AT347044B - Teststreifen oder testfilme als indikator fuer enzymatische nachweisreaktionen - Google Patents

Description

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   In der DE-OS 2205733 ist ein Verfahren zur Herstellung des   9- (Y-Aminopropyl)-3-amino-carbazols der   Formel 
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 sowie seiner Salze mit organischen oder anorganischen Säuren beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man an eine Verbindung der allgemeinen Formel 
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 in welcher X ein Wasserstoffatom, eine gegebenenfalls acylierte Aminogruppe oder eine Nitrogruppe darstellt, Acrylnitril unter Bildung der entsprechenden   9-jS-Cyanäfhylverbindung   anlagert, für den Fall, dass X ein Wasserstoffatom darstellt, zur Einführung einer Nitrogruppe in 3-Stellung des Carbazolringes nitriert, die Cyanogruppe zur   Gruppe-CH-NH, ebenso   wie auch die gegebenenfalls vorhandene Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, und gegebenenfalls die Aminogruppe deacyllert, und die erhaltenen Verbindungen (I)

   gewünschtenfalls mit organischen oder anorganischen Säuren in Salze   überführt.   



   Das   9-     (') I-Aminopropyl) -3-amino-carbazol ist   ein geeigneter Indikator für den enzymatischen Glucosenachweis, der zusammen mit andern Oxydationsindikatoren, insbesondere mit o-Tolidin, in weiten Grenzen temperaturunabhängige und damit reproduzierbare Farbwerte je nach Glucosekonzentration liefert. Darüber hinaus wird dieser Indikator durch ständige Bestandteile des Urins, wie z. B. Acetessigsäure oder Ascorbinsäure, nicht beeinflusst, so dass die Testpapiere mit diesem Indikator ein gutes Harndiagnostikum sind. 



   Es wurde nun gefunden, dass Teststreifen oder Testfilme mit neuen 9-substituierten 3-Amino-carbazolDerivaten der allgemeinen Formel 
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 in welcher X Wasserstoff oder ein Halogenatom, Y ein Sauerstoffatom oder zwei Wasserstoffatome, R und   R2   unabhängig voneinander je Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe, die gegebenenfalls durch eine Hydroxygruppe substituiert sein kann, bedeuten, wobei ferner einer der beiden Reste    R1   und   R,   auch für eine Aminogruppe stehen kann, und in welcher n die Zahlen 1 oder 2 bedeutet, wobei für den Fall, dass n die Zahl 2 bedeutet, X, Y, R1   und IL   nicht gleichzeitig Wasserstoff sein dürfen,

   und deren Salze mit organischen und anorganischen Säuren als Teststreifen zur Glucosebestimmung hervorragend und bezüglich bestimmter Parameter noch besser als das bekannte   9" (Y-Aminopropyl)-3-amino-oarbazol   geeignet sind. 



   Die Herstellung von Teststreifen bzw. Testfilmen unter Verwendung der Verbindungen der Formel   (1')   erfolgt wie in der genannten DE-OS beschrieben, wobei auch die dort angegebenen Rezepturen eingesetzt werden können. 

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   Die erfindungsgemäss verwendeten Indikatoren können auch zusammen mit o-Tolidin angewendet werden, ohne dass daraus eine grössere Störanfälligkeit der Testpapiere resultieren würde. Diese Kombination führt manchmal zu besseren Farbabstufungen. Bei der Bestimmung von Glucose im Blut oder Serum erhält man dann je nach dem verwendeten Indikator   (1')   gelbe bis rote Färbungen (bei niedrigem Glucosegehalt) ; bei höheren Glucosegehalten tritt die blaue bis grüne Farbe des o-Tolidin-Radikals auf. 



   Ausser den in der genannten DE-OS aufgeführten Phosphat- und Citrat-Puffern kommen auch weniger gebräuchliche Puffer, wie z. B. 3, 3-Dimethyl-glutarat, Mellithat und Äthylendiamintetraessigsäure sowie die sogenannten Good-Puffer in Frage, sofern sie im pH-Bereich von 4, 5 bis 7 wirksam sind. 



   Zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen   Forme ! (1')   wird so verfahren, dass man in einer Verbindung der allgemeinen Formel 
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 gangsverbindung der allgemeinen Formel   (IT)   ausgegangen wurde, in welcher A für die Gruppe der Formel 
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 steht, gleichzeitig oder anschliessend mit einer Verbindung der allgemeinen Formel 
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 in welcher    R1     und R2   die oben angegebene Bedeutung haben, umsetzt, woraufhin man die erhaltenen Verbindungen der allgemeinen Formel (I') gewünschtenfalls mit organischen oder anorganischen Säuren in ihre Salze   überführt.   



   Als Halogenatome kommen Fluor, Chlor, Brom und Jod in Frage, bevorzugt jedoch Chlor. 



   Die niederen Alkylgruppen enthalten 1 bis 4 Kohlenstoffatome. 



   Bei der Umsetzung mit Verbindungen der allgemeinen Formel (V) werden diese zweckmässig im Überschuss eingesetzt, so dass die Verwendung von Lösungsmitteln überflüssig wird. 



   Reaktiv veresterte oder verätherte Hydroxylgruppen Z sind Halogenide, insbesondere Chloride und Bromide, sowie Alkylsulfonate, Tosylate, Brosylate bzw. niedere Alkoxygruppen mitl bis 3 Kohlenstoffatomen. 



   Die zur Gewinnung der Ausgangsstoffe durchzuführende Nitrierung wird mit üblichen Nitrierungsmitteln vorteilhaft in Eisessig und Salpetersäure bewirkt. Die Nitrogruppe kann dann katalytisch, beispielsweise mit Raney-Nickel, zur Aminogruppe reduziert werden. 



   Die Verbindungen der Formel (I') werden im allgemeinen mit Säuren in einfache oder Doppelsalze überführt. 



   Als Säuren kommen beispielsweise in Frage : Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure, Borsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Benzoesäure, Malonsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Buttersäure, Propionsäure. 



   Die folgenden Vorschriften 1 bis 7 sollen zur weiteren Erläuterung für die Herstellung der neuen Ver- 

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 bindungen   dienen ; die   Beispiele 1 bis 5 zeigen Einsatzmöglichkeiten der erfindungsgemäss ausgebildeten Testpapiere und Testfilme. 



   Vorschrift 1: 9-(Carbamidomethyl)-3-aminocarbazol
29, 83 g (0,1 Mol) 9-(Carbäthoxymethyl)-3-nitrocarbazol werden in 375 ml 6 n methanolischem Ammoniak in Gegenwart von 10 ml   Raney-Nickel   4 h bei   500C   unter 10 bar mit Wasserstoff hydriert. Nach Absaugen vom Katalysator und Einengen im Vakuum erhält man   27, 3 g hellbraune   Kristalle. Nach dreimaligem Umkristallisieren aus Isopropanol werden 8, 23 g (34, 3% d.   Th.)   reines 9- (Carbamidomethyl)-3-aminocarbazol als beigefarbene Kristalle (Schmp. 220 bis   2220C)   isoliert ; aus den Mutterlaugen können noch weitere Anteile gewonnen werden. 



   Gesamtausbeute zirka 50% d. Th. 



   Den als Ausgangsprodukt verwendeten Nitrocarbazolester erhält man wie folgt :   50, 6   g (0, 2 Mol) 9-(Carbäthoxymethyl)-carbazol (Schmp. 97 C) werden in einem mit Rührer, Kühler, Tropftrichter und Thermometer versehenen 500 ml-Dreihalskolben in 200 ml Eisessig gelöst und im Ölbad auf   80 C   erwärmt. Danach tropft man unter Rühren bei   800C   eine Mischung von   13, 2 ml65o/oiger   Salpetersäure (zirka 0, 2 Mol) und 40 ml Eisessig in die essigsaure Lösung des Esters und rührt 30 min nach. Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur wird auf 11 Wasser gegossen, die gebildeten Kristalle abgesaugt, gut mit Wasser gewaschen und das dunkelgrüne Rohprodukt aus Aceton umkristallisiert. Man erhält 25,8 g (41,1% d.Th.) 9-(Carbäthoxymethyl)-3-nitrocarbazol als gelbe Kristalle vom Schmp. 1630C.

   Aus der Mutterlauge kann noch weiteres Produkt isoliert werden. 



   Vorschrift 2: 9-(ss-Dimethylaminoäthyl)-3-aminocarbazol
In einer 1   1-Schüttelapparatur   werden   25 g (0, 0725Mol) 9- (ss-Dimethylaminoäthyl)-3-nitrocarbazolin   200 ml 4, 2 n methanolischem Ammoniak mit zirka 17 g Raney-Nickel 3 h 16 min bei 23 bis   250C   hydriert. Nach Absaugen vom Katalysator und Waschen mit Methanol erhält man nach Einengen des Filtrats 12,75 g öliges Produkt. Dieses wird in Isopropanol gelöst und tropfenweise unter Eiskühlung mit ätherischer Salzsäure versetzt. Das gebildete Dihydrochlorid wird abgesaugt und bei   600C   im Trockenschrank getrocknet. Man erhält 16,25 g 9- (ss-Dimethylaminoäthyl)-3-aminocarbazol als Dihydrochlorid.

   Nach Umkristalli- 
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 1433   [19411)   in 100 ml Eisessig und tropft eine Lösung von 8,28 ml (0,2 Mol) wasserfreier Salpetersäure in 50 ml Eisessig bei 15 bis   200C   zu. Es wird noch 1 h bei 20 bis   250C   nachgerührt, dann auf 500 ml Eiswasser gegossen, die ausgefallenen grünen Kristalle abgesaugt, gut mit Wasser gewaschen und bei   800C   im Trockenschrank getrocknet. Ausbeute 32, 4 g (94% d.   Th.   ; Schmp.   1900C   (Zers.). 



   Vorschrift 3 :9-(ss-Dimethylaminoäthyl)-6-chlor-3-aminocarbazol
38 g (0,1 Mol) 9-(ss-Dimethylaminoäthyl)-6-chlor-3-nitrocarbazol werden in 1   l   Methanol in Gegenwart von 30 ml Raney-Nickel innerhalb 3 h bei 18 bis   230C   unter Normaldruck hydriert. Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff wird die Hydrierung abgebrochen und aufgearbeitet. Das Rohprodukt wird in 200 ml Methanol gelöst und unter Kühlung mit 150 ml 6 n ätherischer Salzsäure versetzt, die Fällung des Dihydrochlorids durch Zugabe von Äther vervollständigt. Das Salz wird in Wasser gelöst, dreimal unter Erwärmen mit Kohle behandelt und die geklärte Lösung abgesaugt. Nach Einengen des wässerigen Filtrates wird der Rückstand in Methanol gelöst und das Dihydrochlorid durch Zugabe von Äther zur Kristallisation gebracht.

   Nach Absaugen und Trocknen erhält man 30, 1 g (80,1% d.Th.) 9-(ss-Dimethylaminoäthyl)-6-chlor-   - 3-aminocarbazol   als Dihydrochlorid vom Schmp. 2800C   (Zers.).   



   Die als Ausgangssubstanz verwendete Nitroverbindung wird wie folgt hergestellt :
In einem 500 ml Dreihalskolben mit Rührer, Kühler, Thermometer, Claisenaufsatz, Tropftrichterund Calciumchlorid-Rohr werden 10 g (0, 24 Mol) Natriumamid in 100 ml trockenem Toluol suspendiert, auf   900C   erwärmt und 48 g (0, 24 Mol)   3-Chlorcarbazol   (erhalten durch Umsetzung von 1 Mol Carbazol mit 1, 3 Mol Sulfurylchlorid in   Chloroform ; Ausbeute :   40% d. Th.) zugegeben und innerhalb 30 min unter Rühren 26, 8 g (0, 25 Mol)   jS-Dimefhylaminoäfhylchlorid zugetropft   und 5 h unter Rückfluss gekocht. Nach dem Erkalten werden vorsichtig 30 ml Wasser zugetropft, die Toluolschicht abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Man erhält 65 g braunes Öl.

   Nach Destillation im Vakuum erhält man 59, 6 g (91, 5% d.   Th.)   9-(ss-Dimethylaminoäthyl)-3-chlorcarbazol als gelbes Öl, Kp. 2198 bis   2010C.   



     54, 4   g (0, 2 Mol) der erhaltenen Carbazol-Verbindung werden in 250 ml Eisessig gelöst, unter Kühlung bei 5 bis   100C   innerhalb 50 min eine Lösung von 16, 6 ml (0, 4 Mol) Salpetersäure (d   =1, 51) in   100 ml Eisessig zugetropft. Nach   1stündigem   Rühren bei 0 C wird die gebildete Nitroverbindung abgesaugt, mit 2 x 50 ml Äther gewaschen und das Rohprodukt aus einer Mischung Methanol-Wasser (2 : 1) oder Aceton- 
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<tb> 
<tb> 



  7)1, <SEP> 2 <SEP> m <SEP> Citratpuffer <SEP> pH <SEP> 5 <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> ml
<tb> 9- <SEP> (&gamma;-Dimethylaminopropyl)-6-
<tb> -chlor-3-aminocarbazol-dihydrochlorid <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> g
<tb> Glucoseoxydase <SEP> (104 <SEP> U/mg) <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Peroxydase <SEP> (63 <SEP> U/mg) <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> ad <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ml <SEP> 
<tb> 
 

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Das Testpapier reagiert mit glucosehaltigem Urin mit rotorangen bis schwärzlich roten Farbtönen. 



  Urine verschiedener Herkunft sowie acetessigsäurehaltige Urine der gleichen Glucosekonzentration zeigen im Farbton keine ins Gewicht fallende Abweichung. 



   Beispiel2 :VerwendetmaninderRezepturvonBeispiel1alsIndikatorenje0,02Molderfolgenden Indikatoren, so erhält man Testpapiere mit praktisch gleichen Eigenschaften und lediglich andern Reaktionfarben :   9-   (ss-Dimethylaminoäthyl)-6-chlor-3-aminocarbazol-dihydrochlorid (Farbabstufungen von ocker über sepia nach schwarz)   9-   (ss-Dimethylaminoäthyl)-3-aminocarbazol-dihydrochlorid (Farbabstufungen von gelb über sepia nach schwarz). 



   Beispiel 3 : Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und bei   500C   getrocknet. 
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<tb> 
<tb> 



  1 <SEP> m <SEP> Citratpuffer <SEP> pg <SEP> 6 <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> ml
<tb> 9- <SEP> (j3-Dimethylaminoäthyl)-3-
<tb> - <SEP> aminocarbazol-dihydrochlo- <SEP> 
<tb> rid <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> o-Tolidin <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Glucoseoxydase <SEP> (104 <SEP> U/mg) <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Peroxydase <SEP> (63 <SEP> U/mg) <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> g <SEP> 
<tb> Natriumlaurylsulfat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Äthanol <SEP> 33, <SEP> 0 <SEP> ml <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> ad <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ml <SEP> 
<tb> 
 
Das Testpapier liefert mit glucosehaltigen Urinen Farbabstufungen von gelb über braunoliv nach grün. 



  Urine verschiedener Herkunft sowie acetessigsäurehaltige Urine der gleichen Glucosekonzentration zeigen keine ins Gewicht fallenden Farbabweichungen. 



   Beispiel 4 : Testfilme zum Nachweis von Glucose im Blut
Bestandteile : 
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Die Bestandteile werden gut gemischt, in einer Schichtdicke von 300   jn   auf   PVC-Folie   ausgestrichen und 35 min bei   600C   getrocknet. Auftropfen von glucosehaltigem Blut und Abwischen desselben nach 1 min liefert nach weiteren 2 min folgende temperaturunabhängige Reaktionsfarben : 
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<tb> 
<tb> 60 <SEP> mg% <SEP> Glucose <SEP> - <SEP> bräunlich <SEP> rot
<tb> 120 <SEP> mg% <SEP> Glucose <SEP> - <SEP> braunrot <SEP> 
<tb> 180 <SEP> mg% <SEP> Glucose-dunkeloliv
<tb> 
 

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240   mg%   Glucose und   mehr - grün   mit wachsender Farbtiefe. 



   Die Zeichnung zeigt bei 20 und   3500   mit einem handelsüblichen Remissionsphotometer gemessene Eichkurven. 



   Beispiel 5 : Testfilme gemäss Beispiel 4, die an Stelle von 0,035 g 9-[(ss-Hydroxyäthyl)-aminocarbonyläthyl]-3-aminocarbazol-hydrochlorid 0,025 g 9-(ss-Carbamidomethyl)-3-aminocarbazol (A) oder 0, 034 g 
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    (ss-Dimethylaminoäthyl) -3-aminocarbazol-dihydrochlorid- aminocarbazol (0)   enthalten, reagieren mit glucosehaltigem Blut in temperaturunabhängiger Reaktion mit folgenden Farben : 
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<tb> 
<tb> mg% <SEP> Glucose <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> 
<tb> 60 <SEP> bräunlich <SEP> rot <SEP> beige <SEP> bräunlich <SEP> rot
<tb> 120 <SEP> oliv <SEP> grünlich <SEP> beige <SEP> braunoliv
<tb> 180 <SEP> bräunlich <SEP> grün <SEP> gelblich <SEP> grün <SEP> braungrün <SEP> 
<tb> 240 <SEP> und <SEP> mehr <SEP> grün <SEP> mit <SEP> wachsender <SEP> Farbtiefe
<tb> 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Teststreifen oder Testfilme als Indikator für enzymatische Nachweisreaktionen, gekennzeichnet durch einen Gehalt an neuen 9-substituierten 3-Aminocarbazol-Derivaten der allgemeinen Formel EMI6.3 in welcher X Wasserstoff oder ein Halogenatom, Y ein Sauerstoffatom oder zwei Wasserstoffatome, EI und E, unabhängig voneinander je Wasserstoff, eine niedere Alkylgruppe, die gegebenenfalls durch eine Hydroxygruppe substituiert sein kann, bedeuten, wobei ferner einer der beiden Reste Ei und B2 auch für eine Aminogruppe stehen kann, und in welcher n die Zahlen 1 oder 2 bedeutet, wobei für den Fall, dass n die Zahl 2 bedeutet, X, Y, Ri und B2 nicht gleichzeitig Wasserstoff sein dürfen, und deren Salze mit organischen und anorganischen Säuren.