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Verfahren und diagnostisches Reagenz zur Bestimmung von
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Wasserstoffperoxid, unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagierenden
Substanzen sowie peroxidatisch wirkenden Substanzen Gegenstand der Erfindung sind
Verfahren und diagnostisches Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid bzw.
von unter Wasserstoffperoxidbildung reagierenden Substanzen sowie von Peroxidase
und peroxidatisch wirkenden Substanzen durch Messung der gebildeten Färbung eines
Chromogens, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen
Formel I in Lösungsmitteln der allgemeinen Formel II gelöst verwendet werden, in
welchen R1 und R2 Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe, R3 und R4 eine niedere
Alkylgruppe und R5 und R6 eine niedere Alkylgruppe oder Arylgruppe bedeuten, X gleich
C oder S Es ist bekannt, daß Substanzen der allgemeinen Formel I in wässrigem Milieu
durch Luftsauerstoff oder Wasserstoffperoxid zu stark gefärbten Verbindungen, wie
Chinonimine oxidiert werden. Diese wässrigen Lösungen sind aber völlig instabil
und können daher für eine quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid bzw. unter
Wasserstoffperoxidbildung reagierenden Substanzen nicht verwendet werden.
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Es ist ferner bei zwei Substanzen der allgemeinen Formel I bekannt
(B.A,Bowie et al., Offenlegungsschrift 26 53 821 v.
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30.6.77 Offenlegungstag / G 01 N 33/16 ), daß diese in Di -methylsulfoxid
eine stabile Lösung bilden. Die Lösung dient zum Nachweis bestimmter Mikroorganismenkolonien.
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Ferner ist bekannt, daß Sulfoxide mittels Wasserstoffperoxid
leicht
in Sulfone umgewandelt werden können. Hierbei wird das Wasserstoffperoxid zu Wasser
reduziert. Auch die Ketone (Formel II : X gleich C) können, wenn auch nicht so leicht,
oxidativ umgewandelt werden. Ferner zeigen die beiden Substanzklassen R5-CO-R6 und
R5-SO-R6 in reiner Form eine Enzymhemmwirkung.
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Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß mit der erfindungsgemäßen
Ohromogenlösung trotz relativ zum vorhandenen bzw. gebildeten Wasserstoffperoxid
großen Substanzilberschusses der allgemeinen Formel II das Wasserstoffperoxid bzw.
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unter Wasserstoffperoxidbildung reagierende Substanzen quantitativ
und mit höchster Empfindlichkeit über die Verfärbung der Lösung bestimmt werden
können. Die Farbe erreicht bei vorhandenem Wasserstoffperoxid und Peroxidase bzw.
peroxi -datisch wirkenden Substanzen nach wenigen Sekunden einen der Wasserstoffperoxidmenge
proportionalen Endwert. Bei Bildung des Wasserstoffperoxides in der Reagenzlösung
mit Hilfe von Enzymen welche mit bestimmten Substanzen in biologischen Proben wie
z.B. Blut, Plasma, Serum oder Urin und Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid
reagieren, wird der Parbendwert nach wenigen Minuten erreicht. Der S lare Ex -tinktionskoeffizient
ist mit> 30 000 ungewdhLlich hoch (Beispiel N,N,N' ,N' -Tetramethyl-p-phenylendiammoniumchlorid
in iimetbylsulfoxid). Hierdurch ist die rasche, exakte und hochempiindliche Bestimmung
obiger Substanzen in biologischen Proben mdglic... Derartige Messungen sind in der
klinischen Chemie und Lebensmittelchemie von größter Bedeutung.
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Vorzugsweise findet das erflndungsgem§ße Verfahren und Reagenz Anwendung
zur enzymatischen Bestimmung von Glucose, Galactose, Cholesterin, Aminosäuren, Triglyceriden,
Bilirubin, Harnsäure,
Xanthin sowie Peroxidase bzw. peroxidatisch
wirkenden Substanzen.
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Gegenüber bekannten Verfahren x) zur Wasserstoffperoxid -bestimmung
hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß eine stabile, gebrauchsfertige
Chromogenlösung eingesetzt werden kann, die trotz ihrer Stabilität auch gegenüber
Luftsauerstoff den Nachweis von Wasserstoffperoxid mit höchster Empfindlichkeit
zuläßt Die Störanfälligkeit von mit dem erfindungsgemäßen Chromogen durchgeführten
Testen durch Komponenten der biologischen Probe ist ferner vernachlässigbar gering,
wahrscheinlich darauf beruhend, daß es sich bei dem erfindungsgemäßen Chromogen
um ein Einkompo -nentensystem handelt.
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Ein weiterer Vorteil liegt in der Möglichkeit, durch Variation der
Enzymmenge bereits nach 1 min zu stabilen Farbendwerten zu gelangen. Damit ist das
erfindungsgemäße Verfahren und Reagenz nicht nur stabil und sehr empfindlich, sondern
auch ausgesprochen schnell durchführbar. Dieser Vorteil spielt besonders bei den
neueren Analysenautomaten eine entscheidende Rolle.
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X)Emerson, US-PS 2 194 201: Phenol + 4-Aminophenazon; Gochman et al.
,Clin.Chem. 18,1972,5.943: 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon + N,N-Dimethylanilin;
P.U.Nix et al.,OS 30 03 490 v.
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14.8.80: 4-Aminophenazon + 3-N,N-Dimethylaminobenzoesäure; Erinder,Analyst
Vol,97,1972,S.142: 4-Aminophenazon + 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure; Haeckel,Auslegeschrift
24 50 726 v,22,5,80: Alkohol + Katalase + NAD+ + AlDH; Rey et al.,OS 19 17 996 v.
15. 10.70:Äthylbenzoxazolon-azin-Derivat + p-Aminosalicylsäure,
Neben
der guten Stabilität und hohen Sensibilität besitzt die erfindungsgemäße Chromogenlösung
die Vorteile, einen sehr gut löslichen Farbkomplex (charge transfer complex) bei
der Oxidation zu bilden (kein Ausflocken), dessen Absorptionsmaxima im langwelligen
Spektralbereich oberhalb 500 nm hauptsächlich liegen. Damit liegt der Meßbereich
außerhalb der störenden Eigenfärbung biologischer Proben wie Serum, Plasma oder
Urin mit Absorptionen von 460 nm für Bilirubin und 404 nm für Hämoglobin (R.Richterich,
Klinische Chemie, 3.Auflage, S.140/141).
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Ferner spielen durch Eigentrübung der biologischen Proben bedingte
Meßfehler bei einer Messung oberhalb von 500-550 nm praktisch keine Rolle mehr.
Hinzu kommt, daß das Lösungsmittel der allgemeinen Formel II des erfindungsgemäßen
Chromogens die Eigentrtibung der biologischen Proben vermindert.
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Der Zusatz von Substanzen der allgemeinen Formel III nach Anspruch
7 ist für die eigentliche Farbreaktion des erfindungsgemäßen Chromogens nicht unbedingt
erforderlich. Es konnte aber nachgewiesen werden, daß der Zusatz derartiger Substanzen
die Stabilität der Chromogenlösung noch weiter 7-rbessern kann.
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Der Zusatz erfolgt vorzugsweise so, daß die Chr.ogen- oder Reagenzlösung
0,01 - 1 óig an der Zusatzsubstanz ist.
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Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Reagenzien sind
in den folgenden Beispielen näher erläutert:
Beispiel 1 Glucosebestimmung:
0,5 ml der Chromogenlösung (0,5 mMol/l N,N,N',N'-Tetramethyl-p-phenylendiammoniumsulfat
in 95% Dimethylsulfoxid/ 5% Wasser gelöst) werden mit 2,0 ml Trispuffer 0,1 Mol/l
pH 7,0 (0,1%ig an Äthylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz sowie 0,1%ig an p-AminobenzoesCure;
11kU/l Glucose oxidase; 700 U/l Peroxidase) gemischt und bei 20-25 0C 10 M1 der
auf Glucose zu prüfenden Probe hinzugegeben. Der nach etwa 10 min gebildete Farbendwert
kann im Spektral -photometer im Maximum bei 565 nm und 615 nm bzw. bei einem Filterphotometer
bei 578 nm oder 623 nm gemessen werden.
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Die Berechnung der Glucosekonzentration erfolgt entweder mit Hilfe
des molaren Extinktionskoeffizienten (für 565 nm 36 000) oder im Vergleich der Extinktionen
nach Zugabe einer Glucosestandardlösung zu einem zweiten Testansatz.
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Gute Ergebnisse wurden auch mit 2,0 ml der obigen Pufferlösung erzielt,
die nur 1000 U/l Glucoseoxidase und 100 U/l Peroxidas neben den anderen Bestandteilen
enthielt.
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Beispiel 2 Harnsäurebes timmung: 0,5 ml der Chromogenlösung (0,4 mMol/l
N,N,N',N'-Tetramethylp-phenylendiammoniumchlorid in 90% Dimethylketon /10% 0,1 M
Trispuffer pH 7,0) werden mit 1,5 ml Trispuffer (0,1 Mol/l; 0,1%ig an Äthylendiamintetraessigsäure
Dinatriumsalz 150 Ull Peroxidase ) gemischt, und anschließend 50pl der auf Harz
säure
zu prüfenden Probe hinzugegeben und die Reaktion mit 20 rl einer Urikaselösung (
1000 U/l in Glycerin-Wasser 1:1) gestartet. Die Ablesung der Extinktion erfolgt
nach 10 min bei 20-25°C entweder im Absorptionsmaximum von 565 nm bzw.
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515 nz oder bei Filterphotometembei 578 nm oder 623 nm. Die molare
Extinktion beträgt für 565 nm 34 000 . Die Berechnung der Harnsäurekonzentration
kann auch im Vergleich mit der Extinktion einer Harnsäurestandardlösung erfolgen.
Bei niedrigen Harnsäurekonzentrationen empfiehlt es eich, vor der Berechnung von
der Extinktion den Reagenzienleerwert (Ansatz ohne Probe) abzuziehen.
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Beispiel 3 Cholesterinbestimmung: 0,75 ml der Chromogenlösung (1 mMol/l
N,N-Diäthyl-p-phenylendiamindihydrochlorid in 8096 Diäthylsulfoxid/2096 0,1 M Tris
-puffer pH 7,4 , 0,2 96ig an Äthylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz) werden
mit 1,5 ml Trispuffer 0,1 Mol/l pH 7,4 (500 U/l Cholesterinesterase, 95 Ull Cholesterinoxidase,
460 U/l Peroxidase, 0,1,'ig an Triton X-100) bei Raumtemperatur gemischt und 10
pl der zu untersuchenden Probelösung ugegebcn.
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Die molare Extinktion beträgt für 554 nm 35 500. Die Messung kann
ebenfalls im zweiten Absorptionsmaximum bei 520 nm sowie mit dem Filter 546 nm erfolgen.
Eine Berechnung der Cholesterinkonzentration ist auch im Vergleich mit der Extinktion
nach Zugabe einer Cholesterinstandardlösung zur Testmischung möglich.
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Beispiel 4 Harnsäurebestimmung: 1,0 ml der Chromogenlösung (5 mMol/l
N,N-Diäthyl-p-phenylendiamindihydrochlorid in 5096 Dimethylsulfoxid/ 5096 0,1 M
Trispuffer pH 8,0 , 0,4%ig an Äthylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz) werden
mit 1,0 ml 0,05 Mol/l Trispuffer pH 8,0 (500 U/l Peroxidase, 500 U/l Uricase) und
50 ul der auf Harnsäure zu prüfenden Probe bei Raumtemperatur gemischt. Die Ablesung
kann bereits nach 1 min als Endwert erfolgen. Die molare Extinktion beträgt für
554 nm 34 000. Die Berechnung kann auch im Vergleich mit der Extinktion einer Harnsäurestandardlösung
erfolgen. Bei niedrigen Harnsäurekonzentrationen empfiehlt es sich, vor der Berechnung
den Reagenzienleerwert (Ansatz ohne Probe) von der Extinktion abzuziehen.
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Beispiel 5 Kinetische Substratbestimmung am Beispiel Harnsäure: 1,0
ml der Chromogenlösung (10 niMol/l N,-Diäthyl-p-phenylendiamindihydrochlorid in
50',?b Dimethylketon j 50% 0,1 M Phosphatpuffer pH 8,5 , 0,3%ig an Äthylendiaminteraessigsäure
Dinatriumsalz) werden mit 1,0 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 8,5 ( 500 U/l Peroxidase)
und 50 ul der auf Harnsäure zu prüfenden Probe gemischt, Die Reaktion wird bei 25
durch 7ugabe von 10 ul Uricase (4 U/ml ) gestartet. Es wird die Extinktion jeweils
nach 1 min dreimal bei 554 nm gemessen. Die Berechnung der Harnsäurekonzentration
erfolgt durch Vergleich der gefundenen
Etinkctonszunahme/min mit
der einer Harzsäure -standardlösung oder Harnsälareechreihe.
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Beispiel 6 Interaktionsstudien mit einigen potentiellen Störfaktoren:
Zusatz in In Prozent der reinen Standardlösung mg/dl Probe Glucose Harnsäure Cholesterin
Bilirubin(IOmg/dl) 101 102 98 Natriumascorbat 95 100 97 (50 mg/dl) Acetylsalicylsäure
99 99 100 (100 mg/dl)