CN104087544A - 降解有机磷农药工程菌、其构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可以降解有机磷农药工程菌、其构建方法和应用。该工程菌含有编码广谱有机磷农药水解酶（OPH）的opd基因，能表达有机磷农药水解酶。该菌株为Bacillussubtilissp.LTG1菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.9272。该工程菌可以同时降解敌敌畏、马拉硫磷、乐果、氧化乐果、对硫磷、甲基对硫磷和乙酰甲胺磷等有机磷类农药，该菌株可用于水源、土壤中有机磷农药污染的生物降解和生物净化。

Description

降解有机磷农药工程菌、其构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种可降解有机磷农药工程菌，其构建方法及其应用，属于生物降解技术领域。可用于土壤农药污染的原位修复工程。

背景技术

农药是目前世界各国防治农作物病虫害和养殖业病害的有效手段。大量化学农药,特别是高毒、高残留农药的使用,成为食品安全和危害人们健康的主要“杀手”。

目前，主要使用的化学农药按其功能不同,主要分为杀虫剂(Insecticide)、除草剂(Herbicide)和杀菌剂(Fungicide)三大类。依据化学结构不同,可分为有机氯类、有机磷类、拟除虫菊脂类、氨基甲酸脂类和无机农药等多种类型。这些化学农药的共同特点是:①有毒性,且靶向性差；②残留性,一般分为高残留、中残留和低残留等；③迁移性和累积性,可通过空气、土壤或地下水发生迁移,甚至在生物体内累积。有机磷类杀虫剂成为目前使用量最大的农药之一,多属于高效农药。目前,有机磷农药包括甲拌磷、乙拌磷、内吸磷、对硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、杀螟硫磷、特普、敌百虫、乐果、马拉硫磷、甲基对硫磷、二甲硫吸磷、甲基对硫磷、甲基内吸磷、氧化乐果、久效磷等。有机氯农药有滴滴涕、六六六、林丹、甲氧、高残毒DDT、硫丹。常用的拟除虫菊脂类农药有溴氰菊脂、氯氰菊脂、氯菊脂、胺菊脂、甲醚菊脂等。氨基甲酸酯类有西维因、叶蝉散、涕灭威、呋喃丹和异索威等。

在我国的农药品种结构中，具有高毒和“三致性”的杀虫剂占全部农药的40％以上，我国农药剧毒、高毒农药品种居多，存在着“3个70％”，即：农药中杀虫剂占70％；杀虫剂中有机磷类品种占70％；有机磷类中少数几个高毒品种占70％。

目前，世界上有机磷农药(organophosphorus pesticides,OPs)的种类已达150多种，成为使用量最大的农药之一，我国生产的有机磷农药的品种就有20余种，年产量超过100kt，占我国农药总产量的80％以上。

据统计，我国施用农药面积在218亿hm2以上，每年用量50～60万吨。这些施用的农药，有50％～60％残留于土壤。目前,我国约有87～107万hm2的农田土壤受到有机磷农药严重污染，危害也越来越大。主要表现为：

一是有机磷农药在杀死靶标生物的同时,也或多或少地杀死非靶标生物,对周围环境乃至整个生态环境造成严重的破坏。

二是土壤中有机磷的成分含量过高，通过粮食、蔬菜、水果等间接影响人体和动物的健康。有机磷农药对人体的危害不仅表现在干扰人体化学信息的传递，破坏身体的酶，而且它阻碍器官发挥正常的生理功能，导致神经系统功能失调。癌症、不孕症、内分泌紊乱等疾病均与有机磷农药污染有关。

三是有机磷农药对土壤微生物数量、种群结构和生物活性产生严重影响，造成土壤生产力下降。土壤微生物是调节土壤肥力的重要因素。高毒性有机磷农药的不断使用，破坏了土壤微生物的繁殖，使敏感性的菌种受到抑制，土壤微生物的多样性遭到破坏，种群趋于单一化，引起原有的平衡紊乱功能失调从而影响土壤物质和能量的循环，影响土壤微生物的氨化硝化和呼吸作用等，由此破坏了土壤结构和理化性质，土地肥力持续下降。

为治理有机磷农药对生态环境的危害，各国的研究人员做了大量的农药降解方法研究，建立了生物降解、化学降解、光化学降解、超声波、洗涤剂和电离辐射等。而土壤中有机磷农药污染的治理主要是通过微生物降解有机磷农药。从上个世纪60年代开始，在污染物降解菌的分离、污染土壤微生物多样性以及微生物中污染物降解基因的克隆等方面均有一定的研究。到目前为止，已分离到多种降解有机磷农药微生物，包括细菌、放线菌、真菌及藻类，其中细菌和真菌最多，细菌研究的较为透彻。细菌中优势菌主要为假单胞菌、芽胞杆菌、产碱杆菌、无色杆菌、黄杆菌等。但是，据《国际微生物学会联盟通讯》有关专家估计，全球约有50万～60万种微生物，而今已被研究和记载的还不到5％，在如此丰富的微生物资源库中，由于自然环境及其它理化条件的差异，尤其是长期受农药胁迫的环境中，仍有很多能降解农药的微生物未被发现，现在分离到的还只是沧海一粟。因此，降解农药的微生物还需进一步的发现和研究。

研究发现新的农药降解菌，可丰富降解农药微生物的种类，为土壤生物修复技术的研究和应用提供依据，为构建有机磷降解高效工程菌提供新的资源，推进生物修复工程的发展，造福人类具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种降解有机磷农药工程菌、其构建方法及其应用。

根据本发明的一个方面，一种降解有机磷农药工程菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)sp.LTG1，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该菌株已于2014年6月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.9272。

所述的降解有机磷农药工程菌，它是包含有机磷农药水解酶OPH编码基因的菌枯草芽孢杆菌。

所述的有机磷农药水解酶OPH编码基因来源于黄杆菌(Flavorbacterium.sp)ATCC27551质粒pDL2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的另一个方面，所述的降解有机磷农药工程菌的构建方法，通过聚合酶链式反应从黄杆菌(Flavorbacterium.sp)ATCC27551中提取有机磷农药水解酶OPH编码基因opd，再将编码基因opd插入至载体pHT43，构建表达载体pHT43-opd，再将pHT43-opd转入枯草芽孢杆菌WB800中。

优选的，编码基因opd插入至载体pHT43的步骤是：构建重组表达质粒载体pTG19-T-opd，再对载体pTG19-T-opd和表达载体pHT43分别用BamHI、SmaI酶双酶切，再将pTG19-T-opd切下的opd基因克隆到载体pHT43上。

优选的，pHT43-opd转入枯草芽孢杆菌WB800中的步骤是：先将pHT43-opd载体克隆到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，提取质粒，然后再通过电击转化法把pHT43-opd转入枯草芽孢杆菌WB800中。

所述的聚合酶链式反应中使用的上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.2～3所示。

所述的电击转化法中，电转培养基为：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％葡萄糖，其余为水；电转仪设置为2.1kv，5ms，电击1次。

根据本发明的另一个方面，所述的降解有机磷农药工程菌在有机磷类农药降解中的应用。

根据本发明的另一个方面，所述的降解有机磷农药工程菌在制备用于有机磷类农药降解的菌剂中的应用。

所述的有机磷类农药选自甲基对硫磷、马拉硫磷、乐果、氧化乐果、对硫磷、甲基对硫磷或乙酰甲胺磷。

有益效果

本发明提供的降解农药工程菌的优益之处在于，其为用分子生物学方法构建的工程菌，该工程菌利用枯草芽孢杆菌的穿梭表达载体pHT43，在载体的多克隆位点上通过双酶切定向引入opd编码基因,转入枯草芽孢杆菌WB800。因而，该工程菌农药的降解谱加宽，在实际应用中枯草芽孢杆菌WB800易在土壤中形成优势菌，对有机磷类降解具有独特的优势，工程菌及其粗酶液可以同时降解多种有机磷类农药，特别是在固定化后该工程菌对有机磷农药有很高的降解能力，该菌株可用于水源、土壤中有机磷农药污染的生物降解和生物净化。

附图说明

图1PCR产物opd的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。泳道1、2为PCR产物，泳道M为Maker5000bp

图2重组pTG19-T-opd质粒双酶切电泳鉴定图。泳道1为pTG19-T-opd酶切产物，泳道M为Maker5000bp

图3pHT43-opd质粒双酶切验证图。1泳道为pHT43-opd酶切产物，M泳道为Maker5000bp

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

黄杆菌Flavorbacterium.sp ATCC27551购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，pHT43购自MoBiTec GmbH,Germany，pTG19-T购自上海捷瑞生物工程有限公司，枯草芽孢杆菌WB800购自上海北诺生物科技有限公司。

实施例1重组质粒pHT43-opd的构建

1.以黄杆菌携带的质粒pDL2作为模板扩增出opd基因

提取黄杆菌Flavorbacterium.sp A TCC27551质粒pDL2，以黄杆菌质粒pDL2作为模板,合成引物，扩增出opd基因序列，引物序列如下：

P1:opda:5’-CGGGATCCCA TGCAAACGAGAAGGGTTGTGCTC-3’；(SEQ ID NO.2)

P2:opds:5’-CGCCCGGGCATGACGCCCGCATCTTGACGGGGA-3’(SEQ ID NO.3)

上游引物(P1)引入BamH I位点，下游引物(P2)引入Sma I的酶切位点。5’端各引入两个酶切位点保护碱基。

PCR产物经凝胶电泳分析，opd基因大小约为1100bp(图1)，与预期大小相符。PCR产物纯化后，送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序。测序结果与genebank上的已知opd基因一致，其序列如SEQ ID NO.1所示。

atgc aaacgagaag ggttgtgctc aagtctgcgg ccgccgcagg aactctgctc ggcggcctgg ctgggtgcgc gagcgtggct

ggatcgatcg gcacaggcga tcggatcaat accgtgcgcggtcctatcac aatctctgaa gcgggtttca cactgactca cgagcacatc

tgcggcagct cggcaggatt cttgcgtgct tggccagagt tcttcggtag ccgcaaagct ctagcggaaa aggctgtgag

aggattgcgc cgcgccagag cggctggcgt gcgaacgatt gtcgatgtgt cgactttcga tatcggtcgc gacgtcagtt tattggccga

ggtttcgcgg gctgccgacg ttcatatcgt ggcggcgacc ggcttgtggt tcgacccgcc actttcgatg cgattgagga gtgtagagga

actcacacag ttcttcctgc gtgagattca atatggcatc gaagacaccg gaattagggc gggcattatc aaggtcgcga

ccacaggcaa ggcgaccccc tttcaggagt tagtgttaaa ggcggccgcc cgggccagct tggccaccgg tgttccggta

accactcaca cggcagcaag tcagcgcgat ggtgagcagc aggccgccat ttttgagtcc gaaggcttga gcccctcacg

ggtttgtatt ggtcacagcg atgatactga cgatttgagc tatctcaccg ccctcgctgc gcgcggatac ctcatcggtc tagaccacat

cccgcacagt gcgattggtc tagaagataa tgcgagtgca tcagccctcc tgggcatccg ttcgtggcaa acacgggctc

tcttgatcaa ggcgctcatc gaccaaggct acatgaaaca aatcctcgtt tcgaatgact ggctgttcgg gttttcgagc tatgtcacca

acatcatgga cgtgatggat cgcgtgaacc ccgacgggat ggccttcatt ccactgagag tgatcccatt cctacgagag

aagggcgtcc cacaggaaac gctggcaggc atcactgtga ctaacccggc gcggttcttg tcaccgacct tgcgggcgtc

atgacgccat ctggatcctt ccagccagcg gccactattc cccgtcaaga tgcgggcgtc atga(SEQ ID NO.1)

2.pTG19-T-opd质粒构建

纯化的PCR产物与pTG19-T连接，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取阳性质粒，阳性质粒用BamH I、Sma I双酶切，酶切产物电泳验证，大小正确(图2)。

3.表达载体pHT43-opd构建与电击转化

用BamH I、Sma I酶切表达载体pHT43，将从pTG19-T-opd上用BamH I和Sma I双酶切下的opd基因片段连接到载体pHT43上，转到大肠杆菌DH5α中，涂加氯霉素的平板进行蓝白斑筛选，提取质粒pHT43-opd。

然后再通过电击转化法把转入枯草芽孢杆菌WB800中，进行表达，最后测定表达产物的酶活。

4.电击转化和转化子的选择性筛选

1)把枯草芽孢杆菌WB800接种于LB培养基中，进行过夜培养。

2)从过夜培养物中取2mL接入50mL(LB培养基+0.5M山梨醇)中，在37℃，200rpm条件下，培养至OD₆₀₀＝0.85～0.95。

3)把菌液放置冰水浴中10min，然后设置高速冷冻离心机5000g，5min，4℃离心，倒出液体收集菌体。

4)取适量预先冷冻的电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％葡萄糖)，把菌体重新吹悬，设置高速冷冻离心机5000g，5min，4℃离心，倒出上清液，按此方法漂洗4次。

5)最后加入1mL电转培养基，重新吹悬，再进行分装，每个EP管中装入120μL，并混匀。此为感受态细胞，于-80℃内保存。

6)取一管感受态细胞，在4℃解冻，然后在其中加入10μLpHT43-opd，放置于冰上冰浴2min，加入预冷的电转杯(规格为1mm)中，放置于电转仪，电击一次。电转仪设置为2.0kv，1ms，电击1次。

7)最后电击结束后，立即在电击杯中加入1mL RM(LB培养基+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，然后在37℃，200rpm，培养3h，取100μL进行涂加氯霉素的平板(5μg/mL)。再在37℃的培养箱中进行过夜培养。

实施例2转化子的诱导表达

从新鲜转化的平板分别挑取重组菌株的单克隆菌落，加入含5μg/mL氯霉素的5m1LB培养基37℃，200rpm，震荡培养10-12小时，然后将5ml培养液注入50ml含氯霉素的培养液继续培养。待菌种生长到对数期末期即OD₆₀₀＝0.80时，加入IPTG，使IPTG终浓度为0.8mM，在15-25℃诱导15-20小时，得到本发明的工程菌。经过筛选，得到一株对有机磷农药降解率最高的菌株CGMCC No.9272，本申请中称之为Bacillus subtilis sp.LTG1，它对于甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷的降解率分别是最低的一株4.4倍、3.5倍、4.1倍(测定方法参照实施例3)。

实施例3:本发明的工程菌对甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷的降解作用

在三个100mL灭菌的三角瓶中均加入20mL无机盐培养基(g.L^-1，NH₄NO₃0.5，Na₂HPO₄1.19，KH₂PO₄0.45，MgSO₄0.5，去离子水1000ml，pH6.8)，然后分别添加甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷浓度至300mg/L，按10％的接种量接入(与实施例2中培养方法相同)对数生长期的Bacillus subtilis sp.LTG1菌株，然后置于摇床(30℃、160rpm)中振荡培养，相应地配置3个不含该菌剂的空白对照，对照组同样在上述条件下进行培养。同样地，也采用原始菌株(未转化入pHT43-opd载体的枯草芽孢杆菌WB800)进行对照试验。

在培养中定时取样，通过高效液相色谱分别测定甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷浓度。该菌对甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷的降解率见表1(表中数值为三个重复的平均值)。

高效液相测定甲基对硫磷色谱条件：色谱柱Hypersil C18柱；流动相:V(甲醇)：V(水)：＝80：20；流速：1.0mL/min；检测波长274nm,柱温:30℃；进样量:20μ1。

高效液相测定马拉硫磷色谱条件：色谱柱Hypersil C18柱；流动相:70％甲醇(含2mM甲酸铵+30％水；流速：0.3mL/min；检测波长220nm,柱温:室温；进样量:15μ1。

高效液相测定乙酰甲胺磷色谱条件：色谱柱Hypersil C18柱；流动相:V(甲醇)：V(水)：＝15：85；流速：1.5mL/min；检测波长215nm,柱温:30℃；进样量:15μ1。

降解率(％)＝(1－处理样品残留量/对照样品残留量)×100％。

表1 Bacillus subtilis sp.LTG1菌株对液体培养基有机磷降解率

上表中“CK”代表未加入菌株的空白样品、“原始是指未转化入pHT43-opd载体的枯草芽孢杆菌WB800，处理是指采用了本发明得到的Bacillus subtilis sp.LTG1菌株。

在培养10h后，本发明降解菌对300mg/L甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷降解率分别为97.28％、94.33％和98.24％，该菌剂15h后将甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷几乎彻底降解，说明工程菌Bacillus subtilis sp.LTG1可利用甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并具备高效降解甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷的能力。相比较而言，未转化入pHT43-opd载体的枯草芽孢杆菌WB800在培养15h后，对三种农药的降解率均小于15％，说明芽孢杆菌对甲基对硫磷和甲胺磷等有机磷农药也有一定的降解能力，这与以往的研究结果相一致，但远低于该工程菌的降解率。

实施例3:工程菌降解土壤中的甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷能力

从试验田里取土作为供试土样。将土样过2-mm筛，甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷分别用丙酮溶解，硅藻土吸附，干燥硅藻土，拌入无菌土壤中，使农药被完全吸附。使每公斤土壤含农药量为20mg，每一种含农药土样各取100g，新鲜培养至对数生长期的该工程菌菌液(OD₆₀₀＝0.80)10mL分别接入上述各土样中，搅拌均匀。同时，以相同的方法和步骤接种枯草芽孢杆菌WB800(原菌，未转化入pHT43-opd载体)，以不接菌的作为对照。于30℃恒温培养箱中培养，期间土壤的持水量保持在65％。培养1天和3天后分别取样，按照快速溶剂萃取(ASE)方法制样，环己烷萃取各土样中的农药，土壤中残留的甲基对硫磷、马拉硫磷和乙酰甲胺磷高效液相检测方法参照前述。通过样品与对照的比较来确定农药的降解率。降解率(％)＝(1－处理样品残留量/对照样品残留量)×100％。测定结果见表2。

表2 Bacillus subtilis sp.LTG1菌株对土壤中有机磷降解率

上表中“CK”代表未加入菌株的空白样品、“原始是指未转化入pHT43-opd载体的枯草芽孢杆菌WB800，处理是指采用了本发明得到的Bacillus subtilis sp.LTG1菌株。

从表可以得出，在实验室条件下，经过3天的培养后，Bacillus subtilis sp.LTG1对马拉硫磷的降解率分别达到97.90％，对甲基对硫磷和乙酰甲胺磷几乎全部降解。以上结果说明，该工程菌在施入土壤中后，它的降解性能仍然稳定。未转化入pHT43-opd载体的枯草芽孢杆菌WB800在培养3天后，其对甲基对硫磷降解率达到了26.87％，其对马拉硫磷和乙酰甲胺磷降解率分别为10.98％和17.43％，其对甲基对硫磷和乙酰甲胺磷降解率比马拉硫磷要高，可能是由于芽孢杆菌对甲基对硫磷和甲胺磷等有机磷部分农药也有一定的降解能力，但远远低于该工程菌的降解率。

                         SEQUENCE LISTING

 <110>  徐州工程学院

 <120>  降解有机磷农药工程菌、其构建方法及应用

 <130>  none

 <160>  3    

 <170>  PatentIn version 3.5

 <210>  1

<211>  1158

<212>  DNA

<213>  opd

 <400>  1

atgcaaacga gaagggttgt gctcaagtct gcggccgccg caggaactct gctcggcggc       60

 ctggctgggt gcgcgagcgt ggctggatcg atcggcacag gcgatcggat caataccgtg      120

 cgcggtccta tcacaatctc tgaagcgggt ttcacactga ctcacgagca catctgcggc      180

 agctcggcag gattcttgcg tgcttggcca gagttcttcg gtagccgcaa agctctagcg      240

 gaaaaggctg tgagaggatt gcgccgcgcc agagcggctg gcgtgcgaac gattgtcgat      300

 gtgtcgactt tcgatatcgg tcgcgacgtc agtttattgg ccgaggtttc gcgggctgcc      360

 gacgttcata tcgtggcggc gaccggcttg tggttcgacc cgccactttc gatgcgattg      420

 aggagtgtag aggaactcac acagttcttc ctgcgtgaga ttcaatatgg catcgaagac      480

 accggaatta gggcgggcat tatcaaggtc gcgaccacag gcaaggcgac cccctttcag      540

 gagttagtgt taaaggcggc cgcccgggcc agcttggcca ccggtgttcc ggtaaccact      600

 cacacggcag caagtcagcg cgatggtgag cagcaggccg ccatttttga gtccgaaggc      660

 ttgagcccct cacgggtttg tattggtcac agcgatgata ctgacgattt gagctatctc      720

 accgccctcg ctgcgcgcgg atacctcatc ggtctagacc acatcccgca cagtgcgatt      780

 ggtctagaag ataatgcgag tgcatcagcc ctcctgggca tccgttcgtg gcaaacacgg      840

 gctctcttga tcaaggcgct catcgaccaa ggctacatga aacaaatcct cgtttcgaat      900

 gactggctgt tcgggttttc gagctatgtc accaacatca tggacgtgat ggatcgcgtg      960

 aaccccgacg ggatggcctt cattccactg agagtgatcc cattcctacg agagaagggc     1020

 gtcccacagg aaacgctggc aggcatcact gtgactaacc cggcgcggtt cttgtcaccg     1080

 accttgcggg cgtcatgacg ccatctggat ccttccagcc agcggccact attccccgtc     1140

 aagatgcggg cgtcatga                                                   1158

 <210>  2

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  2

cgggatccca tgcaaacgag aagggttgtg ctc                                    33

 <210>  3

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  3

cgcccgggca tgacgcccgc atcttgacgg gga                                    33

 

 

Claims (9)

1.一株降解有机磷农药工程菌，其特征在于，它为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）sp.LTG1，该菌株已于2014年6月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 9272。

2.权利要求1所述的降解有机磷农药工程菌的构建方法，其特征在于：通过聚合酶链式反应从黄杆菌(Flavorbacterium. sp )ATCC27551中提取有机磷农药水解酶OPH编码基因opd，再将编码基因opd插入至载体pHT43，构建表达载体pHT43-opd，再将pHT43-opd转入枯草芽孢杆菌WB800中。

3.根据权利要求2所述的降解有机磷农药工程菌的构建方法，其特征在于，编码基因opd插入至载体pHT43的步骤是：构建重组表达质粒载体pTG19-T-opd，再对载体 pTG19-T-opd和表达载体pHT43分别用BamHI、SmaI酶双酶切，再将pTG19-T-opd切下的opd基因克隆到载体pHT43上。

4.根据权利要求2所述的降解有机磷农药工程菌的构建方法，其特征在于，pHT43-opd转入枯草芽孢杆菌WB800中的步骤是：先将pHT43-opd载体克隆到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，提取质粒，然后再通过电击转化法把pHT43-opd转入枯草芽孢杆菌WB800中。

5.根据权利要求2所述的降解有机磷农药工程菌的构建方法，其特征在于：所述的聚合酶链式反应中使用的上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.2～3所示。

6.根据权利要求4所述的降解有机磷农药工程菌的构建方法，其特征在于：所述的电击转化法中，电转培养基为：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖，其余为水；电转仪设置为2.1kv，5ms，电击1次。

7.权利要求1所述的降解有机磷农药工程菌在有机磷类农药降解中的应用。

8.根据权利要求7所述的降解有机磷农药工程菌在有机磷类农药降解中的应用，其特征在于：所述的有机磷类农药选自敌敌畏、马拉硫磷、乐果、氧化乐果、对硫磷、甲基对硫磷或乙酰甲胺磷。

9.权利要求1所述的降解有机磷农药工程菌在制备用于有机磷类农药降解的菌剂中的应用。