DE3222366A1

DE3222366A1 - Analysenmaterialien fuer glucoseoxidase-enzym-reaktionssysteme in fluessigkeitsproben

Info

Publication number: DE3222366A1
Application number: DE19823222366
Authority: DE
Inventors: Fuminori Arai; Harumi Asakashi Saitama Katsuyama; Masao Kitajima
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1981-06-17
Filing date: 1982-06-15
Publication date: 1982-12-30
Also published as: US4452887A; JPS57208997A; JPH0234600B2; GB2104215B; GB2104215A; DE3222366C2

Description

Analysenmaterialien für Glucoseoxidase-Enzym-Reaktionssysteme in Flussigkeitsproben

Die vorliegende Erfindung betrifft Analysenmaterialien für Flüssigkeitsproben. Die Erfindung betrifft insbesondere verbesserte, trocken arbeitende Analysenmaterialien, die zur Bestimmung von Glucose in einer Flüssigkeitsprobe, insbesondere bei Vorliegen relativ hoher Glucose-Konzentrationen, in dem Fall besonders wirksam sind, in denen in der Startreaktion der Analyse ein Hydrogenperoxid bildendes Glucoseoxidase-Enzym-Reaktionssystem eingesetzt wird.

Analytische Methoden, bei denen ein zu untersuchender Stoff oder eines seiner Reaktionsprodukte mit Hilfe eines Oxidase-Enzyms oxydiert wird und das gleichzeitig bei dieser Oxidation gebildete Hydrogenperoxid mittels verschiedener Methoden bestimmt wird, haben in neuerer Zeit Bedeutung erlangt. Der Grund hierfür ist, daß eine genaue Bestimmung des Hydrogenperoxids mit Hilfe einer koloriiaetrischen Methode nach einer Farbstoff-Bildungsreaktion unter Anwendung von Peroxidase oder mit Hilfe einer Elektrodenreaktion durchgeführt werden kann.

Wohlbekannt ist eine auf dem vorerwähnten Prinzip beruhende kolorimetrische Methode unter Verwendung des Trinder-Reagens. Bei dieser Methode wird das durch die Reaktion eines Oxidase-Enzyms gebildete Hydrogenperoxid mit Peroxidase umgesetzt, um die oxidative Kupplung.r.-

reaktion von Aminoantipyrin und einem Phenol zu katalysieren, und der dadurch gebildete Farbstoff wird kolorimetrisch bestimmt. Der Vorzug dieses Reaktionssystem besteht darin, daß ein und dasselbe Ncichweissyctem für

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untcrsch j edliche Arten von Oxidasc-Enzymen eingesetzt werden kann, und die Anwendungsmöglichkeiten dieses Systems für verschiedenartige Analysen werden gegenwärtig untersucht. In der klinischen Chemie besonders wichtige unter diesen Oxidase-Enzymen sind Glucoseoxidase, Cholesterinoxidase, Uricase, Glycerinoxidase, Phosphoglucoseoxidase etc..

Materialien für die klinische Analyse, die ein Oxidase-System und ein Nachweissystem für das entstehende Hydrogenperoxid enthalten, entweder in Form eines integrierten mehrschichtigen Films oder in Form imprägnierter Filterpapierstreifen etc., finden für praktische Zwecke weit verbreitete Anwendung.

Bei den letzteren Analysenmaterialxen wird ein Filterpapier mit jeder ein Reagens, das unmittelbar zum Nachweis des zu analysierenden Materials beiträgt, enthaltenden Zusammensetzung getränkt oder beschichtet, wobei das Filterpapier entweder selbst als Träger dient oder ein getrennter Träger eingesetzt wird.

Mehrschichtige Analysenmaterialxen des integrierten Typs sind von unterschiedlicher Bauart, und Schichten mit verschiedenen Funktion liegen in Form laminierter Schichten vor. Beispiele solcher funktionellen Schichten sind eine Spreitungsschicht, die die gleichmäßige Ausbreitung einer P'lüssigkeitsprobe bewirkt, wie sie beispielsweise in der JP-Patentveröffentlichung 21677/78 offenbart ist; eine lichtabschirmende Schicht zur optischen Isolierung einer weißes Licht streuenden Oberfläche zur Reflo::ionsmessung und eines auf der oberon Schicht vorhandenen gefärbten Bestandteils aus dem zum Nachweis dienenden Farbstoff, wie in der JP-OS

40191/76 offenbartist; eine Sperrschicht für eine selektive Diffusion eines Materials, wie sie in der JP-OS 3488/77 offenbart ist; eine Nachweisschicht für den Nachweis durch Beizen mit einem gebildeten Farbstoff,
wie sie in der JP-OS 131089/78 offenbart ist; eine Wanderungshemmschicht zur Verhinderung einer Diffusion eines gebildeten Farbstoffs in andere Schichten, wie sie in der JP-OS 29700/79 offenbart ist; eine Haftschicht zur Verbesserung der Haftung zwischen den
Schichten etc..

Von diesen Schichten ist eine Reagensschicht eine Schicht, in der eine chemische Reaktion stattfindet; die Reagensschicht kann, je nach der gestellten Aufgabe, aus einer einzigen oder aus mehreren Schichten

bestehen. Die JP-Patentveröffentlichung 21677/78 beschreibt beispielsweise ein Analysenmaterial, bei dem ein Träger mit einer Reagensschicht und einer Spreitungsschicht mit isotroper Porosität beschichtet ist, wobei die Reagensschicht Salicylsäure enthält, die als

Stabilisierungsreagens für eine Blutprobe wohlbekannt ist.

Zur Analyse von in Wasser wenig löslichem Probematerial·, etwa Cholesterin, Neutralfett etc., oder Probematerial wie Bilirubin etc., das mit einem Protein wie

Albumin etc. in einer Flüssigkeitsprobe kombiniert ist und in einem Zustand vorliegt, daß es kaum eine Diffusion in der Schicht erleidet, wird in der äußersten Schicht zunächst eine Vorbehandlung, etwa der Hydrolyse, Dissoziation etc., durchgeführt, um die Diffusion des in der Reagensschicht zn analysierenden Probematerials zu fördern, wie beispielsweise in den JPrOSen 137192/77, 24893/78 und 89796/78 beschrieben ist.

Weiterhin offenbart die JP-OS 164356/77, daß mehrere Reagentien, die für mehrere Reaktionen benötigt werden, die zur Analyse eines speziellen Bestandteils erforderlich sind, getrennt, entsprechend der Abfolge der Reaktionen, in eine erste Reagensschicht, eine zweite Reagensschicht etc. eingearbeitet sein können; diese Arbeitsweise ist jedoch nur dann zweckmäßig, wenn die Reaktionen nacheinander mit zeitlichem Abstand ablaufen.

Einige dieser bekannten Analysenmaterialien sehen vor, daß ein Oxidase-Enzym wie Glucoseoxidase etc. in sie eingearbeitet werden kann, jedoch wird das Oxidase-Enzym in eine Reagensschicht in dem Analysenmaterial eingearbeitet, um eine Berührung des Enzyms mit Luft zu verhindern.

In bekannten, aus mehreren Schichten bestehenden Analysenfilmen ist ein Beispiel des Einsatzes einer Reagensschicht als der äußersten Schicht in der JP-OS 27093/78 offenbart, jedoch ist die in dieser Erfindung offenbärte Reagensschicht eine spezielle Reagensschicht zur Entfernung störenden Materials, das die gesamte Analyse beeinflußt und dadurch falsche Analysenergebnisse ergeben würde, und zu diesem Zweck ist es erforderlich, daß die Reagensschicht als äußerste Schicht des Analysen-

films angeordnet ist, damit sie nur den Durchgang der Flüssigkeitsprobe zuläßt.

Wie im Vox'stehenden beschrieben wurden verschiedene Versuche unternommen, ein Reagens in eine andere als eine Reagensschicht einzuarbeiten; Sinn und Zweck die-0 ser Maßnahmen war jedoch stets die Lösung eines durch

das jeweilige spezielle Probcmaterinl bedingten Problems, und demzufolge können die in den vorbezeichneten bekannten Veröffentlichungen dargestellten Arbeitsweisen nicht auf Analyten übertragen werden, die sich von
den dort untersuchten Probematerialien unterscheiden.

Ein mehrschichtiges Analysenmaterial, das für ein System verwendet wird, bei dem ein nachweisbarer Stoff durch Einwirkung eines Oxidase-Enzyms und Hydrogenperoxid gebildet wird, ist in der früheren JP-OS 164356/80 der Anmelderin ausführlich beschrieben. Das offenbarte, mehrere Schichten umfassende Analysenmaterial ist ein solches für Flüssigkeiten und besteht aus einem wasserundurchlässigen, lichtdurchlässigen Träger, auf dem sich eine Reagensschicht mit einer reaktionsfähigen

Zusammensetzung, die durch Wirkung eines Oxidase-Enzyms und Hydrogenperoxid einen nachweisbaren Stoff bildet, eine nicht-poröse lichtabschirmende Schicht und eine faserförmige poröse Spreitungsschicht befinden.

Der Änalysengang unter Verwendung dieses Analysenmaterials umfaßt die folgenden Stufen: Eine Flüssigkeitsprobe, bei der das zu analysierende Material in der Probeflussigke.it gelöst vorliegt, wird mit der Reagensschicht in Berührung gebracht; unter der Einwirkung des Oxidase-Enzyms wird in der Schicht Hydrogenperoxid gebildet, und sodann wird unter, der Einwirkung der Peroxidase die oxidative Farbbildungsreaktion herbeigeführt. -

Bei der Verwendung eines derartigen Ä.nalysenmaterials, das sämtliche Reagentien (einschließlich eines Oxidase-Enzyms), in einer Reagensschicht enthält, läuft die Reaktion bei der Analyse einer relativ großen Menge dos

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Probematerials (z.B. bei Glucose mehr als 300 mg/dl) nur sehr langsam ab. Insbesondere bei Bildung einer wäßrigen Phase im Inneren irgendeiner oder mehrerer oberhalb der Reagensschicht angeordneter Schichten oder in einem durch diese Schicht(en) gebildeten Zwischenraum wird die Reaktion noch stärker verzögert: Diese Erscheinung wird besonders dann beobachtet, wenn das Analysenmaterial eine nicht-poröse Schicht aufweist, z.B. eine nicht-poröse lichtabschirmende Schicht auf
der Reagensschicht, wie beispielsweise in der JP-OS 164356/80 erläutert ist. Eine solche wäßrige Phase wirkt als eine Sperre für gasförmigen Sauerstoff, da die wäßrige Phase ein glattes Hindurchtreten des Sauerstoffs nicht zuläßt.

In der JP-AS 45599/81 (entsprechend der US-PS

3 983 005) wird ein integriertes Element für die Analyse von Cholesterin offenbart. In diesem offenbarten integrierten Element ist Cholesterinoxidase in eine oberhalb einer Reagensschicht angeordnete Spreitungs-

schicht eingearbeitet. Die Einbeziehung der Cholesterinoxidase in eine solche Spreitungsschicht wird im wesentlichen durch die Eigenart der Cholesterin-Analyse bedingt. Der Grund liegt darin, daß Cholesterin in den Körperflüssigkeiten in freier und in veresterter Form

vorliegt und daß zur Analyse des Gesamt-Cholesterins das veresterte Cholesterin in freies Cholesterin zu überführen ist, das anschließend in Gegenwart von Cholesterinoxidase zersetzt werden muß, damit in dem Element .eine nachweisbare Veränderung erzeugt wird, die

mit. dem Gesamt-Cholesterin-Gehalt der Flüssigkeitspr.obe in Beziehung steht. Entsprechend einem solchen Analy- ■ senfilm ist es vorteilhaft, wenn Cholesterinoxidase zum Teil in eine solche Spreitungsschicht eingearbeitet

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ist, zusätzlich zur Einarbeitung in eine Reagensschicht. In dieser Veröffentlichung findet sich jedoch keinerlei Angabe, nicht einmal eine Andeutung, dahingehend, daß die Einbeziehung der Cholesterinoxidase in
die Spreitungsschicht eine wichtige Rolle im Hinblick auf eine Beschleunigung einer Enzym-Reaktion spielen könnte, wie im Folgenden noch erläutert wird. Vielmehr ist es in der Fachwelt bekannt, daß die Beschleunigung des enzymatischen Verfahrens der Cholesterin-Analyse in der Stufe der Hydrolyse der Cholesterinester mit Hilfe von Cholesterinesterase stattfindet.

Betrachtet man den Fall der Glucose, so ist bekannt, daß eine beträchtliche Menge Sauerstoff bei der Enzym-Reaktion unter Beteiligung der Glucose verbraucht wird, im Vergleich zu einem System, an dem z.B. Harnsäure beteiligt ist. Im Falle der Harnsäure-Analyse mittels einer enzymatischen Methode unter Verwendung von Harnsäureoxidase sind nämlich etwa nur 2 mg/dl Sauerstoff für die Oxidation der Harnsäure ausreichend, wohingegen 0 im Falle der Glucose-Analyse der Glucose-Gehalt im Blut eines Patienten oft 300 mg/dl oder mehr beträgt, und in einem solchen Falle werden mindestens 15 mmol/dl Sauerstoff für die Oxidation der Glucose benötigt.

Untersuchungen seitens der Anmelderin haben nunmehr
ergeben, daß bei einem mehrschichtigen Analysenmaterial, das sich der Farbbildungsreaktion mittels eines Glucoseoxidase-Enzyms und Hydrcgenperoxid bedient, die Diffusion der Stoffe in einer Schicht, insbesondere die Diffusion von Sauerstoff, der für die oxidative Wirkung des Oxidase-Enzyms benötigt wird, Voraussetzung für das wirksame Fortschreiten der Reaktion ist. Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde im Hinblick auf diese Tat-

sache gefunden, daß in dem Fall, wenn ein Glucoseoxidase-Enzym in eine andere als die Reagensschicht eingearbeitet ist und sich diese betreffende Schicht oberhalb der Reagensschicht befindet, die Reaktionsgeschwindigkeit durch die Diffusionsgeschwindigkeit des Sauerstoffs bestimmt wird, wodurch sich Geschwindigkeit und Genauigkeit der Analyse erhöhen lassen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Analysenmaterial für Flüssigkeiten, das aufgrund der
Verbesserung der Sauerstoff-Zufuhr zu einem Glucoseoxidase-Enzym eine rasche und genaue Analyse liefert und für ein System besonders geeignet ist, das mit hoher Wahrscheinlichkeit große Mengen Sauerstoff verbraucht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein trocken arbeitendes Analysenmaterial für Flüssigkeiten, das ein günstiges Verhältnis der optischen Dichte zur Konzentration der Glucose liefert, insbesondere wenn diese in relativ hoher Konzentration, z.B. mehr als

300 mg/dl Glucose, vorliegt.

Zu diesem Zweck umfaßt das mehrschichtige Analysenmaterial für Flüssigkeitsproben einen wasserundurchlässigen und lichtdurchlässigen Träger, auf den nacheinander eine Reagensschicht, die eine unter der Einwirkung von

Hydrogenperoxid einen nachweisbaren Stoff bildende Zusammensetzung enthält, eine nicht-poröse lichtabschirmende Schicht und eine faserförmige poröse Spreitungsschicht aufgebracht sind, und ir.t dadurch gekennzeichnet:, daß ein Glucor.eoxidase-Enzym in eine andere als

0 die Reagensschicht eingearbeitet ist, die übor der letzteren liegt.

Die Fig. 1 bis Fig. 5 zeigen pchcmati:fche Querschnitt-Ansichten verschiedener Ausführungsformen des Analysenmaterials gemäß der vorliegenden Erfindung.

Die Fig. 6 und Fig. 7 sind graphische Darstellungen der Beziehung zwischen der Reflexionsdichte und der Inkubationszeit bei Einsatz bekannter Glucose-Konzentrationen, und Fig. 8 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen der Glucose-Konzentration und der optischen (Reflexions-) Dichte.

Die analytische Grundlage des Analysenmaterials gemäß der vorliegenden Erfindung bildet prinzipiell die zuerst von Trinder mitgeteilte Reaktionsfolge, d.h. die durch Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4) katalysierte Oxidation der Glucose und die anschließende oxidative Kupplung, die durch Peroxidase (EC 1.11,1.7) katalysiert wird. Diese Reaktionen, z.B. unter Verwendung von 4-Aminoantipyrin als Wasserstoff-Donator und 1,7-Dihydroxynaphthalin als Farbindikator, läuft folgendermaßen ab:

Glucoseoxidase

Glucose + O₂ + 2 K₃O

2H₂O +

CH.

-' Gluconsäure + 2 H₀O

OH

Peroxidaoe

In der vorliegenden Erfindung bezeichnet die Formulierung "eine über der Reagensschicht liegende Schicht" eine solche Schicht, die auf derjenigen Seite der Reagensschicht angeordnet ist, die dem Träger abgewandt ist, und sich oberhalb der Reagensschicht befindet.

Wie oben beschrieben beeinflußt der geschwindigkeits'-bestimmende Schritt der Sauerstoff-Zufuhr die Oxidation des mittels eines Glucoseoxidase-Enzyms zu analysierenden Stoffes.' Aufgrund dieser Kenntnis wurde gefunden, daß in dem Fall, in dem. ein Glucoseoxidase-Enzym getrennt von der Reagensschicht gehalten und in eine über dieser liegende Schicht eingearbeitet wurde, eine solche Schicht insofern vorteilhaft war, daß sie das Glucoseoxidase-Enzym in Berührung mit Luft brachte und eine sehr bemerkenswerte Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit stattfand.

Als über der Reagenr.schicht liegende Schicht, d.h. als die auf der dem Träger abgewandten Seite befindliche Schicht, können die nicht-poröse Strahlungsblockierende 0 oder lichtabschirmende Schicht oder die faserige Spreitungsschicht verwendet werden, oder, falls erwünscht oder erforderlich, können eine die Funktion oder eine die Struktur dieser Schichten begünstigende Schicht (z.B. eine Regulierschicht, eine Haftschicht etc.) gebildet werden, und ein Glucoseoxidase-Enzym kann in eine oder mehrere dieser zusätzlichen Schichten eingearbeitet v/erden. Eine allein ein Glucoseoxidase-Enzym enthaltende Schicht kann selbstverständlxch ebenfalls über der Reagencschicht gebildet werden.

Die Funktion dor f.iserigo.n porösen Spreitungsschicht

• besteht darin, der Reagenr-^chicht ο inc· i-'lüssigkeitsprobe nit einem annähernd konstanten Volumen pro Flächeneinheit zuzuführen, und zwar unabhängig von deren aufgebrachtem Volumen; d.h.diese Schicht wirkt als Mittel
zur gleichmäßigen Verteilung einer Flüssigkeitsprobe.' Die Wirkung der faserigen porösen Spreitungsschicht besteht also einfach darin, dafür zu sorgen, daß eine auf die faserige poröse Spreitungsschicht mit einem gemessenen Volumen von χ μΐ, 2x μΐ, 3x μΐ ... aufgetragene Flüssigkeitsprobe sich auf der Fläche der Schicht aufgrund der dieser eigenen Spreitungswirkung im Verhältnis zu dem aufgetragenen Volumen ausbreitet und dabei eine Fläche von y cm², 2y cm²- bzw. 3y cm²
bedeckt und dementsprechend bewirkt, daß die der Flä-

cheneinheit der Reagensschicht zuzuführende Menge der Flüssigkeitsprobe konstant gehalten wird. Das hat zur Folge, daß eine Flüssigkeitsprobe quantitativ analysiert werden kann, ohne daß eine- genaue Messung des Probevolumens erfolgen muß, was außerordentlich bedeut-

sam ist. ■ .

Die Reagensschicht ist eine Schicht, die Reagentien enthält, die für die kolorimetrische Bestimmung des bei der durch das Enzym Glucoscoxidase katalysierten Oxidation der Glucose gebildeten Ilydrogenperoxids erforderlieh sind; sie enthält im allgemeinen Peroxidase, einen Wasserstoff-Donator wie ein Aminoantipyrin und einen Farbindikator wie 1,7-Dihydroxynaphthalin.

Die nicht-poröse lichtabschirmende (oder strahlungsblockierende) Schicht ist eine Schicht, die in wirksamer Weise den Durchgang elektromagnetischer Strahlung, die zum erfolgreichen Nachweis der in dem Analysenmaterial· hervorgerufenen analytischen Veränderung verwendet

wird, erlaubt. Wie oben beschrieben verhindert diese
nicht-poröse Ijchtabschirmcnde Schicht auch die Permeation von Sauerstoff in einem beträchtlichen Maße und damit die Möglichkeit, daß eine solche Schicht ein Systern schaffen würde·, in dem Sauerstoff die Reagensschicht nur noch unter Schwierigkeiten erreicht.·

Die Regulierschicht (timing layer), die gegebenenfalls zwischen der Reagensschicht und der nicht-porösen lichtabschirmenden Schicht angeordnet wird, wirkt als
Schicht, die die Diffusionsgeschwindigkeiten der in den Schichten diffundierenden Bestandteile steuert, so daß eine nachweisbare Species die Reagensschicht schneller als andere Bestandteile erreicht.

Die Haftschicht wirkt grundsätzlich in der Weise, daß
sie die Kaftkräfte zwischen der Reagensschicht oder der nicht-porösen lichtabschirmenden Schicht und der faserigen porösen Spreitungsschicht vergrößert.

Ein Glucoseoxidase-Enzym wird wie oben beschrieben in eine über der Reagensschicht liegende Schicht eingearbeitet.

Zur Erzielung eines besseren Verständnisses des Analysenmaterials für Flüssigkeiten gemäß' der vorliegenden Erfindung v/ird diese praktisch und im einzelnen unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.

Fig. 1 und Fig. 2 zeigen jeweils die Grundstruktur des Analysenmaterials für Flüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung, bei. dem ein lichtdurchlässiger Träger ' 1, eine Reagensschicht 2, eine nicht-poröse lichtabschirmende Schicht 3 und eine faserförmige Spreitungs-

. schicht 4 für die Flüssigkeitsprobe in dieser Reihen-

folge laminiert sind. Ein Glueoseoxidase-Enzym ist in die nicht-poröse lichtabschirmende Schicht 3 (Fig. 1) oder in die faserförmige Spreitungsschicht 4 für die Flüssigkeitsprobe (Fig. 2) eingearbeitet.

Fig. 3 zeigt eine andere Ausführungsform des Analysenmaterials, bei der eine Haftschicht 5 unter der Spreitungsschicht angeordnet ist und ein Glucoseoxidase-Enzym enthält.

Fig. 4 zeigt noch eine andere Ausführungsform des Analysenmaterials mit einer Struktur, bei der eine ein Glucoseoxidase-Enzym enthaltende zusätzliche Schicht 6 zwischen der Haftschicht 5 und der lichtabschirmenden Schicht 3 ausgebildet ist.

Fig. 5 zeigt eine weitere Ausführungsform des Analysenmaterials mit einer Struktur, bei der eine Regulierschicht 7 zwischen der Reagensschicht 2 und der ein Glücoseoxidase-Enzym enthaltenden lichtabschirmenden Schicht 3 ausgebildet ist.

Lin Glucoseoxidase-Enzym wird im allgemeinen in die
vorbezeichnete Schicht dadurch eingearbeitet, daß das die Schicht bildende Material in eine wäßrige Lösung des Glucoseoxidase-Enzyms eingetaucht und mit dieser getränkt wird oder daß eine derartige wäßrige Lösung auf das Material aufgesprüht wird (Imprägnierung und
Trocknung). Im. Falle einer Herstellung einer Schicht, die für sich allein das Glucoseoxidase-Enzym enthält (im Folgenden oft als Glucoseoxidase-Enzymschicht bezeichnet) , wird vorzugsweise ein geeignetes Bindemittel mit dem Enzym vermischt und die Schicht wie gewünscht
durch Beschichten auf der vorhergehenden hergestellt,

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beispielsweise auf der lichtabschirmenden Schicht 3 in Fig. 4. Außerdem wird, sofern ein Glucoseoxidase-Enzym in das gewöhnlich bei der Laminat-Herstellung zum Benetzen verwendete Wasser eingebracht wird, eine Glucoseoxidase-Enzymschicht nach Beendigung des Laminieren^ an der Grenzfläche zwischen den Schichten ausgebildet.

Die für das Analysenmaterial gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzte faserige poröse Spreitungsschicht besteht aus einem faserförmigen porösen Material wie Papier (z.B. Filterpapier, synthetischem Papier, Vlies, Polyethylen-Pulpe etc.) oder Tuch (z.B. natürlichem oder synthetischem Textilmaterial etc.., insbesondere solchem mit Leinenbindung).

Für die faserige poröse Spreitungsschicht läßt sich eine Vielzahl verschiedener Textilmaterialien einsetzen. Von den verschiedenen Textilgeweben werden solche mit Leinenbindung bevorzugt verwendet, die durch abwechselndes Verweben von Kette- und Schußgarn gebildet wird. Für Kette und Schuß dieser Leinenbindung liegen ■ die geeigneten Titer im Bereich von 20 bis 120. Von den in Leinenbindung verarbeiteten Textilmaterialien werden die als Dichtgewebe, Canequim, Feingewebe und Popeline bezeichneten Baumwollgewebe bevorzugt verwendet. Neben in gleicher Weise wie die obigen Baumwollgewebe verwebten Naturfasern (z.B. Kapok, Flachs, Hanf, Ramie, Seide und dergleichen) können auch in entsprechender Weise hergestellte Mischcrcwebe aus Baumwollfasern und Chemiefasern (z.B. Viskor.c-Kunstseide, Kupferamraonium-Kunstseide, Celluloseacetat, Vinylon, Polyethylenterephtha-0 lat und dergleichen) und in gleicher Weise verwebtes Garn aus Chemiefasern eingesetzt werden. 'Vorzugsweise werden diese Gewebe hydrophil gemacht.

7\ls Beispiele für Verfahren, mit deren Hilfe Gewebe hydrophil gemacht werden, seien ein Verfahren erwähnt, bei dem die technisch hergestellten Gewebe gründlich mit Wasser gewaschen und gespült werden, um Stärke und
andere Verarbeitungshilfsmittel daraus zu entfernen, und gegebenenfalls noch 1- bis 5-proz. wäßrige Lösungen oberflächenaktiver Mittel getaucht werden, sowie ein Verfahren, bei dem oberflächenaktive Mittel dadurch in die Gewebe im Verhältnis von 0,1 bis 10 Gew.-% des Gewebes eingearbeitet werden, daß wäßrige Lösungen oberflächenaktiver Mittel zur Befeuchtung der Gewebe auf diese aufgesprüht und diese dann getrocknet werden.

Bei einem Verfahren eines anderen Typs, mittels dessen Gewebe hydrophil gemacht v/erden, werden die Gewebe mit

Lösungen hydrophiler Polymerisate, die feine Pulver wie Titandioxid, Bariumsulfat und dergleichen und Netzmittel wie Glycerin, Polyethylenglycol und dergleichen neben hydrophilen Polymerisaten wie Gelatine, Polyvinylalkohol und dergleichen enthalten können, befeuchtet und dann getrocknet. Die hydrophilen Polymerisate werden in die Gewebe in Mengen von etwa 0,05 bis
10 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 0,1 bis 5 Gew.-%, des Gewebes eingearbeitet.

Weitere Einzelheiten hierzu sind in der JP-OS 164356/80 und der US-PS 4 292 272 beschrieben.

Die nicht-poröse lichtabschirmende Schicht ist eine Schicht, die durch Dispergieren eines feinen Pulvers wie. Titandioxid, Aluminiumoxid, Bariumsulfat etc.. in einem wasserdurchlässigen hydrophilen polymeren Bindemittel .hergestellt·wird, und ihre Dicke beträgt gewöhnlich von 1 um bis 100 μΐη, vorzugsweise von 2 . μτη bis 20 μκ. . __.,-''

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Die Reagensschicht enthält ein oder mehrere Reagentien, die für die kolorimetrische Bestimmung des Hydrogenperoxids, das aufgrund der Reaktion des Glucoseoxidase-Enzyms und einem speziellen Bestandteil in einer Flüssigkeitsprobe gebildet wird, mittels eines gebräuchlichen Verfahrens benötigt werden. In der beispielsweise bei der vorliegenden Erfindung eingesetzten Reagensschicht werden die drei Bestandteile Peroxidase, Amino-¹ antipyrin und 1,7-Dihydroxynaphthalin unter Verwendung von Gelatine als Bindemittel zu einer Schicht von etwa 5 μΐη bis 50 μπ\ Dicke verarbeitet.

Der Wasserstoff-Donator ist eine Verbindung, die ein Sauerstoff-Akzeptor ist, der in seinem oxydierten Zustand mit dem Fabrindikator kuppelt. Repräsentative Beispiele für Wasserstoff-Donatoren sind 4-substituierte Antipyrine, wie sie in der US-PS 3 983 005 offenbart sind, Ν,Ν-disubstituierte o- oder p-Phenylendiamine, wie sie in der US-PS 3 886 .045 offenbart sind, 2-Hydrazonobenzothiazoline, wie sie in der JP-OS 20471/80 offenbart sind, p-Halogenophenole, wie sie in der JP-OS 148100/80 offenbart sind, und Ν,Ν-disubstituierte Phenylendiamine, wie sie in der US-Patentanmeldung vom 26.02.1982 unter dem Aktenzeichen 352 790 offenbart sind.

Als Farbindikatoren können verschiedene bekannte, färbbildende Verbindungen eingesetzt werden'. Zu speziellen Beispielen für solche Verbindungen zählen Monoamine wie Anilin, o-Toluidin, p-Toluidin etc., Diamine wie o-Phenylendiamin, Ν,Ν-Dimethyl-p-phenylendiamin, Benzidin, Dianisidin etc., Phenole wie Phenol, Thymol, oc- oder · ß-Nciphthol etc., Polyphenole wie Brenzkatechin, Guajacol, Pyrogallol etc., aromatische Säuren wie Salicyl-

säure, Gallussäure etc., Leukofarbstoffe wie Leuko-Malachitgrün etc.. Weitere Einzelheiten sind in der US-PS 3 983 005 und der US-Patentanmeldung vom
26.02,1982 unter dem Aktenseichen 352 790 beschrieben.

Eine Peroxidase ist ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, bei der Hydrogenperoxid eine andere Substanz katalysiert. Peroxidase kommt in Tieren etwa in Leukozyten, Milch, Leber, Milz, Uterus, Speicheldrüse, Magenwand etc: sowie in Merrettich, Kartoffeln, Feigenbaumsaft, Tabakpflanzen, Hefe, Schimmel, -Bakterien etc. vor. Andere Substanzen, die keine Enzyme sind, jedoch Peroxidase-ähnliche Wirksamkeit besitzen, sind Eisenthiocyanat, Eisentannat, an Silicagel adsorbiertes Kaliumchromsulfat etc. .

Falls erwünscht oder erforderlich kann eine Regulierschicht (timing layer) zwischen der Reagensschicht und der lichtabschirmenden Schicht ausgebildet werden. Die Regulierschicht wird manchmal als Wanderungshemmschicht bezeichnet, da sie dazu dient, einen nachzuweisenden

Stoff relativ schneller zu der Reagensschicht gelangen zu lassen, und eine derartige Schicht ist insbesondere dann von Nutzen, wenn das nachzuweisende Material in mehreren Reaktionen, die jeweils mit Zeitunterschieden nacheinander ablaufen, gebildet wird.

Die Regulierschicht enthält im allgemeinen ein Beizmittel wie z.B. in der JP-OS 29700/79 beschrieben oder besteht aus dem Polymer-Latex, das beispielsweise in den JP-OSen 72622/78 (entsprechend der US-PS 4 199 362) und 138432/79 (entsprechend der US-PS 4 256 827) be-

schrieben ist und als Regulierschicht für photographische Materialien eingesetzt wird..

Anstelle der Ausbildung der Regulierschicht als 'unabhängige Schicht wie in Fig. 6 dargestellt kann auch die Reagensschicht mit der Regulierfunktion ausgestattet werden, indem die Reagensschicht gehärtet wird. Wenn nämlich die Reagensschicht unter Verwendung gebräuchlicher organischer oder anorganischer Härtungsmittel (allein oder in Kombination), wie sie zum Härten normaler photographischer Schichten verwendet werden, gehärtet wird, wird die gleiche Regulierwirkung wie im Falle der Ausbildung einer Regulierschicht erzielt. Mit Erfolg einsetzbare Härtungsmittel sind beispielsweise von C.E.K. Mees und T.H. James, "The Theory of the Photographic Process", 3. Auflage, Seiten 55-60 (1966), und in den US-PSen 3 316 095, 3 232 764 und 3 288 775 beschrieben.

Typische Beispiele für derartige Härtungsmittel sind Verbindungen der Aldehyd-Reihe (z.B. Mucochlorsäure, Formaldehyd etc.), aktive Verbindungen der Vinyl-Reihe (z.B. Divinylsulfon etc.), aktive Halogen-Verbindungen (z.B. 2, 4-Dichloro--6-hydroxy-s~triazin-Natrium-Salz etc.), Verbindungen .der Epoxy-Reihe ' (z.B. 1,4-Bis-(2',3'-epoxychloroperoxy)butan etc.), Verbindungen der Ethylenimin-Reihe, der Methansulfonsäureester-Reihe, der Carbodiimid-Reihe, der Isoxazol-Reihe sowie anorganische Verbindungen (z.B. Chromalaun etc.).

Zu geeigneten lichtdurchlässigen, wasserundurchlässigen Trägern für das Analysenmaterial gemäß der vorliegenden Erfindung zählen bekannte Träger mit einer Dicke von 50 |.im bis 2 mm, vorzugsweise von 80 bis 300 um. Ein-, solcher Träger wird als lichtdurchlässig angesehen, · wenn er für sichtbcires Licht und solches im nahen Ul-

traviolett-Bereich durchsichtig ist, z.B. mit einer Wellenlänge von 290 nm bis 400 nm. Beispiele geeigneter Träger sind Folien aus synthetischen Harzen wie Polyestern oder Polycarbonaten (z.B. Polyethylenterephthalat oder Polycarbonate von Bisphenol A, Celluloseester wie Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat oder Celluloseacetatpropionat, Polymethylmethacrylat etc.), regenerierter Cellulose und Glasplatten.

Das für die Analysenmaterialien für Flüssigkeitsproben
'gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Glucoseoxidase-Enzym kann beliebig unter denjenigen ausgewählt werden, die aus Schimmel stammen, z.B. aus Aspergillus niger, Penicillium notatum etc..

Ein solches Glucoseoxidase-Enzym bildet Hydrogenperoxid aufgrund einer Reaktion mit einem Substrat, und nachdem das so gebildete Hydrogenperoxid in herkömmlicher Weise einer Farbbildungsreaktion unterworfen wurde, wird die kolorimetrische Bestimmung durchgeführt.

Die Hydrogenperoxid-Bildung ist jedoch nicht auf das
vorhergehende Beispiel der Hydrogenperoxid-Bildung durch direkte Reaktion eines Glucoseoxidase-Systems mit einem zu analysierenden Stoff beschränkt, sondern kann in ähnlicher Weise auch durch Reaktion eines Glucoseoxidase-Systems mit einem ersten, zweiten etc. Reaktionsfolgeprodukt eines zu analysierenden Stoffes erfolgen.

Das im Vorstehenden beschriebene mehrschichtige Analysenmaterial' gelangt im allgemeinen in integrierter oder laminierter Form zum Einsatz; hierzu wird Druck auf die aus einem Tuch bestehende Spreitungsschicht für die

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Flüssigkeitsprobe zur Einwirkung gebracht, wenn das hydrophile Bindemittel in den Schichten halbtrocken ist oder nachdem das hydrophile Bindemittel mit Wasser oder ein oberflächenaktives Mittel enthaltendem Wasser befeuchtet wurde.

Der mehrschichtige Analysenfilm für die Analyse von Flüssigkeitsproben gemäß der .vorliegenden Erfindung eignet sich für die analytische Bestimmung eines speziellen Bestandteils in einer Flüssigkeit, wobei von

einem Glucoseoxidase-Systern Gebrauch gemacht wird, das durch Reaktion mit einem Substrat Hydrogenperoxid bildet. Beispielsweise eignet sich der mehrschichtige Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung vor allem für die Bestimmung von Glucose in Körperflüssigkeiten

wie Urin, Blut etc.·

Ein wichtiges Merkmal des Analysenfilms der vorliegenden Erfindung ist, daß im Fall einer Blutprobe der zu analysierende Bestandteil im Blut ohne Beeinflussung durch die Menge anderer Bestandteile bestimmt werden
kann, und zwar nicht nur im Serum sondern auch im VoIl-Blut, ohne daß dadurch die Analyse an Schnelligkeit einbüßt.

Die vorliegende Erfindung wird nunmehr durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

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Eine Reagensschicht nachstehender Zusammensetzung im trockenen Zustand zur Bestimmung der Glucose-Konzentration in Blut wurde auf einen transparenten Film aus
Polyethylenterephthalat (PET) von 185 um Dicke mit einer darauf befindlichen haftvermittelnden Gelatine-Schicht aufgetragen und getrocknet, so daß die Dicke der trockenen Schicht etwa .15 |xm betrug.

Peroxidase 25 000 Int.Einh.

1,7-Dihydroxynaphthalin 5 Gew.-Teile

4-Aminoantipyrin 5 Gew.-Teile

Gelatine 200 Gew.-Teile

Nonion HS 210 (oberflächenaktiven

Mittel; Polyoxyethylen-nonylphenylether, hergestellt von

Nippon Oils and Fats Co., Ltd.) 2 Gew.-Teile

Auf diese Reagensschicht wurde eine lichtabschirmende Schicht aus 8 Gew.-Teilen Titandioxid-Pulver dispergiert in 1 Gew.-Teil Gelatine aufgetragen und getrock-
-20 net, so daß die Dicke der trockenen Schicht 15 μΐη betrug.

Weiterhin wurde eine Haftschicht aus 0,2 Gew.-Teile Nonion HS 210 und 50 000 Int.Einheiten Glucoseoxidase enthaltender Gelatine auf die lichtabschirmende Schicht aufgetragen und getrocknet, so daß die Dicke der trokkenen Schicht 5 μπι betrug.

Der so hergestellte beschichtete Film wurde mit einor wäßriqon Lösung von 0,2 (",cw.-?, eines nichhionischon oberflächenaktiven Mittels (Nonion IiS 210) gleichmäßig

befeuchtet, und unmittelbar anschließend wurde' eine Spreitungsschicht aus einem Mikrofilter (FM 120, hergestellt von der Fuji Photo Film Co., Ltd.) in inniger Berührung auflaminiert; nach dem Trocknen wurde so ein mehrschichtiger Analysenfilm für die Glucose-Bestimmung erhalten.

Der so hergestellte Analysenfilm wurde in quadratische Stücke von 15 mm χ 15 mm zerschnitten, und die Stücke wurden auf Kunststoffrähmehen von 24 mm χ 28 mm mit
einer zentralen kreisförmigen Öffnung von 10 mm Durchmesser befestigt, wodurch ein mehrschichtiges Analysen-Diapositiv für die Glucose-Bestimmung erhalten wurde.

Vergleichsbeispiel 1

' Nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 1, jedoch mit der Abänderung, daß 50 000 Int.Einheiten GIucoseoxidase statt in die Haftschicht in die Reagensschicht eingearbeitet wurden, wurde ein mehrschichtiges Analysen-Diapositiv hergestellt.

Analvsenvorschrift:

Auf jedes der so hergestellten Diapositive wurden 10 |il einer 7-proz. wäßrigen Albumin-Lösung mit bekannter Glucose-Konzentration (110 mg/dl oder 560 mg/dl) aufgetropft, und nach Inkubation bei 27⁰C wurde die Reflexionsdichte bei 500 nm gemessen. Die Beziehung zwischen der Inkubationszeit und der Reflexionsdichte wird - in den Fig. 6 und Fig. 7 gezeigt.

Die mit niedriger Glucose-Konzentration (110 mg/dl) erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt, und die mit hoher Glucose-Konzentration (560 mg/dl) erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt.

Wie aus Fig. 6 zu ersehen ist, war im Fall der Verwendung des Analysenmaterials gemäß der vorliegenden Erfindung (Kurve a,), das die Glucoseoxidase in der Haftschicht enthielt, die Geschwindigkeit des Auftretens der Färbung höher als diejenige bei Verwendung des herkömmlichen Analysenmaterials (Kurve b, ) . Bei Anwendung einer hohen Glucose-Konzentration trat diese Differenz deutlicher in Erscheinung, und bei Verwendung des Analysenmaterials gemäß der vorliegenden Erfindung (Kurve a_) war im Vergleich zu dem herkömmlichen Analysenmaterial (Kurve b_) eine stärker ausgeprägte Erhöhung der Geschwindigkeit des Auftretens der Färbung zu beobachten (Fig. 7) .

Beispiel 2

Entsprechend der Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde eine Glucoseoxidase enthaltende Schicht zwischen der Haftschicht und der lichtabschirmenden Schicht ausgebildet. Das heißt, eine Reagensschicht der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 wurde auf einen transparenten Polyethylenterephthalat-Film aufgetragen und getrocknet.

Darauf wurde eine lichtabschirmende Schicht der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 aufgetragen und getrocknet.' Sämtliche Schichtdicken waren die gleichen wie in Beispiel 1.

Eine 50 000 Int.Einheiten Glucoseoxidase enthaltende Gelatine-Schicht wurde dann auf die lichtabschiriuende Schicht aufgetragen und getrocknet, so daß die Dicke der trockenen Schicht 15 μπι betrug. Weiterhin wurde . eine Haftschicht aus 0,2 % Non ion HS 210 enthaltender Gelatine darauf aufgetragen und getrocknet, so daß die Dicke dieser trockenen Schicht 5 μτη betrug.

Der so hergestellte beschichtete Film wurde mit einer wäßrigen Lösung von 0,2 Gew.-% eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels (Nonion HS 210) befeuchtet, und unmittelbar anschließend wurde eine Spreitungsschicht aus einem Mikrofilter (FM 120, hergestellt von der Fuji Photo Film Co., Ltd.) in inniger Berührung auflaminiert; nach dem Trocknen' wurde so ein mehrschichtiger Analysenf ilrn für die Glucose-Bestimmung erhalten.

Der Analysenfilm wurde dann in quadratische Stücke von 15 mm χ 15 mm zerschnitten, und die Stücke wurden auf Kunststoffrähmchen von 24 mm χ 28 rnm mit einer zentralen kreisförmigen öffnung von 10 mm Durchmesser befestigt, wodurch ein mehrschichtiges Analysen-Diapositiv für die Glucose-Bestiinmung erhalten wurde.

Analysenvorschrift:

Unter Einsatz des auf diese Weise hergestellten Analy-

25' sen-Diapositivs wurde eine Untersuchung von Voll-Blut durchgeführt, d.h. nach Zusatz von Natriumfluorid zu einer Probe Voll-Blut mit Heparin als Glycolyse-Inhibitor wurde eine bestimmte Menge Blut mit einer kleinen Menge physiologischer Kochsalz-Lösung, die Glucose enthielt, gemischt, und nach 2 h wurde die Glucose-Konzen-

tration mit Hilfe des mehrschichtigen Analysen-Diäpositivs gemessen. Außerdem wurde eine kleine Menge jeder Probe der Trennung durch Zentrifugieren unterworfen, und im erhaltenen Überstand wurde die Serum-Glucose-Konzentration mittels einer herkömmlichen Hexokinase-Methode gemessen. Die Ergebnisse der wie in Beispiel 1 durchgeführten Messung sind in Tabelle 1 angeführt.

Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse bestätigen das Vorliegen einer guten Korrelation zwischen der GIucose-Konzentration und der Färbungsdichte.

Tabelle 1

Glucose-Konzentration ' Färbungsdichte im Serum (mg/dl)

0 . 0,170

98 0,392

185 0,535

248 0,591

352 0,743

472 0,897

Beispiel 3

Eine Reagensschicht nachstehender Zusammensetzung im trockenen Zustand zur Bestimmung der Glucose-Konzentration in Blut wurde auf.einen transparenten Film aus Polyethylenterephthalat (PET) von 185 um Dicke mit einer darauf befindlichen haftvermittelnden Gelatine-Schicht aufgetragen und getrocknet, so daß die Dicke der trockenen Schicht 15 μηι betrug.

Peroxidase 25 000 Int.Einh.

1,7-Dihydroxynaphthalin 5 Gew.-Teilo

4-Aminoantipyrin 5 Gew.-Teile

Gelatine ' 200 Gew.-Teile

Nonion HS 210 (oberflächenaktives

Mittel; Polyoxyethylen-nonyl-

phenylether, hergestellt von

Nippon Oils and Fats Co., Ltd.) 2 Gew.-Teile

Auf diese Reagensschicht wurde eine lichtabschirmende
Schicht aus 8 Gew.-Teilen Titandioxid-Pulver dispergiert in 1 Gew.-Teil Gelatine aufgetragen und getrocknet, so daß die Dicke der trockenen Schicht 15 μπι betrug.

Weiterhin wurde eine Haftschicht aus 0,2 Gew.-Teile
Nonion HS 210 enthaltender Gelatine darauf aufgetragen und getrocknet, so daß. die Dicke der trockenen Schicht 5 μ,πι betrug.

Der so hergestellte beschichtete Film wurde mit einer wäßrigen Lösung von 0,2 Gew.-% eines nichtionischen

oberflächenaktiven Mittels (Nonion HS 210) gleichmäßig befeuchtet, und unmittelbar anschließend wurde eine Spreitungsschicht aus Popeline-Gewebe (# 100), das mit Glucoseoxidase imprägniert worden war (25 000 Int.Einheiten/m²) in inniger Berührung auflaminiert; nach dem Trocknen wurde so ein mehrschichtiger Analysenfilm für die Glucose-Bestimmung erhalten.

Der so hergestellte Analysenfilm wurde in quadratische Stücke von ' 15 mm χ 15 mm zerschnitten, und die Stücke wurden auf Kunnt.sto! f^:r;ihmchen von 24 mm χ 28 run mit
einer zentralen kreisförmigen öffnung von 10 mm Durch-

messer befestigt, wodurch ein mehrschichtiges Analysen-Diapositiv für die Glucose-Bestimmung erhalten wurde.

Vergleichsbeispiel 3

Mach der gleichen Arbeitsweise wie in Vergleichsbeispiel 1, jedoch mit der Abänderung, daß die der Reagensschicht zugesetzte Menge Glucoseoxidase 25 000 Int.Einheiten/m² betrug, wurde ein mehrschichtiges Analysen-Diapositiv hergestellt.

Mit jedem der so erhaltenen Analysen-Diapositive wurde
ein Färbetest in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei die optische Reflexionsdichte bei jeder Glucose-Konzentration gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt, aus der hervorgeht, daß das gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene Analysen-Diapositiv eine ausgezeichnete Färbewirkung besitzt.

Tabelle 2

Glucose-Konzen- Färbungsdichte

tration (mg/dl) Beispiel 3 Vergleichsbeispiel 3

100	0,506	0,309
300	0,8 97	0,521
500	1,171	0,784

- 30 Beispiel 4

Eine Reagensschicht nachstehender Zusammensetzung im trockenen Zustand zur Bestimmung der Glucose-Konzentration in Blut wurde auf einen transparenten Film aus Polyethylenterephthalat (PET) von 185 um Dicke mit einer darauf befindlichen haftvermittelnden Gelatine-Schicht aufgetragen und getrocknet, so daß die Dicke der trockenen Schicht 15 um betrug.

Peroxidase 25 000 Int.Einh.

1,7-Dihydroxynaphthalin 5 Gew.-Teile

4-Aminoantipyrin 5 Gew.-Teile

Gelatine 200 Gew.-Teile

Nonion HS 210 (oberflächenaktives

Mittel; Polyoxyethylen-nonylphenylether, hergestellt von

Nippon Oils and Fats Co., Ltd.) 2 Gew.-Teile

Auf diese Reagensschicht wurde eine wäßrige Lösung von 1,6 Gew.-% Poly-p-tricyclohexylaminoethylstyrolchlorid, 2,2 Gew.-% Gelatine und 0,2 Gew.-% Nonion HS 210 aufgetragen, so daß die Dicke der trockenen Schicht 2 um betrug, wodurch eine Wanderungshemmschicht gebildet wurde.

Weiterhin wurden eine Schicht aus 25 Gew.-Teilen Titandioxid, 2 Gew.-Teilen Gelatine und 4 000 Int.Einheiten
Glucoseoxidase mit einer Dicke der trockenen Schicht von 7 um und darauf eine Haftschicht aus 0,2 Gew.-% Nonion HS 210 enthaltender Gelatine darauf aufgetragen und getrocknet, so daß die Dicke der trockenen Schicht 5 \im betrug.

Der so hergestellte beschichtete Film wurde ir.it 'einer wäßrigen Lösung von 0,2 Gew.-% eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels (Nonion HS 210) gleichmäßig befeuchtet, und unmittelbar anschließend wurde eine
Spreitungsschicht aus 100-proz. Baumwollpopeline-Gewebe (# 100) in inniger Berührung auflaminiert; nach dem Trocknen wurde so ein mehrschichtiger Analysenfilm für die Glucose-Bestimmung erhalten.

Der so hergestellte Analysenfilm wurde in quadratische
Stücke von 15 mm χ 15 mm zerschnitten, und die Stücke \tfurden auf Kunststoffrähmchen von 24 mm χ 28 mm mit einer zentralen kreisförmigen Öffnung von 10 mm Durchmesser befestigt, wodurch ein mehrschichtiges Analysen-Diapositiv für die Glucose-Bestimmung erhalten wurde.

Bei der Bestimmung der Färbeeigenschaften des so hergestellten mehrschichtigen Diapositivs zur Glucose-Bestimmung (vgl. Kurve a_ in Fig. 8) und eines Vergleichs-Analysenmaterials, das Glucoseoxidase in der Reagensschicht enthielt und in gleicher Weise wie in

Vergleichsbeispiel 1 hergestellt wurde, (vgl. Kurve b_ in Fig. 8) wurden die in Fig. 8 dargestellten Ergebnisse erhalten.

Die erhaltenen Ergebnisse beweisen die beträchtlich verbesserte Färbewirkung des Analys.enmaterials gemäß
der vorliegenden Erfindung, bei dem die Glucoseoxidase in eine von der Reagensschicht getrennte Schicht eingearbeitet ist. ■

Claims

Patentansprüche

!^Material zur Analyse einer Flüssigkeitsprobe, bei dem auf einen wasserundurchlässigen, lichtdurchlässigen Träger nacheinander eine Reagensschicht, die einen unter der Einwirkung von Hydrogenperoxid einen nachweisbaren Stoff bildenden reaktionsfähigen Bestandteil enthält, eine nicht-poröse lichtabschirmende Schicht und eine poröse Spreitungsschicht aufgebracht sind,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Glucoseoxidase-Enzym in mindestens eine der über der Reagensschicht liegenden Schichten eingearbeitet ist.
2. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Regulierschicht (timing layer) zwischen der Reagensschicht und der nicht-porösen lichtabschirmenden Schicht oder der Schicht, in die die Oxidase'eingearbeitet ist,·angeordnet ist.
3. Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Haftschicht zwischen der nicht-porösen lichtabschirmenden Schicht und der porösen Spreitungsschicht angeordnet ist.
4. Material nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die über der Reagensschicht liegende Schicht ausgewählt ist aus der nicht-porösen lichtabschirmenden Schicht, der porösen Spreitungsschicht, der Regulierschicht, der Haftschicht und der Schicht, in die die Oxidase eingearbeitet ist.