CH640003A5

CH640003A5 - Verfahren zur bestimmung von alpha-amylase.

Info

Publication number: CH640003A5
Application number: CH246879A
Authority: CH
Inventors: Sigmar Dr Klose; Hans-Georg Dr Batz; Michael Dr Stoltz; Alexander Dr Hagen; Guenter Dr Weimann
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1978-03-20
Filing date: 1979-03-15
Publication date: 1983-12-15
Also published as: FR2420759A1; JPS5587A; GB2017908B; JPS5730000B2; DE2812154A1; DE2812154B2; GB2017908A; FR2420759B1; SE7902238L; US4268628A; IT7921092A0; ATA113179A; BE874944A; DE2812154C3; NL7901699A; ES478624A1; AT363612B; SE436759B; IT1166710B

Description

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Nachweismethoden zu beseitigen und ein Verfahren zur Bestimmung von a-Amylase zu schaffen, welches sich auch für die Anwendung auf Analysenautomaten mit mehreren getrennten Lösungskreisläufen eignet.

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Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein Verfahren zur Bestimmung von a-Amalyse unter Verwendung einer oligomeren oder polymeren Stärke als Substrat, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Stärke verwendet, welche einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Sub- 5 stituenten trägt, die bei der Substratspaltung gebildeten niedermolekularen löslichen Spaltprodukte aus der stärkehaltigen Phase abtrennt, mit einer weiteren Farbstoffbildungskomponente kuppelt und den so gebildeten Farbstoff misst.

Wesentliches Merkmal der Erfindung ist die Verwendung ,0 einer Stärke, welche nicht mit einem Farbstoff, sondern nur mit einer zur Farbstoffbildung befähigten niedermolekularen Verbindung substituiert ist. Es ist dabei nicht erforderlich,

eine vernetzte unlösliche Stärke einzusetzen, vielmehr lässt sich sowohl lösliche als auch unlösliche Stärke verwenden. 15

Die Derivatisierung muss derart sein, dass bei der Spaltung durch die a-Amalyse ein Bruchstück abgespalten wird, welches mit einer weiteren Farbstoffbildungskomponente unter Farbstoffbildung reagieren kann. Da die Stärke keinen umfangreichen Farbstoffrest trägt, wird auch der Angriff der 20 a-Amalyse nicht gehindert, so dass ein sehr hoher Substitutionsgrad gewählt werden kann. Dies hat zur Folge, dass der grösste Teil der entstehenden Spaltprodukte einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten trägt und die Bestimmung daher einen hohen Empfindlichkeitsgrad 25 aufweist. Vorzugsweise wird daher eine Stärke verwendet,

welche auf je 6 bis 30 Glucoseeinheiten einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten aufweist. Es ist jedoch möglich, auch Stärken mit noch höherem Substitutionsgrad einzusetzen. Andererseits kann es unter gewissen 30 Umständen auch ausreichen, wenn ein kupplungsfähiger Substituent auf mehr als 30 Glucoseeinheiten kommt, falls hohe Empfindlichkeit nicht gefordert wird. Für die Anwendung auf Analysenautomaten hat sich eine Stärke besonders bewährt, welche auf je 15 bis 25 Glucoseeinheiten einen 35 kupplungsfähigen Substituenten trägt.

Prinzipiell lässt sich jede zur Farbstoffbildung geeignete Komponente als Substituent der Stärke verwenden, welche nicht hochmolekular ist, lösliche Spaltprodukte bei Einwirkung der a-Amalyse ergibt und sich zu einem gut messbaren 40 Farbstoff umsetzen lässt. Bevorzugt werden solche Substituenten, welche klein genug sind, um das abgespaltene Bruchstück, das bei der Substratspaltung gebildet wird, dialysierbar zu halten. Geeignete Farbstoffbildungskomponenten sind dem Fachmann bekannt, desgleichen die zur Farbstoffbil- 45 dung führenden Reaktionen und Kupplungskomponenten. Der Substituent darf jedoch keine die enzymatische Aktivität der a-Amalyse beeinträchtigende Funktion enthalten.

Als besonders geeignet erwiesen sich im Rahmen der Erfindung Stärken, welche mit einer Verbindung der Formel I 50

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substituiert sind, in der R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Rest -(CH2)n-X, X eine zur Bildung einer covalenten Bindung mit einer OH-Gruppe der Stärke geeignete Funktion und n die Zahl 1,2,3 oder 4 Bedeuten.

Eine andere bevorzugte Gruppe von Stärken ist substituiert mit Gruppen der Formel II

in der R! ein Wasserstoffatom oder eine abspaltbare Schutzgruppe, wie z.B. eine Acylgruppe, und X und n die bei Formel I angegebenen Bedeutungen aufweisen.

Eine weitere bevorzugte Gruppe von Stärken entspricht der Formel III

X

<-Q

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t>5

x-(CH2)n

(II)

in der X] = N bzw. N-N

II

N

Als zur Bildung einer covalenten Bindung mit einer OH-Gruppe der Stärke geeignete Funktion haben sich besonders bewährt Oxirangruppen, Halogenatome, Säurechloridgruppen, Isocyaiiatgruppen, Isothiocyanatgruppen, Tosylatgrup-pen, Dichlortriazingruppen oder Mesilatgruppen. Diese Aufzählung ist jedoch nicht erschöpfend und zahlreiche weitere, mit einer OH-Gruppe der Stärke reaktionsfähige Gruppen sind dem Fachmann bekannt.

■. Die mit den Substituenten der Formel I und II unter Farbstoffbildung kupplungsfähige weitere Komponente ist vorzugsweise eine Diazoniumsalz oder eine zur oxidativen Kupplung mit Phenolen oder Anilinen geeignete Verbindung. Besonders geeignet innerhalb dieser bevorzugten Gruppe sind N-Alkylpyridon-(4-)hydrazone, N-Methyl-benzthiazo-lon-hydrazon, Aminodimethylanilin oder l-Phenyl-2,3-dime-thyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on (4-Aminophenazon).

Zur oxidativen Kupplung eignen sich vor allem FeCl3, Kaliumferricyanid, Kupfersulfat, Silbernitrat, Natriumhypochlorit, Bleidioxid, Ce(S04)2, H202 oder allgemein H202 bildende Reaktionssysteme.

Eine bevorzugte Verbindung der Formel I ist N-Methyl-N-l-(2,3-epoxy)-propylanilin. Bei der oxidativen Kupplung mit N-Methylbenzthiazolon-hydrazon (MBTH) entsteht ein Farbstoff mit einem sehr hohen Extinktionsmaximum bei den Wellenlängen 570 bis 600 m|i, der für die Messung besonders gut geeignet ist.

Die Abtrennung der bei der Substratspaltung gebildeten niedermolekularen löslichen Spaltprodukte kann beispielsweise durch Dialyse, Filtration oder Zentrifugation erfolgen. Diese Methoden eignen sich besonders bei Verwendung einer unlöslichen Stärke. Bei Verwendung von löslichen Stärken hingegen wird besonders die Dialyse oder Ultrafiltration zur Abtrennung eingesetzt. Vorzugsweise trennt man bei löslichen Stärken die niedermolekularen Spaltprodukte durch Dialyse ab, indem man aus einem ersten kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom einen prozentualen Anteil der Spaltprodukte in einen zweiten Flüssigkeitsstrom ausdialysiert, der auf der anderen Seite der Dialysemembran entlanggeführt wird. Als Dialysemembran verwendet man hierzu zweckmässig eine solche mit hoher Durchlässigkeit sowohl bezüglich der Qualität als auch der Molekülgrösse.

Wie oben bereits erwähnt, eignet sich das erfindungsge-mässe Verfahren gut zur Anwendung auf üblichen Analysenautomaten, insbesondere auch auf solchen, bei denen mehrere getrennte Lösungskreisläufe vorliegen, die miteinander durch eine Dialysemembran in Verbindung stehen. Dann enthält der Primärkreislauf die lösliche oder unlösliche Stärke. Das niedermolekulare lösliche Spaltprodukt mit dem zur Farbstoffbildung befähigten Substituenten, tritt durch die Dialysemembran in den Sekundärkreislauf über und wird dort zum Farbstoff umgesetzt und letzterer gemessen. Die Messung des Farbstoffs erfolgt üblicherweise unter Verwendung eines Photometers, welches im sichtbaren Bereich oder gegebenenfalls auch im UV misst.

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Die erfindungsgemäss verwendete Stärke wird im allgemeinen in Mengen zwischen 0,05 und 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 2 Gew.-%, eingesetzt. Die Einwirkung der a-Amylase erfolgt in der Regel bei pH-Werten zwischen 5,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5. Zur Aktivierung der Amylase werden zweckmässig Chloridionen, z.B. NaCl oder KCl, in Mengen zwischen 0,01 und 12%, vorzugsweise 0,05 und 5%, zugesetzt. Die Inkubinationszeit hängt ab von der Temperatur und dem Substitutionsgrad der verwendeten Stärke. Bei einer Inkubinationstemperatur von 45 °C reichen im allgemeinen Inkubinationszeiten zwischen 3 und 12 Minuten aus.

Ein zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens verwendbares Reagens zur Bestimmung der a-Amylase enthält als wesentlichen Bestandteil eine Stärke, welche einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten trägt.

Bevorzugt enthält das Reagens eine Stärke der Formel IV

S-Y-(CH ) —

2 n in der R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder den Rest-(CH2)n-Y-S, Y den Rest einer mit OH-Gruppen reaktiven Funktion, S die Stärke und n die Zahl 1,2,3 oder 4 bedeuten.

Weiter wird bevorzugt eine Stärke der Formel V

S-Y-(CH0) z n verwendet, in der Ri ein Wasserstoffatom oder eine abspaltbare Schutzgruppe, wie z.B. eine Acylgruppe, und S, Y und n die zu Formel IV angegebenen Bedeutungen aufweisen.

Vorzugsweise enthält das Reagens getrennt von der Stärke eine Farbstoffbildungskomponente, die mit dem Substituenten der Stärke unter Farbstoffbildung reagieren kann. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Diazoniumsalz oder um eine zur oxidativen Kupplung mit Phenolen oder Anilinen geeignete Verbindung, zusammen mit einem Oxidationsmittel. Zur oxidativen Kupplung geeignete Verbindungen sind insbesondere N-Alkylpyridon-(4)-hydrazone N-Methylbenzthiazo-lonhydrazon, Aminodimethylanilin oder 4-Aminophenazon.

Ferner enthält das Reagens zweckmässig noch Puffersubstanz und Chloridionen.

Das Reagens kann auch auf einem saugfähigen Träger imprägniert vorliegen, welches blattförmig oder stäbchenförmig sein kann. Bei derartigen Teststreifen ist es auch möglich, die modifizierte Stärke covalent mit dem Trägermaterial, beispielsweise Filterpapier zu verbinden. Eine derartige Verbindung ist mit OH-Reagentien, wie den oben erwähnten, möglich, beispielsweise mittels Epichlorhydrin.

Die Teststreifen können in die zu untersuchende Lösung eingetaucht und nach einer bestimmten Reaktionszeit wieder entnommen werden. Anschliessend kann die Farbkupplungs-reaktion entweder in der Lösung, die die derivatisierten Bruchstücke enthält, vorgenommen werden, oder auf dem Teststreifen selbst, wobei in diesem Fall die Kupplung mit den nicht abgespaltenen farbstoffbildenden Substituenten erfolgt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

A. Herstellung der derivatisierten Stärke

100 g Zulkowski-Stärke (K.Kulkowski, Ber. 13 [1880] 1395) werden in einer Lösung von 600ml und 20g NaOH gelöst. Hierzu werden 10ml N-Methyl-N-l-(2,3-epoxy)-propylanilin (hergestellt nach J. Chem. Soc. (1950), 890 ff.) gegeben. Die entstehende Emulsion wird 5 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird anschliessend durch Eintropfen in die 4fache Menge Methanol ausgefällt, abgesaugt und getrocknet.

Ausbeute 95%, Stickstoffgehalt 0,46% (entspricht einer Anilingruppe je 18 Glucoseeinheiten).

B. Oxidative Kupplung mit MBTH

Eine 0,5%ige wässrige Lösung der nach A. mit Epoxypro-pyl-N-methylanilin derivatisierten Zulkowski-Stärke in 0,1 mol/1 Phosphatpuffer, pH 7,0 mit 5% NaCl wird mit Hilfe einer Schlauchpumpe über einen Schlauch mit einem Fliessvolumen von 1,0 ml/min angesaugt. Nach Luftsegmentierung dieses Flüssigkeitsstroms wird mit einem Fliessvolumen von 0,1 ml/min die Serumprobe mit a-Amylase zudosiert. Dieser luftsegmentierte Flüssigkeitsstrom wird nach einer Inkubinationszeit von 7 Minuten bei 45 °C oberhalb einer Dialysemembran entlanggeleitet. Die durch die a-Amylase abgespaltenen Anilin-Stärke-Bruchstücke dialysieren zu einem über den jeweiligen Bereich gleichbleibenden Prozentsatz. Auf der Gegenseite der Dialysemembran strömt netzmittelhaltiges Wasser (Brij®-35) mit einem Fliessvolumen von 1 ml/min entlang. Zu diesem ebenfalls luftsegmentierten, durch das Dialy-sat angereicherten Flüssigkeitsstrom wird eine 0,5%ige wässrige Lösung von Methylbenzthiazolonhydrazon (MBTH) mit 0,1 ml/min zudosiert und nach Mischen in einer Mischschlange wird eine l%ige wässrige Lösung von K3[Fe(CN)6] mit 0,23 ml/min zugegeben. Die Extinktion des entstehenden violetten Farbstoffs wird in einer Durchflussküvette im Photometer bei 560 nm gemessen und durch einen Schreiber aufgezeichnet. Durch Vergleich mit der Extinktion einer Probe mit bekannter Konzentration an a-Amylase wird die a-Amylasekonzentration in der unbekannten Probe ermittelt.

Beispiel 2

A. Kupplung von Anilin über Schiffsche Base an oxidierte Stärke

Zu einer Lösung von 100 g Zulkowski-Stärke in 1,3 1 Wasser werden 6,6 g Natriumperjodat gegeben. Der Ansatz wird über Nacht gerührt, dann wird die oxidierte Stärkelösung durch Eintropfen in 41 Methanol ausgefällt.

50 g der oxidierten Stärke werden in 600ml Wasser gelöst, dann werden 350ml 15%ige Essigsäure zugegeben. Zu dieser Lösung werden langsam unter Rühren 50 ml Anilin getropft. Nach 20 Stunden Reaktionszeit wird das Produkt durch Eintropfen in die 3fache Menge Methanol gefällt, abgesaugt, mit Äther gewaschen und getrocknet.

B. Oxidative Kupplung mit 4-Aminophenazon

Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch unter Verwendung der durch Oxidation und Kupplung mit Anilin erhaltenen Stärke von A. Anstelle von MBTH wird 4-Aminophenazon eingesetzt, als Oxidationsmittel dient FeCl3. Die Auswertung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3

A. Herstellung des Derivats

100 g unlösliche Stärke werden in einer Lösung von 150 ml Wasser und 20 g NaOH suspendiert. Dann werden 10 ml Ortho-2,3-epoxyprophylphenol (hergestellt gemäss J.Org. Chem. 24 [1959] 1197) zugegeben und die erhaltene Mischung wird 5 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

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B. Oxidative Kupplung mit 4-Aminophenazon

Zu einer Suspension von 10 mg des nach A. hergestellten Substrats in 10ml Phosphatpuffer (20 mMol/1), pH 7,0 unter Zusatz von 50 mMol/1 NaCl werden 0,1 ml die a-Amylase enthaltende Probe gegeben. Es wird 15 Minuten bei 30 °C inkubiert. Anschliessend wird der nicht in Lösung gegangene Anteil des Substrats abzentrifugiert. Zum Überstand werden 0,1 ml einer 0,5%igen wässrigen Lösung von 4-Aminophenazon sowie 0,1 ml einer l%igen Lösung von K3[Fe(CN)6] gegeben. Die Extinktion des entstandenen Farbstoffs wird bei 578 nm gemessen.

Beispiel 4

POD-katalysierte oxidative Kupplung

Eine 2%ige wässrige Lösung der mit Epoxypropyl-N-methylanilin derivatisierter Zulkowski-Stärke von Beispiel 1 in 0,1 mol/1 Phosphatpuffer, pH 7,0, mit 0,06% NaCl und 2 U Glucoseoxidase (GOD)/ml wird mit Hilfe einer Schlauchpumpe über einen Schlauch mit einem Fliessvolumen von 0,8 ml/min angesaugt. Nach Luftsegmentierung dieses Flüssigkeitsstromes wird mit einem Fliessvolumen von 0,1 ml/min die Urinprobe zudosiert, weiterhin eine wässrige Glucoselö-sung mit einer Konzentration von 200 mg/100 ml mit 0,1 ml/ min. Dieser Flüssigkeitsstrom wird nach einer Inkubinations-zeit von 7 Minuten bei 45 °C oberhalb einer Dialysemembran entlanggeleitet. Die durch die a-Amylase abgespaltenen Ani-lin-Stärke-Bruchstücke und das durch die GOD-Reaktion entstandene H202 wandern durch die Membran, auf deren anderer Seite strömt netzmittelhaltiges Wasser mit einem Fliessvolumen von 0,6 ml/min. Zu diesem ebenfalls luftseg-mentierten, durch das Dialysat angereicherten Flüssigkeitsstrom wird eine 0,05%ige wässrige Lösung von MBTH und 5 U Peroxidase (POD)/ml in 0,1 mol/1 Citronensäure/Citrat-Puffer, pH 4,0 mit 0,42 ml/min zugegeben. Nach Mischen in einer Mischschlange wird der Flüssigkeitsstrom durch eine 5 Durchflussküvette in einem Photometer geleitet. Die Extinktion des entstandenen Farbstoffs wird bei 560 nm gemessen und über einen Schreiber aufgezeichnet. Durch Vergleich mit der Extinktion einer Probe mit bekannter Konzentration an a-Amylase wird die a-Amylasekonzentration in der unbe-10 kannten Probe ermittelt.

Beispiel 5

Diazokupplung mit Echtrotsalz

Es wird die Versuchsanordnung von Beispiel 1 verwendet. 15 Im Sekundärkreislauf wird jedoch mit einem Fliessvolumen von 0,6 ml/min netzmittelhaltigem Wasser aufgenommen. Anstelle von MBTH wird eine 0,6%ige Lösung von Echtrotsalz in 0,025 N H2S04 mit einem Fliessvolumen von 0,4 ml/ min zugegeben.

20 Die Messung der Extinktion erfolgt bei 505 nm.

Herstellung eines Teststreifens

Filterpapier wird in Streifenform geschnitten und in eine Lösung von Epichlorhydrin in Aceton eingetaucht. Nach 1 25 Stunde werden die Streifen entnommen und mit einer nach Beispiel 1 A. hergestellten derivatisierten Stärke beschichtet. Das beschichtete modifizierte Filterpapier wird mit erwärmter 2n NaOH behandelt. Hierbei erfolgt eine covalente Verknüpfung zwischen Papier und Stärke. Der so erhaltene Strei-30 fen wird noch mit Wasser gewaschen und getrocknet.

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Claims

640 003 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Bestimmung von a-Amylase unter Verwendung einer oligomeren oder polymeren Stärke als Substrat, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Stärke verwendet, welche einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten trägt, die bei der Substratspaltung gebildeten niedermolekularen löslichen Spaltprodukte aus der stärkehaltigen Phase abtrennt, mit einer weiteren Farbstoffbildungskomponente kuppelt und den so gebildeten Farbstoff misst.

2. n substituiert ist, in der R ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Rest X—(CH2)n—, X eine zur Bildung einer covalenten Bindung mit einer OH-Gruppe der Stärke geeignete Funktion und n die Zahl 1,2,3 oder 4 bedeuten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Stärke verwendet, welche einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten auf je 6 bis 30 Glucoseeinheiten aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Stärke verwendet, welche einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten auf je 15 bis 25 Glucoseeinheiten trägt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Stärke verwendet, welche mit einer Verbindung der Formel I

X-(CH~)

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Stärke verwendet, welche mit einer Verbindung der Formel II

x-<CH2>n umgesetzt ist, in der Rj ein Wasserstoffatom oder eine abspaltbare Schutzgruppe, z.B. eine Acylgruppe, darstellt und X und n die in Anspruch 4 angegebenen Bedeutungen aufweisen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Stärke, bei der jede 10. bis 50. Glucoseeinheit oxidiert wurde, mit einem Anilin- bzw. Phenylhydrazin umsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die entstandenen Schiffschen Basen bzw. Hydrazone durch Reduktion in die entsprechende Amine überführt.

8. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass X eine Oxirangruppe, ein Halogenatom, eine Säurechloridgruppe, Isocyanatgruppe, Isothiocyanatgruppe, Tosylatgruppe, Dichlortriazingruppe oder Mesilatgruppe bedeutet.

9. Verfahren nach Anspruch 4,5,6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als weitere Farbstoffbildungskomponente ein Diazoniumsalz verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 4, 5,6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als weitere Farbstoffbildungskomponente eine zur oxidativen Kupplung mit Phenolen oder Anilinen geeignete Verbindung verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein N-Alkyl-pyridon-(4)-hydrazon, N-Methyl-benzthiazolon-hydrazon, Aminodimethylanilin oder 1-Phe-

nyl-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass man zur oxidativen Kupplung FeCl3, Kalium-ferricyanid, Kupfersulfat, Silbernitrat, Natriumhypochlorit, Bleidioxid, Ce (S04)2, H202 oder ein H202 bildendes Reaktionssystem verwendet.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung des niedermolekularen löslichen Spaltprodukts durch Dialyse, Filtration oder Zentrifugation erfolgt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man bei löslichen Stärken die niedermolekularen löslichen Spaltprodukte durch Dialyse abtrennt, indem man aus einem ersten kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom die Spaltprodukte zu einem prozentualen Anteil in einen zweiten Flüssigkeitsstrom dialysiert, den man auf der anderen Seite der Dialysemembran entlangführt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Dialysemembran mit hoher Durchlässigkeit verwendet.

Das Enzym a-Amylase spaltet bekanntlich die ct-1,4-glycosidische Bindung in Polysacchariden, wie Amylose, Amylopectin und Glycogen sowie in deren Abbauprodukten mit einer Kettenlänge von mindestens 3 D-Glucose-resten. Reaktionsprodukt ist das Disaccharid Maltose. Die Maltose kann z.B. von a-Glucosidase in Glucose gespalten werden, welche wiederum enzymatisch bestimmt werden kann. Bei dieser komplexen Nachweisreaktion stört unter anderem die im Serum schon enthaltene Glucose.

Bei einer anderen bekannten Nachweisreaktion für a-Amylase nutzt man die bekannte Jodstärke-reaktion. Dabei misst man das Verschwinden der blauen Farbe der Jodeinschlussverbindung im Stärkemolekül. Da diese Einschlussverbindung von einer helikalen Kettenstruktur der Stärke abhängt, die nur teilweise vorliegt, ist diese Bestimmungsmethode relativ ungenau (DE-OS 2508714).

Eine grössere Bedeutung hat dagegen ein Bestimmungsverfahren erlangt, bei dem aus einer durch einen Farbstoff gefärbten unlöslichen Stärke durch die Einwirkung der a-Amylase lösliche farbige Bruchstücke freigesetzt werden, die dann die überstehende Lösung anfärben. Die Anfärbung dieser Lösung ist ein Mass für die Menge der a-Amylase. Neben der Schwierigkeit, ein reproduzierbar gleich stark vernetztes unlösliches Stärkederivat herzustellen, stört bei dieser Methode auch stets der durch Hydrolyse freigesetzte Farbstoff, der einen gewissen Leerwert bedingt. Besonders störend wirkt sich auch das hohe Molekulargewicht des Reaktivfarbstoffs aus. Dies bedingt, dass in unmittelbarer Nachbarschaft der Bindungsstelle an der Zuckerkette aus sterischen Gründen kein Angriff durch die a-Amylase erfolgen kann. Die Konzentration des Farbstoffs auf der Stärke kann daher nicht beliebig erhöht werden, wodurch auch die messbare Extinktion begrenzt ist. Da das Molekulargewicht von Stärkebruchstücken im Verhältnis zu dem des Farbstoffs relativ klein ist, ist z.B. auch keine Trennung von niedermolekularen, gefärbten Bruchstücken von gefärbter löslicher Stärke durch Dialyse möglich. Gerade eine derartige Abtrennung im fliessen-den Lösungssystem wäre aber für eine Bestimmung mit Analysenautomaten erwünscht.