CN108486024A

CN108486024A - 基于菌群的传感系统检测有机磷农药的方法

Info

Publication number: CN108486024A
Application number: CN201810232046.4A
Authority: CN
Inventors: 冯雁
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2018-03-20
Filing date: 2018-03-20
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-03-20
Also published as: CN108486024B

Abstract

本发明提供了一种基于菌群的传感系统检测有机磷农药的方法，所述传感系统包括含OPH信号感应模块和含信号发生模块的基因工程菌群。其中一个用于将OPs水解成对硝基苯酚(PNP)，另一个将PNP信号转化成β‑半乳糖苷酶产生用于比色检测。通过优化，该传感系统能够在28℃诱导3.5小时内以1×10^‑9M的浓度检测乙基对氧磷，其比单细胞全细胞传感器灵敏性高约200倍。另外，它能够检测农业中常用的多种类型的OP。此外，该传感系统可制备成检测有机磷农药用滤纸，展示了便携式现场检测的前景。本发明提供了一个敏感、快速和便携的污染物检测生物传感平台，也展示了工程微生物生态系统的实用新型环境应用。

Description

基于菌群的传感系统检测有机磷农药的方法

技术领域

本发明涉及农药检测技术领域，具体涉及一种基于菌群的传感系统检测有机磷农药的方法。

背景技术

有机磷农药(OPs)广泛用于昆虫防治，约占全球农药使用量的38％。作为神经系统乙酰胆碱酯酶的有效抑制剂，它们还可以引起人和动物的急性神经毒性中毒。因此，尽管OPs有大量的农业利益，OPs的大规模应用引起了公众对健康，环境和食品安全的严重关注。因此迫切需要开发用于快速，灵敏和便携式OPs检测的方法。已经开发了许多分析方法，如液相色谱或气相色谱和质谱，用于检测OPs。但是，它们花费往往很昂贵，需要大量的物流。近年来，生物传感器由于操作简单，响应速度快，性价比高而受到越来越多的关注。对于OPs，有机磷酸酯水解酶(OPH)是一种高效的OPs转化酶，已经被固定在电化学分析检测器的表面，为OPs化合物的检测提供了另一种方法。然而，这种类型的传感器在实际样品中经常受到其他可氧化物质(例如葡萄糖，蔗糖和苯酚)的干扰。

解决现有方法局限性的一种有前景的方法是全细胞生物传感，它利用微生物的不同调控元件来检测环境信号。全细胞生物传感器通常由与其靶分析物结合的转录调节因子和将调节物-靶标相互作用转化为可测量的输出物的报告基因组成。对于OPs检测，Chong等人通过用二甲基苯酚调节蛋白(DmpR)检测和报道OPs水解产物中的一种对硝基苯酚(PNP)来构建新型全细胞大肠杆菌生物传感器。值得注意的是，由于DmpR不是对PNP敏感的天然调节因子，因此研究人员采用了一种系统的工程方法来优化DmpR，从而产生的检测灵敏度。然而，灵敏度仍然是个数量级，幅度低于电化学和色谱方法。另外，它花费很长的响应时间(超过6小时)。

作为来自假单胞菌的PNP降解途径的一部分，菌株WBC-3，LysR型转录调节因子LTTR(表示为PnpR)已经显示响应于PNP激活三个操纵子(pnpA，pnpB和pnpCDEFG)。因此，有希望的解决方案是利用这种本地PNP响应调节器可以成为开发超灵敏的OPs生物传感器。除了OPH的催化效率之外，PNP传感也很大程度上取决于OPH的OPH的物理可接近性。研究表明OPs在OPH所在的细胞质中的扩散是PNP感应的一个限速步骤。事实上，当OPH锚定在外膜上时，其活性提高了七倍。与表面展示有关的一个问题是长时间的孵育需要适当的目标蛋白质易位，导致延迟和非线性信号积累。

最近，合成的微生物菌群已经成为细胞功能编程的有效途径。一系列人造生态系统已被成功地创造出来，大量生产化学物质和生物大分子以及产生确定的种群动态。与单一工程菌株相比，这些设计合理的生态系统具有几个明显的优势，包括通过生态系统内物种间的分工来增强细胞功能的性能，稳定性和可编程性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种基于菌群的传感系统检测有机磷农药的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种基于菌群的传感系统，包括含OPH信号感应模块和含信号发生模块的基因工程菌群。

优选地，所述含OPH信号感应模块的基因工程菌的构建方法包括以下步骤：将OPH与pVLT33载体进行连接，构建pPNCO33质粒，然后将pPNCO33质粒转化到基因工程菌中形成含OPH信号感应模块的基因工程菌。优选所述基因工程菌为大肠杆菌XL1-Blue。

优选地，所述含信号发生模块的基因工程菌的构建包括以下步骤：

通过重叠延伸聚合酶链式反应将pnpR-PpnpC基因序列插入到pSV-β-galactosidase载体中，形成pSVRTCL质粒,在这个构建的质粒中引入pnpR基因表达受组成型启动子SV40调控，引入的pnpC启动子负责调控下游的lacZ基因表达；然后将pSVRTCL质粒转化到大肠杆菌中，形成含信号发生模块的基因工程菌。优选所述基因工程菌为大肠杆菌DH5α。

优选地，所述含OPH信号感应模块的基因工程菌和含信号发生模块的基因工程菌的相对比例为10:1～1:10。

优选地，所述含OPH信号感应模块的基因工程菌和含信号发生模块的基因工程菌的总密度相同。

第二方面，本发明提供了一种基于前述的传感系统在检测有机磷农药中的应用。

优选地，所述有机磷农药包括乙基对氧磷、甲基对氧磷、乙基对硫磷、甲基对硫磷、对硝基苯基苯基硫代磷酸乙酯(EPN)和杀螟松。

第三方面，本发明提供了一种基于菌群的传感系统检测有机磷农药的方法，包括以下步骤：

将前述的传感系统悬浮在含有X-gal和有机磷的2YT液体培养基中，28℃下共温育，通过颜色强度测得有机磷的浓度。

第四方面，本发明提供了一种基于前述的传感系统的检测有机磷农药用滤纸。

第五方面，本发明提供了一种检测有机磷农药用滤纸的制备方法，包括以下步骤：将前述的含OPH信号感应模块的基因工程菌和含信号发生模块的基因工程菌悬浮在干燥保护剂溶液中，并在无菌条件下滴在滤纸条上，形成细胞区，然后将滤纸条真空冷冻干燥，即得。

第六方面，本发明提供了一种检测有机磷农药用滤纸的使用方法，包括以下步骤：将含有机磷的待测溶液溶于2YT液体培养基中，然后将滤纸的细胞区插入该培养基中，28℃孵育2小时后，将X-gal加入滤纸的细胞区，通过颜色强度测定有机磷的浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明所述的基于菌群的传感系统可用于检测和响应OPs，且该系统在纳摩尔浓度下具有较低的检测限，敏感度高。最低检测限可达1×10^-9M。

2、相比于转化和检测步骤通常难以改变的单一工程菌株，OPs感测的基于菌群的实施允许通过简单地改变相对种群丰度在转化和检测之间进行简单且有效的调节。

3、该系统在液体和冻干状态下都能工作，具有广泛的适用性。

4、其对OPs的快速比色反应消除了对精密仪器的需求，这在低资源环境下提供了可行的分析测试。

5、尽管生物传感系统设计用于检测由OPs转换而来的PNP，但原则上它可用于检测任何其他来源的PNP(47)。因此，该系统可以作为独立子系统用于其他PNP-相关的领域。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1：本发明用于OPs检测的基于菌群的生物传感系统示意图；

图2：本发明实施例中pPNCO33质粒图谱和全细胞OPH活性结果；其中图2A为pPNCO33质粒图谱；图2B为全细胞OPH活性结果；

图3：本发明实施例中pBBR1-tacpnpR质粒和pCMgfp-spClacZ质粒的图谱以及信号发生模块对PNP浓度的剂量相应；其中图3A为pBBR1-tacpnpR质粒和pCMgfp-spClacZ质粒的图谱；图3B为信号发生模块对PNP浓度的剂量相应；

图4：本发明实施例中用乙基对氧磷测试基于菌群的生物传感系统结果；其中，图4A为两种含信号发生模块的大肠杆菌；图4B为存在不同乙基对氧磷浓度的培养悬浮液650nm处的吸光度；图4C为在不同浓度的乙基-对氧磷下两种不同体系的比色测试的图片；

图5：本发明实施例中不同乙基对氧磷接种浓度时间函数对应的生物传感器样品的吸光度；

图6：利用基于菌群的系统来检测不同的OPs的结果；其中图6A为待检测的OPs的结构；图6B为检测结果；

图7：用基于菌群传感系统的纸质检测乙基对氧磷的结果；其中图7A为用数码相机获得的比色结果的图像；图7B为采用图7A中结果的颜色强度以乙基对氧磷浓度的函数作图；

图8：使用实际样本对菌群传感系统进行比色测试结果；

图9：采用不同比例混合的基于菌群的传感系统的吸光度结果；

图10：pSVRCL和pSVRTCL的质粒图谱；其中图10A为pSVRCL质粒；图10B为pSVRTCL质粒；

图11：采用含有包含携带pSVRCL质粒的信号发生细胞的菌群传感系统对不同浓度乙基对氧磷的比色响应；

图12：携带pSVRTCL和pBBR1-tacpnpR的大肠杆菌生长的时间过程；

图13：使用化学发光实验监测β-半乳糖苷酶表达；其中图13A为β-半乳糖苷酶存在下的光生成机理图；图13B为基于化学发光测定的不同浓度OPs的样品中β-半乳糖苷酶表达的校准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

1、本实施例采用的菌株，培养基和试剂

大肠杆菌XL1-Blue(Clontech公司，美国)和大肠杆菌DH5α(Invitrogen公司，美国)用于所有的克隆和蛋白表达步骤。细菌在2YT培养基(16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物和5g/L氯化钠)中培养。

将对硝基苯酚(PNP)和Ops(如乙基对氧磷，甲基对氧磷，乙基对硫磷，甲基对硫磷，杀螟硫磷和EPN)溶于乙腈中以制备浓度为1×10^-1M的原液。

测试化学品购自Sigma-Aldrich公司。Whatman通用滤纸(中等速度，起绉，直径＝9.0厘米)，动物组织蛋白胨，牛肉膏，明胶，L-抗坏血酸钠，D-(+)-五氟化钠，L-谷氨酸单钠盐一水合物，氨苄西林，卡那霉素，四环素和无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)购自Promega(Madison，WI，USA)。HPLC级乙腈，氯化钠，氯化钾，氯化镁，磷酸钠一水合物和七水合磷酸二钠购自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA，USA)。显色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-吡喃半乳糖苷)购自Gold Biotechnology(St.Louis，MO，USA)。β-Glo分析试剂得自Promega(Madison，WI，USA)。Alpha 2-4冻干机购自Martin ChristGefriertrocknungsanlagenGmbH(Osterode，德国)。使用Q5高保真DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)进行聚合酶链式反应(PCR)，并用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，美国)。限制性酶和T4DNA连接酶购自New EnglandBiolabs(Ipswich，MA，USA)，使用QIA prep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)回收重组质粒。

2、基于菌群的传感系统的构建

2.1含OPH信号感应模块的大肠杆菌的构建

OPH信号感应模块包含处于IPTG诱导型tac启动子控制下的inpnc-opd片段(编码的INPNC-OPH融合蛋白)。将其置于基于pVLT33的载体pPNCO33中(图2A)。opd部分用于编码将OP转换成PNP的水解酶。inpnc-opd片段的inpnc编码INP的截短版本，其中仅包含其N-和C-末端结构域，已被广泛用作表面锚定基序。这种融合设计允许OPH在细胞表面展示，以提高OP-PNP转换速率。因为活性OPH在细胞表面上的过度表达是高度宿主特异性的，并且在XL1-Blue菌株中表现出更高的OP降解速率，所以将pPNCO33质粒转化到大肠杆菌XL1-Blue中。

将编码INPNC-OPH有机磷水解酶片段从pINCOP质粒进行PCR扩增，克隆到EcoRI-HindIII消化的pVLT33(一种大肠杆菌-假单胞菌穿梭载体)中以产生pPNCO33。将pPNCO33质粒转化到大肠杆菌XL1-Blue中以形成OPH信号感应模块，即得含OPH信号感应模块的大肠杆菌。

将携带pPNCO33质粒的大肠杆菌在含有卡那霉素(50μg/mL)的2YT培养基中250rpm、37℃振荡培养。当大肠杆菌培养物的OD600达到0.6时，加入0.3mM IPTG，28℃诱导蛋白质表达24小时。

2.2含信号发生模块的大肠杆菌

为了构建pCMgfp-spClacZ质粒，将mcs-gfp片段(其中mcs是多克隆位点)由pEX18Tc-cmgfp模板扩增并克隆到KpnI-SacI消化的pCM130中，得到pCMgfp质粒。将lacZ片段克隆到BamHI-HindIII消化的pCMgfp中以产生pCMgfp-lacZ质粒。将pnpC启动子(-94至+25区)克隆至经SphI-BamHI消化的pCMgfp-lacZ中以产生pCMgfp-spClacZ质粒(图3A所示)，所述pCMgfp-spClacZ质粒中lacZ基因位于pnpC启动子下游。

用KpnI和BamHI消化tac片段，用BamHI和SacI消化含His标签序列的pnpR片段，将这两个片段克隆到KpnI-SacI消化的pBBR1mcs-2中，得到pBBR1-tacpnpR质粒。

将pCMgfp-spClacZ质粒和pBBR1-tacpnpR质粒共转化到单一的大肠杆菌DH5α细胞中以形成信号发生模块(即含信号发生模块的大肠杆菌1)。将转化的大肠杆菌DH5α在250rpm和37℃下在补充有卡那霉素(50μg/mL)和四环素(100μg/mL)的2YT培养基中振荡培养。一旦大肠杆菌培养物的OD₆₀₀达到0.6，向其中加入0.5mM IPTG表达PnpR蛋白,与OPH模块感应有机磷农药产生的PNP结合，激发β-半乳糖苷酶的表达，催化信号指示分子X-gal分解产生蓝色信号。

为了测试构建组件含信号发生模块的大肠杆菌1的功能，将带有pCMgfp-spClacZ和pBBR1-tacpnpR的信号发生大肠杆菌DH5α细胞在100-mL培养瓶中生长至OD₆₀₀为1，然后将90μL培养物等分到96孔微量滴定板。加入不同浓度的PNP后，每孔加入10μL10mg/mL的X-gal溶液，培养板在28℃，220rpm的振荡培养。使用SpectraMax○R M5酶标仪每隔30分钟测量650nm处的吸光度，一共测量3.5小时。

PNP结合相应pnpC启动子诱导下游b-半乳糖酶基因表达，分解X-gal产生蓝色。通过量化X-gal消耗后由报告蛋白β-半乳糖苷酶产生的蓝色来确定系统对PNP的响应，这可以通过测量650nm处的吸光度来实现。实际上，数据清楚地表明650nm处蓝色的吸光度与PNP浓度正相关(图3B)。

分别从pBBR1-tacpnpR和pCMgfp-spClacZ质粒扩增野生型pnpR和PNP分解代谢操纵子pnpC的启动子，并用于构建产生信号的单个质粒(引物列表如表1所示)。扩增产物通过凝胶电泳分离并纯化。这两个基因pnpR和pnpC通过重叠延伸PCR(OEP)融合。pSV-β-半乳糖苷酶质粒载体(pSV-β-galactosidase载体)购自Promega(Madison，WI，USA)。pSV-β-半乳糖苷酶载体和融合的pnpR-pnpC用HindIII-BsaAI双重消化。将pSV-β-半乳糖苷酶和融合的pnpR-pnpC的消化产物混合在一起并在16℃下过夜连接以产生pSVRCL质粒(图10A)。在该质粒中，在组成型启动子SV40的控制下表达pnpR基因，并且在pnpC启动子的控制下表达lacZ基因。将pSVRCL质粒转化到大肠杆菌DH5α中形成含信号发生模块的大肠杆菌2。

表1

将含信号发生模块的大肠杆菌2进行微量滴定板测定以测试该系统的响应。出乎意料的是，系统失去了剂量依赖性的反应，因为在用或不用对氧磷孵育2小时后出现明显的蓝色(图11)。

为了在所需位置终止SV40启动子的活性，将来自pET-28a(+)质粒的长T7末端区(48bp，T7终止子)插入到pnpR和pnpC之间以产生pSVRTCL质粒。将该重组质粒pSVRTCL转化大肠杆菌DH5α，形成含信号发生模块的大肠杆菌3。将含信号发生模块的大肠杆菌3进行微量滴定板测定以测试该系统的响应。如图4A和图10B所示，T7终止子的引入恢复了之前观察到的浓度依赖性反应。为了测试调节蛋白质的量增加是否抑制细胞生长，我们比较了携带pSVRTCL和pBBR1-tacpnpR质粒细胞的生长动力学。将携带pSVRTCL和pBBR1-tacpnpR的大肠杆菌在含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的2YT培养基中于37℃培养几小时。当含有pBBR1-tacpnpR的细菌培养物的OD₆₀₀达到0.6时，加入0.5mM IPTG，并将两种细胞培养物在30℃下继续培养24小时。通过测量培养液的OD₆₀₀来确定细胞浓度。结果显示，增加的PnpR的产量不会导致明显的生长抑制(图12)。

采用化学发光实验检测含信号发生模块的大肠杆菌3的β-半乳糖苷酶活性。具体步骤如下：

从平板中挑取新鲜的含信号发生模块的大肠杆菌3的单菌落，在含有5mL 2YT培养基中的试管中培养。培养6小时后，将1mL培养液接入含有100-mL 2YT培养基的培养瓶中。当培养物达到OD₆₀₀为1时，将90μLpSVRTCL细胞培养物加入到含有90μL已表达24小时的OPH细胞培养物(OD₆₀₀＝1)的96孔板中。最后，将20μL不同浓度的OP加入到每个孔中，并将96孔板置于28℃，220rpm的振荡器中。3.5小时后，将细胞培养物离心，将细胞重新悬浮于200μL新鲜的2YT培养基中以除去OPs化合物。最后，收集OD₆₀₀为0.30的细胞并置于黑色的96孔板中用于β-半乳糖苷酶活性测定。报告蛋白(β-半乳糖苷酶)的表达量使用基于化学发光的β-galactosidase测定系统来确定，操作方法参照产品说明书。测定诱导的化学发光(1s/孔)。结果如3B所示，光吸收与PNP浓度正相关。

3、全细胞OPH活性

使用乙基对氧磷作为底物测量全细胞OPH活性。在IPTG诱导6,12,18和24小时后收获表达重组OPH的大肠杆菌细胞，用100mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗涤两次，然后在相同的缓冲液中重悬至OD₆₀₀为1。通过分光光度法测量405nm处的PNP形成(ε405＝16,600M^-1cm^-1)来测量乙基对氧磷的水解。OPH活性测定在补充有1×10^-4M底物和100μL细胞(OD₆₀₀＝1.0)的100mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中于28℃下进行。酶活性以1.0OD₆₀₀全细胞的酶活力单位表示(1个酶活力单位等于每分钟水解1微摩尔底物量)。结果如图2B所示，OPH催化活性在指数期开始出现，并且在细胞达到稳定期后还在增加。值得注意的是，该时程关系表明了将INPNC-OPH融合物完全转移到细胞表面所需的时间。因此，将稳定后期(24小时)的细胞用于OP降解，因为这些细胞可以有效地分解污染物并且为信号发生模块产生最大量的PNP。

4、菌群生物传感系统对OPs的信号响应

用于OPs检测的基于菌群的生物传感系统示意图如图1所示。将市售的OPs如乙基对氧磷，甲基对氧磷，乙基对硫磷，甲基对硫磷，EPN和杀螟松溶解在乙腈中以获得浓度为1×10^-1M的储备溶。

离心收集已经培养24小时的OPH大肠杆菌细胞(即含OPH信号感应模块的大肠杆菌)，并用新鲜培养基稀释以达到OD₆₀₀为1。

3种信号发生大肠杆菌细胞(即含信号发生模块的大肠杆菌1-3)均在100-mL培养瓶中生长直至OD₆₀₀为1。

OPH大肠杆菌与发生器大肠杆菌细胞比率为1：1，用于基于96孔微量滴定板的OPs检测。使用20μL不同OPs化合物的母液来稀释得到1×10^-4～1×10^-10M的终浓度。将10μL的10mg/mL X-gal溶液添加至每个孔中，然后将培养板在平板摇床中220rpm和28℃培养。将用OP诱导的等分试样孵育最多5小时，并使用SpectraMax○R M5酶标仪以30分钟间隔测量诱导的和未诱导的培养物在650nm处的吸光度。如图5所示，吸光度值随着感应(或曝光)时间的增加而增加，如曲线的正斜率所反映的。如图5B所示，该系统表现出可预测的和剂量依赖性的方式，与目视检查的结果一致。如图6A，我们发现，类似于乙基对氧磷检测中观察到的信号响应，共培养基的颜色从所有测试的农药逐渐由浅黄色变为深蓝色(图6B)。对于测试的OPs，我们还通过测量酶促反应的程度来进行基于化学发光的测定(图13)。通过比较检测结果，发现对于不同的农药，基于菌群体系的灵敏度从1×10^-9M到1×10^-5M不等。对于常见的OPs化合物，该系统的灵敏度比单细胞比色法灵敏2-4倍。我们还注意到，杀螟松灵敏度为1×10^-5M，即这可能是由于OPH对该底物的催化效率低下或由于2-甲基-4-硝基苯酚的生成而不是对硝基苯酚的产生。

通过改变两种细胞类型(含OPH信号感应模块的大肠杆菌和含信号发生模块的大肠杆菌1)的相对丰度(10：1,3：1,1：1,1：3和1:10)，同时保持它们的总密度相同(OD600＝1.0)，我们发现输出的颜色吸光度遵循“钟形”变化，吸光度最高出现在1：1和1：3的比例(图9)。这个结果证实了三层信息。首先，基于菌群的系统能够成功地检测乙基对氧磷。其次，检测需要两种菌株来完成任务，即OPH转换和信号生成。第三，检测的性能取决于两个菌株的相对丰度。以1：1的比例，我们接下来通过在2YT液体培养基中补充不同浓度的乙基对氧磷(从1×10^-10到1×10^-6)，将两种菌株的悬浮培养物共培养来检测生物传感系统的检测极限10^-4M。如图4C(行I)所示，我们观察到响应的颜色强度随着乙基对氧磷的浓度而增加，表明颜色强度与乙基对氧磷的浓度之间呈正相关。值得注意的是，系统响应的极限被发现是1×10^-6M的乙基对氧磷。从该测定中，我们还发现将全部活性表面表达的OPH(更容易达到PNP的阈值量)与处于指数生长阶段的信号发生细胞偶联，导致响应时间(3.5小时)显著短于以前的报道(约6小时)。与对照相比，乙基对氧磷浓度低至1×10^-9M时还显示着明显的颜色增加。相反，在高于1×10^-6M的浓度下，2小时内就能检测到信号。

OPH大肠杆菌分别与含信号发生模块的大肠杆菌2或3的悬浮培养物共培养相应对乙基对氧磷的灵敏度，结构如图4A和图4B所示，在低至1×10^-9M乙基对氧磷的浓度下还观察到可检测的颜色水平(图4C，行II)。结果表明，含信号发生模块的大肠杆菌2或3的灵敏度从起始系统(含有pBBR1-tacpnpR和pCMgfp-spClacZ质粒的细胞)成功地增加了三个数量级(图4A，行I；图4B，圆圈和图4C，第一行)。

实施例2、滤纸传感条的制备

根据前述的基于菌群的生物传感系统制备传感纸条。简而言之，是将两种细胞类型以1：1的比例悬浮于在37℃预热的无菌干燥保护溶液中。在Whatman滤纸条(0.6×4cm)上点上5μL细胞悬浮液，然后将这些纸条在层流空气箱中干燥10分钟，随后在冻干器20℃进行真空干燥。然后将滤纸传感条在4℃下储存备用。

实施例3、滤纸传感条上的剂量反应OPs曲线的测定

用含有50mM氯化钠，氯化钾和氯化镁各50mM的HEPES缓冲液(pH7.0)稀释乙基对氧磷(浓度为1×10-³-1×10^-9M)。取100μL每种标准溶液添加到含有900μL2YT培养基和制备好的滤纸条的培养管中。然后将培养管在28℃下静置温育2小时。然后将纸条从培养管中取出并保持在保鲜膜层之间以防止干燥。随后，取10μL溶解在DMF中的X-gal底物溶液(50mg/mL)小心地添加到含有传感细胞的位置，并使显色进行90分钟。如图7A所示，随着乙基对氧磷的浓度增加，纸条的细胞保留区从无色变为蓝色。

除了目测观察显色的蓝色之外，还使用ImageJsoftware(NIH，Bethesda，MD，USA)(http://rsbweb.nih.gov/ij/)测量颜色强度。简单地说，ImageJ中的测量设置为平均灰度值，并且图像被反转。由于ImageJ将100％黑色记录为0，将100％白色记录为255，所以图像的反转是必要的。使用选择工具在要测量的点周围绘制矩形截面，并记录平均灰度值。测定光点附近相同的矩形面积作为背景值，以考虑由于拍摄照片时的环境照明的差异导致的色彩强度的变化。基本上，最后的颜色强度信号是针对空白和照度相关的颜色强度变化进行校正的。ImageJ软件分析证实了通过目测评估纸条获得的结果(图7B)，表明所测量的颜色强度与乙基对氧磷浓度的对数之间的线性关系。结果还表明，在该设置下，传感系统可以在1.5h内以1×10^-7M的浓度清晰地检测乙基对氧磷。总之，这些结果证明了使用纸基菌群生物传感器可靠地检测OPs的可行性，这在发展中国家和偏远社会特别有用。

实施例4、真实样品测试

本实施例制备并测量加入了乙基对氧磷的苹果和土壤样品。在该测定中，收集约1g土壤并溶解于900μl水中。为了比较，还测试了乙基对氧磷(1×10^-5或1×10^-6M)的标准溶液。将收集的苹果切成块并捣碎，将1g粉碎的苹果溶于900μl水中，形成样品溶液1。将1g收集的土壤溶于900μl水中，形成样品溶液2。

将两种样品溶液在37℃和8000rpm下离心10分钟，再通过0.22-μmPVDF过滤器过滤上清液并用去离子水稀释2倍。随后，将上清液加入乙基对氧磷溶液中以获得1×10^-5和1×10^-6M的浓度。最后，使用显影的生物传感器检测加入标准的OPs浓度，并使用Spectramax○RM5读板器测量650nm处的吸光度。如图8所示，苹果和土壤样品获得的响应值与标准溶液具有相同的模式。此外，苹果和土壤样品中加入的乙基对氧磷的回收率范围为89.40±5.1至94.80±6.9％(表2)，表明该新型传感平台可以适用于实际测定OPs样本。

表2苹果和土壤中乙基对氧磷的加标回收率(数值为三次测定的平均值)

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 基于菌群的传感系统检测有机磷农药的方法

<130> DAG35493

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgggatccat ggcgccaggc gtggtattt 29

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgagctctt aatgatgatg atgatggtgt tgctcttcct gttccgg 47

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acatgcatgc ctgtgctgtt gatcgttcgc 30

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggatccca tgatttcacc ttttttgttg taa 33

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaagcttat ggcgccaggc gtggtattt 29

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accatcatca tcatcattaa ctgtgctgtt gatcgttcgc 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgaacgatc aacagcacag ttaatgatga tgatgatggt 40

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcacgtaca tgatttcacc ttttttgttg taa 33

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgaagcttat ggcgccaggc gtggtattt 29

<210> 10

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttggc ctgtgctgtt 60

gatcgttc 68

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccccaaggg gttatgcatg ttaatgatga tgatgatggt gtt 43

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcacgtaca tgatttcacc ttttttgttg taa 33

Claims

1.一种基于菌群的传感系统，其特征在于，包括含OPH信号感应模块和含信号发生模块的基因工程菌群。

2.根据权利要求1所述的基于菌群的传感系统，其特征在于，所述含OPH信号感应模块的基因工程菌的构建方法包括以下步骤：将OPH与pVLT33载体进行连接，构建pPNCO33质粒，然后将pPNCO33质粒转化到基因工程菌中形成含OPH信号感应模块的基因工程菌。

3.根据权利要求1所述的基于菌群的传感系统，其特征在于，所述含信号发生模块的基因工程菌的构建包括以下步骤：

通过重叠延伸聚合酶链式反应将pnpR-PpnpC基因序列插入到pSV-β-galactosidase载体中，形成pSVRTCL质粒,然后将pSVRTCL质粒转化到基因工程菌中，形成含信号发生模块的基因工程菌。

4.根据权利要求1所述的基于菌群的传感系统，其特征在于，所述含OPH信号感应模块的基因工程菌和含信号发生模块的基因工程菌的相对比例为10:1～1:10。

5.根据权利要求1所述的基于菌群的传感系统，其特征在于，所述含OPH信号感应模块的基因工程菌和含信号发生模块的基因工程菌的总密度相同。

6.一种基于权利要求1所述的传感系统在检测有机磷农药中的应用。

7.一种基于菌群的传感系统检测有机磷农药的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求1所述的传感系统悬浮在含有X-gal和有机磷的2YT液体培养基中，28℃下共温育，通过颜色强度测得有机磷的浓度。

8.一种基于权利要求1所述的传感系统的检测有机磷农药用滤纸。

9.一种根据权利要求8所述的检测有机磷农药用滤纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的含OPH信号感应模块的基因工程菌和含信号发生模块的基因工程菌悬浮在干燥保护剂溶液中，并在无菌条件下滴在滤纸条上，形成细胞区，然后将滤纸条真空冷冻干燥，即得。

10.一种根据权利要求8所述的检测有机磷农药用滤纸的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有机磷的待测溶液溶于2YT液体培养基中，然后将滤纸的细胞区插入该培养基中，28℃孵育2小时后，将X-gal加入滤纸的细胞区，通过颜色显现强度测定有机磷的浓度。