NO148380B - Diagnosetestsystem for paavisning av bakterier som frembringer beta-galaktosidase - Google Patents

Description

Selv om det finnes mange tester for identifisering av mikroorganismer i familien Enterobakteriaceae, har det alltid vært vanskelig å differensiere organismer som f.eks. Arizona eller Citrobacter fra Salmonella og Pseudomonas cepacia eller P. maltophilia fra andre pseudomonader. Nylig har en o-nitrofenyl-[3-D-galaktopyranosidtest vist seg brukbar for å skille ovennevnte organismer. Denne testen påviser (3-galaktosidase-produserende organismer ved bakteriell hydrolyse av substratet, o-nitrofenyl-3-D-galaktopyranosid. Dette sistnevnte o-nitrofenyl-|3-D-galaktopyranosid, vanligvis kjent som "ONPG" , er et kunstig substrat som opprinnelig er fargeløst i løsning. Hydrolyse av substratet med bakterielt fremstilt |3-galaktosidase-enzym frigjør fri o-nitrofenol som er gul under alkaliske be-tingelser. Det er således skaffet en hensiktsmessig metode for påvisning av [3-galaktosidase-aktivitet og mikroorganismene som frembringer dette enzymet.

ONPG-testen er underkastet en rekke undersøkelser: Lederberg, J., J. Bact. 60, 381-392 (1950), Lowe, G.H., J. Med. Technol. 19, 21-25 (1962), Pickett, M.J. et al., Appl. Microbiol. 14, 178-182 (1966) og Sonnenwirth, A.C., Kapitel 62, Gradwohl's Clinical Laboratory Methods and Diagnosis, 7de utg., sidene 1111-1112. I alle disse undersøkelser fremstilles ONPG-substratet i en buffer-løsning på den tiden testen med en ukjent organisme skal utføres. Forhåndsfremstilte substratløsninger med passende følsomhet og stabilitet er ikke omtalt. Sammen-lignende undersøkelser av bruken av en ONPG-diagnosetest-strimmel er angitt av Rosner, R. i Appl. Microbiol. 26, 890-

893 (desember 1973). Resultater med ONPG-teststrimmel var fordelaktige ifølge Rosner-undersøkelsene, men hverken sammen-setning, form eller fremgangsmåte for fremstilling av strimmel-en er angitt i dette arbeide. Den ONPG-strimmel som ble brukt i Rosner-undersøkelsene er i virkeligheten et tidlig forsøk av oppfinnerne av diagnosetestsystemet i foreliggende oppfinnelse på å fremstille et stabilt, følsomt produkt som nøyaktig ville påvise (3-galaktosidase-produserende organismer. Uheldigvis var stabiliteten for ONPG-teststrimmelen som ble undersøkt av Rosner, så dårlig at hverken følsomheten for testproduktet

eller nøyaktigheten av resultatene kunne garanteres dersom kommersiell utvikling skulle bli igangsatt. Et forhåndsfrem-

stilt diagnosetestsystem må kunne motstå de fabrikasjons-, transport- og lagringsbetingelser som vanligvis forekommer, for å bli ansett som egnet for markedsføring. Et slikt produkt må skaffe pålitelige, reproduserbare testresultater. Mens det således er oppnådd en viss fremgang, er det fortsatt behov for et forhåndsfremstilt, stabilt, følsomt ONPG-testsystem som kan anvendes for rask påvisning av mikroorganismer som produserer [3-galaktosidaseenzymer.

Ifølge oppfinnelsen skaffes det således et diagnosetestsystem for påvisning av bakterier som frembringer (3-galaktosidase ved bakteriell hydrolyse av et o-nitrofenyl-(3-D-galakto-pyranosidsubstrat anbrakt på et porøst materiale eventuelt avgrenset av en sperresone og eventuelt forsynt med en identifi-seringsfargesone. Testsystemet karakteriseres ved at substratet er impregnert som en eluerbar, vandig acetonoppløsning inneholdende fra 0,05 til 3,0 mg tørt o-nitrofenyl-g-D-galakto-pyranosid i en sone A som grenser opp til en sone B impregnert med 0,01 til 0,1 mmol av et tørt buffersystem som ved eluering vil holde en pH på en verdi fra 6,5-8,5.

Det anvendes fortrinnsvis en enbasisk kalium- og to-basisk natriumfosfatbuffer. Eventuelt kan det være en vanntett barrieresone i tilslutning til den ytre reagensimpregnerte sonen. Ved bruk innføres det impregnerte porøse bærermaterialet i en saltsuspensjon av en ukjent organisme og inkuberes i fire timer. Utviklingen av en gulfarge angir at det er til stede en 3-galaktosidase-produserende organisme. Diagnosetestsystemet ifølge oppfinnelsen er stabil i ett år ved 4°C, ved romtemperatur og ved 3 7°C.

Det nye testesystem er således velegnet for påvisning av (3-galaktosidaseproduserende bakterier og representerer et stabilt, følsomt testsystem som kan brukes for rask identifi-kasjon av slike mikroorganismer. For fremstilling av testsystemet ifølge oppfinnelsen oppløses et o-nitrofenyl-|3-D-galaktopyranosid-substratmateriale i en spesiell konsentrasjon av aceton og vann og påføres på en sone av et porøst bærermateriale. O-nitrofenyl-g-D-galaktopyranosidet er et kunstig substratmateriale som er vanlig kjent som "ONPG". Løsningen som brukes for påføring av ONPG-substratet på det porøse bærermaterialet fremstilles ved å løse 0,5 til 5,0 % vekt/volum av ONPG basert på volumet av total-1 øsningen i en løsning inneholdende fra 25 til 75 volum% av aceton i vann. Den vandige substratløsningen inneholder fortrinnsvis 5,0 % vekt/volum ONPG og 70 volum% aceton. Substratl øsningen påføres på en ende av det porøse bærermaterialet og inndampes til tørrhet slik at det oppnås fra 0,05 til 3,0 mg tørt ONPG på en testenhet av det porøse bærermaterialet. Substratløsningen kan påføres det porøse bærermaterialet på enhver passende måte på en eller begge sidene av en substratsone for å oppnå den ovennevnte mengde tørr ONPG-substratavsetning i substratsonen. ONPG-substratløsningen påføres fortrinnsvis tre ganger på hver side av det porøse materialet for å oppnå i alt ca. 1,5 mg tørt substrat på en testenhet.

Et mikrobiologisk inert buffersystem som har evnen til å bibeholde pH på fra 6,5 til 8,5, fortrinnsvis 7,2 til 7,6,

mest foretrukket 7,4, påføres på en adskilt men tilstøtende del av det porøse bærermaterialet og fordampes til tørrhet. Egnede buffersysterner som har den ovenfor beskrevne evne omfatter: barbitalnatrium/saltsyre; natriumacetat og barbital-natrium/saltsyre; boraks/enbasisk kaliumfosfat; sitronsyre, fosforsyre, ortoborsyre og natriumhydroksyd/saltsyre; sitronsyre og tobasisk natriumfosfat; enbasisk kaliumfosfat/tobasisk natriumfosfat; piperazindihydroklorid/natriumhydroksyd; piper-azindihydroklorid i glycylglycin/natriumhydroksyd; tris[hydroksy-mstyl] aminometan/saltsyre og tris[hydroksymetyl] aminometan og maleinsyre eller maleinsyreanhydrid/natriumhydroksyd. Blant de egnede buffersysterner er følgende foretrukket: enbasisk kaliumfosfat/tobasisk natriumfosfat; tris[hydroksymetyl] aminometan/saltsyre og barbitalnatrium/saltsyre. Av disse er enbasisk kaliumfosfat/tobasisk natriumfosfatbuffer et spesielt foretrukket system.-.

Ved fremstilling av bufferløsningen for påføring på det porøse bærermaterialet er det funnet at en bufferløsning med en konsentrasjon på fra 0,5 til 1 molar er passende. Slike løsninger anvendes for å avsette den krevede 0,01 til 0,1

• millimol buffer på en testenhet av porøst bærermateriale i en sone som er adskilt fra men tilstøtende den substratimpregnerte sonen. I den foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen på-føres en 1 molar enbasisk kaliumfosfat og tobasisk' natrium-

fosfat bufferløsning på det porøse bærermaterialet i en sone som er tilstøtende til substratsonen, slik at det avsettes 0,02 millimol på en testenhet av det porøse materialet. Som når det gjaldt påføringen av substratløsningen ovenfor, kan enhver egnet måte for påføring av bufferløsningen på det porøse bærermaterialet anvendes forutsatt at den ovenfor nevnte mengde tørr buffer avsettes på den bestemte sone av det porøse bærermaterialet. Fortrinnsvis påføres buffer-løsningen to ganger på hver side av den bestemte sonen på det porøse bærermaterialet med tørking mellom hver påføring.

De ovenfor angitte mengder tørt substrat og tørr buffer som er impregnert på adskilte men tilstøtende soner på en testenhet av det porøse materialet er beregnet på inkubering med ca. 0,3 ml saltsuspensjon av testorganismene i fire timer ved 35-37°C. For å oppnå optimalt resultat innenfor den anbefalte inkuberingstid bør det være til stede en tilstrekke-lig mengde testorganismer slik at suspensjonen blir synlig uklar. En tynnere suspensjon kan brukes, men ville kreve øket inkuberingstid. En tykkere suspensjon som inneholder en større konsentrasjon av organismer, kan brukes med diagnosetestsystemet ifølge oppfinnelsen uten vanskelighet. Skulle mengden testorganisme eller inkuberingstid eller temperatur varieres, ville det kreves tilsvarende justeringer av mengdene buffer og substrat for å sikre at det hadde funnet sted til-strekkelig kontakt mellom testreagensene og testorganismene for å hindre feilaktige negative resultater. De mengder som brukes i diagnosetestsystemet ifølge oppfinnelsen er funnet å gi nøyaktige, følsomme resultater så raskt som mulig. Varia-sjoner i mengder av reagenser, mengder av testorganismer eller inkuberingstider eller temperaturer kan naturligvis anvendes, men testsystemet vil da ikke være like følsomt eller nøyaktig og resultatene vil ikke oppnås på så kort tid.

Diagnosetestsystemet ifølge oppfinnelsen kan omfatte et porøst bærermateriale med bare to soner som er helt impregnert med substrat og buffer. Hvor det imidlertid er ytterligere uimpregnert porøst materiale, er det nødvendig med påføring av en vanntett eller hydrofob barriereløsning for å hindre vandring av testreagenser og sluttprodukter til de uimpregnerte områider av det porøse materialet under inkubering med suspensjonen av testorganismer. Dersom testreagensene blir dispergert over de uimpregnerte områder av det porøse bærermaterialet, minkes de konsentrasjoner som kommer i kontakt med testorganismene og resultatene kan bli unøyaktige. Et positivt testresultat kan dersom det er lysegult, dessuten bli meget vanskelig å fastslå. Derfor er en vanntett eller hydrofob barrieresone nødvendig for å hindre vandring av reagensene.

Den barriereblanding som skal påføres på det porøse bærermaterialet må være kjemisk inert i det biologiske testsystemet ifølge oppfinnelsen. Enhver inert substans som vil danne en vanntett barriere av denne type kan anvendes. Egnede materialer omfatter voks, lakk og plast. Et slikt materiale er det fargeløse, polymeriserte metylmetakrylat-beleggpreparatet som markedsføres under varemerket "Krylon 150 Crystal Clear", som selges oppbevart toluen og sem kan fortynnes med mere toluen eller, med fortynningsmidler som f.eks. metyl-, etyl-

og propylalkohol. En annen egnet barriereblanding er et kromkompleks markedsført under varemerket "Quilon" og som fåes i isopropanol-løsning som kan fortynnes. En spesielt foretrukket vanntett barriere oppnås ved først å påføre "Quilon"-belegget på det porøse bærermaterialet og så påføre "Krylon 150 Crystal Clear"-belegget over "Quilon"-belegget, med eller uten tørking slik som beskrevet i US-patent 3 846 247.

De ovenfor nevnte barrierebelegg-blandinger påføres på begge sider av det porøse materialet for å sikre fullstendig inntrengning i det porøse materialet.

Eventuelt kan det forefinnes en identifikasjonssone for håndtering av diagnosetestmaterialet på den motsatte ende av de reagensimpregnerte soner på det porøse bærermaterialet. Enhver egnet markering eller farge som vil identifisere eller farge det porøse materialet og således utskille "håndterings-sonen" fra de reagensimpregnerte soner kan anvendes. Det er eksempelvis funnet at 0,40 til 0,60 gram av et fargestoff opp-løst i et egnet løsningsmiddel og justert til 100 ml kan på-føres på det porøse materiale. Den foretrukne fargeløsning inneholder 0,50 gram "FD & C Blue no. 2", 0,10 gram "FD & C Red no. 2" og 0,10 gram vannløselig "Nigrosin". Andre fargeløs-ninger kan imidlertid anvendes med like stor effekt.

Porøse bærermaterialer som er egnet for anvendelse ved utførelsen av oppfinnelsen, er de materialer som ved hjelp av kapillærvirkning er funnet å suge opp væsker. Slike materialer omfatter filtrerpapir, filt, porøse keramiske strimler, vevede eller sammenfiltrede fibre og liknende. Et spesielt foretrukket porøst materiale er tungt filtrerpapir.

Ved fremstilling av diagnosetestsystemet ifølge oppfinnelsen kan det anvendes en rull av egnet porøst materiale som eksempelvis en 10 meters rull filtrerpapir. Substratløsningen, bufferløsningen og barriereløsningen påføres på hele rullen på langs i parallelle soner eller bånd ved å føre filtrerpapiret mellom tilmålte påføringsvalser som opptar reagensløsningen fra beholdere. Filtrerpapiret blir impregnert med løsningen når det passerer over valsene. Mengden reagens som avsettes på den beregnede sone på filtrerpapiret er en funksjon av størrelsen av påføringsvalsen og antallet ganger filtrerpapiret føres over påføringsvalsen. Begge sider av filtrerpapiret kan om ønsket belegges. Etter at all reagens-løsning er påført på bestemte soner av filtrerpapirrullen og fordampet til tørrhet, deles filtrerpapiret i enkeltstrimler som representerer en testenhet av diagnosetestsystemet ifølge oppfinnelsen, som hver inneholder tilstrekkelige mengder av substrat og buffer til å identifisere og adskille 3-galaktosidase-produserende mikroorganismer.

Ved anvendelse innføres en testenhet eller teststrimmel av diagnosetestsystemet ifølge oppfinnelsen i et reagensrør inneholdende en saltsuspensjon av den ukjente kultur som skal testes, slik at substrat- og buffersonene er neddykket i test-suspensjonen. Røret inkuberes ved 35-37°C i ca. fire timer og observeres på nærvær av gulfarging av væsken som er en posi-tiv indikasjon på nærvær av 3-galaktosidase-produserende organismer. Dersom suspensjonen forblir fargeløs er testen negativ.

For ytterligere å illustrere oppfinnelsen hitsettes følgende eksempler:

Eksempel I

Fremstilling av substratløsningen.

70 ml aceton og 30 ml destillert vann blandes og 5 gram o-nitrofenyl-3-D-galaktopyranosid tilsettes under omrøring for å oppløse substratet.

Eksempel II

Fremstilling av bufferløsningen.

2,006 gram enbasisk kaliumfosfat og 12,106 gram to-basisk natriumfosfat tilsettes til destillert vann, bringes til 100 ml og oppvarmes til ca. 60°C under omrøring for å oppløse bufferen.

Eksempel III

Fremstilling av barriereløsningen

Løsning A.

5,45 ml "Quilon C"-løsning blandes grundig og tilsettes til 21,8 ml isopropylalkohol med stadig omrøring, 45,4 ml vann tilsettes til "Quilon C"/isopropylalkohol-løsningen. 27,3 ml 0,05N natriumhydroksyd tilsettes med kontinuerlig omrøring og hele løsningen bringes til 100 ml med destillert vann.

Løsning B.

15 . ml etanol (95 %) tilsettes til 85 ml "Krylon 150 Crystal Clear" og blandes grundig.

Eksempel IV

Fremstilling av identifiseringsfargeløsningen.

0,50 gram "FD & C Blue no. 2", 0,10 gram "FD & C Red no. 2" og 0,10 gram vannløselig "Nigrosin" oppløses i destillert vann og bringes til 100 ml.

Eksempel V

Fremstilling av diagnose- testsystemet.

En 10 meters rull tungt filtrerpapir med 83 mm bredde anvendes som porøst materiale. Substratløsningen fra eksempel I plasseres i en beholder fra hvilken den mates til overflaten av et roterende påføringshjul. En 3,7 mm sone langs den 10 meter lange filtrerpapirremsen impregneres med substratløsningen ved å føre filtrerpapiret over et roterende påføringshjul med en bredde på 4 mm. Det roterende hjulet fører samtidig papiret fremover og belegget fordampes til tørrhet. Denne fremgangsmåte gjentas tre ganger med tørking mellom påføringene på hver side av den 3,7 mm brede substratsonen.

Bufferløsningen fra eksempel II plasseres i en beholder og påføres ved hjelp av et roterende påføringshjul med en bredde på 4 mm til en 3,7 mm bred buffersone som støter opp til substratsonen på filtrerpapiret. Bufferløsningen påføres to ganger på hver side av buffersonen og får tørke etter hver påføring. Buffersonen må ikke overlappe substratsonen.

Barriereløsning A fra eksempel III plasseres i en beholder og påføres til sentret av en 16 mm sone i tilslutning til buffersonen ved hjelp av et roterende påføringshjul med en bredde på 5 mm. Påføringen utføres en gang på hver side av denne sentrerte barrieresone. Barriereløsning B fra eksempel III plasseres i en beholder og påføres oppå den impregnerte løsning A uten tørking på begge sider av hele den 16 mm brede barrieresonen ved hjelp av et roterende hjul med en bredde på 15 mm og får tørke.

Identifiseringsløsningen fra eksempel IV plasseres i en beholder og påføres på en 6 mm sone langs den 10 meter lange kanten av filtrerpapiret på motsatt side av substratsonen ved hjelp av et 6,3 mm bredt påføringshjul. Identifiseringsløsningen påføres en gang på hver side av identifiseringssonen og får tørke.

Etter at alle impregnerte soner på filtrerpapirrullen er helt tørre deles papiret i 6,3 mm brede og 83 mm lange strimler.

Eksempel VI

Bruk av diagnose- testsystemet.

En metalltråd-løkke full av en ukjent kultur suspenderes

i 0,3 ml saltløsning i en 13 x 100 reagensrør'. Diagnose-test strimmelen fra eksempel V innføres slik at sonen motsatt identifiseringsfargesonen neddykkes, og inkuberes i et vann-

bad i fire time ved 35-37°C- Utviklingen av gulfarge i væsken angir et positivt testresultat. Dersom væsken forblir farge-løs er testen negativ.

Claims (2)

1. Diagnosetestsystem for påvisning av bakterier som frembringer 3-galaktosidase ved bakteriell hydrolyse av et o-nitrofenyl-/3-D-galaktopyranosidsubstrat anbragt på et porøst materiale eventuelt avgrenset av en sperresone og eventuelt forsynt med en identifiseringsfarvesone, karakterisert ved at substratet er impregnert Som en eluerbar, vandig acetonoppløsning inneholdende fra 0,05 til 3,0 mg tørt o-nitrofenyl-Ø-D-galaktopyranosid i en sone A som grenser opp til en sone B impregnert med 0,01 til 0,1 mmol av et tørt buffersystem som ved eluering vil holde en pH på en verdi fra 6,5-8,5.

2. Diagnose-testsystem ifølge krav 1, karakterisert ved at substratsonen i det porøse materialet inneholder ca. 1,5 mg tørt o-nitrofenyl-6-D-galaktopyranosid og buffersonen inneholder ca.

0,02 mmol buffer som holder pH ved ca. 7,4.