粉芽孢杆菌BA40新鲜菌液，连续灌服20天，显著提高仔猪断奶重以及教槽料采食量，同时降低仔猪断奶后腹泻发生率。

本发明的有益效果是：

1.提高肠道菌群多样性、减少腹泻发生：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌可以提高猪肠道菌群的多样性，可以调节菌群丰度、降低血清炎症因子含量。

2.提高机体抗氧化能力：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌能够提高机体SOD含量，降低MDA含量，能够提高机体抗氧化能力，减少机体氧化应激的发生，减少腹泻产生。

3.抑制肠道病原菌：本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌能够抑制常见的猪肠道病原菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌，能够降低腹泻率，提高日增重。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌BA40菌落形态图。

图2为解淀粉芽孢杆菌BA40显微镜检查图。

图3为解淀粉芽孢杆菌BA40抑制致病菌实验结果。

图4为解淀粉芽孢杆菌BA40的生长曲线。

图5为解淀粉芽孢杆菌BA40在不同pH条件下的生长图。

图6为解淀粉芽孢杆菌BA40在不同浓度胆盐条件下的生长图。

图7为解淀粉芽孢杆菌BA40在不同浓度胰酶条件下的生长图。

图8为不同处理仔猪粪便微生物OTU韦恩图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1 分离鉴定获得解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株BA40

1）芽孢杆菌菌株筛选

取180日龄金华猪空肠、回肠肠道内容物以及粪便样品1g，按1：10的比例，用灭菌生理盐水稀释，75℃水浴15min，然后用无菌水10倍梯度稀释，选取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个稀释梯度，分别吸取100 μL菌悬液在LB平板上涂布，上层LB半固体培养基冷却至50℃左右，按照5%的比例，分别加入大肠杆菌(ATCC 25922)、沙门氏菌(ATCC 14028)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、产气荚膜梭菌(ATCC 13124)，每个稀释梯度和每个致病菌至少做3个平板，挑取具有抑制指示菌能力的菌株，进行形态学观察，挑选光镜下具有芽孢杆菌特点的菌株进行纯化培养，然后获得芽孢杆菌。其中本实施例中所用解淀粉芽孢杆菌BA40，细菌菌落形态如图1所示，显微镜检查图如图2所示。

2）拮抗菌株的筛选

对分离得到的芽孢杆菌挑取菌落，接种于LB液体培养基，并在37℃摇床中培养12h，即为种子液，将所得种子液按照体积比1：100转接于新鲜的LB液体培养基中，在37℃、120-200rpm培养24h，即为所需新鲜菌液。对新鲜菌液4℃条件下10000 rpm 离心，10 min收集菌体，上清用0.22μm的过滤头过滤，得到培养上清。

利用牛津杯法，下层固体培养基在50℃左右，按照5%添加量添加上述四种致病菌中，带下层琼脂凝固后，均匀放置牛津杯，在牛津杯中加入100 μL芽孢杆菌上清液，置于37℃厌氧培养箱内24h，每个平板做三个重复，测定抑菌圈直径，筛选具有综合抑菌能力较强的芽孢杆菌菌株。实验结果如图3所示。

表1本发明实施例1菌株抑制病原菌能力测定

3）菌株生长和抗逆特性测定

将解淀粉芽孢BA40在37℃液体LB培养基中培养24h，每隔2h在吸光度OD600下测定一次吸光值，绘制解淀粉芽孢杆菌BA40的生长曲线，同时对解淀粉芽孢杆菌在不同的酸度、胆盐和胰酶的生长条件下进行生长能力测定（参见图4-图7）。在pH = 5.5、0.2%和0.2%胆盐的浓度下，解淀粉芽孢杆菌活菌数均超过半数以上，结果说明该菌具有较好的耐受胆盐、胰酶和胃酸的能力。

4）菌株鉴定

菌该株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株BA40经由16S rDNA测序之后，将其基因序列于NCB中的GenBank数据库进行Blast比对，结合生理生化、革兰氏染色，菌落形态等鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。其中16SrDNA测序结果其序列如 SEQ ID NO：1所示。

实施例2 预防断奶仔猪腹泻的饲养实验

制备解淀粉芽孢杆菌BA40的新鲜菌液，将上述解淀粉芽孢杆菌BA40在固体培养基LB上划线，取单一菌落接种于LB液体培养基中，在37℃摇床中培养12h，即为种子液，将所得种子液按照体积比1：100转接于新鲜的LB液体培养基中，在37℃、120-200rpm培养24h，即为所需新鲜菌液。

饲养实验：选择12头长白二元母猪进行试验，随机分为3组，益生菌BA40组从5d-24d每日灌服BA40新鲜菌液（10⁸CFU/mL）1mL，益生菌产品组选择市售益生菌产品（植物乳杆菌、戊糖片球菌和双歧杆菌混菌产品），从5d-24d每日用灌喂仔猪1ml（PBS混匀），对照组灌服PBS，实验期共36天，前21天灌服益生菌，判断益生菌对仔猪生长性能的影响，后15天观察腹泻率和死亡率，以及仔猪对营养物质消化吸收的能力。

表2.本发明实施例2对仔猪生长性能的影响

项目	对照组	益生菌BA40组	益生菌产品组
				初生窝重，Kg	20.95	19.10	20.12
产活仔数，头	12.25	12	11.75
				断奶窝重，Kg	90.46	95.59	88.11
断奶窝增重，Kg	69.025	76.1	67.785
				仔猪出生重，Kg	1.66	1.68	1.68
仔猪断奶重，Kg	8.28	8.75	8.32
				仔猪增重，Kg	6.63	7.07	6.63

由表2可知，与对照组相比，益生菌BA40组显著提高了断奶窝重以及仔猪断奶重，可以看出其在生产性能上具有一定的效果，并且其益生效果要优于益生菌产品组。

益生菌应用试验腹泻率=腹泻头次数/（试验仔猪总数×正式试验天数）×100％

表3本发明实施例2对仔猪断奶后腹泻率与存活率的影响

项目	对照组	益生菌BA40组	益生菌产品组
				存活率，%	89.80	91.67	89.36
腹泻率，%	2.11	1.83	1.95

由表3可知，与对照组相比，益生菌BA40组显著提高仔猪存活率，并且显著降低仔猪断奶后的腹泻发生率，其效果要优于益生菌产品组。

表4.本发明实施例2对仔猪全肠表观消化率的影响

项目	对照组	益生菌BA40组	益生菌产品组
				总能，%	84.90	87.48	86.60
干物质，%	84.08	86.67	85.74
				粗蛋白，%	79.76	82.63	81.71
粗脂肪，%	76.87	80.56	79.49
				钙，%	76.19	83.20	82.01
磷，%	64.15	74.02	71.48

试验期19至21d，采用全收粪法，每天收集仔猪未落地粪便样品200g，粪便55℃烘干后用内源指示剂发测定表观消化率。结果由表4可知，与对照组相比，实施例2中的益生菌BA40组的仔猪干物质、粗蛋白、粗脂肪和磷的全肠表观消化率均显著提高，且优于益生菌产品组。

表5.本发明实施例2对仔猪抗氧化指标、促炎因子和免疫球蛋白含量的影响

项目	对照组	益生菌BA40组	益生菌产品组
				谷丙转氨酶，U/L	55.17	51.17	50.00
谷草转氨酶，U/L	54.54	48.53	50.50
				T-AOC，U/L	0.35	0.92	0.84
SOD，U/L	73.54	89.47	85.27
				MDA，nmol/mL	8.94	4.37	4.85
IL-1β，ng/L	103.54	102.92	101.23
				IL-6，ng/L	5.23	5.94	4.04
TNF-α，ng/L	39.21	40.33	38.06
				IgA，g/L	0.53	0.54	0.52
IgG，g/L	1.33	0.90	1.05
				IgM，g/L	0.50	0.45	0.50

在实施例2的基础上，从各组随机选取6头仔猪，测定血清中抗氧化、促炎因子和免疫球蛋白等指标。由表5可知，与对照组相比，实施例2中益生菌BA40组仔猪抗氧化能力显著提高，并且优于益生菌产品组，但促炎因子和免疫球蛋白等指标与对照组和益生菌组无显著差异。

本发明实施例2对仔猪肠道微生物多样分析

对仔猪粪便中的微生物测序功德到529个OTU，其中所偶测序样本共有OUT数量为395个，对照组特有OTU数量为19个，益生菌BA40组特有OTU数量为13个，益生菌产品组特有OTU数量为4个，结果如图8所示。

表6.本发明实施例2对仔猪粪便微生物的Alpha多样性分析表

项目	Shannon指数	Simpson指数	Ace指数	Chao1指数
					对照组	6.01	0.97	321.23	339.45
益生菌BA40组	6.57	0.98	325.17	341.20
					益生菌产品组	4.33	0.88	300.14	300.55

通过Shannon指数、Simpson指数、Ace指数、Chao1指数对各样本的α多样性进行分析发现，结果如表6所示，三个组之间的四项指数之间均无限制差异，但是益生菌BA40组的四项参数有高于对照组和益生菌产品组的趋势，这表明BA40处理有会增加仔猪肠道微生物的多样性。

表7.本发明实施例2对仔猪粪便微生物属水平上的组间差异

属水平	对照组（%）	益生菌BA40组（%）	益生菌产品组（%）	标准误	P值
						Lactobacillus	6.34	15.48	42.72	5.95	0.01
Prevotella	10.57	15.32	4.99	1.84	0.04
						Phascolarctobacterium	3.23	4.32	1.31	1.21	0.08
Clostrudium	3.79	2.24	069	1.00	0.51
						Actinobaacillus	5.64	0.21	0.40	0.10	0.39
Ruminococcaceae-UCG-002	1.86	2.64	0.95	0.57	0.54
						Escherichia-Shigella	1.97	0.05	0.28	0.63	0.46
Prevotellaceae	0.50	0.86	0.34	0.13	0.30
						Lacgbisouraceae	0.30	1.02	0.06	0.30	0.45
Vagococcus	1.04	0.00	0.00	0.35	0.42
						Anaerotruncus	0.34	0.49	0.32	0.05	0.06
Unclassified	12.03	13.41	10.30	2.43	0.33

大肠杆菌-志贺氏菌（Escherichia-Shigella）含量过高与肠道感染、肥胖、糖尿病等疾病发生有关，从表7可见，相比于对照组，益生菌BA40组可以显著降低其相对丰度，且效果优于益生菌产品组。瘤胃菌属（Ruminococcaceae-UCG-002）是肠道后段的优势菌，能够产生丁酸盐从而减少炎症的发生，并于纤维的降解呈正相关，益生菌BA40组相比对照组和益生菌产品组的瘤胃菌属Ruminococcaceae-UCG-002显著提高，说明本发明的菌株在降低炎症反应、促进营养消化吸收等方面具有一定的潜力。普氏菌属（Prevotella）和考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）都可以降解负责的膳食纤维，产生短链脂肪酸，从而有益于肠道健康。与对照组和益生菌产品组相比，益生菌BA40组显著提高普氏菌属（Prevotella）和考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）的相对丰度，从而说明本发明的菌株在提高肠道微生态平衡是有一定的潜力。乳酸菌属（Lactobacillus）能够促进动物肠道消化吸收，抑制肠道内致病菌的增殖，相比于对照组，益生菌BA40组显著提高了乳酸菌属的含量。

综上所述，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BA40能够提高猪的仔猪的断奶增重以及肠道菌群的多样性，减少断奶仔猪腹泻，降低腹泻率，促进营养吸收，提高机体的抗氧化能力和抗病能力。

上述描述中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施方案仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用

<141> 2021-06-17

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

ccccgtgcgg ggtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960

cagtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac 1020

aggtgtgcat attgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcacgagcg 1080

caacccttga tcttagttgc agcatcagtg gcacctctaa gtgactgccg tgacaaaccg 1140

gagaaaggtg gggatgacgt caatcatcat 1170

Claims (6)

1.一种解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用，其特征在于，将所述的解淀粉芽孢杆菌以新鲜菌液的形式灌喂哺乳仔猪，连续灌胃至仔猪断奶；所述的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株BA40，于2021年5月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为：CCTCC NO:M2021535。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用，其特征在于，将所述的解淀粉芽孢杆菌新鲜菌液活菌含量10⁸-10⁹ CFU/mL。

3.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用，其特征在于，所述新鲜菌液的制备方法为：将所述解淀粉芽孢杆菌菌株BA40按照体积百分比1%接种到LB液体培养基中，在摇床中37℃培养12h，获得新鲜菌液。

4.根据权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用，其特征在于，所述哺乳仔猪为5日龄仔猪，断奶日龄为24日龄。

5.根据权利要求4所述解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌BA40新鲜菌液以1mL/头/天的标准经口灌服。

6.根据权利要求4所述解淀粉芽孢杆菌在预防断奶仔猪腹泻中的应用，其特征在于，用于提高新生仔猪生产性能和降低腹泻率，具体如下：

仔猪出生第5天，经口灌服1mL 解淀粉芽孢杆菌BA40新鲜菌液，连续灌服20天，显著提高仔猪断奶重以及教槽料采食量，同时降低仔猪断奶后腹泻发生率。

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