DE2653821A1 - Stabile oxidase-reagenz-loesung - Google Patents

Stabile oxidase-reagenz-loesung

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DE2653821A1 DE19762653821 DE2653821A DE2653821A1 DE 2653821 A1 DE2653821 A1 DE 2653821A1 DE 19762653821 DE19762653821 DE 19762653821 DE 2653821 A DE2653821 A DE 2653821A DE 2653821 A1 DE2653821 A1 DE 2653821A1
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Description

"Stabile Oxidase-Reagenz-Lösung"
Priorität: 22. Dezember 1975, V.St.A.,-Nr. 643 "465
Die Erfindung betrifft eine wasserfreie Qxidase-Reagenz-Lösung, die sich insbesondere zum Nachweis von Kolonien von Neisseria, die Cytochrom-Qxidase bilden, eignet.
Die Verwendung von Oxidase-Reagenz-Lösungen zum Nachweis von Neisseria-Kolonien, wie Neisseria gonorrhoeae oder Neisseria meningitidis, ist bekannt. Das U.S. Public Health Service hat Richtlinien zur vorläufigen und endgültigen Identifizierung von N. gonorrhoeae aufgestellt. Bei der vorläufigen, präsumtiven Diagnose muß der auf einem selektiven Medium für N. gonorrhoeae gezüchtete Organismus als Oxidase-positiv identifiziert werden und die typische Kolonienmorphologie von gram-negativen Diplococcen aufweisen. Zur weiteren Bestätigung dieser Diagnose müssen
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Zucker-Eermentationstests und/oder Fluoreszenz-Antikörpertests durchgeführt werden.
!Nach einem Standard Laboratoriumsverfahren zum Nachweis von N. gonorrhoeae werden Proben mit einem sterilen Abstrichtupfer gewonnen. Die Seiten und die Spitze des Tupfers werden sodann auf einem selektiven Medium gewälzt. Ein typisches festes Nährmedium zur Züchtung von N. gonorrhoeae wird von J. E. Martin Jr. und A. Lester in HSMHS Health Reports, Bd. 86 (1971), Seiten 30 bis 33 t beschrieben. Das Medium wird 24- bis 48 Stunden inkubiert und dann auf Kolonienwachstum untersucht. Vermutliche N. gonorrhoeae-Kolonien werden sodann einem Qxidase-Test unterzogen, um festzustellen, ob Cytochrom-Oxidase gebildet worden' ist. Eine Öxidase-positive Reaktion läßt sich durch Bildung einer dunklen Purpurfärbung innerhalb 5 bis 30 Sekunden erkennen. Läßt sich bei einer sorgfältigen Untersuchung des Mediums kein Wachstum nachweisen, wird das Qxidase-Reagenz auf das gesamte Medium aufgebracht. Dies erleichtert das Erkennen von punktartigen Oxidasepositiven Kolonien, die leicht übersehen werden können. Das Wachstum von Qxidase-positiven Kolonien gibt einen zuverlässigen vorläufigen Hinweis auf Ii. gonorrhoeae. Zur endgültigen positiven Identifizierung werden unbehandelte Kolonien weiteren Laboruntersuchungen unterzogen, d.h. dem Zucker-Fermentationstest und dem Fluoreszenz-Antikörpertest.
Herkömmliche Oxidase-Reagenzien, die zum Nachweis von Neisseria-Kolonien verwendet werden, bestehen aus einer Iprozentigen wäßri-
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gen Lösung von K,N,F1 ,N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin-dihydrochlorid. Diese Lösung ist aber sehr unstabil. Sie weist in frischem Zustand unmittelbar nach der Herstellung eine hellblaue Färbung auf und verfärbt sich innerhalb von 2 oder 3 Tagen schwarz. Diese verfärbten Lösungen sind aufgrund des raschen Abbaus des Diaminsalzes zum Nachweis von Qxidase nicht mehr geeignet. Aus diesem Grund wird empfohlen, die herkömmlichen Eeagenzlösungen täglich herzustellen.
Aufgrund der großen Instabilität der herkömmlichen Qxidase-Reagenzien wird auch empfohlen, diese unter Stickstoffatmosphäre und in luftdicht verschlossenen Glasampullen aufzubewahren, wenn sie nicht unmittelbar verwendet werden. Die natürliche blaue Farbe des Reagenz, die beim Stehen dunkler wird, konkurriert mit der dunklen Purpurfärbung, die beim Aufbringen des Reagenz, auf Neisseria-Organismen entsteht. Dies stellt eine für das mit der Untersuchung befaßte Personal nur schwierig auszuschaltende Störungsquelle dar.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine farblose, stabile Oxidase-Reagenz-Lösung zum Nachweis von Mikroorganismenkolonien zur Verfügung zu stellen. Diese Lösung soll im Vergleich zu herkömmlichen Lösungen eine wesentlich längere Lagerbeständigkeit aufweisen.
Der Gegenstand der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
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Überraschenderweise wurde festgestellt, daß mit der erfindungsgemäßen Oxidase-Reagenz-Lösung die Stabilitätsprobleme von herkömmlichen Oxidase-Reagenzien überwunden werden können. Die erfindungsgemäße Qxidase-Reagenz-Lösung ist farblos und stabil. Beispielsweise bleibt sie bis zu 8 Wochen farblos und behält ihre Aktivität. Die Lösung kann in Tropfflaschen abgefüllt werden und muß nicht unter Stickstoffatmosphäre aufbewahrt werden.
Die stabile, wasserfreie Qxidase-Reagenz-Lösung der Erfindung ergibt im Vergleich zu herkömmlichen Reagenzien einen wesentlich besseren Kontrast zwischen den Kolonien und dem Medium. Die Verwendung einer farblosen Lösung als Ausgangsmaterial erleichtert die Erkennung und die richtige Zuordnung der Kolonien, die in Gegenwart der Reagenz-Lösung eine dunkle Purpurfarbe annimmt.
Die erfindungsgemäße stabile, wasserfreie Qxidase-Reagenz-Lösung enthält Tetramethyl- oder Dimethyl-p-phenylendiamin in Dimethylsulfoxid. Der Anteil des Phenylendiamins beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,0 Gewichtsprozent und vorzugsweise etwa 0,2 bis 0,5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Reagenz. Besonders bevorzugt ist ein Reagenz mit einem Gehalt an N,N,N1 ,N1-Tetramethyl-p-phenylendiamin.
Ferner können die vorgenannten Basen auch in Form von Salzen mit organischen und anorganischen Säuren, vorzugsweise in Form von pharmäkologisch verträglichen Salzen, vorliegen. Diese Salze
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. 6.
lassen sich leicht nach üblichen Verfahren herstellen. Beispielsweise wird die Base mit einer stöchiometrischen Menge einer organischen oder anorganischen Säure in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Aceton oder Äthanol umgesetzt, wobei das Salz durch Einengen oder Abkühlen isoliert wird. Es kann auch eine Säure in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Diäthyläther oder Chloroform,im Überschuß verwendet werden, wobei das gewünschte Salz direkt ausfällt. Salze mit organischen Säuren leiten sich beispielsweise von Maleinsäure, Fumarsäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Propionsäure, Weinsäure, Salicylsäure, Citronensäure, Stearinsäure und Palmitinsäure ab. Entsprechende Salze mit anorganischen Säuren leiten sich beispielsweise von Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoff säure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure ab. Diese Salze können auch nach dem üblichen Verfahren der doppelten Zersetzung von entsprechenden Salzen hergestellt v/erden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Bestandteile Menge
ΪΤ,Ν,ΪΤ1 ,N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin 0,300 g
Dimethylsulfoxid ad 100,000 ml
Die freie Base wird in Dimethyl sulf oxid zu einer klaren, farblosen Lösung gelöst.
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B ei s ρ i e 1 2
Bestandteile ■ -^. Menge
IT,N,Ή' , N' -Tetrametliyl-p-phenylendiamin'-dihydrochlorid 0,500 g Dimethylsulfoxid ad 100,000 ml
Das Dihydrochlorid wird in Dimethyl sulf oxid zu einer klaren, farblosen I/o sung gelöst. - .
B e" i s ρ i e 1 3
Bestandteile
N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin 1,0 g
Dimethyl sulf oxid ■ ' ad 100,0 ml
Die Base wird in Dimethylsulfoxid gelöst.
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Claims (5)

-Sf-
1. Stabile Qxidase-Reagenz-Lösung zum Nachweis von Mikroorganismenkolonien, enthaltend N,N,N1 ,N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin oder Ν,Ν-Dimethyl-p-phenylendiamin oder deren Salze mit Säuren in Dimethylsulfoxid.
2. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Diamin H,N,N1 ,N1-Tetramethyl-p-phenylendiamin enthält.
J. Lösung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 0,1 bis etwa 0,5 Irozent Diamin enthält.
4. Lösung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Diamin als Dihydrochlorid vorliegt.
5. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Diamin Ν,Π-Dimethyl-p-phenylendiamin enthält.
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ORIGINAL INSPECTED
DE2653821A 1975-12-22 1976-11-26 Stabile Oxidase-Reagenz-Lösung Expired DE2653821C2 (de)

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US05/643,465 US4017420A (en) 1975-12-22 1975-12-22 Stable oxidase reagent solutions

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DE2653821C2 DE2653821C2 (de) 1986-04-17

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JP (1) JPS5915636B2 (de)
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GB1565675A (en) 1980-04-23
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