DK142461B

DK142461B - Diagnostisk prøvestrimmel til detektering af mikroorganismer samt fremgangsmåde til fremstilling og anvendelse heraf.

Info

Publication number: DK142461B
Application number: DK438675AA
Authority: DK
Inventors: Donald Paul Kronish; William Donald Young Jr
Original assignee: Warner Lambert Co
Priority date: 1974-09-30
Filing date: 1975-09-29
Publication date: 1980-11-03
Also published as: CA1045531A; FR2286192A1; GB1466828A; JPS5431396B2; NO752544L; DE2531982A1; JPS5147491A; DK438675A; AU8300975A; FR2286192B1; NO148380C; US3957584A; DE2531982B2; NO148380B; IT1054910B; CH615460A5; DK142461C; SE7510895L

Description

U2461 i o

Den foreliggende opfindelse angår en diagnostisk prøve-strimmel til detektering af mikroorganismer, der er kendt for at frembringe Ø-galactosidase, ved bakteriel hydrolyse af et o-nitrophenyl-Ø-D-galactopyranosidsubstrat anbragt på et su-5 gende materiale, eventuelt afgrænset med en spærrezone og eventuelt forsynet med en identificeringsfarvezone. Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til prøvestrimlens fremstilling, og endelig angår opfindelsen prøvestrimlens anvendelse til identificering og differentiering af mikroorganismer, som er kendt 10 for at frembringe Ø-galactosidase, og som tilberedes i saltvandssuspension ud fra en kultur. Prøvestrimlen ifølge opfindelsen er stabil i hvert fald i 1 år, såvel ved 4°C som ved stuetemperatur og endda oftest også ved 37°C.

Skønt mange biokemiske prøver er tilgængelige til identi-15 ficering af mikroorganismer af familien Enterobacteriaceae, har det altid været vanskeligt at skelne sådanne organismer som Arizona eller Citrobacter fra Salmonella, og Pseudomonas cepacia eller P. Maltophilia fra andre pseudomonader. Inden for den seneste tid har o-nitrophenyl-Ø-D-galactopyranosid-prøven vist sig 20 anvendelig til at skelne mellem de ovenfor anførte organismer.

Denne prøve afslører Ø-galactosidasefrembringende organismer ved deres bakterielle hydrolyse af substratet o-nitrophenyl--Ø-D-galactopyranosid. Dette sidstnævnte o-nitrophenyl-Ø-D--galactopyranosid, der er almindelig kendt som "ONPG" er et 25 kunstigt substrat, som til at begynde med er farveløst i opløsning. Hydrolyse af substratet ved hjælp af bakteriefrembragt Ø-galactosidase-enzym frigør fri o-nitrophenol, der er gul under alkaliske betingelser. Der tilvejebringes således en bekvem metode til detektering af Ø-galactosidaseaktivitet og dermed de 30 mikroorganismer, som frembringer dette enzym.

ONPG-prøven har været genstand for et antal undersøgelser og afhandlinger, jfr.: Lederberg, J., J. Bact. 60: 381-392 (1950); Lowe, G.H., J. Med. Technol. 19: 21-25 (1962); Pickett, M.J. et al., Appl. Microbiol. 14: 178-182 (1966); og Sonnen-35 wirth, A.C., Chapter 62, Gradwohl's Clinical Laboratory Methods and Diagnosis, 7th Ed., 1970, side 1111-1112.

O

2 142461

Ifølge alle de ovenfor anførte afhandlinger fremstilles ONPG-substratet i en pufferopløsning til det tidspunkt, hvor prøven skal gennemføres på en ukendt organisme. I forvejen fremstillede substratopløsninger med hensigtsmæssig følsomhed 5 og stabilitet er endnu ikke beskrevet. Sammenlignende undersøgelser over anvendelsen af en ONPG-diagnostisk prøvestrimmel er omtalt af R. Rosner i Appl. Microbiol. 26: 890-893 (decemher 1973).. Resultaterne med ONPG-prøvestrimlen er gunstige ifølge Rosners undersøgelser, men hverken sammensætningen, 10 konfigurationen eller fremgangsmåden til fremstilling af prøvestrimlen omtales i denne rapport. ONPG-prøvestrimlen, som benyttes af Rosner ved dennes undersøgelser, er i virkeligheden blot et tidligt forsøg på at tilvejebringe et diagnostisk afprøvningssystem af den her omhandlede type til fremstilling af et 15 stabilt, følsomt produkt, der nøjagtigt vil detektere β-galac-tosidasefrembringende organismer. Uheldigvis er den af Rosner undersøgte QNPG-prøvestrimmels stabilitet så kortlivet, at hverken prøveproduktets følsomhed eller resultaternes nøjagtighed kan garanteres, således at man dermed kan foretage undersøgel-20 ser af kommercielt tilsnit, specielt med henblik på videreudvikling. Et i forvejen fremstillet diagnostisk afprøvningssystem skal nemlig være i stand til at modstå de betingelser, som det normalt er udsat for ved fremstilling, forsendelse og opbevaring, således som disse forekommer ved almindelig markedsfø-25 ring, for at et produkt er egnet til kommerciel videreudvikling.

Et sådant produkt må derfor tilvejebringe pålidelige, reproducerbare afprøvningsresultater. Skønt der således allerede er foretaget visse forsøg inden for området, er der dog stadig klart behov for et i forvejen fremstillet, stabilt, følsomt 30 ONPG-afprøvningssystem, der kan anvendes til hurtig identificering af mikroorganismer, som frembringer β-galactosidaseen-zymer,

Ovennævnte behov og betingelser dækkes og opfyldes netop af prøvestrimlen ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, 35 at substratet er imprægneret som eluerbart reagens i en zone A indeholdende fra ca. 0,05 mg til ca. 3,0 mg tørt o-nitrophenyl- U2461 3

O

-Ø-D-galactopyranosid grænsende op til en zone B imprægneret med ca. 0,01 til ca. 0,1 mmol af et tørt puffersystem, som ved eluering holder pH på en værdi fra ca. 6,5 til ca.

8,5. Prøvestrimlen fremstilles let og pålideligt ved frem-5 gangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, at man fremstiller en vandig opløsning indeholdende fra ca. 0,5 til ca. 5,0% (efter vægt/rumfang), beregnet på hele opløsningen, o-nitrophenyl-Ø-D-galactopyranosid og fra ca. 25 til ca, 75 rumfangsprocent acetone, som man påfører på en 10 zone A af det sugende materiale og inddamper til tørhed, således at der tilvejebringes fra ca. 0,05 mg til ca. 3,0 mg o-nitrophenyl-Ø-D-galactopyranosid, og at man fremstiller en opløsning af et puffersystem, som holder pH fra ca. 6,5 til ca. 8,5, idet det er fra ca. 0,5 til ca. 1,0 molært, og som 15 man påfører på en zone B grænsende op til zonen A og inddamper til tørhed, således at der tilvejebringes fra ca. 0,01 til ca. 0,1 mmol puffer, hvorhos man om ønsket fremstiller og påfører en vandfast spærreopløsning i en zone grænsende op til zonen B og inddamper til tørhed og eventuelt fremstiller og på-20 fører en identificeringsfarvestofopløsning i den modsatte ende af prøvestrimlen i forhold til de med reagens imprægnerede zoner A og B og inddamper til tørhed.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opløses fra ca. 0,5 til ca. 5,0% (efter vægt/rumfang) af et o-nitrophenyl-Ø-D-25 galactopyranosid-substrat i en ca. 25 til ca. 75% (efter rumfang) vandig acetoneopløsning, som påføres på den ene zone af et sugende bæremateriale, og endvidere fremstilles en ca. 0,5 til ca. 1 molær pufferopløsning, der vil holde pH på en værdi fra ca. 6,5 til ca. 8,5, og den påføres på en zone af det su-30 gende bæremateriale, som grænser op til substratzonen. Det imprægnerede, tørre, sugende bæremateriale indeholder fra ca.

0,05 mg til ca. 3,0 mg af o-nitrophenyl-Ø-D-galactopyranosidet i den ene zone og fra ca. 0,01 til ca. 0,1 mmol puffer i en tilstødende zone. Fortrinsvis anvendes en monobasisk kalium- og 35 dibasisk natriumphosphatpuffer. Eventuelt kan tilvejebringes en vandfast spærrezone grænsende op til den yderst beliggende U2Å61

O

4 med reagens imprægnerede zone. Ved brugen indsættes det imprægnerede sugende bæremateriale i en saltvandssuspension af en ukendt organisme og inkuberes i 4 timer. Udviklingen af en gul farve indicerer, at en β-galactosidase-frembringende orga-5 nisme er til stede.

Det har nemlig vist sig, at et pufret o-nitrophenyl-β--D-galactopyranosid-prøvesystem til detektering af β-galacto-sidasefrembringende bakterier kan påføres på et sugende bære-materiale, således at der tilvejebringes en stabil, følsom 10 prøvestrimmel, der kan benyttes til hurtig identificering af sådanne mikroorganismer. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opløses et o-nitrophenyl^-D-galactopyranosid substratmateriale i en specifik koncentration af acetone og vand og påføres på den ene zone af et sugende bæremateriale, o-nitro-15 phenyl^-D-galactopyranosidet er et kunstigt substratmateriale, der er kommercielt tilgængelig fra Calbiochem. Co., La Jolla, Californien, USA, og som er almindeligt kendt som "ONPG". Den til påføreisen af ONPG-substratet på det sugende bæremateriale anvendte opløsning fremstilles ved at opløse fra ca. 0,5 til 20 ca. 5,0% (efter vægt/rumfang) ONPG, beregnet på hele opløsningens rumfang, i en opløsning indeholdende fra ca. 25 til ca. 75 rumfangsprocent acetone i vand. Fortrinsvis indeholder den vandige substratopløsning ca. 5,0% (efter vægt/rumfang) ONPG og ca. 70 rumfangsprocent acetone. Substratopløsningen 25 påføres yderst i den ene side af det sugende bæremateriale og inddampes til tørhed, således at der tilvejebringes fra ca.

0,05 mg til ca. 3,0 mg tørt ONPG på én (1) afprøvningsenhed af det sugende bæremateriale. Substratopløsningen kan påføres på det sugende bæremateriale ved en hvilken som helst hen-30 sigtsmæssig foranstaltning, på den ene eller på begge sider af en substratzone, således at man får den ovenfor anførte mængde tørt ONPG substrat afsat i substratzonen. Fortrinsvis påføres ONPG substratopløsningen 3 gange på hver side af det sugende materiale, således at der fås en total mængde på ca. 1,5 mg 35 tørt substrat på én afprøvningsenhed.

O

5 142461

Der tilvejebringes herved et mikrobiologisk indifferent puffersystem, som er i stand til at opretholde et pH fra 6,5 til 8,5, og ifølge opfindelsen fra ca. 7,2 til ca. 7,6 og isar på ca. 7,4, da dette giver de nøjagtigste og lettest reproducerba-5 re resultater på en særskilt, men tilgrænsende del af det sugende bæremateriale, hvilket puffersystem derefter inddampes til tørhed, Hensigtsmæssige puffersysterner, der har den ovenfor beskrevne evne, indbefatter: natriumbarbital/saltsyre; natriumacetat og natriumbarbital/saltsyre; borax/monobasisk 10 kaliumphosphat; citronsyre, phosphorsyre, orthoborsyre og na-triumhydroxid/saltsyre; citronsyre og dibasisk natriumphosphat; monobasisk kaliumphosphat/dibasisk natriumphosphat; piperazin--dihydrochlorid/natriumhydroxid; piperazin-dihydrochlorid i glycylglycin/natriumhydroxid; tris[hydroxymethyl]aminomethan/-15 saltsyre; og tris[hydroxymethyl]aminomethan og maleinsyre eller maleinsyreanhydrid/natriumhydroxid. Blandt de ovenfor anførte hensigtsmæssige puffersysterner foretrækkes især følgende: monobasisk kaliumphosphat/dibasisk natriumphosphat; tris[hydroxymethyl] aminomethan/saltsyre; og natriumbarbital/saltsyre.

20 Det foretrækkes ifølge opfindelsen, at puffersysternet er monobasisk kaliumphosphat og dibasisk natriumphosphat, der er stabilt billigt og effektivt. Optimale resultater i henseende til stabilitet er opnået med en prøvestrimmel, hvor ifølge opfindelsen substratzonen A indeholder ca. 1,5 mg tørt o-nitrophenyl-25 -β-D-galactopyranosid, og pufferzonen B indeholder ca. 0,02 mmol tør puffer til at holde et pH på ca. 7,4 ved eluering.

Ved fremstilling af puffersystem-opløsningen til påførel-se på det sugende bæremateriale har det vist sig, at en pufferopløsning med en koncentration fra ca. 0,5 til ca. 1 molær 30 er særdeles velegnet. Sådanne opløsninger anvendes til at afsætte de fornødne ca. 0,01 til ca. 0,1 mmol puffer på én (1) afprøvningsenhed af det sugende bæremateriale i en zone adskilt fra, men stødende op til den med substrat imprægnerede zone. Ved den foretrukne udførelsesform for opfindelsen påføres en ca.

35 1 molær monobasisk kaliumphosphat og dibasisk natriumphosphat- -pufferopløsning på det sugende bæremateriale i en zone støden- 6 1Λ2461

O

de op til substratzonen, således at der afsættes ca. 0,02 iranol puffer på én afprøvningsenhed af det sugende materiale. Således som ved påføreisen af substratopløsningen ovenfor kan en hvilken som helst hensigtsmæssig foranstaltning til påførelse 5 af pufferopløsningen på det sugende bæremateriale benyttes, forudsat at den ovenfor anførte mængde tør puffer afsættes i den rigtige zone af det sugende bæremateriale. Fortrinsvis påføres pufferopløsningen to gange på hver side af den rigtige zone af det sugende bæremateriale, idet der foretages 10 tørring mellem hver påføring.

Prøvestrimlen indeholdende de her anførte mængder tørt substrat og puffer imprægneret på særskilte, men tilstødende zoner af én afprøvningsenhed af det sugende bæremateriale anvendes ifølge opfindelsen ved, at de med reagens imprægnerede 15 zoner A og B af den diagnostiske prøvestrimmel neddyppes i ca. 0,3 ml af suspensionen i et reagensglas og inkuberes i ca.

4 timer og ved en temperatur på ca. 35 til ca. 37°C, hvorefter udvikling af gulfarvning kan konstateres som positiv indikation for β-galactosidasefrembringende mikroorganismers til-20 stedeværelse. Til opnåelse af optimale resultater i løbet af den anbefalede inkubationstid bør en tilstrækkelig mængde af prøveorganismerne være til stede, således at suspensionen er synligt uklar. En mindre tæt suspension kan anvendes, men vil kræve forøget inkubationstid. En mere tæt suspension indehol-25 dende en større koncentration af organismer kan anvendes sammen med den diagnostiske prøvestrimmel ifølge opfindelsen uden nogen som helst vanskelighed. Skal mængden af prøveorganismer eller inkubationstiden eller temperaturen varieres, vil der kræves tilsvarende justeringer i mængderne af 30 puffer og substrat for at sikre, at fornøden kontakt mellem prøvereagenserne og prøveorganismerne har fundet sted for at forhindre falske negative resultater. De mængder, der anvendes ved fremstilling af den diagnostiske prøvestrimmel ifølge opfindelsen, har vist sig at give nøjagtige, følsomme resul-35 tater, der fås hurtigt ved strimlens anvendelse. Variationer i

O

7 142461 mængderne af reagenserne, mængderne af prøveorganismer eller inkubationstid eller temperatur kan naturligvis foretages, men prøvestrimlen vil da muligvis ikke være helt så følsom eller nøjagtig, og resultaterne vil muligvis ikke opnås i 5 løbet af så kort tid. De bedste resultater fås, når man ifølge opfindelsen fremstiller en opløsning indeholdende ca.

5,0% (efter vasgt/rumfang), beregnet på hele opløsningen, o-nitrophenyl-fJ-D-galactopyranosid og ca. 70 rumfangsprocent acetone, som påføres i zonen A og inddampes til tørhed, så 10 der fås ca. 1,5 mg o-nitrophenyl-Ø-D-galactopyranosid, og man fremstiller en opløsning af et puffersystem, der holder pH på ca. 7,4 og er ca. 1 molært, og påfører puffersystem-opløsningen i zonen B og inddamper til tørhed, så der fås ca. 0,02 mmol puffer.

15 Den diagnostiske prøvestrimmel ifølge opfindelsen kan omfatte et sugende bæremateriale med kun to zoner, som er fuldstændigt imprægneret med substrat og puffer. Hvor yderligere uimprægneret bæremateriale er til stede, er det imidlertid nødvendigt at påføre en vandfast eller hydrofob spærre-20 zone for at forhindre, at prøvereagenserne og slutprodukterne migrerer videre til de uimprægnerede områder af den sugende bærer i løbet af inkubationen med suspensionen af prøveorganismer. Hvis prøvereagenserne dispergeres over uimprægnerede områder af det sugende bæremateriale, formindskes koncentratio-25 nerne, som faktisk er i kontakt med organismerne, og resultaterne kan blive unøjagtige. Hertil kommer, at et positivt prøveresultat, hvis det kun er bleggult, kan være meget vanskeligt at erkende. Derfor er en vandfast eller hydrofob spærrezone da nødvendig for at forhindre migration af reagenser.

30 Spærresammensætningen, som skal påføres på det sugende bæremateriale, må være kemisk indifferent i den diagnostiske prøvestrimmel ifølge opfindelsen. Et hvilket som helst indifferent stof, der vil danne en vandfast spærring af denne type, kan anvendes. Hensigtsmæssige materialer indbefatter vokser, 35 lakker og plaster. Et sådant materiale er det farveløse, poly-meriserede methacrylatovertræksmateriale, som fås under beteg- 8 Ο 14246ΐ nelsen "KryIon 150 Crystal Clear" x~, og som tilvejebringes i et toluenbæremedium og kan fortyndes med yderligere toluen eller fortyndingsmidler såsom methyl-, ethyl- og propylalkohol. Et andet velegnet spærremateriale er et chromkompleks, 5 der fås under betegnelsen "Quilon" og som tilvejebringes i en isopropanolopløsning, der kan fortyndes. En særlig foretruk- r) ken vandfast spærring fås ved først at påføre "Quilon" --overtrækket på det sugende bæremateriale og dernæst at påføre "Krylon 150 Crystal Clear" ^overtrækket ovenpå "Quilon" 10 -overtrækket, enten med eller uden mellemliggende tørring.

Ovennævnte spærreovertrækssammensætninger påføres på begge sider af det sugende bæremateriale for at sikre fuldstændig indtrængning i det sugende materiale.

Eventuelt kan en identificeringszone til håndtering af 15 den diagnostiske prøvestrimmel være til stede på den yderste kant modsat de med reagens imprægnerede zoner af det sugende bæremateriale. Et hvilket som helst hensigtsmæssigt mærke eller farvestof, der vil identificere eller farve det sugende materiale og således tjene til at skelne "håndteringszonen" 20 fra de reagensimprægnerede zoner, kan benyttes. Det har f.eks. vist sig, at ca. 0,40 til ca. 0,60 g af et farvestof opløst i et hensigtsmæssigt opløsningsmiddel og indstillet til 100 ml kan påføres på det sugende bæremateriale. Den foretrukne farvestofopløsning indeholder 0,50 g farvestof colour index nr.

25 73015 (blåt) af 0,10 g farvestof colour index 16185 (rødt) og 0,10 g vandopløseligt nigrosin. Imidlertid kan andre farvestofopløsninger anvendes med lignende effektivitet.

Sugende bærematerialer, der er velegnede til brug ved den praktiske fremstilling af identifikationsstrimler ifølge 30 opfindelsen, er sådanne materialer, der ved hjælp af kapil- lærvirkning har vist sig at kunne rumme væske. Sådanne materialer indbefatter filtrerpapir, filt, porøse keramiske strimler, vævede eller måttelagte filtre og lignende. Et særlig foretrukket sugende materiale er svært filtrerpapir.

35 Ved fremstilling af den diagnostiske prøvestrimmel iføl ge opfindelsen kan anvendes en rulle hensigtsmæssigt sugende

O

9 142461 materiale, f.eks. en 10 meter lang rulle filtrerpapir. Substratopløsningen, pufferopløsningen og spærreopløsningen påføres længdevis på hele rullen i parallelle zoner eller bånd ved, at filtrerpapiret sendes mellem overtrukne påføringsval-5 ser, som opsamler reagensopløsningerne fra respektive reservoirsæt. Filtrerpapiret imprægneres med opløsningen, efterhånden som det passerer hen over valserne. Mængden af afsat reagens på de rigtige eller hensigtsmæssige respektive zoner af filtrerpapiret er en funktion af påføringsorganets størrel-10 se og det antal gange, som filtrerpapiret sendes hen over påføringsvalsen. Desuden kan begge sider af filtrerpapiret overtrækkes, om ønsket. Efter at alle reagensopløsninger er påført på de rette zoner af filtrerpapirrullen og inddampet til tørhed, opskæres filtrerpapiret i individuelle strimler, der re-15 præsenterer én prøveenhed af den diagnostiske prøvestrimmel ifølge opfindelsen og hver især indeholder tilstrækkelige mængder substrat og puffer som nødvendigt til identificering og differentiering af β-galactosidase-frembringende mikroorganismer.

20 Ved brugen indsættes én prøvestrimmel ifølge opfindelsen i et reagensglas indeholdende en saltvandssuspension af den ukendte kultur, som skal afprøves, således at substrat- og pufferzonerne neddyppes i prøvesuspensionen. Reagensglasset inkuberes ved ca. 35-37°C i ca. 4 timer og iagttages til kon-25 statering af tilstedeværelsen af gul farvning i væsken, hvilket er en positiv indikation for tilstedeværelsen af β-galac-tosidasefrembringende organismer. Hvis suspensionen forbliver farveløs, er prøven negativ.

Til yderligere illustration af prøvestrimlen ifølge op-30 findelsen, dens fremstilling og anvendelse tjener følgende eksempler:

Eksempel 1

Fremstilling af substratopløsningen 35 70 ml acetone og 30 ml destilleret vand blandes, og 5 g o-nitrophenyl-3-D-galactopyranosid tilsættes under omrøring til opløsning af substratet.

142661 ίο o

Eksempel 2

Fremstilling af pufferopløsningen 2,006 g monobasisk kaliumphosphat og 12,106 g dibasisk natriumphosphat tilsættes til destilleret vand, hvis rumfang 5 bringes op på 100 ml, og det opvarmes til ca. 60°C under omrøring for at opløse pufferen.

Eksempel 3

Fremstilling af spærreopløsning 10 Opløsning A

'S' 5,45 ml "Quilon C" ^-opløsning (fra du Pont) blandes grundigt og sættes til 21,8 ml isopropylalkohol under konstant tn omrøring. 45,4 ml vand tilsættes til "Quilon C" -isopropylal-kohol-opløsningen. 27,3 ml 0,05 normal natriumhydroxid tilsæt-15 tes under konstant omrøring, og hele opløsningens rumfang bringes op på 100 ml med destilleret vand.

Opløsning B

15 ml 95%*s ethanol sættes til 85 ml "KryIon 150 Crystal 20 Clear" og sammenblandes grundigt.

Eksempel 4

Fremstilling af identificeringsfarvestofopløsningen 0,50 g Cl 73015 blåt farvestof, 0,10 g Cl 16185 rødt 25 farvestof og 0,10 g vandopløselig nitrosin opløses i destilleret vand, idet hele opløsningens rumfang indstilles på 100 ml.

Eksempel 5

Fremstilling af den diagnostiske prøvestrimmel 30 En 10 meter rulle svært filtrerpapir med en bredde på 83 mm anvendes som det sugende materiale. Substratopløsningen fra eksempel 1 anbringes i et reservoir, hvorfra den fødes til overfladen af et roterende påføringshjul. En 3,7 mm bred zone langs kanten af det 10 meter lange filtrerpapir imprægneres 35 med substratopløsningen ved, at filtrerpapiret sendes over et roterende påføringshjul med en bredde på 4 mm. Det roterende 142461 11 o hjul fremfører samtidig papiret, og overtrækket inddampes til tørhed. Denne fremgangsmåde gentages 3 gange, idet der foretages tørring mellem hver påførelse, på hver side af den 3,7 mm bredde substratzone.

5 Pufferopløsningen ifølge eksempel 2 anbringes i et re servoir og anbringes ved hjælp af et roterende påføringshjul med en bredde på 4 mm som en 3,7 mm bred pufferzone, der grænser op til filtrerpapirets substratzone. Pufferopløsningen påføres 2 gange på hver side af pufferzonen og tillades at tørre 10 efter hver påførelse. Pufferzonen må ikke overlappe substratzonen.

Spærreopløsning A ifølge eksempel 3 anbringes i et reservoir og påføres på midten af en 16 mm bred zone grænsende op til pufferzonen ved hjælp af et roterende påføringshjul med 15 en bredde på 5 mm. Påføreisen foretages en gang på hver side af denne centrerede spærrezone. Spærreopløsning B ifølge eksempel 3 anbringes i et reservoir og påføres ovenpå den imprægnerede opløsning A uden mellemliggende tørring på begge sider af hele den 16 mm brede spærrezone ved hjælp af et roterende hjul med 20 en bredde på 15 mm og tillades at tørre.

Identificeringsfarvestofopløsning ifølge eksempel 4 anbringes i et reservoir og påføres som en 16 mm bred zone langs den modstående kant af det 10 meter brede filtrerpapir (dvs. modsat i forhold til substratzonen) ved hjælp af et 6,3 mm på-25 føringshjul. Identificeringsfarvestofopløsningen påføres en gang på hver side af identificeringszonen og tillades at tørre.

Efter at alle imprægnerede zoner på filtrerpapirrullen er grundigt tørre, opskæres papiret på tværs, dvs. efter 83 mm's bredde, i 6,3 mm brede strimler.

30

Eksempel 6

Anvendelse af den diagnostiske prøvestrimmel

Et øjefuld af en ukendt kultur suspenderes i en 0,3 ml saltvandopløsning i et reagensglas med en diameter på 13 mm og 35 en længde på 100 mm. Den diagnostiske prøvestrimmel ifølge eksempel 5 indsættes, således at zonen modsat identificerings- 142461

O

12 farvestofzonen nedsænkes, og prøven i reagensglasset inkuberes i et vandbad i 4 timer ved 35-37°C. Udviklingen af en gul farvning i væsken indicerer et positivt prøveresultat. Hvis væsken forbliver farveløs, er prøven negativ.

Claims

14 2 Λ 6 1 P_a_t_e_n_t_k_r_a_v_.

1. Diagnostisk prøvestrimmel til detektering af mikroorganismer, der er kendt for at frembringe β-galactosidase, ved bakteriel hydrolyse af et o-nitrophenyl-p-D-galactopy- 5 ranosidsubstrat anbragt på et sugende materiale, eventuelt afgrænset med en spærrezone og eventuelt forsynet med en identificeringsfarvezone, kendetegnet ved, at substratet er imprægneret som eluerbart reagens i en zone A indeholdende fra ca. 0,05 mg til ca. 3,0 mg tørt o-nitro-10 phenyl-Ø-D-galactopyranosid grænsende op til en zone B imprægneret med ca. 0,01 til ca. 0,1 mmol af et tørt puffersystem, som ved eluering holder pH på en værdi fra ca. 6,5 til ca. 8,5.

2. Diagnostisk prøvestrimmel ifølge krav 1, k e n d e-15 tegnet ved, at puffersystemet holder pH fra ca. 7,2 til ca. 7,6.

3. Diagnostisk prøvestrimmel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at puffersystemet er baseret på monobasisk kaliumphosphat og dibasisk natriumphosphat.

4. Diagnostisk prøvestrimmel ifølge krav 1 eller 3, kendetegnet ved, at substratzonen A indeholder ca. 1,5 mg tørt o-nitrophenyl-13-D-galactOpyranosid, og at pufferzonen B indeholder ca. 0,02 mmol tør puffer til at holde et pH på ca. 7,4 ved eluering.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af den diagnostiske prøvestrimmel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man fremstiller en vandig opløsning indeholdende fra ca. 0,5 til ca. 5,0% (efter vægt/rumfang), beregnet på hele opløsningen, o-nitrophenyl-3-D-galactopyranosid og fra ca. 25 30 til ca. 75 rumfangsprocent acetone, som man påfører på en zone A af det sugende materiale og inddamper til tørhed, således at der tilvejebringes fra ca. 0,05 mg til ca. 3,0 mg o-nitrophenyl-Ø-D-galactopyranosid, og at man fremstiller en opløsning af et puffersystem, som holder pH fra ca.

6,5 35 til ca. 8,5, idet det er fra ca. 0,5 til ca. 1,0 molært, og som man påfører på en zone B grænsende op til zonen A og inddamper til tørhed, således at der tilvejebringes fra ca. 0,01 til ca. 0,1 mmol puffer, hvorhos man om ønsket frem-