DE2205733A1 - Stabiler indikator fuer teststreifen - Google Patents

Stabiler indikator fuer teststreifen

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Description

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH ' 1812"""
Stabiler Indikator für Teststreifen
Schon seit längerer Zeit wird Glucose in Körperflüssigkeiten durch eine enzymatische Nachweisreaktion quantitativ bestimmt, bei welcher Glucose mittels Glucose-oxidase und Luftsauerstoff zu Gluconsäure oxidiert wird. Das bei dieser Reaktion freiwerdende Wasserstoffperoxid reagiert mittels Peroxidase mit einem möglichst farblosen Chromogen. Die Extinktion des dabei entwickelten- Farbstoffs liefert ein Maß für die Menge der in der untersuchten Flüssigkeit vorhandenen Glucose. Da die im Reagenzglas und in der Küvette durchgeführten Reaktionen nur mittels teurer Geräte und durch ausgebildetes Personal ausgewertet werden können, sind in den letzten Jahren Teststreifen entwickelt worden, die die erforderlichen Reagenzien bereits in richtiger Dosierung enthalten und die Farbreaktion nach dem Befeuchten mit der zu untersuchenden Flüssigkeit unmittelbar auf dem Reagenzienträger entwickeln. Solche Teststreifen können aus einem saugfähigen Träger, wie z.B. Fließpapier, bestehen, es ist jedoch gemäß DOS 1.598.153 auch möglich, die Reagenzien in wasserfeste Filme einzuarbeiten. Diese Testfilme können abgewischt v/erden und eignen sich deshalb besonders zur Untersuchung trüber Flüssigkeiten, wie z.B. Blut.
In jüngster Zeit ist man dazu übergegangen, die an sich nur halbquantitative Auswertung der Teststreifen anhand von Farbtafeln dadurch zu verbessern, daß Teststreifen nach erfolgter Nachweisreaktion optisch ausgemessen werden. Hierfür sind relativ unkomplizierte Remissionsphotometer entwickelt worden, die eine quantitative Auswertung von.Testfilmen erlauben.
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Bei der Entwicklung von Testfilmen stellte es sich heraus, daß die Nachweisreaktionen relativ stark temperaturabhängig sind, so daß es kaum möglich war, ohne Berücksichtigung der Temperatur-Verhältnisse, reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Besonders störend macht sich dies im Remissionsphotometer bemerkbar, da der Meßlichtstrahl die Reaktionszone schnell stark erwärmt.
Als Chromogen wurde bisher für Testfilme ein Gemisch der Oxydationsindikatoren o-Tolidin und 3~Amino-9-äthylcarbazol eingesetzt. Dieses Gemisch hat sich aufgrund seines besonders günstigen Farbumschlags von rot nach grün bewährt, jedoch haftet ihm der beschriebene Nachteil einer starken Temperaturabhängigkeit an.
Bisher sind trotz intensiver Forschung überhaupt keine Indikatoren gefunden worden, die temperaturunabhängig reproduzierbare Farbwerte geliefert hätten. Vielmehr traten je nach Reaktionstemperatur und abhängig von der Temperatur, bei der die Teststreifen abgelesen wurden, Farbabweichungen auf, die die Ergebnisse zum Teil erheblich verfälschten. Bei Temperaturschwankungen, wie sie bei der Auswertung im Remissionsphotometer auftreten, waren Testfilme zur Bestimmung von Glucose im Blut^bisher aus den genannten Gründen unbrauchbar.
Es wurde nun gefunden, daß 9-(y-Aminopropyl)-3-amino-carbazol ein Indikator für den enzymatischen Glucosenachweis ist, der zusammen mit anderen Oxidationsindikatoren, insbesondere mit o-Tolidin, in weiten Grenzen temperaturunabhängxge und damit reproduzierbare Farbwerte je nach Glucosekonzentration liefert, über die Temperaturunabhängigkeit hinaus besitzt der erfindungsgemäße Indikator noch eine weitere wertvolle und überraschende Eigenschaft, die dessen Verwendbarkeit in Teststreifen erheb- v lieh erweitert. Es hat sich nämlich herausgestellt, daß der erfindungsgemäße Indikator durch störende Bestandteile des Urins nicht beeinflußt wird, so daß es nunmehr möglich ist, mittels Teststreifen quantitative Bestimmungen von Glucose im Harn durchzuführen. Die bisher bekannten Teststreifen, die
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äüf dem Prinzip der enzymatischen Glucosebestimmung nach der GlucöSS^oxidase/Peroxidäse-Methode basierten, enthielten als indikator meist o-Tolidin, und wurden von bestimmten häufig auflötenden bekannten Harnbestandteilen,wie z.B. Acetessigsäure Oder Ascorbinsäure", aber auch von vielen unbekannten im Harn anwesenden Stoffen erheblich gestört. Es war dadurch iwaf möglich, qualitative oder bestenfalls halbquantitative Auslagen ub&t die Glucosekonzentration zu machen, jedoch waren Visrlaäiliehe quantitative Auswertungen nicht möglich. Testpapier© zur Bestimmung von Glucose im Harn mit dem erfindungs- ■ gemäßen Indikator zeigen in den verschiedenartigsten Urinen (pH, Begleitstöffe, Eiweißgehalt etc.) mit gleichem Glucosegehölt stets die gleichen Reaktionsfarben. Dieser Befund war nicht vorhersehbar und führte zu einem Harndiagnostikum von hohem praktischem Wert.
Zur Herstellung temperaturunabhängiger Testfilme mischt man die Reagenzien,wie in der DOS 1.598.153 beschrieben, mit einer Kunststoff dispersion, wie z.B. mit Polyvinylacetatpropionat-Copolymeren (Propiofan 70 D) und setzt als Verdickungsmittel oder Quellstoff Natriumsalz der Alginsäure (Algipon) zu. Als weitere Zusätze haben sich anionenaktive Netzmittel, wie Nätriumnonyl-Sülfat, oder technische Gemische organischer Sulfonate (Texapon P) und Ammoniumperfluoroctanoat bewährt.
Als Puffer kommen im wesentlichen Phosphatpuffer mit einem pH-Bereich von 5-8, vorzugsweise von 5,5-7,0, bzw. Citratpuffer oder andere gebräuchliche Puffer, die den" genannten pH-=Bereich einstellen, infrage.
.Die nachfolgende Tabelle gibt eine Übersicht über mögliche Rezepturen, mittels welchen eine temperaturunabhängige Farbreaktion bei Glucose-Testfilmen erzielt werden kann:
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Tabelle I
Die angegebenen Mengen sind bezogen auf 100 g Beschichtungsmasse
Bestandteil untere Grenze obere Grenze bevorzugte 0,6 g
Menge 1,0 g
Kunststoffdispersion 20 g 80 9 40-50 3,5 g
Quellstoff 0,1 g 2,0 g 0,5 - ίο4 g
Netzmittel 0,1 g 2,0 g 0,5 - 104 U
Puffer 0,5 g 5,0 g 2,5 - 0,7 U
Glucoseoxidase 102 U 105 U 103 - 0,03 g
Peroxidase 102 U 105 U 103 - g
o-Tolidin 0,1 g . 1,0 g 0,2 -
Indikator I* 0,01 g 0,5 g 0,02-
* = 9- (/"-AminopropylJ-S-amino-carbazol
Die Testfilme werden wie folgt hergestellt: Zu der Kunststoffdispersion werden die übrigen Bestandteile gelöst in Wasser hinzugegeben mit Ausnahme des Indikators I und o-Tolidin, die in Methanol oder Aceton gelöst werden. Die Dispersion wird gut gemischt und in einer Schichtdicke von 100-500 ,u, vorzugsweise 300-400 ,u, auf eine nicht saugende Unterlage aufgetragen und im warmen Luftstrom getrocknet. Der Auftrag kann z.B. streifenweise auf eine steife Kunststoff-Folie erfolgen. Diese wird dann quergeschnitten, so daß rechteckige Kunststoff-Stäbchen entstehen, die am unteren Ende die reaktive Schicht enthalten.
Man kann aber auch ein wasserundurchlässig beschichtetes Papier oder eine dünne Folie flächig mit der Reagenzienmasse beschichten. Die so beschichtete Fläche wird in schmale Streifen geschnitten, diese werden an den unteren Rand von Folienbändern aufgesiegelt oder aufgeklebt, welche wie oben quergeschnitten werden. Die letztgenannte Methode besitzt den Vorteil der kürzeren Beschichtungszeit.
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Die so hergestellten Teststreifen können gemäß DOS 1.598.153
zum Nachweis von Glucose in Vollblut verwendet werden. Der Farbumschlag erfolgt hierbei von rot über olivfarben nach grün. Aufgrund der Temperaturunabhängigkeit ihrer Farben eignen sich die
Streifen besonders zur Auswertung im Remissionsphotometer, beispielsweise gemäß Patentanmeldung P 20 56 232.7.
Die Testpapiere zur Bestimmung der Harnglucose werden in Analogie zu bereits bekannten Streifen .(vgl. DOS 1.546.307) durch Tränken von saugfähigen Trägern, wie z.B. Fließpapier,mit den Reagenzien hergestellt.
Die folgende Tabelle II gibt einen Überblick über einige für
die Herstellung von Testpapieren geeigneten Rezepturen:
Tabelle II
Die angegebenen Mengen sind bezogen auf 100 ml Imprägnierlösung
Bestandteil untere Grenze bis obere Grenze U bevorzugte U
bis U Menge U
Glucoseoxidase 103 U 105 M 2-4 · 104 M
Peroxidase 102 U 105 g 3-5 · 103 g
Puffer 0,01 M 0,1 g 0,025-0,05 g
Netzmittel zu 2 g 0,1 - 0,2 g
Verdickungsmittel zu 5 0,1 - 0,5
Indikator I 0,5 g 10 5-7
Als Puffer kommen gebräuchliche Puffer wie Phosphat- oder Zitrat-Puffer infrage und zwar von pH 4,5-7, vorzugsweise 5-6.
Als Netzmittel sind sowohl nichtionogene (z.B. Polyoxyäthylensorbitan-monolaurat) als auch anionische Vertreter (z.B." Dioctylnatrium-sulfosuccinat, Natriumlaurylsulfat oder Ammoniumperfluor octanoat) brauchbar.
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Als Verdickungsmittel haben sich niedermolekulare Polyvinylpyrrolidone bewährt, aber auch Alginate, Gelatine und ähnliche Stoffe sind brauchbar.
Die Bestandteile werden in einem geeigneten Lösungsmittel, meist Wasser-Äthanol-Gemisch gelöst. Mit dieser Lösung wird Filterpapier imprägniert und getrocknet. Man kann aber auch die wasserlöslichen Bestandteile, wie Puffer, Enzyme, Netzmittel und Verdickungsmittel einerseits und den Indikatoren andererseits in zwei getrennten Arbeitsgängen aufbringen. Die imprägnierten Testpapiere können in schmale. Streifen geschnitten und zwischen zwei Kunststoff-Folien oder, zwischen einer Kunststoff-Folie und einem feinmaschigen Netzwerk eingesiegelt werden. Man taucht die Testpapiere kurz in den zu untersuchenden Urin und vergleicht nach einer gewissen Zeit mit einer Farbvergleichsskala. Bei niederen Glucosekonzentrationen v/ird nach 1/2 - 1 Minute, bei höheren nach 3-5 Minuten abgelesen. Man kann die Farbe aber auch wie bereits geschildert mit Remissionsphotometern oder einfachen Teststreifen-Photometern messen.
Die Genauigkeit der beschriebenen Testfilme und Testpapiere entspricht den für praktische und klinische Untersuchungen geforderten Maßstäben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist 9- (j^-AminopropyD-3-amino-carbazol der Formel I
(D,
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sowie dessen Salze mit organischen oder anorganischen Säuren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von 9-(y-Aminopropyl)-3-amino-carbazol oder von dessen Salzen als Indikator für enzymatische Nachweisreaktionen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Teststreifen oder Testfilme mit einem Gehalt an 9-(y-Aminopropyl)-3-amino-carbazol oder dessen Salzen.
Die Verbindung der Formel I ist neu und wird in an sich bekannter Weise dadurch hergestellt, daß man
1. eine Verbindung der allgemeinen Formel II
in welcher X ein Wasserstoffatom, eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe oder eine Nitrogruppe darstellt
a) mit Acrylnitril umsetzt, für den Fall, daß X ein Wasserstoffatom darstellt, nitriert und sowohl die Cyanogruppe als auch die gegebenenfalls vorhandene Nitrogruppe zum Amin reduziert und gegebenenfalls die Aminogruppe deacyliert oder
b) für den Fall, daß X eine Nitrogruppe darstellt, die N-H-acide Verbindung in ein Alkalisalz überführt und dieses mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III
Y - CH2 - CH2 - CH2 - N (HI) ,
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in welcher Y eine reaktive Estergruppe und R. und R übliche Schutzgruppen für die Aminofunktion darstellen. umsetztjUnd anschließend in beliebiger Reihenfolge die Nitrogruppe hydriert und die Schutzgruppen R, und R0 abspaltet, oder
2. eine Verbindung der allgemeinen Formel IV
in welcher Y die oben genannte Bedeutung hat und Z eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe darstellt,
mit Ammoniak umsetzt und gegebenenfalls anschließend Z deacyliert und die erhaltenen Verbindungen I gewünschtenfalls mit organischen oder anorganischen Säuren in Salze überführt.
Die in 3-Stellung des Carbazolsystems befindliche Aminogruppe kann mit aliphatischen oder aromatischen Resten acyliert sein. Bevorzugt sind Alkanoylreste mit 2 bis 6 C-Atomen, insbesondere der Acetylrest.
Die Umsetzung der Verbindungen der allgemeinen Formel II mit Acrylnitril erfolgt in Gegenwart eines basischen Katalysators, wie z.B. Benzyl-trimethy1-ammoniumhydroxid in einem inerten Lösungsmittel wie z.B. Benzol. Für den Fall, daß X ein Wasserstoff atom darstellt, wird in Eisessig mit Salpetersäure nitriert. Sowohl die in 3-Stellung befindliche Nitrogruppe, als auch die Nitrilgruppe wird dann katalytisch, beispielsweise mit Raney-Nickel, hydriert. Die Abspaltung einer eventuell vorhandenen Acylgruppe vom 3-Aminorest erfolgt am einfachsten durch Erhitzen in wässrigen Mineralsäuren. Mit Salzsäure erhält man auf diese Weise direkt das wegen seiner Haltbarkeit bevorzugte Dihydrochlorid.
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Als Alkalisalze von 3-Nitrocarbazol kommen praktisch nur das Natrium- oder Kaliumsalz infrage; es lassen sich aber auch starke quaternäre Ammoniumbasen verwenden. Die Salze bilden sich beim Lösen von 3-Nitrocarbazol in einer alkoholischen Lösung der eingesetzten Basen.
Reaktive Estergruppen Y sind vor allem die Halogenide, insbesondere die Chloride und Bromide; es lassen sich jedoch auch Alkylsulfonate, Tosylate, Brosylate und ähnliche reaktive Ester einsetzen.
Als Reste R, und R kommen an sich alle übüchen Aminoschutzgruppen, wie z.B. Acylgruppen insbesondere Acetylgruppen, sowie die bifunktionelle Phthaloylgruppe infrage, wobei im letzteren Fall die Abspaltung besonders einfach mit Hydrazin durchgeführt werden kann. Für den Fall, daß X eine Nitrogruppe darstellt, kann die Abspaltung der Phthaloylgruppe zusammen mit der Reduktion der Nitrogruppe im Eintopfverfahren durch Kochen mit Hydrazin und anschließende Zugabe von.Raney-Niekel in wässriger Lösung erfolgen. Acylgruppen können wie üblich mit verdünnten Mineralsäuren abgespalten werden.
Die Herstellung der Verbindungen IV kann z.B. durch Umsetzung von 3-Nitro-carbazol mit einem 1,3-Dihalogenpropan, wie z.B. l-Brom-3-chlorpropan und anschließende Hydrierung mit Raney-Nickel erfolgen; jedoch ist die Umsetzung nicht auf Halogenide beschränkt, sondern läßt sich beispielsweise auch mit 1-Chlorpropyl-äthylsulfonat-(3) und ähnlichen Verbindungen durchführen.
Die Umsetzung mit Ammoniak, die in wässriger Lösung in der Wärme erfolgt, führt zu den Verbindungen I, welche gegebenenfalls mit Mineralsäuren in einfache oder Doppelsalze überführt werden können.
Als Säuren kommen beispielsweise infrage: Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure, Borsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Milchsäure, Zitronensäux-e, Apfelsäure, Benzoesäure, Malonsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Buttersäure, Propionsäure*
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Die folgenden Beispiele sollen zur weiteren Erläuterung der Erfindung dienen.
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Beispiel Herstellung von 9-(Y-AminopropyD-S-aminocarbazol-dihydrochlorid
11,7 g 9-(ß-CyanoäthyD-S-nitrocarbazol werden in 50 ml Dioxan, 75 ml 5n methanolischem Ammoniak und 4,5 g Raney-Nickel 6 Stunden bei 110 und 65 Atmosphären im M-R-Autoklaven hydriert. Nach Absaugen des Katalysators und Einengen des Lösungsmittels erhält man 12 g braunes öl. Dieses wird in 50 ml Methanol gelöst und mehrmals heiß mit Kohle behandelt. Zu dem abgekühlten Filtrat tropft man unter Eiskühlung 35 ml 8,5n ätherische Salzsäure. Die gebildeten Kristalle werden abgesaugt und mit Äther gewaschen. Man erhält .11,6 g = 84,2 % gelblich-grünes Dihydrochlorid. Zur Reinigung wird dieses in 50 ml Wasser unter Erwärmen durch Zugabe von Kohle geklärt, abgesaugt und eingeengt. Nach nochmaligem Umkristallisieren aus Methanol und wenig Wasser erhält man 9,7 g 9-(Y-AminopropyD-S-aminocarbazol-dihydrochlorid /_— 70,2 % d. Th^ als farblose Kristalle; Schmp. 29O°C(zers.).
Das als Ausgangsprodukt verwendete 9-(ß-Cyanoäthyl)-3-nitrocarbazol wird wie folgt hergestellt:
Variante A:
66,8 g (0,4 Mol) Carbazol werden im 1000 ml Dreihalskolben mit Rührer, Kühler, Thermometer und Tropftrichter in einer Mischung von 100 ml (1,66 Mol) Acrylnitril und 250 ml Benzol suspendiert, unter Rühren auf 60 erwärmt und mit einigen Tropfen einer 40 %igen wässrigen Lösung von Benzyltrimethylammoniumhydroxid versetzt. Unter starkem Schäumen erwärmt sich das Reaktionsgemisch auf 78 . Es wird noch 45 Minuten bei dieser Temperatur weitergerührt, wobei das Carbazol vollständig in Lösung geht. Nach Abdampfen des Lösungsmittels und des überschüssigen Acrylnitrils wird das rohe 9-(ß-Cyanoäthylcarbazol) aus Aceton umgelöst. Man erhält 75,1 g = 85,3 % beige-farbene Kristalle, Schmp. 154° (Lit. 155-156 ). Die Substanz ist chromatographisch einheitlich.
/
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17,9 g (0,08 Mol) des so erhaltenen 9-(ß-Cyanäthyl)-carbazols werden in einem Dreihalskolben mit Rührer, Kühler, Thermometer und Tropftrichter in 108 ml Eisessig suspendiert und bei 80° eine Mischung aus 13,5 ml Eisessig und 6,75 ml 65 % Salpetersäure unter Rühren zugetropft, dabei geht.das Nitril in Lösung. Es wird noch 15 Minuten bei 80 nachgerührt, danach tropft man die erkaltete Lösung auf 200 ml Eiswasser. Man saugt die ausgefällte Nitroverbindung ab, wäscht mit wenig Wasser nach und kristallisiert das Rohprodukt aus Aceton um. Man erhält 17,2 g {= 79,9 % d.Th.) als gelbgrüne Kristalle, Fp. 225°.
Variante B:
In einem Dreihalskolben mit Rührer, Kühler und Thermometer werden im ölbad 21,2 g (0,1 Mol) 3-Nitrocarbazol in 250 ml Benzol suspendiert, mit 50 ml Acrylnitril versetzt, auf 50°C erwärmt und nach Zugabe von 2 Tropfen Benzyltrimethylammoniumhydroxid 2 Stunden unter Rühren bei 70°C umgesetzt. Nach Einengen des Reaktionsgemisches und Umkristallisieren des Rückstandes aus Aceton/Wasser, erhält man 22 g 9-(ß-CyanoäthylJ-S-nitrocarbazol, das direkt weiterverarbeitet werden kann.
Beispiel Testfilm zum Nachweis von Glucose im Blut
Polyvinylacetatpropionatdispersion (Propiofan 70 D) 45,Og
1,85 %ige Lösung von Natriumalginat in 0,5 m
Phosphatpuffer von pH 5,5 35,Og
Organische Natriumsulfonate (Texapon P) . 1,0 g
Glucoseoxidase (104 U/mg)) 0,114 g
Peroxidase (63,1 U/mg) j in l0 ml WaSSer gelÖSt 0,128 g
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o-Tolidin · ' · ] in 6 ml Methanol °'2 g
9-(y-Aminopropyl)-3-aminocarbazol( gelöst . . 0,026 g
Die Bestandteile werden gut gemischt, in einer Schichtdicke von 30OyU auf PVC-Folie ausgestrichen und 35 Minuten bei 60 C getrocknet. Auftropfen von glucosehaltigem Blut und Abwischen desselben nach 1 Minute liefert nach weiteren 2 Minuten folgende temperaturunabhängige Reaktionsfarben:
60 mg % Glucose - bräunlich-rot
120 mg % Glucose - oliv
180 mg % Glucose und mehr - grün mit wachsender Farbtiefe..
Fig. 1 zeigt bei 20°C und 30°C mit einem handelsüblichen Remissionsphotometer gemessene Eichkurven.
Ein Testfilm gleicher Zusammensetzung und Herstellung, der aber anstelle von 0,026 g Indikator I 0,04 g 9-(Äthyl)-3-aminocarbazol enthält, zeigt praktisch die gleichen Reaktionsfarben, die jedoch temperaturabhängig und daher nicht reproduzierbar sind.
Fig. 2 zeigt, daß sich die bei 20°C und 30°C erstellten Eichkurven erheblich unterscheiden.
Beispiel 3 Testfilm zum Nachweis von Glucose im Blut
Bestandteile
Polyvinylacetatpropionatdispersion (Propiofan 70 D) 45,0 g 1,85 %ige Lösung von Natriumalginat in 0,5 m
Phosphatpuffer vom pH 5,5 35,Og
Natriumnonylsulfat in 5,0 ml Wasser gelöst 0,75 g
Glucoseoxidase (62,7 U/mg)^ , _ , r, . ...... 0,189 g
3I in 10 ml Wasser gelöst
Peroxidase (68,8 U/mg) \ 0,235 g
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o-Tolidin in 2,5 ml Aceton gelöst 0,6 g
9-(y-AminopropyU-S-aminocarbazol-dihydrochlorid 0,026 g in 2,5 ml Wasser gelöst
Die Bestandteile werden gut gemischt, in einer Schichtdicke von 310 ,u auf polyvinylidenchloridbeschichtetes Papier ausgestrichen
ο
und 35 Minuten bei 60 getrocknet. Die Handhabung entspricht Beispiel 2. Die bei 200C und 300C mit einem Remissionsphotometer gemessenen Eichkuryen weisen keine ins Gewicht fallende Abweichungen auf.
Reaktionsfarben:
60 mg % Glucose - rosaocker
120 mg % Glucose - oliv
180 mg % Glucose und mehr - blaugrün mit wachsender Farbtiefe.
Bei einer Untersuchung des Blutes von 53 diabetischen Patienten, bei der die Reaktionsfarben mit einem Teststreifen-Photometer ausgemessen wurden, ergab sich im Vergleich zur Glucose-Bestimmung mit der Hexokinase-Methode ein Korrelationskoeffizient von 0,9857. Die Standard-Abweichung (2s) betrug +' 15 mg % Glucose Praktisch gleiche Ergebnisse (r = 0,982; 2s = + 17 mg) wurden mit einem Testfilm aus folgenden Bestandteilen erhalten:
Polyvinylacetatpropionat-Dispersion (Propiofan 70 D) 4 5,Og 1,85 %ige Lösung von Natriumalginat in 0,5 m
Phosphatpuffer von pH 6,5
Ammonium-perfluoractanoat (Fluorad FC 126) in 10 ml Wasser gelöst
Glucoseoxidase (62,4 U/mg)")
_ . , /-ΙΛΛ tw \ \ in 1° ml Wasser gelöst Peroxxdase (100 U/mg) J *
Colanylgelb HR
°-Tolidin 7 in 20 ml Methanol
9-(Y-Aminopropyl)-3-aminocarbazol-\ gelöst
dihydrochlorid J 0,025 g
35, 0 g g
1/ 0 g g
0, 19 g
O, 16 g
o, 02
P, 4
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Beispiel Testpapier zum Nachweis von Glucose im Harn
Filterpapier Schleicher & Schüll 597 NF wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und bei 50 C getrocknet.
1 m Citratpuffer pH 5 ■ 50,0 ml
Polyvinylpyrrolidon (mittl. MG 12000) ' 0,1 g
Polyvinylpyrrolidon (mittl. MG 40000) 0,1 g
9-(Y-Aminopropyl)-3-aminocarbazol-dihydrochlorid 3,12 g
Glucoseoxidase (104 U/mg) 0,3 g
Peroxidase (63 U/mg) 0,06 g
Wasser ad 100,0 ml
Das Testpapier reagiert mit glucosehaltigem Urin mit rosa- bis violettbraunen Farbtönen. Urine verschiedener Herkunft sowie acetoacethaltige Urine der gleichen Glucosekonzentration zeigen im Farbton keine ins Gewicht fallende Abweichung. Ein Testpapier gleicher Zusammensetzung, welches anstelle von Indikator I 3,0 g o-Tolidin enthält, reagiert mit diesen Urinen mit stark unterschiedlichen Farbtönen. Störungsfreie Reaktionen erhält man auch mit einem Testpapier, welches wie folgt hergestellt wurde: Filterpapier Schleicher & Schüll 2312 "wird mit einer Lösung von 6,25 g 9-(y-AminopropyD-S-aminocarbazol-dihydrochlorid in 100 ml Wasser imprägniert und bei 50 C getrocknet. Das so vorbehandelte Papier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung nachimprägniert:
Glucoseoxidase (104 U/mg) 0,39 g
Peroxidase (63 U/mg) 0,06 g
Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat (Tween 20) 0,2 g
0,25 m Phosphatpuffer pH 5,0 ad 100,0 ml
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Claims (4)

Patentansprüche
1. 9- (r-AminopropyD-3-amino-carbazol der Formel I
sowie dessen Salze mit organischen oder anorganischen Säuren.
2.Verwendung von 9~(γ-Aminopropyl)-3-amino-carbazol oder von dessen Salzen aIb Indikator für enzymatisch^ Nachweisreaktionon.
3.Teststreifen oder Testfilme mit einem Gehalt an 9-(Y^Aminopropyl)· 3-amino-carbazol oder dessen Salzen.
4. Verfahren zur Herstellung von 9- (f-Aminopropyl)-3-amino-carbazol und von dessen Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise
1. eine Verbindung" der allgemeinen Formel II
in welcher X ein Wasserstoffatom, eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe. oder eine Nitrogruppe darstellt
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a) rait Acrylnitril umsetzt, für den Fall, daß X ein Wasserstoffatom darstellt, nitriert und sowohl die Cyanogruppe als auch die gegebenenfalls vorhandene Nitrogruppe zum Amin reduziert und gegebenenfalls die Aminogruppe deacyliert oder
b) für den Fall, daß X eine Nitrogruppe darstellt, die N-II-acide Verbindung in ein Alkalisalz überführt und dieses mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III
Y - CH0 - CHn -
(III) ,
in welcher Y eine reaktive Estergruppe und R, vmd R„ übliche Schutzgruppen für die Aminefunktion darstellen^ umsetz^und anschließend in beliebiger Reihenfolge die Nitrogruppe hydriert und die Schutzgruppen R. und R7 abspaltet, oder
2. eine Verbindung der allgemeinen Formel IV
(CH2) 3-Y
in welcher Y die oben genannte Bedeutung hat und Z eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe dairs teilt,
mit Ammoniak umsetzt und gegebenenfalls anschließend Z deacyliert und die erhaltenen Verbindungen I gewünschtenfalls mit organischen oder anorganischen Säuren in Salze überführt.
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