DE2446099A1 - Bestimmung der harnsaeure - Google Patents
Bestimmung der harnsaeureInfo
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/62—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving uric acid
Description
RAN 4O9lA
F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Bestimmung der Harnsäure
Die vorliegende Erfindung betrifft eine automatisierte,
enzymatisch^ Harnsäure-BeStimmung mit Messung im sichtbaren Bereich und ein für die Durchführung der Methode geeignetes Testsystem.
enzymatisch^ Harnsäure-BeStimmung mit Messung im sichtbaren Bereich und ein für die Durchführung der Methode geeignetes Testsystem.
Es besteht seit langer Zeit das Bedürfnis für eine spezifische
quantitative Methode zur Bestimmung von Harnsäure in biologischen
Flüssigkeiten, wie z.B. Urin, Blut bzw. Serum oder
Plasma, die spezifisch ist, nur eine kleine Menge an Untersuchungsmaterial benötigt, billig genug ist um Massenuntersuchungen zu ermöglichen, keine besondere technische Ausbildung verlangt, und somit für die klinische Verwendung gut geeignet ist. Zusätzlich wird als besonders wünschenswert betrachtet, dass eine derartige Methode sich für ein automatisches System das mit kontinuierlicher Probenströmung arbeitet, eignet, so dass eine grosse Anzahl Proben schnell und mit grosser Genauigkeit analysiert
werden kann.
Plasma, die spezifisch ist, nur eine kleine Menge an Untersuchungsmaterial benötigt, billig genug ist um Massenuntersuchungen zu ermöglichen, keine besondere technische Ausbildung verlangt, und somit für die klinische Verwendung gut geeignet ist. Zusätzlich wird als besonders wünschenswert betrachtet, dass eine derartige Methode sich für ein automatisches System das mit kontinuierlicher Probenströmung arbeitet, eignet, so dass eine grosse Anzahl Proben schnell und mit grosser Genauigkeit analysiert
werden kann.
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Es besteht ein Bedürfnis für ein automatisches System, welches
mit kontinuierlicher Probenströmung arbeitet und bei der diagnostischen Untersuchung von einer grossen Anzahl Menschen
auf die Anwesenheit von pathologischen Mengen an Harnsäure in ihrem Blut, hochgenaue Ergebnisse liefert. Die Harnsäure stellt
beim Menschen das Endprodukt des Purinabbaus dar und wird deshalb physiologischerweise im Blut aufgefunden. Bei zahlreichen
Erkrankungen kommt es zu einer Erhöhung bzw. Erniedrigung der Harnsäure-Konzentration, sodass das Feststellen einer
Abweichung vom physiologischen Harnsäurespiegel im Blut ein äusserst wichtiger diagnostischer Hinweis für den Arzt ist.
So werden z.B. bei folgenden Erkrankungen Erhöhungen der Harnsäure-Konzentration gefunden: Gicht, schwere Pneumonien
mit ausgedehnten Gewebsζerstörungen, Leukämie, Perniciosa;
eine Erniedrigung wird z.B. bei der toxischen Schädigung der Nierentubuli bei der Wilson-Erkrankung gefunden.
Aus diesem Grund ist es wichtig, eine automatisierte Methode zur Harnsäurebestimmung zur Verfügung zu stellen,
welche gleichzeitig einfach und genau ist und als Ergänzung zu Routineuntersuchungen in Kliniken oder zu periodischen
Untersuchungen von Kranken in Spitälern oder Pflegeheimen usw. dienen kann.
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Die bekannten Methoden zur Bestimmung von Harnsäure können im weiteren Sinn in enzymatische Methoden, Methoden,
worin ein Alkalimetallsalz von Phosphorwolframsäure verwendet wird und verschiedene chemische kolorimetrische
Methoden, eingeteilt werden. Die enzymatischen Methoden worin das Enzym "Uricase verwendet wird, haben den Nachteil, dass
die Messung im U.V.-Gebiet durchgeführt wird, wodurch mit teuren Quarzkixvetten und mit einem Spektralphotometer gearbeitet
werden muss. In der Methode, worin ein Alkalimetallsalz der Phosphorwolframsäure Verwendung findet, wird zwar
im sichtbaren Bereich gemessen, jedoch hat diese Methode den Nachteil, dass andere reduzierend wirkende Komponenten miterfasst
werden, was zu hohe und damit falsche Messwerte ergibt.
Vor kurzem wurde von G.F. Domagk und H.H. Schlicke
in Analytical Biochemistry 22, 219-224 (1968) eine besonders interessante Methode zur enzymatischen Bestimmung von Harnsäure
beschrieben, welche den Vorteil der spezifischen enzymatischen Bestimmung mit dem Vorteil der Messmöglichkeit im
sichtbaren Bereich kombiniert. Gemäss dieser Methode wird in einem ersten Schritt Harnsäure mit Uricase in Allantoin und
Wasserstoffperoxid umgewandelt.
I H
j,
0+2H2O+O2
+CO +H 0 2 2 2
Harnsäure
Allantoin
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Anschliessend wird eine Indikatorreaktion angekoppelt, wobei ' das entstandene Wasserstoffperoxid unter katalytischer Einwirkung
von Peroxidase ein in der Leucoform vorliegendes Chromogen zum Farbstoff oxidiert. Als Chromogen wird
o-Dianisidin erwähnt
OCH
OCH,
OCH
OCH,
H 0 +HN
2 2 2
2 2 2
+ 2H2°
Einer der Nachteile dieser Methode ist jedoch der zeitraubende Enteiweissungsschritt vor der eigentlichen Durchführung der
Bestimmung. Diese Methode ist für manuelles Vorgehen beschrieben und eignet sich gemäss den Ausführungen von D.Susic und
P.Scheibe, in Z.Anal. Chem. 257* 150-132 (1971) nicht für eine
Automatisierung.
Es wurde nun gefunden, dass sich trotzdem eine einfache automatisierte Methode schaffen lässt, die mit genügender
Empfindlichkeit, sehr hoher Genauigkeit, grossem Linearitätsbereich
und mit in chemischer wie auch in technischer Hinsicht geringer Störanfälligkeit arbeitet.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure in biologischen
Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass man in kontinuierlicher Strömung die folgenden. Schritte nacheinander
durchführt,
a) in kontinuierlicher Strömung eine bestimmte Menge an Probe mit einer VerdUnnungslösung mischt,
b) diese Mischung durch einen Dialysator leitet, wobei eine klare wässerige Lösung von dieser Mischung abgetrennt
wird,
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c) diese klare wässrige Lösung mit einer gepufferten Urieaselösung mit einem pH-Wert zwischen 8,5 und 10 mischt,
d) die gemäss Schritt c) erhaltene wässerige Lösung inkubiert,
e) das Reaktionsgemisch bei einem pH-Wert zwischen
5,5 und 8,5 mit einem unsubstituierten oder kernsubstituierten
Benzidin oder Diphenylin und Peroxidase mischt, dadurch eine gefärbte Lösung erzeugt und
f) diese gefärbte Lösung durch eine Durchflussküvette leitet und den in der Probe vorhandenen Harnsäuregehalt,
während des Fliessens dieser gefärbten Lösung durch die Durchflussküvette, photometrisch bestimmt.
In Schritt a) der erfindungsgemassen Methode kann als
Verdünnungsmittel eine wässerige Lösung von Alkali- oder Erdalkalisalzen, wie z.B. Natriumchlorid, Natriumtetraborat,
Kaliumchlorid oder Calciumchlorid verwendet werden. Besonders bevorzugt wird Natriumchlorid. Die Konzentration an Alkali oder
Erdalkalisalzen hängt vom jeweiligen salz ab. Im Falle
von Natriumchlorid wird eine Konzentration zwischen ungefähr 1,2 bis 2,0 Prozent bevorzugt, wobei eine Konzentration von
ungefähr 1,3 Prozent ganz besonders bevorzugt ist.
In Schritt b) der erfindungsgemassen Methode wird die
Mischung zum Zweck der Enteiweissung durch einen Dialysator geleitet, wobei eine klare wässerige Lösung von dieser Mischung
abgetrennt wird. Die Art des Dialysators ist nicht kritisch. Es wird jedoch bevorzugt, einen Dialysator mit einem Dialysierweg
von 30 bis 100 cm zu verwenden.
In Schritt c) wird in den Dialysator die entproteinisierte
Lösung mit einer gepufferten Urieaselösung vereinigt. Als Uricase werden aus tierischen Organen isolierte Präparate verwendet,
wie z.B. Schweinsleberuricase. Diese Uricase wird vor
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der Reaktion in einen wässrigen Puffer von pH-Wert 8,5 bis 10 aufgelöst. In der Regel kann jede übliche Puffermischung, welche
sich zur Aufrechterhaltung eines derartigen pH-Bereiches eignet, verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch ein Borat-Puffer,
insbesondere ein Natriumtetraborat-Puffer verwendet.
Die Konzentration des Puffers in der Puffer-Uricase-Lösung hängt von dem jeweiligen Puffer ab. Im Falle von Natriumtetraborat
liegt diese Konzentration zweckmässig zwischen 5 und 15 mMol/liter. Besonders bevorzugt wird eine Konzentration von
10 mMol/liter. Die erforderliche Aktivität an Uricase hängt
von dem jeweiligen Puffer ab. Im Falle von Natriumtetraborat liegt diese Aktivität vorzugsweise bei mindestens 2 Einheiten,
wobei 10 Einheiten pro Liter besonders bevorzugt sind.
Zur Vervollständigung der in Schritt c) erfolgten Umwandlung von Harnsäure in Allantoin und Wasserstoffperoxid
wird in Sehritt d) das Reaktionsgemisch inkubiert. Die Temperatur der Inkubation ist nicht kritisch, liegt jedoch
mit Vorteil bei ungefähr 37°C. Die Dauer der Inkubation hängt
von mehreren Parametern ab, wie z.B. von der Temperatur, dem Dialysierweg,und der Uricaseaktivität. Als Inkubationszeit
wird bevorzugt 4 Minuten gewählt.
Nach der Inkubation wird in Schritt e) das entstandene Wasserstoffperoxid unter katalytischer Einwirkung von Peroxidase
mit einem kernsubstituierten oder unsubstituierten Benzidin (4,4'-Diaminobiphenyl) oder Diphenylin (2,4'-Diaminobiphenyl)
zur Reaktion gebracht. Als substituiertes Benzidin eignen sich z.B. o-Dianisidin und o-Tolidin. Diese Leucofarbstoffe werden
in wässeriger Lösung zugegeben. Die Konzentration dieser Leucofarbstoffe ist nicht kritisch und beträgt im Falle von
o-Dianisidin mit Vorteil 1,5 mg/ml. Die Peroxidase wird in Form einer wässerigen, vorzugsweise gepufferten Lösung zugegeben.
Als Peroxidase wird eine solche, welche aus Meerrettich
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isoliert wurde, bevorzugt.
Die Aktivität der Peroxidase in der Lösung hängt von dem jeweiligen Puffer ab beträgt jedoch mit Vorteil mindestens
0,04 Einheiten/ml, wobei 0,4 Einheiten/ml besonders bevorzugt werden. Die Peroxidase-Lösung wird zweckmässigerweise
auf einen pH-Wert zwischen 5,5 und 8,5 gepuffert. Es kann jede übliche Puffermischung, welche sich zur Aufrechterhaltung
eines derartigen pH-Bereiches eignet, verwendet werden. Vorzugsweise wird ein Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5
eingesetzt. Die Reihenfolge der Zusetzung des Leucofarbstoffes,
des Puffers und der Peroxidase spielt keine Rolle, es wird' jedoch vorzugsweise zuerst die Leucofarbstofflösung und anschliessend
die gepufferte Peroxidase-Lösung zugesetzt.
Schliesslich wird in Schritt f) die Extinktion der erhaltenen gefärbten Lösung in einem Photometer gemessen. Im Falle
von o-Dianisidin erfolgt diese Messung zwischen 420 und 460 nm. Die Ergebnisse der photometrischen Messung werden mit einem
geeigneten Registriergerät festgehalten.
Eine Ausführungsform der erfindungsgemässen automatisierten
Methode wird durch Fig. 1 veranschaulicht.
Figur 1 illustriert ein automatisches System mit kontinuierlicher Strömung, worin die zu analysierenden Proben
der Reihe nach aus getrennten Probebehältern vom Probenschlauch 2 gesaugt wird (Durchfluss 0,42 cc/Min)* Der Probeteller 1
dreht mit einer konstanten Geschwindigkeit und liefert dem System 60 Proben pro Stunde mit einem Waschverhältnis von
5:1. Eine auf 'diese Weise angesaugte Probe wird in Strömung mit einer I,j5$-igen Kochsalzlösung (Durchfluss 2,00 cc/Min.)
gemischt und durch eine übliche Mischspule 3 mit 5 Windungen
aus Glas geleitet. Nachdem die Mischung die Mischspule durch-
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flössen hat, wird sie durch einen Dialysator 4 (Dialysierweg
60 cm), welcher mit einer Cellophanmembran oder dgl. versehen
ist, gepumpt, wobei die Harnsäure durch Dialyse in die in den
unteren Teil des Dialysators zugefUhrte (Durchfluss 2,00 cc/Min) gepufferte Uricase-Lösung (pH = 9*5)* übergeht. Nach Durchgang
des Dialysators wird das Reaktionsgemisch bei einer Temperatur von 37°C während 4 Minuten in einem Heizbad 5
inkubiert, wobei die Harnsäure quantitativ zu Allantoin und Wasserstoffperoxid umgesetzt wird. Dem erhaltenen Reaktionsgemisch wird dann in kontinuierlicher Weise eine wässrige
Lösung von o-Dianisidin zugesetzt. (Durchfluss 0,10 cc/Min). Anschliessend wird diese Mischung durch eine Mischspule 6 mit
20 Windungen aus Glas geleitet. Nach Durchfliessen dieser Mischspule 6 wird eine gepufferte wässerige Peroxidase-Lösung
von pH-Wert 7*0 zugesetzt (Durchfluss 0,42 cc/Min), wodurch
die entstandene Mischung einen pH-Wert von 7*5 aufweist. Diese Mischung wird dann durch eine zweite Mischspule 7 mit
20 Windungen geleitet. Bei Durchströmung dieser Mischspule 7 reagiert das Wasserstoffperoxid unter katalytischem Einfluss
der Peroxidase mit dem o-Dianisidin unter Bildung einer gelborangen Färbung. Anschliessend werden in einem Photometer 8
in einer I5 mm Durchflussküvette bei 460 nm photometrische
Messungen durchgeführt, d.h. die Extinktion der zu prüfenden Lösung wird bei 460 nm in einem Photometer mit einer Durchflussküvette
gemessen. Die Ergebnisse der photometrischen Messung werden mit einem geeigneten
Registriergerät 9 festgehalten.
Das System mit kontinuierlicher Strömung, welches durch Fig. 1 illustriert ist, saugt 60 Proben/Stunde an. Die
Materialien, welche in das System einströmen, werden mittels einem geeigneten Pumporgan. 10,welches eingestellt wurde um
die gewünschte Strömungsgeschwindigkeiten aufrecht zu erhalten, in dieses System gepumpt. Zur Vermeidung von Kontaminations-
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einflüssen werden die Verdünnungslösuhg und die gepufferte
Urioase-Lösung durch Luftblasen segmentiert (Durchfluss
0,23 cc/Min). Zur Erzielung eines regelmässigen Blasenmusters
wird diesen beiden Lösungen, sowie der gepufferten Peroxidase
Lösung ein Detergenz zugesetzt. Als Detergenz eignet sich
z.B. Polyoxyäthylensorbitanmonolaurylat (Tween 20). Die Konzentration des zugefügten Detergenz beträgt für die Verdünnungslösung
vorzugsweise 0,25 Prozent, für die beiden anderen Lösungen vorzugsweise 1 Prozent.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die für die erfindungsgemässe Methode erforderlichen
Präparate in eine diagnostische Reagenzgarnitur oder in ein diagnostisches Reagenzsystem verpackt. In einem derartigen
Reagenzsystem, werden die Reagenzien in Mengen verpackt, welche es ermöglichen, Vorratslösungen herzustellen, die für
Massenuntersuchungen geeignet sind. Die Menge an Reagenzien, welche in einem bestimmten Reagenzsystem gebraucht wird, kann
ohne Mühe, in Relation zu der zu untersuchenden Probe, mit Hilfe der vorstehend angegebenen molaren Mengen respektive
Enzymaktivität berechnet werden. Diese Berechnungen sind dem Fachmann geläufig. Beispielsweise kann ein Reagenzsystem die
folgenden spezifischen Verbindungen enthalten:
Reagenz A 10 Einheiten Uricase (Suspension)
(oder Lyophilisat)
Reagenz B 60 mmol Phosphat-Puffer (Granulat)
100 Einheiten Peroxidase (Lyophilisat)
Reagenz C 66 mg o-Dianisidin (Lyophilisat)
Reagenz D 18 ml Tween 20 (viskose Flüssigkeit)
Reagenz E 10 mmol Natriumtetraborat (krist-
allines Pulver)
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Die Haltbarkeit dieser Reagenzien beträgt mindestens 1 Jahr bei 2-8°C.
Weitere Einzelheiten der Erfindung werden an Hand der folgenden Beispiele veranschaulicht. Alle Temperaturen sind
in Grad Celsius angegeben.
Es wurde eine Verdünnungsreihe wässriger Harnsäure Standards hergestellt mit den Konzentrationen 2 mg/lOO ml,
5 mg/lOO ml, 10 mg/lOO ml, 20 mg/lOO ml, 30 mg/l00 ml und
40 mg/lOO ml. Diese Standards werden wie Proben eingesetzt und in der durch Fig. 1 veranschaulichten spezifischen AusfUhrungsform
der erfindungsgemassen Methode bestimmt.
| Tabelle I | Ergebnis in Skalenteilen | |
| Harnsäurekonzentration | ||
| mg/ml | 4,4 | |
| 2 | 11,1 | |
| 5 | 22,3 | |
| 10 | 44,4 | |
| 20 | 65,0 | |
| 30 | 87,3 | |
| 40 | ||
Die Tabelle I beweist, dass mit der erfindungsgemassen
Methode ein gesicherter Linearitätsbereich bis 40 mg/ml gewährleistet ist.
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Es wurde der Harnsäuregehalt von-5 verschiedenen
Kontrollseren mit der durch Pig. I veranschaulichten spezifischen AusfUhrungsform der erfindungsgemässen Methode bestimmt.
Das Ergebnis wird in der nachstehenden Tabellen wiedergegeben,
Serum Jc _s VK _N
a 4,50 0,054 1,20 15
b 4,17. 0,049 1,18 15
c 9,11 0,012 0,13 10
d 4,59 0,032 0,73 10
e 4,88 0,07 1,43 10
χ = Mittelwert mg 'Harnsäure/l00 ml
s as Standardabweichung
VK = Variationskoeffizient {%)
N = Anzahl der in der Serie durchgeführten Bestimmungen
Die Tabelle II zeigt einen durchschnittlichen Variationskoeffizienten von weniger als 1 Prozent und beweist somit die
Präzision der Methode. .
Beispiel
3 *.
Es wurden respektiv 0,93 mg/l00 ml, 1,86 mg/lOO ml und
.2,79 mg/lOO ml an Harnsäure 2 verschiedenen Kontrollsera zugesetzt und der Harnsäuregehalt mit der durch Fig. 1 veranschaulichten
spezifischen Ausfuhrungsform der erfindungs-.gemässen
Methode bestimmt.
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Das Ergebnis wird in der nachstehenden Tabelle III wiedergegeben.
Tabelle III veranschaulicht die Rückgewinnung ('Recovery-Methode') von Harnsäure.
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CJl CD CO 00
| Tabelle II | Gesamtmenge an Harnsäure mg/lOO ml |
Zurückgewonnene Harnsäure mg/lOO ml |
Rückge winnung % |
« | ; | |
| Harnsäure in der Probe mg/lOO ml |
Zugefügte Harnsäure mg/100 ml |
5,43 | 5,39 | 99,3 | H V>J I |
|
| 6,36 | 6,35 | 99,8 | ||||
| 4,50 | 0>93 | 7,29 | 7,30 | 100,2 | ||
| 4,50 | 1,86 | 9,89 | 10,08 | 102 | ||
| 4,50 | 2,79 | 10,82 | 10,99 | 101,5 | ||
| 8,96 | 0,93 | 11,75 | 11,68 | 99,4 | ||
| 8,96 | 1,86 | Durchschnitt | 100,36 | |||
| 8,96 | 2,79 | |||||
QD CD CO CD
Es wurden respektive 10 mg/lOO ml Glutathion, 10 mg/
100 ml Allantoin und 5 mg/lOO ml Kreatinin einem Kontrollserum'
mit einem ursprünglichen Harnsäure-Gehalt von 4,6 mg/lOO ml zugegeben und danach der Harnsäuregehalt erneut mit der durch
Fig. 1 veranschaulichten AusfUhrungsform der erfindungsgemassen
Methode bestimmt.
Das Ergebnis wird in der nachstehenden Tabelle IY wiedergegeben.
509819/0671
Probe
| OI | 1 |
| O | |
| co | 2 |
| OO | |
| co | |
| O | 4 |
| OT | |
| -4 | |
| Tabelle IV | Sollwert ms/lOO ml |
/■ |
| ν Zugefügte Fremdsubstanz |
4,6 | Gefundener Wert mg/lOO ml |
| 4,6 | 4,6 | |
| Glutathlon, 10 mg/lOO ml | 4,6 | 4,6 |
| Allantoin, 10 mg/lOO ml | 4,6 | 4,7 |
| Kreatinin, 5 mg/lOO ml | 4,7 | |
Ή1
VJI
O CD CD
Tabelle IV veranschaulicht die geringe Störanfälligkeit
der erfindungsgemässen Methode in Bezug auf Glutathion, Allantoin und Kreatinin.
Es wurde ein Standard hergestellt mit der Konzentration 30 mg Harnsäure pro 100 ml. Ein aliquoter Teil dieses
Standards wurde mit Ascorbinsäure so versetzt, dass die
Gesamtkonzentration an Ascorbinsäure 5 mg/l00 ml betrug.
Anschliessend wurden die beiden Standards wie Proben in das
System eingesetzt und der Gehalt der Harnsäure mit der durch
Fig. 1 veranschaulichten AusfUhrungsform der erfindungsgemässen Methode gemessen.
Ergebnis:
Standards wurde mit Ascorbinsäure so versetzt, dass die
Gesamtkonzentration an Ascorbinsäure 5 mg/l00 ml betrug.
Anschliessend wurden die beiden Standards wie Proben in das
System eingesetzt und der Gehalt der Harnsäure mit der durch
Fig. 1 veranschaulichten AusfUhrungsform der erfindungsgemässen Methode gemessen.
Ergebnis:
Probe ohne Ascorbinsäure 30,0 mg Harnsäure/lOO ml
Probe mit Ascorbinsäure 30,2 mg Harnsäure/lOO ml
Das vorstehende Ergebnis zeigt die geringe Störanfälligkeit der erfindungsgemässen Methode in Bezug auf
Ascorbinsäure.
Ascorbinsäure.
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Claims (1)
- PatentansprücheMethode zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass man in kontinuierlicher Strömung die folgenden Schritte nacheinander durchführt,a) in kontinuierlicher Strömung eine bestimmte Menge an Probe mit einer Verdünnungslösung mischt,b) diese Mischung durch einen Dialysator leitet, wobei eine klare wässerige Lösung von dieser Mischung abgetrennt wird,c) diese klare wässerige Lösung mit einer gepufferten Urioaselösung mit einem pH-Wert zwischen 8,5 und 10 mischt,d) die gemäss Schritt c) erhaltene wässerige Lösung inkubierte) das Reaktionsgemisch bei einem pH-Wert zwischen5*5 und 8,5 mit einem -unsubstituierten oder kernsubstituierten Benzidin oder Diphenylin und Peroxidase mischt, dadurch eine gefärbte Lösung erzeugt undf) diese gefärbte Lösung durch eine Durchflussküvette leitet und den in der Probe vorhandenen Harnsäuregehalt, während des Fliessens dieser gefärbten Lösung durch die Durchflussküvette, photometrisch bestimmt.2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Verdünnungslösung eine Natriumchloridlösung verwendet.35. Methode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine 1,3-prozentige Nätriumchloridlösung verwendet.4. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass die Verdünnungslösung zusätzlich ein Detergenz enthält.509819/06715. Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdünnungslösung Polyoxyäthylensorbitanmonolaurylat als Detergenz enthält.6. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) ein Boratpuffer verwendet wird.7· Methode nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Natriumtetraborat als Puffer verwendet wird.8. Methode nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert 9*5 ist.9. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität der Uricase mindestens 2 Einheiten pro Liter beträgt.10. Methode nach Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität der Uricase 10 Einheiten pro Liter beträgt.11. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) zusätzlich noch ein Detergenz zugefügt wird.12. Methode nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Detergenz Polyoxyäthylensorbitänmonolaurylat verwendet wird.. Methode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Polyoxyäthylensorbitanmonolaurylat 1 Prozent beträgt.509819/067114."-, Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation bei einer/ Temperatur von ungefähr 370C erfolgt.15· Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 1.4»■ dadurch gekennzeichnet;, dass die Inkubation während ungefähr 4 Minuten erfolgt.16. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 15* dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt e) ein kernsubstituiertes Benzidin verwendet.17. Methode nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,.dass man als kernsubstituiertes Benzidin o-Dianisidin verwendet.18. Methode nach Anspruch YJ, dadurch gekennzeichnet, . dass man o-Dianisidin in einer Konzentration von 1,3 mg/ml
verwendet.19t Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) 0,4 Einheiten pro ml
Peroxidase verwendet werden.20.- Methode nach einem der Ansprüche,·! bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) ein Phosphatpuffer verwendet wird.21. Methode nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet,
dass als Phosphatpuffer ein Gemisch von primärem und sekundärem Natriumphosphat verwendet wird.50-9 8 19/0-67122. Methode nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert ungefähr 7*0 beträgt.· Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass wan in Schritt c) zuerst das unsubstituierte oder kernsubstituierte Benzidin oder Diphenylin und anschliessend die Peroxidase zusetzt.24. Methode nach: Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass man gleichzeitig mit der Peroxidase ein Detergenz zusetzt.25· Methode nach Anspruch 17* dadurch gekennzeichnet, dass die photometrische Messung zwischen 420 und 460 nm erfolgt.26. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass als Untersuchungsgut Plasma oder Serum verwendet wird.27. Testsystem zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure In biologischen Flüssigkeiten enthaltend Uricase, ein Material zur Herstellung eines Puffers von pH-Wert 8,5 bis 10, Peroxidase, ein kernsubstituiertes oder unsubstituiertes Benzidin oder Diphenylin, ein Detergenz und ein Material zur Herstellung eines Puffers vom pH-Wert 5,5 bis 8,5.28. Testsystem in Form einer Testgarnitur enthaltendin einem ersten Behälter Uricase, in einem zweiten Behälter ein Material zur Herstellung eines Puffers vom pH-Wert 8,5 bis 10 und Peroxidase in einem dritten Behälter ein kernsubstituiertes oder unsubstituiertes Benzidin oder Diphenylin, in einem vierten Behälter ein Detergenz und in einem fünften Behälter ein Material zur Herstellung eines Puffers vom pH-Wert 5,5 bis 8,5.509819/067129. Testsystem nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Behälter Uricase mit einer Aktivität von IO Einheiten, der zweite Behälter 6O mmol Phosphatpuffer und 2,5 mg Peroxidase, der dritte Behälter 66 mg o-Dianisidin, der vierte Behälter l8 ml. Polyoxyäthylensorbitanmonolaurylat und der fünfte Behälter 10 mmol Natriumtetraborat enthalten.30. Verwendung eines Testsysteme nach einem der Ansprüche 27-29 zur automatischen quantitativen Bestimmung von Harnsäure.509 819/0671Leerseite
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH1480773A CH584405A5 (de) | 1973-10-19 | 1973-10-19 | |
| CH1480773 | 1973-10-19 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2446099A1 true DE2446099A1 (de) | 1975-05-07 |
| DE2446099B2 DE2446099B2 (de) | 1976-09-16 |
| DE2446099C3 DE2446099C3 (de) | 1977-05-05 |
Family
ID=
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD115758A5 (de) | 1975-10-12 |
| FR2248510A1 (de) | 1975-05-16 |
| DK549174A (de) | 1975-06-30 |
| CH584405A5 (de) | 1977-01-31 |
| GB1456925A (en) | 1976-12-01 |
| NL7413119A (nl) | 1975-04-22 |
| FR2248510B1 (de) | 1977-03-25 |
| SE7413066L (de) | 1975-04-21 |
| JPS5068393A (de) | 1975-06-07 |
| DE2446099B2 (de) | 1976-09-16 |
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Legal Events
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
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