KR100420637B1

KR100420637B1 - 박테리오 파지 케이11의 신규 리소자임과 그 제조방법

Info

Publication number: KR100420637B1
Application number: KR10-2001-0058913A
Authority: KR
Inventors: 이상수; 윤주호; 강창원
Original assignee: 학교법인 배재학당
Priority date: 2001-09-24
Filing date: 2001-09-24
Publication date: 2004-03-04
Also published as: KR20030025969A

Abstract

본 발명은 박테리오파지 케이11(Bacteriophage K11)의 신규 리소자임(Lysozyme)과 그 유전자 및 아미노산 서열과 리소자임의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 리소자임의 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 리소자임의 아미노산 서열은 서열번호 4와 같다.

본 발명에 의해 아미다제(Amidase) 활성을 가지며, 박테리오파지 K11의 RNA 중합효소 및 박테리오파지 T7 의 RNA 중합효소에 대해서도 전사저해 활성을 나타내는 박테리오파지 K11 의 리소자임과 그 유전자 및 아미노산 서열과 그 제조방법이 제공된다.

Description

박테리오파지 케이11의 신규 리소자임과 그 제조방법 {THE NOVEL LYSOZYME OF BACTERIOPHAGE K11 AND THE PREPARATION METHOD OF THEREOF}

본 발명은 박테리오파지 케이11의 신규 리소자임에 관한 것이다.

박테리오파지 K11은Klebsiella.sp.390(03:K11)에 감염하는 박테리오파지이다.

박테리오파지 K11의 리소자임은 박테리오파지 K11의 유전자에 의해 발현되는 효소로서, 박테리오파지 K11가 완성된 후 숙주(Host) 균주의 세포벽을 분해시켜 용해(lysis)하는 효소이다.

박테리오파지 T7의 리소자임에 대해서는 많이 연구되어 그 기능 및 구조가 잘 알려져 있다.

박테리오파지 T7의 리소자임은 151개의 아미노산으로 구성되고(서열번호 5), 17 kDa을 나타낸다.

박테리오파지 T7의 리소자임 은 대장균(E.coli)의 세포벽을 분해시키는 아미다제(Amidase) 활성을 가지며, 박테리오파지 T7의 RNA 중합효소의 활성을 저해한다.

박테리오파지 K11의 RNA 중합효소의 유전자 서열은 1989년 알. 하우스만(R.Housman)에 의해 보고되었다.

그 후, 박테리오파지 K11 지놈(genome)내 전사촉진제의 염기서열이 밝혀지고, 박테리오파지 T3, T7, K11, SP6 전사촉진제간의 전사 촉진제 유사성 지역 (PIR, -12∼-8)의 서열 유사성에 근거하는 계통발생학적 연관성이 보고된 바 있다.

그러나, 박테리오파지 K11의 리소자임에 대해서는 그 유전자 및 아미노산 서열과 그 기능에 대해 보고된 바 없다.

본 발명은 박테리오파지 K11의 지놈(Genome)에서 리소자임 유전자를 클로닝하여 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 밝히고, 발현벡터를 만들어 리소자임을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

도 1은 본 발명 리소자임의 클로닝 및 발현벡터 pET-15 KLYS의 제조과정도

도 2의 A는 본 발명 리소자임의 온도별 발현에 따른 SDS-PAGE 분석결과

B는 온도별 발현에 따른 리소자임의 용해도 차이

도 3는 리소자임 봉입체 용해후 SDS-PAGE 분석결과

도 4는 본 발명 리소자임의 아미다제 활성도 조사결과도

도 5는 본 발명 리소자임의 박테리오파지 K11의 전사억제 활성도

도 6은 본 발명 리소자임의 박테리오파지 K11,T7,SP6 전사억제 활성 비교도

본 발명의 리소자임은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 서열번호4의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 리소자임은 아미다제 활성을 가지며, 박테리오파지 K11의 RNA 중합효소와 박테리오파지 T7의 RNA 중합효소의 전사를 억제하는 기능을 나타낸다.

또한 본 발명은 발현벡터를 제조하여 리소자임을 발현시키고 효율적으로 정제하는 방법을 제공한다.

이하 실시예와 실험예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하나, 이들이 발명의 내용을 제한하는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 리소자임 유전자의 클로닝 및 서열 분석

Klebsiella, sp.390 (03:K11)에 감염하는 박테리오파지 K11을 알. 하우스만(R. Hausmann)에게 받았다.

실험실에서 알아낸 리소자임 유전자 서열을 기초로 하여 자동 DNA 합성기로 포스포로아미데이트(phosphoroamidate) 방법에 의해 두 개의 디옥시올리고뉴클레오티드(Deoxyoligonucleotides)를 합성하였다.

두 개의 디옥시올리고뉴클레오티드(Deoxyoligonucleotides)염기 서열은

sense 5'- GCTCTAGAGCCGAAGCGTGATGTAC- 3' (서열번호 1)

antisense 5'- GCGGATCCCTAATGTTTACCCACGGT - 3'(서열번호 2)이다.

이 두 개의 서열을 프라이머로 사용하여 PCR 방법에 의해 리소자임 유전자를 클로닝하였다.

클로닝한 유전자 서열을 유전자서열 자동 분석기를 이용하여 서열을 분석하였다.

그 결과 본 발명의 리소자임은 453 개의 염기쌍으로 되어있으며, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 같다.

서열번호 3으로부터 유추한 리소자임의 아미노산 서열은 서열번호 4와 같다.

서열번호 4의 본 발명의 리소자임과 공지의 박테리오파지 T7 의 리소자임의 서열(서열번호 5)과의 상동성을 비교하여 그 결과를 표 1에 나타냈다.

< 표 1 > 박테리오파지 T7 리소자임 아미노산 서열과의 상동성 비교결과

K11	1 MAKVQFTKRQETSQFFVHCSATKANMDVGVREIRQWHKEQGWLDVGYHFIIRRDGTVEAG
T7	1 MARVQFKQRESTDAIFVHCSATKPSQNVGVREIRQWHKEQGWLDVGYHFIIKRDGTVEAG
	* * * ****** ******************** ******
K11	61 RDQDAVGSHVKGYNSTSVGVCLVGGIDAKGNPEANFTPQQMSALNGVLHELRGTYPKAVI
T7	61 RDEMAVGSHAKGYNHNSIGVCLVGGIDDKGKFDANFTPAQMQSLRSLLVTLLAKYEGAGL
	* ** * ******* *** * * * * *
K11	121 MAHHDVAPKACPSFDLQRWVKTGELVTSDRG
T7	121 RAHHEVAPKACPSFDLKRWWEKNELVTSDRG
	* ******* ********

70.2% identity in 151 residues overlap; Score: 571.0; Gap frequency:0.0%

표 1의 결과와 같이 본 발명의 박테리오파지 K11 리소자임의 아미노산 서열은 박테리오파지 T7 리소자임의 아미노산 서열과는 상동성 비교에서 서로 많이 다른 것으로 나타났다.

< 실시예 2 > 발현벡터 pET-15 KLYS의 제조 및 형질전환

발현벡터 pET-15KLYS 의 제조과정을 도 1에 나타내었다.

대장균을 이용한 발현시 사용하는 벡터 pET15의 랙 프로모터(lac promoter)를 택 프로모터(tac promoter)로 교체한 pET15tac벡터(5.7 kb)를 준비하였다.

제한효소XbaⅠ, BamHⅠ을 이용하여 도 1과 같이 리소자임 유전자를 pET15tac벡터 내로 삽입하였다.

이와같이 만들어진 플라스미드(plasmid)를 pET-15 KLYS라 명명하고 발현벡터로 사용하였다.

pET-15 KLYS(6.1 kb) 발현벡터를 대장균(E.coli)XL-1 blue에 형질전환(transfomation)하였다.

pET-15 KLYS를 갖는 클론(clone)을 암피실린(ampicillin) 저항성을 보이는 선택성 배지에서 선별하였다.

< 실시예 3 > 대장균을 이용한 리소자임의 발현

선별된 클론(clone)을 엘비 암피실린 브로스(LB ampicillin broth)에서 37℃로 OD₆₀₀에서 0.5까지 배양하였다.

배양된 대장균을 서로 다른 배지에서 배양온도를 37℃, 30℃, 25℃로 달리하고 IPTG를 최종농도 0.4 mM이 되게 첨가하였다.

6 시간동안 진탕 배양하여 리소자임을 발현시켰다.

발현시킨 세포추출물을 15% SDS-PAGE에 의해 분석하여, 그 결과를 도 2의 A와 B에 나타냈다.

도 2의 A와 같이 리소자임이 대장균내에서 잘 발현되는 것을 보여주고 있다.

그러나, 도 2의 B와 같이 37℃에서 발현시킨 경우는 대부분 용해되지 않은 상태로 세포내에서 존재했고(lane : 37℃, S and P), 30℃에서 발현시킨 리소자임은 부분적으로 용해 되었고(lane : 30℃, S and P), 25℃에서는 많은 양이 용해된 형태로 존재했다.

< 실시예 4 > 리소자임의 정제

실시예 3 에서의 발현 양상은 대장균에서 리소자임을 발현시켜 정제 할 수 있는 가능성을 보여주고 있다.

그러나, 리소자임이 대장균 세포 내에서 과다 발현되었을 경우 세포 내에서 유독한 영향을 주어 세포 성장 속도나 배양도중 부분적으로 발생하는 용해(lysis)로 인해 대량으로 정제하는데 어려움이 있다.

문제점을 해결하기 위해 37 ℃에서 용해되지 않은 많은 양의 리소자임 봉입체들을 회수하였다.

회수한 리소자임 봉입체를 5 M 구아니딘(guanidine) HCl을 처리하여 용해시켰다.

그 다음, 옥시도-서플링 에이전트(oxido-shuffling agenet, GSH/GSSG)의 존재 하에 옥시데이티브 리폴딩(oxidative refolding)을 실시하였다.

그 결과 활성이 있는 천연(native) 상태의 리소자임 효소를 얻을 수 있었고 SDS-PAGE 분석을 통해 단일 밴드(band)로 확인하였다(도 3 참조).

< 실험예 1 > 리소자임의 아미다제(Amidase) 활성 검색

리소자임의 아미다제 활성을 조사하였다.

정제된 리소자임의 존재하에 대장균(E.coli)의 혼탁도 변화를 흡광도(OD₆₀₀) 로 측정하여 도 4에 나타냈다.

도 4와 같이 리소자임이 주어 졌을 때 세포를 현탁시킨 시료의 흡광도가 감소함을 확인 할 수 있었다.

고염의 상태(100 mM NaCl)에서는 이러한 활성이 감소하였다.

이 결과는 리소자임이 박테리아 세포벽에 있는 펩티도글리칸(peptidoglycan)층의 특정 아미드(amide) 결합을 절단하는 아미다제(amidase) 활성을 가짐을 보여준다.

< 실험예 2 > 리소자임의 박테리오파지 K11의 전사 억제활성 조사

리소자임의 양을 증가시키는 조건에서 K11 RNA 중합효소의 활성을인비트로(in vitro) 전사기작에 의해 측정하여 그 결과를 도 5에 나타냈다.

그 결과 아주 적은 양의 리소자임 첨가에도 K11 DNA로 부터의 전사는 빠르게 감소함을 확인 할 수 있었다.

RNA 중합효소와 리소자임의 몰 비율이 1 : 8 이었을 경우엔 전사물이 거의 합성되지 않을 정도로 강력하게 전사가 억제되었다.

< 실험예 3 > K11 리소자임(lysozyme)의 K11, T7, SP6 전사 억제 활성 비교

K11 리소자임(lysozyme)이 RNA 중합효소에 미치는 영향을 좀 더 알아보기 위해 K11, T7, SP6 RNA 중합효소와의 상호 작용을 비교하여 도 6에 나타냈다.

도 6과 같이 본 발명의 리소자임 효소는 K11 RNA 중합효소와 T7 RNA 중합효소의 전사 활성을 억제하였다.

본 발명에 의해 박테리오파지 K11의 신규 리소자임 유전자의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열이 제공되고, 아미다제 활성을 나타내며 박테리오파지 K11 및 T7 의 전사활성을 저해하는 리소자임의 제조방법이 제공된다.

Claims

서열번호 3의 박테리오파지 케이11의 리소자임 유전자 서열.
서열번호 4의 박테리오파지 케이11의 리소자임 아미노산 서열.
박테리오파지 케이11의 리소자임 발현벡터 pET-15 KLYS
발현벡터 pET-15 KLYS를 대장균에 형질전환하고, 형질전환된 대장균을 배양하여 박테리오파지 케이11 리소자임 효소를 생산하는 방법
제4항의 방법에 의해 제조된 박테리오파지 케이11 리소자임 효소