DE3048705A1 - "reagenz zum nachweis von zahnkaries" - Google Patents

"reagenz zum nachweis von zahnkaries"

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Description

Die Erfindung betrifft ein Reagenz zum Nachweis von Zahnkaries. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Reagenz, das es gestattet, sofort den Zustand von Zahnkaries aus dem Zahnbelag eines Patienten zu bestimmen/und zwar mittels einer Farbreaktion ähnlich dem Schneider-Test.
Bei der Entstehung und Entwicklung von Zahnkäries spielen anscheinend drei Faktoren eine Rolle, nämlich kariogene Bakterien, Zucker und Dentin; vgl. Ind. Dent. J·, Bd. 12 (1962), S. 443. Zur genauen Kenntnis der Entstehung und der Entwicklung von Zahnkaries sollten diese Faktoren berücksichtigt werden. Es ist jedoch schwierig, gleichzeitig diese Faktoren zu bestimmen. .
Es sind schon verschiedene Untersuchungen durchgeführt worden, um Verfahren zur Bestimmung von Zahnkaries zu entwickeln. Beispiele für diese Testverfahren sind der Lactobacillus-Zelltest im Speichel, der Schneider-Test, der Test zur Bestimmung der Zahnschmelzauflösung, der Test zur Bestimmung der säurebildenden Aktivität von Speichelflüssigkeit und ein Test zur Bestimmung der Pufferaktivität von Speichelflüssigkeit. Diese Testverfahren befriedigen jedoch nicht, da sie kompliziert sind, komplexe Vorrichtungen und Einrichtungen erfordern und nicht rasch durchgeführt werden können. Außerdem läßt sich keine gleichmäßige Be-Ziehung mit der Aktivität der Zahnkaries erreichen, was von besonderer Bedeutung ist. Deshalb haben diese Tests keinen allgemeinen Eingang in die Praxis gefunden.
Aus der JP-OS ί 589/75 ist bereits ein Test zur.Bestimmung von.Zahnkaries bekannt ,bei dem man eine wäßrige Lösung, die eine Kohlenstoff quelle (Saccharose), eine Stickstoffquelle, (Tryptose) sowie
L J
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einen Farb-Indikator und einen Inhibitor für oportunistische, für die Zahnkaries nicht ursächliche Keime enthält, mit Zahnbelag beimpft, die beimpfte Lösung für einen bestimmten Zeitraum inkubiert und sodann das Ausmaß der Zahn-
S karies aus der Verfärbung der Kulturlösung bestimmt. Das Verfahren läßt sich zwar einfach durchführen und ermöglicht eine genaue Bestimmung der Zahnkaries, doch erfordert es wegen der Züchtung der Bakterien eine zu lange Zeit.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Reagenz zum raschen und genauen Nachweis von Zahnkaries aufgrund einer Farbreaktion mit dem Zahnbelag zu entwickeln. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich ferner aus der nachstehenden Beschreibung.
Die Figuren 1 bis 3 zeigen den Einfluß der Zugabe der wasserlöslichen Substanzen auf den pH-Wert. Figur 4 zeigt schematisch die Beziehung der Auswertung unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Tests zur Bestimmung der Zahn— karies (JP-OS 1 589/75) und dem Reagenz der Erfindung.
Das Reagenz der Erfindung besteht im wesentlichen aus einem im Indikator-Farbstoff mit einem Farbumschlag-Bereich von 7,5 bis 5,0 in einer wäßrigen Lösung, die mindestens eine wasserlösliche Substanz enthält, die einen höheren osmotischen Druck erzeugen kann als den physiologischen Druck an der Zellmembran kariogener Bakterien, die jedoch keine Pufferwirkung entfaltet.
Der in der JP-OS 1 589/75 beschriebene Test besteht in der Auswertung einer Farbreaktion, die bei Änderung des pH-Werts auftritt, aufgrund der Säuren, die bei der Züchtung kariogener Bakterien gebildet werden. Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß die Azidität von Zahnbelag in unmittelbarer
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r ■ ι
Beziehung zur Zahnkaries steht. Dies bedeutet, daß es möglich ist, die Zahnkaries unmittelbar und ohne Züchtung kariogener Bakterien zu bestimmen, und zwar durch Zusatz von Zahnbelag zu einer wäßrigen Lösung, die einen Indikator-Farbstoff enthält. Aufgrund der vorhandenen Säuren im Zahnbelag erfolgt eine Änderung des pH-Wertes, die sich durch einen Farbumschlag zu erkennen gibt. Da im Zahnbelag die Säuren in sehr geringer Menge vorliegen,ändert sich der pH-Wert der wäßrigen Lösung nur in einem sehr engen Bereich, wie dies aus Figur 1 bis 3 hervorgeht. Es ist deshalb schwierig, eine genaue Farbreaktion zu erhalten und gleichzeitig den richtigen Indikator-Farbstoff auszuwählen. Um das Verfahren in der Praxis durchführen zu können, muß die zu bestimmende Menge an Säure erhöht werden, um den Bereich der Änderung des pH-Wertes zu verbreitern.
Es wurde festgestellt, daß in den Zellen kariogener Bakterien Säuren in ziemlich großer Menge vorliegen und daß diese Säuren durch Änderung des osmotischen Druckes aus den ZeI-len herausgelöst werden können. Mittels des Reagenz der Erfindung ist es möglich, die intrazellulären Säuren in kariogenen Bakterien zu eluieren. Deren Menge zusammen mit der Menge der Säuren im Zahnbelag, d.h. den extrazellulären Säuren, wird durch die Farbreaktion des Reagenz der Erfindung bestimmt. Auf diese Weise wird die Farbreaktion genauer.
Als Substanzen zur Erhöhung des osmotischen Druckes werden erfindungsgemäß wasserlösiche Substanzen verwendet, die einen höheren osmotischen Druck erzeugen, als den physiologischen Druck. Andererseits dürfen diese Substanzen keine Pufferwirkung entfalten, um die Farbreaktion nicht zu stören. Für diesen Zweck kommen die verschiedensten wasserlöslichen Substanzen in Betracht, doch sind bevorzugt Polyvinylalkohol, Polyäthylenglykol, Glycerin, Diglycerin und Saccharose. Außerdem können Stärke, Agar, Gelatine oder Carboxymethyl-
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cellulose verwendet werden. Diese Substanzen können entweder allein oder als Kombination von mindestens zwei Substanzen verwendet werden. Die optimale Konzentration der jeweils verwendeten wasserlöslichen Substanzen in der wäßrigen Lösung hängt von der Art der wasserlöslichen Substanz ab. Im Fall von Polyvinylalkohol liegt die Konzentration im Bereich von 0,1 bis 1 %, im Fall von Polyäthylenglykol im Bereich von 5 bis 5O %, im Fall von Glycerin im Bereich von 10 bis 50 %, im Fall von Diglycerin im Bereich von 5 bis 5O % und im Fall von Saccharose im Bereich von 5 bis 50 %. In den Figuren 1 bis 3 ist graphisch die Wirkung dargestellt, die durch Zusatz der wasserlöslichen Substanz zur Lösung erhalten wird. Figur 1 zeigt die Beziehung zwischen dem pH-Wert der Testlösung und der Zeit, wobei 5 χ 10 /ml Streptococcus mutans KIR in 2 ml der Testlösung
suspendiert worden sind. In Figur 2 wurden 5 χ 10 /ml Lactobacillus casei in der Testlösung suspendiert. In Figur 3 wurden 0,02 ml einer Suspension von Zahnbelag in physiologischer Kochsalzlösung der Testlösung einverleibt.
Es ist ersichtlich, daß der Bereich der Änderung des pH-Wertes im Falle einer reinen wäßrigen Lösung eng ist. Der pH-Wert ist beträchtlich niedriger als der Anfangswert bei Verwendung einer Testlösung der Erfindung, die eine wasserlösliche Substanz zur Erhöhung des osmotischen Druckes ent— hält. Diese Tendenz ist annähernd gleich bei Verwendung bakterieller Zellen (Figur 1 und 2) und bei Verwendung von Zahnbelag (Figur 3). Die Verwendung einer Substanz mit Pufferwirkung, wie Kaliumeitrat, gestattet keine Bestimmung der Zahnkaries, da der pH-Wert der Testlösung sich nicht mehr verändert.
Bei Verwendung der entsprechenden Indikator-Farbstoffe im Reagenz der Erfindung ist es möglich, die Zahnkaries genau und innerhalb kurzer Zeit durch eine Farbreaktion zu bestimmen. Hinsichtlich der zu verwendenden Indikator-Farbstoffe bestehen keine Einschränkungen, sofern sie bei einem
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pH-Wert im Bereich von 7,5 bis 5,0 einen gut erkennbaren Farbumschlag ergeben und sich bei der Lagerung nicht ändern. Typische Indikator-Farbstoffe sind Bromthymolblau, Methylrot, Chinablau und Alizarinblau. Diese Indikator-Farbstoffe können allein oder als Gemisch von mindestens zwei Farbstoffen verwendet werden. Das Reagenz der Erfindung kann zur Erhöhung der Haltbarkeit noch ein Antibiotikum, wie Chloramphenicol, oder ein Antiseptikum, wie Natriumazid, enthalten.
10
Nachstehend werden Rezepturen zur Herstellung von Reagentien der Erfindung gegeben.
(1) Polyäthylenglykol,
J5 mittleres Molekulargewicht 400 10 Gew>-%
Natriumazid 0,03 Gew.~%
Bromthymolblau 0,005 Gew.-%
destilliertes Wasser Rest
pH-Wert (eingestellt mit 0,1 η NaOH) 7,2 Beim pH-Wert 7,2 ist das Reagenz blau, bei pH 6,6 grün, bei pH 6,0 gelbstichiggrün und bei pH 5,4 gelb
(2) Polyvinylalkohol (P = 500) 0,16 Gew.-% Natriumazid 0,03 Gew.-%
Bromthymolblau 0,005 Gew.-%
Methylrot 0,003 Gew.-%
destilliertes Wasser Rest
pH-Wert (eingestellt mit 0,1 η NaOH) 7,2 Beim pH-Wert 7,2 ist das Reagenz blau, bei pH 6,6 gelbstichig grün,
bei pH 6,0 gelb und bei pH 5,4 rotstichig-orange.'
L · -I
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r — - : ■ ■ ·-
(3) Saccharose 10 Gew.-%
Chloramphenicol 0,0005 Gew.-%
Alizarinblau 0,003 Gew.-%
Chinablau 0,001 Gew.-%
destilliertes Wasser Rest
pH-Wert (eingestellt mit
0,1 η NaOHJ 7,2
Beim pH-Wert 7,2 ist das Reagenz grün,
bei pH 6,6 gelbstichig-grün, bei 10
pH 6,O hellgelb und bei pH 5,4 blau.
Die vorstehend aufgeführten Rezepturen für Reagentien der Erfindung sind lediglich beispielhaft gegeben. Entscheidend ist, daß die wäßrige Lösung mindestens eine wasserlösliche Substanz enthält, die den osmotischen Druck erhöhen kann, jedoch nicht bei der Farbreaktion teilnimmt und keine Pufferwirkung ausübt. Ferner muß die Lösung mindestens einen Indikator-Farbstoff enthalten, der bei einem pH-Wert im vorstehend angegebenen Bereich eine gut sichtbare Farbe zeigt.
Die Menge der verwendeten Zusätze läßt sich durch einfache Vorversuche bestimmen.
Es wurde bereits erwähnt, daß sich mit dem Reagenz der Erfindung die Zahnkaries durch eine Farbreaktion bestimmen läßt. Diese Farbreaktion wird durch Eluieren der intrazellulären Säuren kariogener Bakterien aufgrund des osmotischen Druckunterschiedes hervorgerufen, der durch die ·
verwendung einer wäßrigen Lösung erzeugt wird, die bestimmte wasserlösliche Substanzen enthält. Da Zahnbelag selbst erhebliche Mengen an Säuren zusätzlich zu den intrazellulären Säuren der kariogenen Bakterien enthält, kann der pH-Wert auch durch die extrazellulären Säuren etwas vermindert werden, selbst bei Verwendung von reinem Wasser. Dies ergibt sich aus den Figuren 1 bis 3. Es ist
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deshalb möglich, die Zahnkaries auch mittels einer Farbreaktion unter Verwendung der extrazellulären Säuren zu bestimmen, wenn lediglich reines Wasser verwendet wird. Dieses vereinfachte Reagenz ist noch praktischer bei Verwendung von Indikator-Farbstoffen, die ausreichend empfindlich sind, selbst bei geringer Änderung des pH-Wertes und bei Erhöhung der Menge an zugesetztem Zahnbelag deutliche Farben zu entwickeln. Bei Verwendung dieser vereinfachten Methode wird jedoch der pH-Wert der wäßrigen Lösung auf oberhalb 7 eingestellt,und es werden Indikator-Farbstoffe verwendet, die bestimmte Farben im pH-Bereich ■von 7,2 bis.5,8 ergeben. In diesem Fall-wird eine-starke-Änderung des pH-Werts durch geringe Mengen an Säurekomponenten hervorgerufen, oder die Menge an zuzusetzendem Zahnbelag wird erhöht. Nachstehend werden einige Ergebnisse klinischer Versuche mitgeteilt.
Zahnbelag von 50 Kindern wird mittels eines Wattebausches entnommen und in 1 ml der Testlösung (1) gegeben und homogen dispergiert. 30 Minuten später wird der pH-Wert bestimmt. Der Status der Zahnkaries wird aufgrund der Verfärbung der Lösung bestimmt; vgl. Tabelle I. Sodann werden diese Meßergebnisse mit dem tatsächlichen Zustand der Zahnkaries verglichen; vgl. Tabelle II. Die Befunde sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Tabelle I Farbreaktion und Auswertungskriterien
35
Farbe Auswertung
gelb
gelbstichig grün
grün
blau		 +++
++
+
13Ö(K2/05ä3
Tabelle II Bestimmung des Schweregrads der Zahnkaries
Bewertungszahl
Gesunde Zähne Cl. C2, C" C3, C4
Behandelte Zähne, C
O 1 2 0,5
Schweregrad der Zahnkaries =
Gesamte Bewertungszahl
2 χ Zahl der herausgekommenen Zähne
■x1OO
Tabelle III
Schweregrad der
Zahnkaries		 pH-Wert der
Testlösung		 Auswertung
1/3 6,0 ++
7,5 5,7 ++
5,0 6,0 ++
12,5 5,2 ++ +
2,5 6,1 +
15,0 5,4 ++ +
10,0 5,3 ++ +
7,5 5,9 ++
5,0 5,5 ++
5,0 6,0 + +
7,5 5,6 ++
11,3 5,2 ++ +
4,7 6,1 +
11,25 5,4 +++
16,3O 5,1 +++
(21 Personen)
O Ί
(14 Personen)		 7,2^.6,7 -
6,6·ν·6 ,1 +
130042/0533
P 30 48 705.9 u.Z.: P 945 Sankin Industry
TAUCHNBH
Co., Ltd.
- 11 -
Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß offensichtlich eine Beziehung zwischen dem Schweregrad der Zahnkaries bei der visuellen Untersuchung und den Ergebnissen der Auswertung sowie den pH-Werten bei Verwendung des Reagenz der Erfindung besteht. Somit ist es mit dem Reagenz der Erfindung -möglich, den Status der Zahnkaries mittels einer Farbreaktion und ohne visuelle Untersuchung der Zähne genau zu bestimmen.
Vergleichsversuche wurden an 60 Kindern durchgeführt, um eine mögliche Beziehung zwischen^ den Werten zu finden, die mit dem Reagenz der Erfindung bzw. dem in der JP-OS 1 589/75 beschriebenen Mittel erhalten wurden.
Die Werte mit dem bekannten Mittel der in Tabelle IV angegebenen Zusammensetzung und nach 48stündiger Bebrütung ...... werden verglichen mit den mit dem Reagenz der Erfindung erhaltenen Werte", um eine mögliche Beziehung zwischen den beiden Mitteln festzustellen. Der Vergleich wurde anhand des pH-Wertes der jeweiligen Lösungen durchgeführt, um eine genauere Beziehung beobachten zu können.
Tabelle IV Zusammensetzung des bekannten Mittels
Saccharose 20 Gew.-%
Tryptose 1,8 Gew.-%
Natr iumchlor id 0,6 Gew.-%
Natriumazid OrO3 Gew.-%
Bromkresolgrün 0,001 Gew.-% .
Bromkre solpurpur 0,002 Gew.-%
destilliertes Wasser Rest
Es wurden die in Figur 4 wiedergegebenen Beziehungen ermittelt. Bei Aufstellung einer Regressionsgleichung Y = 3,0143 + O,5972Xmit dem pH-Wert im Falle des bekannten Mittels (X) und dem pH-Wert im Falle des Reagenz der Erfindung (Y) aufgrund der in Figur 4 mitgeteilten Ergebnisse, wurde ein Regressionskoeffizient γ ~ 0,568 erhalten. Dies' bestätigt das Vorliegen einer bestimmten Beziehung. Die Analyse des vierten Grad-Kriteriums zur Auswertung mit dem bekannten Mittel durch Anwendung der Regressionsgleichung ergibt die in Tabelle V .mitgeteilten Ergebnisse.
Tabelle V Auswertungskriterien
Auswer
tung		 Bekanntes Mittel PH Farbe Reagenz der Erfindung Farbe
+++
++
+		 4,0
5,0
6,O
7,0		 gelb
gelbstichig grün
grün
blau		 PH gelb
gelbstichig grün
grün
blau
5,4
6,0
6,6
7,2
Aus.den Vergleichsversuchen ist ersichtlich, daß Zahnkaries mit dem Reagenz der Erfindung ebenso genau bestimmt werden kann wie mit dem bekannten Mittel, jedoch ohne Züchtung kariogener Bakterien.
130042/0593
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Claims (11)

VOSSlUS VOSSIUS -TAUCW NJcR J ^EU^N/HM ANN · RAUH SIEBERTSTRASSE 4--800O MÜNCHEN 86 · PHONE; (O8 9) 4-74O 75 CABLE! B ENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX S- 29 453 VOPAT D >■ 3 De u.Z.: P 945 (Vo/kä) Case: PF 2067 SANKIN INDUSTRY CO., LTD. OSAKA, JAPAN " Reagenz zum Nachweis von Zahnkaries " Patentansprüche 15
1. Reagenz zum Nachweis von Zahnkaries, bestehend aus einer wäßrigen Lösung mindestens einer wasserlöslichen Substanz, die an der Zellmembran der im Zahnbelag vorhandenen kariogenen Bakterien einen höheren osmotischen Druck erzeugen kann als der physiologische osraotische Druck, und die keine Pufferwirkung zeigt, sowie mindestens eines. Indikator-Farbstoffs mit einem Farbumschlag-Bereich von 7,5 bis 5,0.
2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserlösliche Substanz ein Polyvinylalkohol, ein Polyäthylenglykol, Glycerin, Diglycerin oder Saccharose ist.
3. Reagenz nach einem der Ansprüche' 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung den Polyvinylalkohol in einer Konzentration von 0,1 bis 1 % enthält.
4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung ein Polyäthylenglykol in einer Konzentration von 5 bis 50 % enthält.
L 130042/0593 orjginal inspected
5. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung Glycerin in einer Konzentration von 10 bis 50 % enthält.
6. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung Diglycerin in einer Konzentration von 5 bis 50 % enthält.
7. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung Saccharose in einer Konzentration von 5 bis 50 % enthält.
3. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator-Farbstoff Bromthymolblau, Methylrot, Chinablau oder Alizarinblau oder ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Farbstoffe ist.
9. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt an einem Antibiotikum und/oder einem Antiseptikum.
10. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator-Farbstoff einen Farbumschlag-Bereich von 7,2 bis 5,87 hat und der pH-Wert der wäßrigen Lösung auf einen Wert oberhalb 7 eingestellt ist.
11. Reagenz zum Nachweis von Zahnkaries, bestehend aus einer wäßrigen Lösung mindestens eines Indikator-Farbstoffs mit einem Farbumschlag-Bereich von 7,2 bis 5,87, wobei die Lösung auf einen pH-Wert von oberhalb 7 eingestellt ist.
L 1300A2/0SÖ3
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