DE2653821C2 - Stabile Oxidase-Reagenz-Lösung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine wasserfreie Oxidase-Reagenz-Lösung, die sich insbesondere zum Nachweis von Kolonien von Neisseria, die Cytochrom-Oxidase bilden, eignet.

Die Verwendung von Oxidase-Reagenz-Lösungen zum Nachweis von Neisseria-Kolonien, wie Neisseria gonorrhoeae oder Neisseria meningitidis, ist bekannt. Das U.S. Public Health Service hat Richtlinien zur vorläufigen und endgültigen Identifizierung von N. gonorrhoea ί aufgestellt. Bei der vorläufigen, präsumtiven Diagnose muß der auf einem selektiven Medium für N. gonorrhoeae gezüchtete Organismus als Oxidase-positiv identifiziert werden und die typische Kolonienmorphologie von gram-negativen Diplococcen aufweisen. Zur weiteren Bestätigung dieser Diagnose müssen Zukker-Fermentationstests und/oder Fluoreszenz-Antikörpertests durchgeführt werden.

Nach einem Standard Laboratoriumsverfahren zum Nachweis von N. gonorrhoeae werden Proben mit einem sterilen Abstrichtupfer gewonnen. Die Seiten und die Spitze des Tupfers werden sodann auf einem selektiven Medium gewälzt. Ein typisches festes Nährmedium zur Züchtung von N. gonorrhoeae wird von J. E. Martin Jr. und A. Lester in HSMHS Health Reports, Bd. 86 (1971), Seiten 30 bis 33, beschrieben. Das Medium wird 24 bis 48 Stunden inkubiert und dann auf Kolonienwachstum untersucht. Vermutliche N. gonorrhoeae-Kolonien werden sodann einem Oxidase-Test unterzogen, um festzustellen, ob Cytochrom-Oxidase gebildei worden ist Eine Oxidase-positive Reaktion läßt sich durch Bildung einer dunklen Purpurfärbung innerhalb 5 bis 30 Sekunden erkennen. Läßt sich bei einer sorgfältigen Untersuchung des Mediums kein Wachstum nachweisen, wird das Oxidase-Reagenz auf das gesamte Medium aufgebracht. Dies erleichtert das Erkennen von punktartigen Oxidase-positiven Kolonien, die leicht übersehen werden können. Das Wachstum von Oxidase-positiven Kolonien gibt einen zuverlässigen vorläufigen Hinweis auf N. gonorrhoeae. Zur endgültigen positiven Identifizierung werden unbehandelte Kolonien weiteren Laboruntersuchungen unterzogen, d. h. dem Zucker-Fermentationstest und dem Fluoreszenz-Antikörpertest.

Herkömmliche Oxidase-Reagenzien, die zum Nachweis von Neisseria-Kolonien verwendet werden, bestehen aus einer lprozentigen wäßrigen Lösung von N.RN'.N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin-dihydrochlorid. Diese Lösung ist aber sehr unstabil. Sie weist in frischem Zustand unmittelbar nach der Herstellung eine hellblaue Färbung auf und verfärbt sich innerhalb von 2 oder 3 Tagen schwarz. Diese verfärbten Lösungen sind aufgrund des raschen Abbaus des Diaminsalzes zum Nachweis von Oxidase nicht mehr geeignet. Aus diesem Grund wird empfohlen, die herkömmlichen Reagenzlösungen täglich herzustellen.

Aufgrund der großen Instabilität, der herkömmlichen Oxidase-Reagenzien wird auch empfohlen, diese unter Stickstoffatmosphäre und in luftdicht verschlossenen Glasampullen aufzubewahren, wenn sie nicht unmittelbar verwendet werden. Die natürliche blaue Farbe des Reagenz, die beim Stehen dunkler wird, konkurriert mit der dunklen Purpurfärbung, die beim Aufbr i.gen des Reagenz auf Neisseria-Organismen entsteht. Dies stellt eine für das mit der Untersuchung befaßte Personal nur schwierig auszuschaltende Störungsquelle dar.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine farblose, stabile Oxidase-Reagenz-Lösung zum Nachweis von Mikroorganismenkolonien zur Verfügung zu stellen. Diese Lösung soll im Vergleich zu herkömmlichen Lösungen eine wesentlich längere Lagerbeständigkeit aufweisen.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert Überraschenderweise wurde festgestellt, daß mit der erfindungsgemäßen Oxidase-Reagenz-Lösung die Stabilitätsprobleme von herkömmlichen Oxidase-Reagenzien überwunden werden können. Die erfindungsgemäße Oxidase-Reagenz-Lösung ist farblos und stabil. Beispielsweise bleibt sie bis zu 8 Wochen farblos und behält ihre Aktivität. Die Lösung kann in Tropfflaschen abgefüllt werden und muß nicht unter Stickstoffatmosphäre aufbewahrt werden.

Die stabile, wasserfreie Oxidase-Reagenz-Lösung der Erfindung ergibt im Vergleich zu herkömmlichen Reagenzien einen wesentlich besseren Kontrast zwischen den Kolonien und dem Medium. Die Verwendung einer farblosen Lösung als Ausgangsmaterial erleichtert die Erkennung und die richtige Zuordnung der Kolonien, die in Gegenwart der Reagenz-Lösung eine dunkle Purpurfarbe annimmt.

Die erfindungsgemäße stabile, wasserfreie Oxidase-Reagenz-Lösung enthält Tetramethyl- oder Dimethylp-phenylendiamin in Dimethylsulfoxid. Der Anteil des Phenylendiamins beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,0 Gewichtsprozent und vorzugsweise etwa 0,2 bis 0,5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Reagent. Besonders bevorzugt ist ein Reagenz mit einem Gehalt an N.N.W.N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin.

Ferner können die vorgenannten Basen auch in Form von Salzen mit organischen und anorganischen Säuren, vorzugsweise in Form von pharmakologisch verträglichen Salzen, vorliegen. Diese Salze lassen sich leicht nach üblichen Verfahren herstellen. Beispielsweise wird die Base mit einer stöchiometrischen Menge einer organischen oder anorganischen Säure in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Aceton oder Äthanol umgesetzt, wobei das Salz durch Einengen oder Abkühlen isoliert wird. Es kann auch eine Säure in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Diäthyläther oder Chloroform, im Überschuß verwendet werden, wobei das gewünschte Saiz direkt ausfällt. Salze mit organischen Säuren leiten sich beispielsweise von Maleinsäure, Fumarsäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Propionsäure, Weinsäure, Salicylsäure, Citronensäure. Stearinsäure und Palmitinsäure ab. EntSDre-

ti I 26 53 821 L* 3 4 vs ρ chende Salze mit anorganischen Säuren leiten sich bei- ?ΐ spielsweise von Chlorwasserstoffsäure, Bromwasser- ^ stoffsäure. Schwefelsäure, Phosphorsäure und Salpeter- 1? säure ab. Diese Salze können auch nach dem üblichen Π Verfahren der doppelten Zersetzung von entsprechen- 5 K den Salzen hergestellt werden. Ji Die Beispiele erläutern die Erfindung.	10
ff Beispiel 1	15
0 Bestandteile Menge
V Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyl- 0,300 g ο p-phenylendiamin C: Dimethylsulfoxid ad 100,000 ml	20
>;' Die freie Base wird in Dimethylsulfoxid zu einer kla- f.} ren, farblosen Lösung gelöst	25 30
;| Beispiel 2
i'i Bestandteile Menge	35
I Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyl- 0,500 g iSy; p-phenylendiamin-dihydrochlorid ξί; Dimethylsulfoxid ad 100,000 ml $■ ji· Das Dihydrochlorid wird in Dimethylsulfoxid zu einer ν klaren, farblosen Lösung gelöst. ji; oe is pi el 3
Ijj Bestandteile Menge	40
1I Λ Ν,Ν-Dimethyl-p-phenylendiamin 1,0 g g Dimethylsulfoxid ad 100,0 ml	45
te Die Base wird in Dimethylsulfoxid gelöst.	50
Υ:',	55
	60
	65

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Stabile Oxidase-Reagenz-Lösung zum Nachweis von Mikroorganismenkolonien, enthaltend Ν,Ν,Ν',Ν'-TetramethyI-p-phenyIendiamin oder Ν,Ν-Dimethyl-p-phenyIendiamin oder deren Salze mit Säuren in Dimethylsulfoxid.

2. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Diamin Ν,Ν,Ν',Ν'-TetramethyI-pphenyiendiamin enthält

3. Lösung nach Anspruch Z dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 0,1 bis etwa 0,5 Prozent Diamin enthält

4. Lösung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Diamin als Dihydrcchlorid vorliegt

5. Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Diamin Ν,Ν-Dimethyl-p-phenylendiamin enthält