DE2603158A1 - Teststreifen zum nachweis von glucose und galaktose - Google Patents
Teststreifen zum nachweis von glucose und galaktoseInfo
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Description
"Teststreifen zum Nachweis von Glucose und Galaktose"
Priorität: 30. Januar 1975, Japan, Nr. I3 153/75
Zur Diagnose von Diabetes werden Teststreifen mit einem enzymatischen
System, das aus Glucoseoxidase,. einer Feroxidase und
einer chromogenen Terbindung besteht, verwendet. Derartige Teststreifen
weisen jedoch einige Nachteile auf, so daß die Empfindlichkeit des Teststreifens wegen der Instabilität der verwendeten
Enzyme oder der Gegenwart von Hemmstoffen, wie reduzierender
Terbindungen, beispielsweise Ascorbinsäure, Kreatinin, Harnsäure
oder Glucuronsäure, in den Testproben, nicht.ausreicht. Vitamin
C (Ascorbinsäure) ist heute oft in Arzneimitteln oder in alkoholfreien Getränken enthalten. Deshalb kann Ascorbinsäure im
Urin oder Blut in großen Mengen vorhanden sein. Es muß daher eine einfache Methode gefunden werden, um diese reduzierenden
Verbindungen zu entfernen oder die unerwünschte Wirkung dieser Verbindungen bei der Farbreaktion einzuschränken.
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Da die Ascorbinsäure leicht oxidiert wird und dies unerwünschte Auswirkungen auf die Farbreaktion hat, die auf einer Redox-Seaktion
zum Nachweis von Glucose oder Galaktose beruht, können keine zuverlässigen Testergebnisse bei Anwesenheit von Ascorbinsäure
in der Testprobe erhalten werden. Deshalb müssen derarti-• ge hemmende Verbindungen vor der Farbreaktion entfernt oder die
hemmende Wirkung eingeschränkt werden. Bei einem im Handel erhältlichen Teststreifen zum Nachweis von Glucose im Urin wird
das Ende des Teststreifens einige Minuten in eine Testprobe eingetaucht,
wobei der Teststreifen mit der Probe auf Chromatograph
is ehe Weise getränkt wird. Danach wird die Farbreaktion durch Beobachtung der gefärbten Linie zwischen dem getränkten Teil
und dem übrigen bestimmt, der die Testprobe nicht adsorbierte." Bei diesem Teststreifen gibt nicht der ganze mit der Testprobegetränkte
Teil, sondern nur ein Teil, das heißt die Grenzlinie, eine positive Farbreaktion. Deshalb ist es bei diesem Teststreifen
ziemlich schwierig, die Farbreaktion genau zu bestimmen. Außerdem ist das Testergebnis erst nach ziemlich langer
Zeit zu erhalten, da die Testprobe in den Streifen auf chromatographische ¥eise aufsteigen muß. Deshalb ist die Verwendung
eines derartigen Streifens in Verbindung mit anderen Teststreifen zur Diagnose zahlreicher Krankheiten unpraktisch.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen verbesserten Teststreifen zum Nachweis von Zuckern in Körperflüssigkeiten zu
schaffen, der zuverlässig und genau die Anwesenheit von Glucose oder Galaktose ohne Beeinflussung durch reduzierende Verbindungen,
wie Ascorbinsäure, anzeigt. Diese Aufgabe wird durch die
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Erfindung gelöst.
Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten
Gegenstand.
Der Teststreifen der Erfindung ergibt auch in Gegenwart eines hohen Ascorbinsäurespiegels zuverlässige Testresultate. Abweichend
von den bekannten vorstehend erwähnten Teststreifen kann der ganze erfindungsgemäße Teststreifen, der die reaktionsfähigen
Verbindungen enthält, in die Testprobe eingetaucht werden, wobei eine homogene und deutliche Farbreaktion innerhalb kurzer
Zeit· entsteht. Wenn eine Urinprobe keine große Menge Ascorbinsäure enthält, kann mit dem Teststreifen der Erfindung ein GIucosegehalt
von 25 bis 2000 mg/100 ml Urin halbquantitativ bestimmt werden. Wenn Arzneimittel oder alkoholfreie Getränke eingenommen
wurden und deshalb eine große Menge Ascorbinsäure (20 bis 100 mg/100 ml) ausgeschieden wird, ergibt der erfindungsgemäße
Teststreifen eine positive Farbreaktion bei einem Glucosegehalt von mindestens 100 mg/100 ml Urin. Bei Verwendung von
Celluloseacetatphthalat wird ein verbesserter Teststreifen zum Nachweis von Glucose oder Galaktose, insbesondere von Glucose
im Urin, erhalten.
Der erfindungsgemäße Teststreifen kann auf folgende Weise hergestellt
werden:
Ein adsorbierendes Material wird zuerst mit einer Lösung einer Zuckeroxidase und einer Peroxidase bei Rauntemperatur getränkt
und anschließend an der Luft oder unter vermindertem Druck ge-
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trocknet. Die Enzyme werden gewöhnlich in einem Puffer mit
einem pH-Wert von etwa 5» O "bis 8,0 gelöst und gegebenenfalls
mit Polyvinylalkohol versetzt. Der Polyvinylalkohol kann die Zuckeroxidase und die Peroxidase unter wirksamer Stabilisierung
dieser Enzyme abdecken. Das so erhaltene adsorbierende Material wird anschließend in eine zweite Lösung einer chro'mogenen Verbindung
und von Celluloseacetatphthalat eingetaucht und nach dem Tränken zum gewünschten Teststreifen getrocknet. Das Celluloseacetatphthalat
wird gewöhnlich in einer Konzentration von 1 bis 10, vorzugsweise etwa 5% (Gewicht/Volumen) verwendet und
kann die Enzyme und die chromogenen Verbindungen abdecken, wobei unerwünschte Nebenwirkungen durch reduzierende Verbindungen,
wie Ascorbinsäure, wirksam verhindert werden.
Spezielle Beispiele für adsorbierende-Materialien, die in die
tränkende Lösung eingetaucht werden, sind Papier, Textilgewebe, oder Stäbchen aus porösem Holz. Spezielle Beispiele für Papier
■sind Filterpapier, Löschpapier, Adsorptionspapier, wie Phosphomethylcellulose-,
Sulfoäthylc'ellulose-, Aminoäthylcellulose-
oder Polyäthylenimincellulosepapier, und Papier auf der Basis von Sephadex-Ionenaustauseher (dreidimensional vernetztes, modifiziertes
Dextran). Weitere adsorbierende Materialien mit entsprechenden Eigenschaften können ebenso verwendet werden. Bevorzugt
sind Ionenaustauschcellulosepapier, insbesondere Diäthylaminoäthylcellulosepapier.
Die Tränklösung kann durch Auflösen jeder Komponente in Wasser, einem organischen Lösungsmittel, wie einem niedrigsiedenden
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Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, Äthanol oder Aceton, oder ihren Gemischen hergestellt werden. Diese Lösung wird gewöhnlich
mit einem Puffer auf einen pH-Wert von etwa 5 his 8
eingestellt. Spezielle Beispiele für Puffer sind Phosphat-, Citrat-, Carbonat- und Boratpuffer. Bei Verwendung von Glucoseoxidase
wird die tränkende Lösung vorzugsweise auf1 einen pH-Wert von 5 "bis 7 eingestellt. Bei Verwendung von Galaktoseoxidase
wird vorzugsweise ein Puffer in solchen Mengen eingesetzt, um einen pH-Wert von 6 bis 8, insbesondere etwa 7»0 zu- erhalten.
Bei Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder deren Gemischen mit Wasser wird das Reagens homogen am adsorbierenden Material
adsorbiert, wobei sich bei einer Farbreaktion eine homogene Farbe ergibt. Zusätzlich ist der Trοcknungsschritt zur Herstellung
des Teststreifens vereinfacht.
Als Zuckeroxidase kann eine Substanz verwendet werden, die Zucker oxidieren kann und dabei Wasserstoffperoxid produziert.
Als Zuckeroxidasen kommen dabei Glucose- oder Galaktoseoxidase in Frage. Zum Nachweis von Glucose bzw. Galaktose wird Glucose-
bzw. Galaktoseoxidase verwendet.
Als Peroxidase kann jede Verbindung verwendet werden, die die '
Oxidation der chromogenen Verbindung mit Wasserstoffperoxid, das aus der Oxidation von Glucose oder Galaktose stammt, katalysieren
kann. Spezielle Beispiele für Peroxidasen sind Peroxidasen von Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen und Leukozyten. Vorzugsx^eise
wird Peroxidase aus Meerrettich verwendet.
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Als chromogene Verbindung kommt eine Verbindung in Frage, die
die Farbe bei der Oxidation mit Wasserstoffperoxid wechselt, das durch Oxidation von Glucose oder Galaktose entsteht, und dabei
nicht die enzymatische Reaktion hemmt. Spezielle Beispiele
für chromogene Verbindungen sind o-Tolidin, m-Tolidin, Guajakol,
o-Dianisidin, Benzidin, o-Methylbenzidin, 4,4'-Diaminodiphenyl,
o-Phenylendiamin, m-Hienylendiamin, p-Phenylendiamin, 2,3-Toluylendiamin,
2,4-Toluylendiamin, 2,5-Toluylendiamin, 2,6-Toluylendiamin,
Gallussäure, Pyrogallussäure, Hydrochinon, Benzidine, deren Aminogruppe(n) mit einem Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen
alkyliert sind (vgl. JA-OS 27 298/1974) und deren
Salze, wie Hydrofluoride, Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate
oder Nitrate. Vorzugsweise wird eine Kombination von o-Tolidin·
und Guajakol verwendet. o-Tolidin ist vorzugsweise in der ersten tränkenden Lösung enthalten, während Guajakol in Verbindung mit
Celluloseacetatphthalat als Komponente der zweiten tränkenden Lösung vorzugsweise verwendet wird. Eine derartige Kombination
ergibt einen genauen Farbwechsel bei der gewünschten Farbreaktion. Bei Verwendung von Guajakol wird vorzugsweise eine chloroformlösliche
Fraktion verwendet.
Die Zuckeroxidase und die Peroxidase werden gewöhnlich im Überschuß
ohne besondere Begrenzung verwendet. Sie können in einem Konzentrationsbereich von mehr als 0,1.bzw. 0,01% (Gewicht/Volumen),
bezogen auf die erste tränkende Lösung, verwendet werden. Die chromogene Verbindung wird ebenso im Überschuß verwendet.
Der erfindungsgemäße Teststreifen eignet sich zum Nachweis von
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Zuckern im Urin oder Blut, insbesondere von Glucose in Urin. Auch wenn eine große Menge von reduzierenden Hemmstoffen, wie
Ascorbinsäure, in einer Testprobe vorhanden ist, v/eist der Teststreifen eine gute Empfindlichkeit ohne signifikante Beeinflussung
durch derartige Hemmstoffe auf und ergibt ein korrektes Diagnoseergebnis bei Diabetes. s
Der erfindungsgemäße Teststreifen wird zum Eintauchen in eine Testprobe verwendet, wobei sich ein erkennbarer Farbwechsel innerhalb
von 30 Skunden ergibt. Die Teststreifen lassen sich auch
auf Kunststoffolien aufbringen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Ein Stück Diäthylaminoäthylcellulosepapier DE-81 (Whatman) der Abmessungen 5 x 10 cm wird in folgende Lösung bei Raumtemperatur
getaucht:
Glucoseoxidase (Sigma, Typ II) Peroxidase (Sigma, Typ II)
0,5m Gitratpuffer (pH 5,0)
1% (Gewicht/Volumen) Tartrazin/lthanol
(gelöst in etwa 0?05 η Natronlauge und anschließend mit Äthanol verdünnt)
10% (Gewicht/Volumen) -wäßrige Polyvinylalkohollösung
500
Das mit der vorstehenden Lösung adsorbierte Material wird unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet und anschlie-
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200 | mg |
20 | mg |
10 | ml |
2 | ml |
4 | ml |
10 | ml |
250 | mg |
2 | ml |
ßend in folgende Lösung bei Raumtemperatur getaucht:
5% (Gewicht/Volumen) Celluloseacetatphthalat/
Aceton
o-Tolidin
20% (Gewicht/Volumen) einer chloroformlöslichen
Fraktion von Guajakol (Marukawa Kagaku
Kogyo, Japan) in Aceton
Der mit der vorstehenden Lösung getränkte Teststreifen wird getrocknet,
auf eine PVC-IFolie geklebt und zu Teststreifen geschnitten.
Die Testergebnisse zum Nachweis von Glucose in Urin in Abwesenheit
von Ascorbinsäure sind in der Tabelle I zusammengefaßt.
Konzentration von Glucose FärbSättigung
in Urin, mg/100 ml
0 ' 5Y-8/10
25 7,5Y-7/8
50 2,5GY-7/6
100 7
250 7
500 10GX-4/6
1000 10GY-4A
Anmerkungen:
Y = gelb, GY = grünlichgelb. Die Farbe wird gemäß, den Standard-Colour
Chip (JIS (Japanese Industrial Standard) Z 8721) angege-
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ben. Die Farbreaktion wird 30 Sekunden nach dem Eintauchen des
Teststreifens in eine Testprobe und Entfernen des Teststreifens aus der uranhaltigen Lösung bestimmt.
Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäße Teststreifen
einen genauen Farbwechsel von gelb nach grünlichgelb bei einer Konzentration von Glucose in Urin von mehr als 50 mg/
100 ml ergibt.
Die Testergebnisse zum Nachweis von Glucose in Urin in Gegenwart von Ascorbinsäure sind in der Tabelle II zusammengefaßt.
Glucose in Urin, mg/100 ml |
Farbsättigung L-Ascorbinsäure, mg/100 ml |
0 | 20 | 50 | 100 |
7,5GT-6/8 | 7,5GI-6/8 | 2,5GY-7/8 | negativ | ||
100 | 7,5GY-5/8 | 7,5GI-5/8 | 7,5GY-5/8 | 7,5GY-5/8 | |
250 | 10GY-V6 | ' 10GY-V6 | 10GY-4/6 | 10GY-V6 | |
500 |
In der Tabelle III ist die Zeit angegeben, die zur Farbreaktion mit dem erfindungsgemäßen Teststreifen, einem Teststreifen ohne
Celluloseacetatphthalat und einem Teststreifen benötigt wird,
der durch Abdecken aller Komponenten mit Celluloseacetatphthalat hergestellt wurde.
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ml | -A.se orbinsäure mg/100 ml |
- 10 - | III | GY-6/10 | He Fr |
rste! . 1 |
2603158 | 30 | |
0 | Tabelle | Färbsattigung | GY-5/8 | 30 | 30 | ||||
glucose ag/100 |
0 | 10 | GX-5/8 | 30 | längsverfahren Nr. 2 Fr. 3 (Sek.) |
60 | |||
100 | 50 | 10 | GX-5/8 | 30 | 30 | 70 | |||
250 | 100 | 10 | 50 | 39 | |||||
250 | 10 | 40 | |||||||
25O | 60 | ||||||||
Anmerkungen:
Herstellungsverfahren Fr. 1 : Der Teststreifen wird auf die vorstehend
beschriebene Weise hergestellt.
Herstellungsverfahren Fr. 2: Der Teststreifen wird auf die vorstehend,
beschriebene Weise, jedoch ohne Verwendung von Celluloseacetatphthalat hergestellt. Dieser Teststreifen wird zu Vergleichszwecken
verwendet.
Herstellungsverfahren Fr. 3: Der Teststreifen wird durch Tränken
eines adsorbierenden Materials mit einer Lösung hergestellt, die
sämtliche nötigen Komponenten enthält. Die Komponenten und deren Konzentrationen entsprechen denen des Herstellungsverfahrens 1.
Der Teststreifen wird zu Vergleichszwecken verwendet.
Aus den Testergebnissen ist ersichtlich, daß sogar in Gegenwart von 50 mg Ascorbinsäure die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen
Teststreifens nicht beeinflußt wird, während die nach dem
Herstellungsverfahren Fr. 2 und Fr. 3 hergestellten Teststreifen eine längere Zeit zur Herstellung der gewünschten Farbreaktion
benötigen. Die Verlangsamung der Farbreaktion des gemäß Herstel-
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lungsverfahren Έτ. 2 hergestellten Teststreifen ist auf die hemmende
Wirkung der Ascorbinsäure zurückzuführen. Bei dem gemäß Herstellungsverfahren 3 hergestellten Teststreifen findet keine
glatte !Farbreaktion wegen der zu großen abdeckenden Wirkung von
Celluloseacetatphthalat statt, obwohl Celluloseacetatphthalat auf die zuzusetzenden Verbindungen abdeckend wirk"Ö.
Die für die Farbreaktion benötigte Zeit ist signifikant, um Testergebnisse auf schnelle Weise zu erhalten. Da 3 bis 4 Diagnosestreifen
zum Nachweis verschiedener Krankheiten jetzt in kombinierter Form auf einer Folie verkauft werden, soll jeder
Teststreifen die gleiche zur Farbreaktion benötigte Zeit aufweisen. Wenn sich die zur Farbreaktion benötigte Zeit eines jeden'
Teststreifens in einer derartigen Kombinationsform unterscheidet,
ist eine zuverlässige Bestimmung der Farbreaktion ziemlich schwierig. Der Farbumschlag in den meisten Teststreifen wird gewöhnlich
30 Sekunden nach dem Eintauchen in eine Testprobe beobachtet.
Deshalb kann der erfindungsgemäße Teststreifen ohne Schwierigkeiten in einer Kombinationsform von Teststreifen angewandt
werden.
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Claims (1)
- Patentansprüche} 1.J Teststreifen zum Nachweis von Zuckern in Körperflüssigkeiten, gekennzeichnet durch ein adsorbierendes Material, das mit einer Lösung einer Zuckeroxidase, einer Peroxidase, einer chromogenen Verbindung und von Celiuloseacetatphthalat getränkt ist.2. Teststreifen zum Nachweis von Glucose oder Galaktose in Urin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Zuckeroxidase Glucose- oder Galaktoseoxidase enthalten.3· Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als chromogene Verbindung o-Tolidin, m-Tolidin, Guajakol, o-Dianisidin, Benzidin, o-Methylbenzidin, 4,4'-Diaminodiphenyl, o~Phenylendiamin, m-Phenylendiamin, p-Phenylendiamin, 2,5-Toluylendiamin, 2,4-Toluylendiamin, 2,5-Toluylendiamin, 2,6-Toluylendiamin, Gallussäure, Pyrogallussäure, Hydrochinon, Benzidine, deren Aminogruppe(n) mit einer Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen alkyliert sind, oder deren Salze enthalten.4. Verfahren zur Herstellung der Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein-adsorbierendes Material in eine Lösung einer Zuckeroxidase, einer Peroxidase und eines Puffers taucht, nach dem Tränken trocknet, anschließend wiederum in eine Lösung von Celluloseacetatphthalat und einer chromogenen Verbindung taucht und danach nochmals trocknet.609832/08055. Verfahren zur Herstellung der Teststreifen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zuckeroxidase die in Anspruch 2 angegebenen Oxidasen verwendet.6. Verfahren zur Herstellung der Teststreifen nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man als chromogene'Verbindungen die i. Anspruch 3 angegebenen Verbindungen verwendet.7· Verfahren zur Herstellung der Teststreifen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymhaltige Tränklösung auf einen pH-Wert von 5»O bis 8,0 einstellt.6098 3 2/UöbS
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NL7600925A (nl) | 1976-08-03 |
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