CN109182242A - 一种异源表达磷酸三酯酶的重组枯草芽孢杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种异源表达磷酸三酯酶的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌的制备方法包括如下步骤：(1)确定磷酸三酯酶的基因编码；(2)将步骤(1)确定的基因插入pHY‑ZL，获得重组表达载体；(3)将重组表达载体转化到宿主枯草芽孢杆菌并在宿主菌中表达所述磷酸三酯酶基因。本发明重组枯草芽孢杆菌能够可溶性分泌表达磷酸三酯酶，该酶可水解多种有机磷化合物，解决了有机磷水解酶底物特异性的制约，其对有机磷化合物的降解率大大提高；同时，所得重组酶是由食品安全菌(GRAS)枯草芽孢杆菌分泌所得，扩大了其应用领域。

Description

一种异源表达磷酸三酯酶的重组枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种将磷酸三酯酶基因整合到枯 草芽孢杆菌基因中，制成重组枯草芽孢杆菌的方法。
背景技术
微生物来源的磷酸三酯酶(PTE,EC3.1.8.1)可以广泛水解有机磷化合物，断裂 其中的磷酯键而使其脱毒，具有环保和原位解毒优势，提供了生物修复新途径。 磷酸三酯酶属于酰胺水解酶超家族成员，该超家族催化的反应包括酰胺、酯、 糖及有机磷酸酯等化合物的水解；活性位点具有单核或双核金属中心。金属中 心具有双功能性：极化水分子增强亲核进攻；增强底物分子解离基团键的断裂。
近年来，国内外对有机磷水解酶的研究颇多，如伍宁丰等对该有机磷降解酶 进行了改造和修饰，制备了重组有机磷降解酶，并成功将该酶在毕赤酵母中诱 导表达。目前对有机磷农药的降解主要是以氯化氧化为主的化学方法，其用量 大多遵循化学计量原理.虽然作用快，洗消效果好，但是普遍存在腐蚀性强、 刺激性强，环境污染严重，用量大和后勤负担重等问题。2016年，Ahmadian, Gholamreza等为实现opd基因及其固有信号肽在大肠杆菌中的胞外分泌，对opd 基因及其天然信号肽进行密码子优化，并在大肠杆菌BL21(DE3)plyss中表达， 但需IPTG诱导6h，重组OPH成功分泌到细胞外介质,该分泌系统可以作为有机 磷农药解毒的高效生物催化剂。
近年来，国内外对有机磷水解酶的研究颇多，如伍宁丰等对该有机磷降解酶 进行了改造和修饰，制备了重组有机磷降解酶，并成功将该酶在毕赤酵母中诱 导表达。可喜的是，此酶对沙林和梭曼也有降解，不过降解率还比较低。目前 对有机磷神经毒剂的洗消主要是以氯化氧化为主的化学洗消剂，其用量大多遵 循化学计量原理.虽然作用快，洗消效果好，但是普遍存在腐蚀性强、刺激性 强，环境污染严重，用量大和后勤负担重等问题。2016年，Ahmadian,Gholamreza 等为实现opd基因及其固有信号肽在大肠杆菌中的胞外分泌，对opd基因及其 天然信号肽进行密码子优化，并在大肠杆菌BL21(DE3)plyss中表达，但需IPTG 诱导6h，重组OPH成功分泌到细胞外介质,该分泌系统可以作为农药化合物解 毒的高效生物催化剂。
生物酶催化效率高、低腐蚀、环境友好，并且能够以氧化、水解等生物催化 的方式降解有机磷杀虫剂及化学毒剂等，被认为是“最理想的洗消剂之一”，符 合绿色消毒发展的需求，已逐渐成为重要研究方向，也是绿色生物洗消材料的 主要研究重点。由于生物酶的催化特性，使其在侦检、防护、救治、环境修复 方面也有不可忽视的应用潜力。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种异源表达磷酸三酯 酶的重组枯草芽孢杆菌。本发明重组枯草芽孢杆菌能够可溶性分泌表达磷酸三 酯酶，其对有机磷化合物的降解率大大提高；同时，所得重组酶是由食品安全 菌(GRAS)枯草芽孢杆菌分泌所得，扩大了其应用领域。
本发明的技术方案如下：
一种异源表达磷酸三酯酶的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌的制 备方法包括如下步骤：
(1)确定磷酸三酯酶的基因编码；
(2)将步骤(1)确定的基因插入pHY-ZL，获得重组表达载体；
(3)将重组表达载体转化到宿主枯草芽孢杆菌并在宿主菌中表达所述磷酸 三酯酶基因。
所述表达载体从5’-3’依次包括以下可操作性元件：
pHY-PLK300质粒骨架、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；
所述的外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位 点以及转录终止子；
所述的筛选标记表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
所述外源基因表达盒中包括启动子BSxyl；转录终止子Terminal；信号肽 Signalpeptide；筛选标记基因表达盒包括氨苄抗性基因、四环素抗性基因。
所述磷酸三酯酶的序列为SEQ ID NO.1。
所述BSxyl启动子的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述Ter终止子的DNA 序列如SEQ ID NO.3所示；Signal peptide序列如SEQ ID NO.4所示。
一种外源基因表达方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备所述表达系统；
(2)将外源基因插入所述的表达载体的外源基因插入的酶切位点，获得重 组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主枯草芽孢杆菌并在宿主中表达所述的外 源基因。
本发明有益的技术效果在于：
本发明采用绿色、无污染且高效的生物酶作为有机磷化合物的生物降解活性 组分。在现有的对磷酸三酯酶研究的基础上，以PTE、OPdA、OPAA及其突变 体作为有机磷降解酶的主要酶源，使用Autodck软件模拟酶源与甲基对硫磷、 乐果分子对接并计算结合能，进行反向虚拟筛选，获得酶源与有机磷化合物的 结合模型，寻找结合能最小的酶源确定为酶源。用Genbank确定该类酶源的基 因编码，根据枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优化并合成基因，合成后的基因 通过变换载体、培养菌、诱导条件等实现高效表达，得到不同种类的生物酶酶 液，按照GB/T 5009.20-2003检测农药残留量，评价酶液对有机磷杀虫剂的消毒效果，筛选并确定活性最高的生物酶基因作为进化研究对象。
本发明筛选出一种磷酸三酯酶，利用枯草芽孢表达系统可允许将外源基因插 入到含有信号肽的载体上，使表达的外源蛋白能够分泌到培养基上清中，不需 破壁，不需诱导就可以得到酶蛋白简化了酶蛋白的后加工工艺，特别有利于酶 蛋白的大规模生产；同时解决底物专一性的制约，而枯草芽孢杆菌被认为是安 全菌(GRAS)，因此本发明扩大磷酸三酯酶的应用范围(如食品领域：果蔬的农残 处理)。在重组菌表达后，未经优化发酵条件，就可水解5mg/mL甲基对硫磷、 水胺硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、乐果，30min可降解50％左右。钟超、黄娇芳 的专利，《枯草芽孢杆菌、生物膜及其构建和应用》是被摸上表达酶，这种方法是无法定量的，虽然也可检测到酶活，但酶始终和细菌捆绑在一起，无法纯化 获得纯酶，应用有一定的困难。本发明可以分离纯化获得纯酶，可定量检测； 表达于胞外，实现可溶性分泌表达，解决了在大肠杆菌中表达产生的包涵体问 题，简化了发酵下游工艺，为后续酶学性质与结构分析提供材料。
附图说明
图1：重组质粒PHY-ZL-ob3酶切鉴定结果；
图中，M：maker；1：PHY-ZL-PTE酶切验证结果。
图2：发酵液中重组磷酸三酯酶的SDS-PAGE电泳图谱；
图中，M：maker；1：WBH600/PHY-ZL-PTE；2：WB600/PHY-ZL，泳道2 为原始菌，其无可检测到的蛋白表达；泳道1为枯草芽孢杆菌在发酵20h后的 蛋白表达情况。
图3：重组磷酸三酶的蛋白纯化SDS-PAGE电泳图谱；
图中，M：maker；1：纯化后WBH600/PHY-ZL-PTE。
图4：枯草芽孢杆菌表达的有磷酸三酯酶降解甲基对硫磷的动力学分析。
图5：枯草芽孢杆菌表达的有磷酸三酯酶降解水胺硫磷的动力学分析
图6：枯草芽孢杆菌表达的有磷酸三酯酶降解马拉硫磷动力学的分析
图7：枯草芽孢杆菌表达的有磷酸三酯酶降解毒死蜱动力学的分析
图8：枯草芽孢杆菌表达的有磷酸三酯酶降解乐果的动力学分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
本发明所涉及的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详 见《分子克隆(第三版)》。
除非本文另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领 域的普通技术人员通常所理解的相同含义。具体如下：
如本文所用，术语“有机磷化合物”指含有碳-磷键的有机化合物，它们主要 用于虫害控制以作为长期存在于环境中的氯化烃、滴滴涕等替代物。很多农药 和化学武器也含有有机磷化合物成分。有机磷农药多为磷酸酯类或硫代磷酸酯 类，其结构式中R1、R2多为甲氧基(CH3O-)或乙氧基(C2H5O-)；Z为氧(O) 或硫(S)原子：X为烷氧基、芳氧基或其他取代基团。可以合成多种有机磷化 合物。
如本文所用的，术语“磷酸三酯酶”指可水解磷酸三酯、有机磷酸硫代烷基 酯和氟代磷酸酯的P-O,P-S和P-F键，对有机磷毒剂GB、GD、VX及其模拟剂 二异丙基氟磷酸酯(DFP)、对氧磷、对硫磷和内吸磷都有很强的水解和脱毒作用。
如本文所使用的枯草芽孢杆菌是Bacillus subtilis WB600购于北京普天同创生物科技有限公司。
如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示 该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸 或蛋白而被修饰，或者所述细胞来自于未修饰的细胞。因此，例如，重组细胞 表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因，但这 些基因异常表达、表达不足或者完全不表达。
如本文所用，术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建 物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含由2OB3A基因编码的有机磷 水解酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选的是枯草芽孢杆菌。
如本文所用，磷酸三酯酶蛋白用OB3表示，有机磷水解酶基因有斜体表示 ob3表示。
如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌”是芽孢杆菌的一个种，有长期制备发酵 食品的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管 理局(FDA)和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株。自20世纪80年代以来， 一批针对B.subtilis的遗传操作工具(载体)被深入研究和应用。迄今为止，在 B.subtilis及其近源种中已经克隆和表达了大量的原核和真核基因，其中有的已 应用于工业化生产，并取得了一定的成效。枯草芽孢杆菌蛋白分泌机理与大肠 杆菌相似。但是，由于两菌结构上(如枯草杆菌没有细胞外模，有厚的细胞壁等) 和分泌元件(如枯草杆菌有PrsA和不同的信号肽酶等)的差异，决定了它们之间 存在明显差异不同。枯草芽孢杆菌蛋白分泌的简要过程为：分泌蛋白在细胞质 以前体的形式合成后，胞质内的分子伴侣和信号识别颗粒结合其上，与信号肽 一起使前体蛋白处于分泌构象状态。在信号识别颗粒受体FtsY的介导下，蛋白 前体复合物与SecA结合。当蛋白前体复合物与SecA结合后，SecA水解ATP 释放能量，在转位酶的作用下，前体蛋白转运到膜外。在转运过程中或转运后 很短时间内，信号肽酶(Sip)移去前体中的信号肽。随后，在膜外促进蛋白折叠 的因子如PrsA、金属离子等的作用下，蛋白折叠成有生物活性的构象形式。释 放到培养基中。
如本文所用，术语“培养”指使一种微生物细胞在适当条件在液体或固体培 养基中生长。
如本文所用，有关核苷酸或蛋白质的术语“异源”指在宿主细胞中并非天然 存在的多核苷酸或蛋白质。该术语意图包含由天然发生的基因、突变基因和、 或合成基因编码的蛋白质。
如本文所用，有关细胞所用的术语“转化”表示该细胞含有非天然的(例如异 源的)的核酸序列，所述核酸序列被整合入其基因组或者作为被保持多代的附加 体质粒。
如本文所用，术语“酶活力单位”指在特定条件下每给定的时间内产生给定 量的产物的酶量。
根据本发明，包含编码有机磷水解酶的核酸的DNA构建物被构建以便导入 宿主细胞。在一些实施方式中，在一些实施中，通过表达载体将DNA构建物导 入宿主细胞。
酶表达的分析和酶活力的测定：
当下面的描述特别提及磷酸三酯酶时，本领域的技术人员将容易理解，相同 或相似的方法适用于OB3表达的分析和酶活力的测定。为了评价有机磷水解酶， 可以进行SDS-PAGE在蛋白水平进行分析。
磷酸三酯酶的活力可以通过龚攀.甲基对硫磷水解酶的稳定性与分泌研究 [D]:贵州大学,2015.中所述的方法来测定。在一些实施方式中酶活力可通过测定 单位时间产生一定量对硝基苯酚所需的酶量来进行测定。
在以下的公开内容和实验部分中，应用下列缩略语：
OB3(具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列的磷酸三酯酶酶)、℃(摄氏度)、 rpm(每分钟的转速)、ddH2O(去离子水，Milli-Q过滤)、kD(千道尔顿)、g(克)、 mg(毫克)、μg(微克)、cm(厘米)、μm(微米)、L(升)、mL(毫升)、μL(微升)、M(摩 尔浓度)、mM(毫摩尔浓度)、U(酶活单位)、min(分钟)、h(小时)、d(天)、Tris(三 羟甲基氨基甲烷)，SDS(十二烷基硫酸钠)、PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。
实施例1
一种异源表达磷酸三酯酶的重组枯草芽孢杆菌，包括如下处理过程：
(1)磷酸三酯酶的获取
使用Autodck软件模拟酶源与有机磷化合物对接并计算结合能，进行反向 虚拟筛选，获得酶源与有机磷化合物的结合模型，寻找结合能最小的酶源确定 为酶源。命名为ob3。送上海生工生物工程股份有限公司按照枯草芽孢杆菌所偏 爱的密码子进行优化合成，获得优化的磷酸三酯酶基因，基因序列为SEQ ID NO.1。
(2)重组质粒pHY-ZL-ob3构建
以pHY-PLK300为骨架，在多克隆位点依次插入启动子BSxyl、终止子Ter、 信号肽Signal peptide元件，得到质粒PHY-ZL；
启动子BSxyl的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；终止子Ter的DNA序列 如SEQ IDNO.3所示；信号肽Signal peptide序列如SEQ ID NO.4所示。
重组质粒pMD19-T-ob3的构建：以合成的基因为模板，用引物P1，P2进行 PCR扩增。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s， 72℃延伸1.5min，29个循环，72℃延伸5min。纯化回收PCR扩增产物后， T/A克隆进pMD19-T Simple Vector，命名为pMD19-T-ob3。获得重组质粒 pMD19-T-ob3。基因两端引入EcoRⅠ/KpnⅠ酶切位点。
引物序列如下：引物P1下划线部分为EcoRⅠ的识别位点，引物P2下划线 部分是KpnⅠ的识别位点。
P1:5’-3’CCGGAATTCATGGATAGAATTAATACAGTTAGAGGACCG
P2:5’-3’CGGGGTACCCTAATGGTGATGGTGATGATGTGCTCTAAGTGTCG GTGACAGAAAT
重组质粒pHY-ZL-ob3的构建:采用EcoRⅠ和KpnⅠ对pMD19-T-ob3进行双 酶切，切胶回收目的片段，将经EcoRI-KpnI线性化的载体pHY-ZL与经 EcoRI-KpnI消化的pMD19-T-ob3的片段，按照质量比1:10的比例加入10μL 体系，于16℃培养箱连接过夜。酶切反应混合物于37℃2h，0.8％琼脂糖凝胶 电泳检测酶切效果，各自的酶切反应体系如表1所示，酶切验证结果如图1所 示，得到大小为6.8kb和1.0kb的两条带，由此可知，重组质粒pHY-ZL-ob3构建成功。
表1
(3)宿主枯草芽孢杆菌细胞的转化、表达和培养
将DNA构建产物或载体导入宿主细胞的技术包括有感受态的制备和转化；
一般的转化的方法是本领域已知的。对于转化枯草芽孢杆菌，参考改进的 1958年John Spizizen的枯草芽孢转化方法。
一般而言，细胞被培养在含生理盐和营养剂的标准培养基中(Pourquieetal.,BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION,Academic Press,1988,71-86和Ilmen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,1997,63:1298-1306)。普通 的商业配置培养基(例如Luria Bertani(LB)肉汤和Terrific Broth(TB)超级肉汤)也 可以用于本发明。
培养条件也是标准的(例如将培养物在摇床培养器中，在合适的培养基中条件 下培养(37℃，200rpm)。
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化:
(1)从甘油管取100μL接种至3mL Sp I培养基中，37℃，200rpm条件 下，培养12h。
(2)从过夜培养的菌液中，转接300μL于5mL Sp I培养基中，37℃，200 rpm条件下，培养4.5h。
(3)从步骤(2)5mL Sp I培养基中转接200μL于2mL Sp II培养基中， 37℃，200rpm条件下，培养1.5h。
(4)向步骤(3)中的Sp II培养基中加20μL 100×EGTA溶液，37℃， 200rpm条件下，培养10min后，分装至1.5mL离心管中，每管500μL，-70℃ 保存或现用。
(5)将10μL连接产物，或者重组质粒加入到感受态细胞当中轻轻混合均 匀，在37℃，200rpm培养2.5h后，6000rpm离心3min，弃掉部分上清，吹 打重悬菌体，然后在超净台均匀涂布在对应的抗性平板上。
(6)将涂布后的抗性平板在37℃生化培养箱中培养，对单菌落进行菌落 PCR验证，挑取正确的转化子酶切验证并送去测序。
检测例：
一、重组枯草芽孢杆菌的分泌表达
1、种子培养
将甘油管菌于LB平板上活化后，挑取平板上较大的单菌落接种于50mL LB 培养基中，37℃，200rpm摇床培养12h。
2、摇瓶培养
以4％(v/v)的接种量接种于TB培养基中，37℃，200rpm摇床培养60h，每 隔两个小时取样测定酶活。
3、粗酶液的制备
取一定量的发酵液12000rpm离心5min，上清即为磷酸三酯酶粗酶液。对其 表达产物进行SDS-PAGE分析，并测定其重组酶活力。
4、磷酸三酯酶的纯化：
重组枯草芽孢杆菌按照上述3的方法，得到粗酶液酶。HisTrapTMHP纯化操 作：上样开始先用15mL A液冲洗亲和柱。进样量40mL，进样时流速为1 mL·min-1，进样结束后，先用30mL A液洗脱杂蛋白，再以B液线性洗脱重组 蛋白20mL，B液的浓度从0-100％，收集蛋白峰。最后用10mL A液平衡亲和 柱，流速一直保持1mL·min-1。HiPrepTM26/10Desalting纯化操作步骤；所得蛋 白峰用HiPrepTM26/10Desalting柱脱去高浓度的咪唑。进样量为5mL，进样前 预先用2倍的超纯水平衡亲和柱，进样后以1.5倍柱体积去离子水洗脱蛋白，实 验流速为10mL·min-1，收集得到蛋白峰，即为除去咪唑的PTE纯蛋白。得到的 蛋白峰用SDS-PAGE分析。结果如图3所示，得到蛋白大小为46KD，重组 B.subtilis WB600/PHY-ZL-ob3粗酶液酶活达到0.56U/mL，纯化后比酶活为2.8 U/mg。
A液：25mmol·L-1Tris-HCl(PH 7.4)，0.5mol·L-1NaCl，20mmol·L-1咪唑；B 液：25mmol·L-1Tris-HCl(PH 7.4)，0.5mol·L-1NaCl，100mmol·L-1咪唑。
二、磷酸三酯酶对有机磷杀虫剂的降解率
在甲基对硫磷的降解过程中，甲基对硫磷的消耗量与其降解产物对硝基苯酚 的生成量之间为1:1的关系，所以本研究通过检测产生的对硝基苯酚的量而得到 甲基对硫磷被降解的量。
甲基对硫磷水解酶酶活性测定方法主要参照邓敏捷的方法：取100μL待测酶 液加入到含有5μL 10mg·mL-1甲基对硫磷和900μL 50mmol·L-1 Tris-HCl(PH＝8.0)的反应体系中，37℃反应10min，加入1mL 10％的TCA终止 液，再加入1mL 10％的Na2CO3溶液显色，410nm测定吸光值OD410，计算水 解产物对硝基酚的含量和对有机磷化合物的降解率。
其中甲基对硫磷水解酶酶活性的定义为：在上述条件下，每分钟释放1μmol 对硝基酚所需要的酶量为1个酶活单位(U)。
计算公式如下：U＝CV/tm。
PTE降解5mg/mL甲基对硫磷、水胺硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、乐果的动 力学分析如图4-8所示，由图分别可以看出，37℃，反应30min后对甲基对硫 磷的降解率达到62％，对水胺硫磷的降解率达到49％，对马拉硫磷的降解率达 到51％，对毒死蜱和乐果的降解率达到59％和48％，12h后对甲基对硫磷、水 胺硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、乐果的降解率达到99.8％、98.5％、99.1％、81％、 96.7％。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种异源表达磷酸三酯酶的重组枯草芽孢杆菌
<130> 1
<141> 2018-07-31
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1002
<212> PRT
<213> 磷酸三酯酶(Phosphotriesterase,PTE)
<400> 1
Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Ala Thr Ala Gly Ala Ala Thr Thr Ala
1 5 10 15
Ala Thr Ala Cys Ala Gly Thr Thr Ala Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys
20 25 30
Gly Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Gly Cys Gly Ala Ala
35 40 45
Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Thr Thr Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala
50 55 60
Cys Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr Thr Gly
65 70 75 80
Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Gly Cys Gly Cys Ala Gly Gly Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys
100 105 110
Cys Gly Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Gly Gly Ala Ala Gly
115 120 125
Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Thr Gly Cys Gly
130 135 140
Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Gly Ala Gly
165 170 175
Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Cys Gly Thr Thr Ala Gly Ala
180 185 190
Ala Cys Ala Ala Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Thr
195 200 205
Cys Ala Ala Cys Ala Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Gly
210 215 220
Cys Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Thr Thr Ala Gly Cys Cys Thr Thr
225 230 235 240
Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Thr Cys Ala Ala
245 250 255
Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Thr Cys Cys Ala
260 265 270
Thr Ala Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala
275 280 285
Gly Gly Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Thr Thr Thr Gly Ala Thr Cys
290 295 300
Cys Gly Cys Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Ala Ala Thr Gly Cys Gly
305 310 315 320
Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala
325 330 335
Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys Thr
340 345 350
Thr Thr Cys Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Ala
355 360 365
Ala Thr Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr
370 375 380
Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly
385 390 395 400
Gly Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Thr Cys Gly Cys
405 410 415
Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala
420 425 430
Ala Cys Ala Cys Cys Gly Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys
435 440 445
Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys
450 455 460
Ala Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Thr Cys Ala Thr Thr Ala
465 470 475 480
Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys Cys Gly Gly
485 490 495
Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Ala Cys Ala Gly Cys
500 505 510
Ala Gly Cys Thr Ala Gly Cys Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr
515 520 525
Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Cys Gly Gly
530 535 540
Cys Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala Ala Thr Cys Ala Gly Ala
545 550 555 560
Ala Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Cys
565 570 575
Ala Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Cys Ala Thr Thr Gly Gly Cys Cys
580 585 590
Ala Thr Thr Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Ala Cys Ala Gly Ala
595 600 605
Thr Gly Ala Thr Cys Thr Thr Ala Gly Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly
610 615 620
Ala Cys Ala Gly Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala
625 630 635 640
Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Thr Gly Gly
645 650 655
Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Cys Ala Thr Ala Thr Thr Cys Cys Gly
660 665 670
Thr Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Cys
675 680 685
Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Ala Thr Gly Cys Gly Thr Cys
690 695 700
Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly
705 710 715 720
Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys
725 730 735
Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly Cys Thr
740 745 750
Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala Thr Thr
755 760 765
Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala
770 775 780
Ala Ala Cys Ala Ala Ala Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala Gly
785 790 795 800
Cys Ala Ala Thr Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Thr Thr
805 810 815
Gly Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Cys Thr Ala Thr Gly
820 825 830
Thr Thr Ala Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala
835 840 845
Thr Gly Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly Ala Gly Thr Thr
850 855 860
Ala Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly
865 870 875 880
Cys Gly Thr Thr Thr Ala Thr Thr Cys Cys Gly Cys Thr Gly Ala Gly
885 890 895
Ala Gly Thr Gly Ala Thr Thr Cys Cys Gly Thr Thr Thr Cys Thr Gly
900 905 910
Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys Gly Thr Thr Cys
915 920 925
Cys Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys
930 935 940
Gly Gly Gly Cys Ala Thr Thr Ala Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Ala
945 950 955 960
Ala Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Cys
965 970 975
Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Ala Cys Thr Thr Ala Gly
980 985 990
Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr Ala Cys Cys
995 1000
<210> 2
<211> 105
<212> DNA
<213> BSxyl启动子(Promoter)
<400> 2
atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60
gcaggaggcg caactcaagc gtttgcgcat catcatcatc atcat 105
<210> 3
<211> 133
<212> DNA
<213> Ter终止子(Terminator)
<400> 3
caggataagc tccagatcct gctatcaata ccaagtcact gaattacccg tcatgattcc 60
tttcctattg cttgttgtta tgacgggtaa cttctataat taggatttat ttagagtgaa 120
tggtttttta ccc 133
<210> 4
<211> 105
<212> PRT
<213> Signal peptide
<400> 4
Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr
1 5 10 15
Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Cys
20 25 30
Ala Gly Thr Ala Thr Thr Ala Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Thr
35 40 45
Ala Cys Cys Gly Cys Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly
50 55 60
Gly Ala Gly Gly Cys Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Ala Ala Gly Cys
65 70 75 80
Gly Thr Thr Thr Gly Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr
85 90 95
Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr
100 105

Claims (6)

1.一种异源表达磷酸三酯酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌的制备方法包括如下步骤：
(1)确定磷酸三酯酶的基因编码；
(2)将步骤(1)确定的基因插入pHY-ZL，获得重组表达载体；
(3)将重组表达载体转化到宿主枯草芽孢杆菌并在宿主菌中表达所述磷酸三酯酶基因。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述表达载体从5’-3’依次包括以下可操作性元件：
pHY-PLK300质粒骨架、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；
所述的外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入的酶切位点以及转录终止子；
所述的筛选标记表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
3.根据权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述外源基因表达盒中包括启动子BSxyl；转录终止子Terminal；信号肽Signal peptide；筛选标记基因表达盒包括氨苄抗性基因、四环素抗性基因。
4.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述磷酸三酯酶的序列为SEQ ID NO.1。
5.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述BSxyl启动子的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述Ter终止子的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；Signal peptide序列如SEQ ID NO.4所示。
6.一种外源基因表达方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备所述表达系统；
(2)将外源基因插入所述的表达载体的插入外源基因的酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化至宿主枯草芽孢杆菌并在宿主中表达所述的外源基因。
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