DE2531982B2 - Verfahren zur herstellung eines diagnosetestsystems - Google Patents

Description

Obwohl zahlreiche biochemische Tests zur Identifizierung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaciae verfügbar sind, bereitet eine Unterscheidung von Organismen, wie Arizona oder Citrobacter von Salmonella und Pseudomonas cepacia oder Pseudomonas maliophilia von anderen Pseudomanaden immer Schwierigkeiten. Seit kurzer Zeit hat sich der o-Nitrophenyl-0-D-galactopyranosidtest zur Unterscheidung der genannten Organismen als brauchbar erwiesen. Bei diesem Test werden 0-Galactosidase bildende Organismen durch bakterielle Hydrolyse des Substrats o-Nitrophenyl-^-D-galactopyranosid nachgewiesen. Bei dem o-Nitrophenyl-0-D-galactopyranosid, das allgemein als ONPG bekannt ist, handelt es sich um ein künstliches Substrat, das zunächst in Lösung farblos ist. Bei der Hydrolyse des Substrats durch bakteriell gebildete /9-Galactosidase wird o-Nitrophenol in Freiheit gesetzt, das unter alkalischen Bedingungen gelb ist. Somit lassen sich bei Verwendung von ONPG auf bequeme Art und Weise eine ß-Galactosidaseaktivität und die dieses Enzym produzierenden Mikroorganismen nachweisen.

Der ONPG-Test wurde bereits verschiedentlich beschrieben, z. B. von J. L e d e r b e r g in »J. &act« Bd. 60, S. 381-392 (1950); G. H. Lowe in »J. Med. TechnoL« Bd. 19, S. 21 -25 (1962); M. J. P i c k e 11 und Mitarbeiter in »AppL Microbiol.« Bd. 14, S. 178-182 (1966) und A. C Sonnenwirth in Kap. 62 von »Gradwohls Clinical Laboratory Methods and Diagnosis«, 7. Ausg. (1970), S. 1111-1112 Bei sämtlichen Untersuchungen wird das ONPG-Substrat zum Zeitpunkt des Beginns des Tests mit einem unbekannten Organismus in einer Pufferlösung zubereitet Ober vorher zubereitete Substratlösungen geeigneter Empfindlichkeit und Stabilität wurde bisher noch nichts mitgeteilt Es werden auch Vergleichsstudien mit einem

ONPG-Diagnoseteststreifen beschrieben (vgL R. Rosner in »AppL BicrobioL«, Bd. 26, S. 890-893 Dezember 1973). Die Ergebnisse mit dem ONPG-Teststreifen waren gemäß den Ausführungen von R ο s η e r günstig. In der genannten Veröffentlichung sind jedoch

ίο weder die Zusammensetzung oder der Aufbau des Teststreifens noch ein Verfahren zu seiner Herstellung beschrieben. Der bei den Rosnerschen Untersuchungen verwendete ONPG-Teststreifen ist in der Tat ein früher Versuch zur Herstellung eines stabilen und empfindli-

2S chen Diagnosetestsystems zum genauen Nachweis /?-Galactosidase produzierender Organismen. Unglücklicherweise ist die Stabilität des von Rosner untersuchten ONPG-Teststreifens so kurzlebig, daß bei kommerzieller Nutzung weder für die Empfindlichkeit des Testprodukts noch die Genauigkeit der hierbei erzielbaren Ergebnisse eine Garantie übernommen werden kann. Ein vorher hergestelltes Diagnosetestsystem muß, um handelsfähig zu sein, den üblicherweise beider Herstellung, beim Versand und bei der Lagerung herrschenden Bedingungen zu widerstehen vermögen. Ferner muß ein solches Produkt zuverlässige und reproduzierbare Testergebnisse liefern. Obwohl also bereits ein gewisser Fortschritt gemacht wurde, besteht nach wie vor ein Bedarf für ein vorher hergestelltes, stabiles, empfindliches ONPG-Testsystem, das zur raschen Identifizierung von jS-Galactosidaseenzyme bildenden Mikroorganismen verwendet werden kann.

Erfindungsgemäß werden nun dem Fachmann ein Diagnosetestsystem zum Nachweis von /J-Galactosidase produzierenden Organismen und ein Verfahren zur Herstellung dieses Testsystems an die Hand gegeben. O^ bis 5,0% (Gewicht/Volumen) eines o-Nitrophenyl-jS-D-galactopyranosid-Substrats werden in einer 25-75 Vol.-%igen wäßrigen Acetonlösung gelöst, worauf die erhaltene Lösung auf eine Zone eines saugfähigen Trägermaterials appliziert wird. Auf eine der Substratzone benachbarte Zone des saugfähigen Trägermaterials wird dann eine 04- bis 1 molare Pufferlösung, die einen pH-Wert von 6,5 - 84 aufrechterhält, aufgetragen.

Das imprägnierte, trockene, saugfähige Trägermaterial enthält 0,5-3,0 mg o-Nitrophenyl-jJ-D-galactopyranosid in einer Zone und 0,01 -0,1 mMol Puffer in einer benachbarten Zone. Vorzugsweise wird ein einbasischer Kalium- und zweibasischer Natriumphosphatpuffer verwendet. Gegebenenfalls kann der äußersten, mit Reagenz imprägnierten Zone benachbart eine wasserdichte Sperrzone vorgesehen sein. Bei Gebrauch wird das imprägnierte saugfähige Trägermaterial in eine Suspension eines unbekannten Organismus in einer physiologischen Kochsalzlösung eingetaucht und 4 h lang inkubiert. Die Bildung einer gelben Färbung zeigt an, daß es sich um einen /?-Galactosidase produzierenden Organismus handelt. Das Diagnosetestsystem

IO

gemäß der Erfindung ist bei einer Temperatur von 4° C, bei Raumtemperatur und bei einer Temperatur von 37"C i Jahr lang stabiL

"■ Es hat sich gezeigt, daß die bekannte Nachweisme- jjacde zur ß-Galactosidasebestimmung nicht ohne ^eueres auf ein saugfähiges Material übertragen Werden kann. So wurde nämlich in höchst überraschender Weise gefunden, daß der ONPG-Substratbestandteil bei dem für eine optimale enzymatische Hydrolyse erforderlichen alkalischen pH-Wert auch beim Auftragen der ONPG-Substrat/Puffer-Lösung auf einen Papierteststreifen und Trocknen der Lösung nicht stabil ist Die nur kurz dauernde Stabilität eines solchen Produkte schließt eine Vermarktung des Diagnosesy-Stems praktisch aus. Eine Trennung des ONPG-Sub- \ strats von der Pufferlösung führt zu einem anderen Problem, da nämlich das ONPG-Substrat in Wasser nicht auf-reichend löslich ist, um es in der erforderlichen Konzentration auf die sehr kleine Zone bzw. den sehr kleinen Bereich des Papierteststreifens applizieren zu können. Um die erforderlichen Konzentrationen zu gewährleisten, müssen die nur schwach konzentrierten wäßrigen Lösungen mehrmals aufgetragen bzw. appliziert werden. Aufgrund der Kosten und der komplexen Herstellungsbedingungen war zunächst auch eine 2; großtechnische Herstellung derartiger Teststreifen praktisch unmöglich.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß ein gepuffertes ο- Ν itrophenyl-0- D-galactopy ranosid-Testsystem zum Nachweise von j3-Galactosidase produzierenden Bakterien auf ein saugfähiges Trägermaterial appliziert werden kann, wobei man ein stabiles, empfindliches Testsystem erhält, das zur raschen Identifizierung solcher Mikroorganismen verwendet werden kann. Gemäß den Lehren der Erfindung wird ein o-Nitrophenyl-0-D-galactopyranosid-Substratmaterial in einer Mischung aus Aceton und Wasser ganz spezieller Konzentration gelöst und auf eine Zone eines saugfähigen Trägermaterials appliziert. Das künstliche Substrat o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid ist im Handel erhältlich. Die zur Applikation des ONPG-Substrats auf das saugfähige Trägermaterial verwendete Lösung wird durch Auflösen von 0,5-5,0% (Gewicht/ Volumen) ONPG, bezogen auf das Volumen der Gesamtlösung, in einer Lösung mit 25-75 Vol.-% Aceton in Wasser zubereitet. Am besten enthält die wäßrige Substratlösung 5,0% (Gew./Vol.) ON PG und 70 Vol.-% Aceton. Die Substratlösung wird auf ein Ende des saugfähigen Trägermaterials appliziert und zur Trockene eingedampft, so daß auf einer Testeinheit des saugfähigen Trägermaterials 0,5-3,0 mg trockenes ONPG vorliegt. Die Substratlösung kann mittels geeigneter Maßnahmen auf das saugfähige Trägermaterial appliziert werden, und zwar auf eine oder beide Seite(n) einer Substratzone. Auf diese Weise kann man die genannte Menge trockenes ONPG-Substrat in der Substratzone ablagern. Am besten wird die ONPG-Substratlösung dreimal auf jede Seite des saugfähigen Materials appliziert, so daß auf einer Testeinheit insgesamt etwa 1,5 mg trockenes Substrat abgelagert werden.

Auf einen von der Substratzone getrennten, jedoch dieser benachbarten Teil des saugfähigen Trägermaterials wird dann ein mikrobiologisch inertes Puffersystem, das einen pH-Wert von 6,5-8,5, zweckmäßigerweise 7,2 -7,6, am besten 7,4, zu gewährleisten vermag, ^appliziert und zur Trockene eingedampft. Geeignete llPuffersvsteme der beschriebenen Fähigkeit sind:

Barbitalnatrium/Chlorwasserstoffsäure; Natriumacetat und

Barbitalnatrium/Chlorwasserstoffsäurs; Borax/einbasisches Kaliumphosphat; Zitronensäure, Phosphorsäure, Orthoborsäure und Natriumhydroxid/Chlorwasserstoffsäure; Zitronensäure und zweibasisches Natriumphosphat,

einbasisches Kaliumphosphat/zweibasisches Natriumphosphat;

Päperazindihydrochlorid/Natriumhydroxid; Piperazindihydrochlorid in
Glycylglycin/Natriumhydroxid; Tris(nydroxymethyl)-aminomethan/Chlorwasserstoffsäure und

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan und Maleinsäure oder

Maleinsäureanhydrid/Natriumhydroxid. Von den beschriebenen Puffersystemen werden die folgenden bevorzugt: einbasisches Kaliumphosphat/ zweibasisches Natriumphosphat; Tris(hydroxymethyl)-aminomethan/Chlorwasserstoffsäure und Barbitalnatrium/Chlofwasserstoffsäure, insbesondere der aus einbasischem Kaliumphosphat und zweibasischem Natriumphosphat bestehende Puffer.

Bei der Zubereitung der Lösung des Puffersystems zum Auftrag auf das saugfähige Trägermaterial hat es sich gezeigt, daß sich 0,5- bis etwa 1 molare Lösungen besonders gut eignen. Diese Lösungen werden dann dazu verwendet, auf einer von der Substratzone getrennten, jedoch dieser benachbarten Zone des saugfähigen Trägermaterials 0,01-0,ImMoI Puffer abzulagern. Gemäß einer Ausführungsform wird eine 1 molare Pufferlösung mit einbasischem Kaliumphosphat und zweibasischem Natriumphosphat auf eine der Substratzone benachbarte Zone des saugfähigen Trägermaterials derart appliziert, daß auf einer Testeinheit des saug.ahigen Materials 0,02 mMol Puffer abgelagert werden. Wie bei dem Auftrag der Substratlösung können auch zum Auftragen der Pufferlösung auf das saugfähige Trägermaterial beliebig geeignete Maßnahmen gewählt werden, sofern nur in einer geeigneten Zone des saugfähigen Trägermaterials eine erforderliche Menge trockener Puffer abgelagert wird. Am besten wird die Pufferlösung auf jede Seite der geeigneten Zone des saugfähigen Trägermaterials zweimal appliziert, wobei zwischen jedem Auft-ag getrocknet wird.

Die genannten Mengen an trockenem Substrat und Puffer, die in getrennten jedoch benachbarten Zonen einer Testeinheit des saugfähigen Trägermaterials untergebracht sind, sind zu einer 4stündigen Inkubation mit etwa 0,3 ml einer Suspension des Testorganismus in physiologischer Kochsalzlösung bei einer Temperatur von etwa 35° bis 37⁰C bestimmt. Im Hinblick auf optimale Ergebnisse innerhalb der empfohlenen Inkubationsdauer sollte eine solche Menge an Testorganismen vorhanden sein, daß die Suspension sichtbar trüb erscheint. Es kann zwar eine weniger dichte Suspension verwendet werden, dadurch erhöht sich jedoch die Inkubationsdauer. Eine eine größere Organismenkonzentration aufweisende, dichtere Suspension kann ohne Schwierigkeit ebenfalls mit dem Diagnosetestsystem gemäß der Erfindung untersucht werden. Wenn die Menge an Testorganismen, die Länge der Inkubationsdauer oder die Inkubationstemperatur variiert werden sollen, müssen die Mengen an Puffer und Substrat angepaßt werden, um einen ausreichenden Kontakt

zwischen den Testreagentien und den Testorganismen zu gewährleisten und um falsche negative Testergebnisse zu vermeiden. Die in dem Diagnosetestsystem gemäß der Erfindung verwendeten Mengen an Substrat und Puffer haben sich zur Gewährleistung genauen empfindlicher Ergebnisse in möglichst kurzer Zeit als geeignet erwiesea

Das Diagnosetestsystem gemäß der Erfindung kann aus einem lediglich 2 Zonen, die voll mit Substrat und Puffer imprägniert sind, aufweisenden saugfähigen Trägermateial bestehen. Wenn jedoch noch zusätzliches nicht imprägniertes saugfähiges Trägermaterial zur Verfügung steht, ist es selbstverständlich erforderlich, daß eine wasserdichte oder hydrophobe Sperrschicht appliziert wird, um eine Wanderung der Testreagentien ij und Endprodukte in die nicht imprägnierten Bereiche des saugfähigen Trägermaterials während er Inkubation mit der Suspension der Testorganismen zu verhindern. Wenn Testreagentien über die nicht imprägnierten Bezirke des saugfähigen Trägermaterials dispergiert so werden, verringern sich die tatsächlich mit den Testorganismen in Berührung stehenden Konzentrationen, so daß ungenaue Ergebnisse erhalten werden können. Daneben läßt sich ein positives Testergebnis bei fahlgelber Farbe nur sehr schwierig eindeutig nachweisen. Folglich ist zur Verhinderung einer Wanderung der Reagentien eine wasserfeste oder hydrophobe Sperrzone erforderlich.

Die auf das saugfähige Trägermaterial zu applizierende Sperrmasse muß sich bei dem biologischen Tastsystem gemäß der Erfindung chemisch inert verhalten. Als inerte Substanz können sämtliche wasserdichte Sperren bildende Verbindungen, wie Wachse, Lacke und Kunststoffe, verwendet werden. Ein derartiges Material ist beispielsweise eine handelsübliehe, farblose, polymerisierte Methacrylsäuremethylester-Beschichtungsmasse, die in einem Toluolträger zur Verfügung steht und mit weiterem Toluol oder Verdünnungsmitteln, wie Methanol, Äthanol und Propanol, weiter verdünnt werden kann. Eine weitere geeignete Sperrmasse ist ein handelsüblicher Chromkomplex, der in einer weiter verdünnbaren Isopropanollösung zur Verfügung steht. Eine wasserfeste Sperre erhält man, indem man zunächst den Chromkomplex auf das saugfähige Trägermaterial und dann die polymeri- 4$ sierte Methacrylsäuremethylester-Besehichtungsmasse mit oder ohne Trocknen auf den Chromkomplexüberzug aufträgt. Die genannten Sperrschichtaufträge werden auf beide Seiten des saugfähigen Trägermaterials appliziert, um ein vollständiges Durchdringen des saugfähigen Materials sicherzustellen.

Gegebenenfalls kann auf dem, den imprägnierten Zonen des saugfähigen Trägermaterials entgegengesetzten Ende eine Identifizierungszone zur Handhabung des Diagnosetestmaterials vorgesehen sein. Zu diesem Zweck kann man jede geeignete Marke oder jeden geeigneten Farbstoff, der das saugfähige Trägermaterial identifiziert oder färbt und somit die »Handhabungszone« von den mit Reagentien imprägnieren Zonen unterscheidet, verwenden. So hat es sich beispielsweise gezeigt, daß eine Lösung von etwa 0,40 —0,60 g eines Farbstoffs in einem geeigneten Lösungsmittel (die Angaben beziehen sich auf 100 ml) auf das saugfähige Trägermaterial appliziert werden kann. Eine bevorzugte Farbstofflösung enthält 0,50 g FD&C Blau Nr. 2, 0,10 g FD&C Rot Nr. 2 und 0,10 g eines wasserlöslichen Nigrosinfarbstoffs. Selbstverständlich können in gleicher Weise auch andere Farbstofflösungen verwendet werden.

Zur Herstellung des Diagnosetestsystems gemäß der Erfindung können sämtlich geeigneten saugfähigen Trägermaterialien, die über eine Kapilarwirkung Flüssigkeit zu halten vermögen, verwendet werdea Solche Materialien sind beispielsweise Filterpapier, Filz poröse Keramikstreifen, Fasergewebe und Fasermatten und dergleichen. Ein besonders saugfähiges Material ist Filterpapier hohen Gewichts.

Bei der Herstellung des Diagnosetestsystems kann man eine Rolle aus einem geeigneten saugfähigen Material, beispielsweise eine 10 m lange Filterpapierrolle, verwenden. Die Substratlösung, die Pufferlösung und die Lösung zur Herstellung der Sperrschicht werden in Längsrichtung auf die gesamte Rolle in parallelen Zonen oder Banden appliziert, indem das Filterpapier zwischen geeignet dimensionierten Auftragswalzen, die die Reagenzlösung aus Reservoiren aufnehmen, laufen gelassen wird. Beim Darüberlaufen über die Walzen wird das Filterpapier mit der jeweiligen Lösung imprägniert. Die Menge des auf der vorgesehenen Zone des Filterpapiers abgelagerten Reagenzes ist eine Funktion der Größe der Auftragswalze und der Anzahl der Auftragsvorgänge. Gegebenenfalls können ferner beide Seiten des Filterpapiers beschichtet werden. Nachdem sämtliche Reagenzlösungen auf die dafür vorgesehenen Zonen der Filterpapierrolle appliziert und dann zur Trockene eingedampft worden sind, wird das Filterpapier in einzelne Streifen, die eine Testeinheit des Diagnosetestsystems der Erfindung darstellen, zerschnitten. Jede Einheit enthält ausreichende Mengen an Substrat und Puffer für die Identifizierung und Differenzierung von /J-Galactosidase produzierenden Mikroorganismen.

Bei Gebrauch wird eine Testeinheit oder ein Teststreifen des Diagnosetestsystems gemäß der Erfindung in ein Teströhrchen, das eine Suspension einer zu prüfenden unbekannten Kultur in einer physiologischen Kochsalzlösung enthält, eingeführt, so daß die Substrat- und Pufferzonen in die Testsuspension eintauchen. Das Teströhrchen wird dann etwa 4 h lang bei einer Temperatur von etwa 35° bis 37° C inkubiert und dann daraufhin untersucht, ob die Flüssigkeit gelb geworden ist. Bejahendenfalls ist dies ein positiver Nachweis für das Vorliegen /J-Galactosidase produzierender Organismen. Wenn die Suspension farblos bleibt, ist das Testergebnis negativ.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel I Zubereitung der Substratlösung

70 ml Aceton und 30 ml destilliertes Wasser werden gemischt, worauf die erhaltene Mischung unter Rühren mit 5 g o-Nitrophenyl-0-D-galactopyranosid versetzt wird.

Zubereitung der Pufferlösung

In destilliertes Wasser werden 2,006 g einbasisches Kaliumphosphat und 12,106 g zweibasisches Natriumphosphat eingebracht, worauf auf 100 ml aufgefüllt und unter Rühren zum Auflösen des Puffers auf eine Temperatur von etwa 6O⁰C prwärmt u/irH

Zubereitung der Lösung
zur Herstellung der Sperrschicht

Lösung A

5,45 ml der handelsüblichen Lösung des Chromkom- s plexes werden gründlich durchgemischt und dann unter konstantem Rühren in 21,8 ml Isopropanol eingetragen. Zu der Lösung des handelsüblichen Chromkomplexes in Isopropanol werden 45,4 ml Wasser zugesetzt. Nach Zugabe von 27,3 ml 0,05 η-Natriumhydroxid unter konstantem Rühren wird die gesamte Lösung mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

Losung B

15 ml Äthanol (95%ig) wird zu 85 ml der handelsüblichen polymerisierten Methacrylsäuremethylester-Beschichtungsmasse zugesetzt, worauf das Ganze gründlich durchgemischt wird.

Zubereitung der Identifizierungsfarbstofflösung

In destilliertem Wasser werden 0,50 g FD&C Blau Nr. 2, 0,10 g FD&C Rot Nr. 2 und 0,10 g eines wasserlöslichen Nigrosinfarbstoffs gelöst, worauf das ganze auf 100 ml aufgefüllt wird.

Beispiel II *⁵

Eine 10 m lange Rolle aus schwerem Filterpapier einer Breite von 83 mm wird als saugfähiges Material verwendet. Die Substratlösung des Beispiels I wird in einem Reservoir untergebracht. Aus diesem wird es der Oberfläche eines sich drehenden Auftragsrades zugeführt. Längs der 10 m langen Kante des Filterpapiers wird eine 3,7 mm breite Zone mit der Substratlösung imprägniert, indem das Filterpapier über das eine Breite von 4 mm aufweisende, sich drehende Auftragsrad laufen gelassen wird. Das sich drehende Rad bewegt gleichzeitig das Papier vorwärts. Nach dem Auftrag wird die aufgetragene Lösung zur Trockene eingedampft. Diese Maßnahme wird auf jeder Seite der 3,7 mm breiten Substratzone dreimal wiederholt, wobei zwischen den einzelnen Auftragsvorgängen getrocknet wird.

Dann wird die Pufferlösung des Beispiels I in einem Reservoir untergebracht und mittels eines sich drehenden Auftragsrades einer Breite von 4 mm auf eine 3,7 mm breite, der Substratzone des Filterpapiers benachbarte Pufferzone appliziert. Die Pufferlösung wird zweimal auf jede Seite der Pufferzone appliziert und nach jedem Auftrag zur Trockene eingedampft. Die Pufferzone darf die Substratzone nicht überlappen.

Weiterhin wird die zur Herstellung der Sperrschicht dienende Lösung A des Beispiels I in einem Reservoir untergebracht und mittels eines sich drehenden Auftragsrades einer Breite von 5 mm in die Mitte einer der Pufferzone benachbarten, 16 mm breiten Zone appliziert. Die Applikation erfolgt einmal auf jede Seite der im Zentrum befindlichen Sperrzone. Weiterhin wird die zur Herstellung der zweiten Sperrschicht dienende Lösung B des Beispiels I in einem Reservoir untergebracht und auf den mit der Lösung A hergestellten Auftrag ohne Trocknen auf beide Seiten der gesamten 16 mm breiten Sperrzone appliziert. Der Auftrag erfolgt mittels eines sich drehenden Rades einer Breite von 15 mm. Schließlich wird die Sperrzone trocknen gelassen.

Ferner wird die Identifizierungsfarbstofflösung des Beispiels I in einem Reservoir untergebracht und längs der 10 m langen Kante des Filterpapiers auf der entgegengesetzten Seite der Substratzone mittels eines 6,3 mm breiten Auftragsrades zu einer 6 mm breiten Zone aufgetragen. Die Identifizierungsfarbstofflösung wird einmal auf jede Seite der Identifizierungszone appliziert und trocknen gelassen.

Nachdem sämtliche imprägnierte Zonen auf der Filterpapierrolle vollständig getrocknet sind, wird das Papier längs ihrer Breitseite von 83 mm in 6,3 mm breite Streifen zerschnitten.

Beispiel IU
Verwendung des Diagnosetestsystems

Eine bestimmte Menge einer unbekannten Kultur wird in 0,3 ml einer in einem 13 χ 100 Tesiröh-chen befindlichen physiologischen Kochsalzlösung suspendiert Dann wird der Diagnoseteststreifen des Beispiels II derart eingetaucht, daß die Zonen entgegengesetzt der Identifizierungsfarbstoffzone in die Suspension eintauchen. Schließlich wird das Ganze 4 h lang bei einer Temperatur von 35" bis 37° C in einem Wasserbad inkubiert. Die Entwicklung einer gelben Färbung in der Flüssigkeit zeigt ein positives Testergebnis. Wenn die Flüssigkeit farblos bleibt, ist der Test negativ.

109516/405

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Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Zubereitung eines Diagnosetestsystems zum Nachweis der Bildung von /?-Galactosidase durch bakterielle Hydrolyse eines o-Nitrophenyl-j3-D-galactopyranosid-Substrats unter Verwendung eines saugfähigen Materials, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine wäßrige Lösung mit 0,5 bis 5,0% (Gewicht/Volumen), bezogen auf das Volumen der Gesamtlösung, o-NitrophenyI-0-D-gaUctcpyranosid und 25 bis 75 Vol.-% Aceton zubereitet,

b) eine 0,5- bis l.Omolare Pufferlösung eines Puffersystems, das einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5 zu gewährleisten vermag, zubereitet,

c) die Lösung (a) auf eine Zone eines saugfähigen Materials appliziert und zur Trockene eindampft, wobei auf eine Testeinheit des saugfähigen Materials 0,05 bis 3,0 mg o-Nitrophenyl-/?- D-galactopyranosid entfallen, und

d) die Lösung (b) auf eine der Substratzone benachbarte Zone des saugfähigen Materials appliziert und zur Trockene eindampft, wobei auf eine Testeinheit des saugfähigen Materials 0,01 bis 0,1 mMol Puffer entfallen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Puffersystem verwendet, das einen pH-Wert von 7,2 bis 7,6 gewährleistet

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß man als Puffersystem ein solches aus einbasischem Kaliumphosphat und zweibasischem Natriumphosphat verwendet

4. Diagnosetestsystem, dadurch gekennzeichnet, daß es nach einem der Ansprüche 1 bis 3 hergestellt worden ist.

5. Verwendung eines Diagnosetestsystems nach Anspruch 4 zum Identifizieren und zur Unterscheidung von Mikroorganismen, die /J-Galactosidase produzieren.