DE2603158A1

DE2603158A1 - Teststreifen zum nachweis von glucose und galaktose

Info

Publication number: DE2603158A1
Application number: DE19762603158
Authority: DE
Inventors: Yasunao Ogawa; Yukio Yonetani
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1975-01-30
Filing date: 1976-01-28
Publication date: 1976-08-05
Also published as: SE7600834L; NO760275L; ES444745A1; AU1026476A; IT1057062B; NL7600925A; JPS5188091A; BE838051A; FR2299635A1; DK37676A

Description

"Teststreifen zum Nachweis von Glucose und Galaktose"

Priorität: 30. Januar 1975, Japan, Nr. I3 153/75

Zur Diagnose von Diabetes werden Teststreifen mit einem enzymatischen System, das aus Glucoseoxidase,. einer Feroxidase und einer chromogenen Terbindung besteht, verwendet. Derartige Teststreifen weisen jedoch einige Nachteile auf, so daß die Empfindlichkeit des Teststreifens wegen der Instabilität der verwendeten Enzyme oder der Gegenwart von Hemmstoffen, wie reduzierender Terbindungen, beispielsweise Ascorbinsäure, Kreatinin, Harnsäure oder Glucuronsäure, in den Testproben, nicht.ausreicht. Vitamin C (Ascorbinsäure) ist heute oft in Arzneimitteln oder in alkoholfreien Getränken enthalten. Deshalb kann Ascorbinsäure im Urin oder Blut in großen Mengen vorhanden sein. Es muß daher eine einfache Methode gefunden werden, um diese reduzierenden Verbindungen zu entfernen oder die unerwünschte Wirkung dieser Verbindungen bei der Farbreaktion einzuschränken.

609832/0855

-2- 7603158

Da die Ascorbinsäure leicht oxidiert wird und dies unerwünschte Auswirkungen auf die Farbreaktion hat, die auf einer Redox-Seaktion zum Nachweis von Glucose oder Galaktose beruht, können keine zuverlässigen Testergebnisse bei Anwesenheit von Ascorbinsäure in der Testprobe erhalten werden. Deshalb müssen derarti-• ge hemmende Verbindungen vor der Farbreaktion entfernt oder die hemmende Wirkung eingeschränkt werden. Bei einem im Handel erhältlichen Teststreifen zum Nachweis von Glucose im Urin wird das Ende des Teststreifens einige Minuten in eine Testprobe eingetaucht, wobei der Teststreifen mit der Probe auf Chromatograph is ehe Weise getränkt wird. Danach wird die Farbreaktion durch Beobachtung der gefärbten Linie zwischen dem getränkten Teil und dem übrigen bestimmt, der die Testprobe nicht adsorbierte." Bei diesem Teststreifen gibt nicht der ganze mit der Testprobegetränkte Teil, sondern nur ein Teil, das heißt die Grenzlinie, eine positive Farbreaktion. Deshalb ist es bei diesem Teststreifen ziemlich schwierig, die Farbreaktion genau zu bestimmen. Außerdem ist das Testergebnis erst nach ziemlich langer Zeit zu erhalten, da die Testprobe in den Streifen auf chromatographische ¥eise aufsteigen muß. Deshalb ist die Verwendung eines derartigen Streifens in Verbindung mit anderen Teststreifen zur Diagnose zahlreicher Krankheiten unpraktisch.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen verbesserten Teststreifen zum Nachweis von Zuckern in Körperflüssigkeiten zu schaffen, der zuverlässig und genau die Anwesenheit von Glucose oder Galaktose ohne Beeinflussung durch reduzierende Verbindungen, wie Ascorbinsäure, anzeigt. Diese Aufgabe wird durch die

609832/08b5

-5- ?6Q3158

Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Der Teststreifen der Erfindung ergibt auch in Gegenwart eines hohen Ascorbinsäurespiegels zuverlässige Testresultate. Abweichend von den bekannten vorstehend erwähnten Teststreifen kann der ganze erfindungsgemäße Teststreifen, der die reaktionsfähigen Verbindungen enthält, in die Testprobe eingetaucht werden, wobei eine homogene und deutliche Farbreaktion innerhalb kurzer Zeit· entsteht. Wenn eine Urinprobe keine große Menge Ascorbinsäure enthält, kann mit dem Teststreifen der Erfindung ein GIucosegehalt von 25 bis 2000 mg/100 ml Urin halbquantitativ bestimmt werden. Wenn Arzneimittel oder alkoholfreie Getränke eingenommen wurden und deshalb eine große Menge Ascorbinsäure (20 bis 100 mg/100 ml) ausgeschieden wird, ergibt der erfindungsgemäße Teststreifen eine positive Farbreaktion bei einem Glucosegehalt von mindestens 100 mg/100 ml Urin. Bei Verwendung von Celluloseacetatphthalat wird ein verbesserter Teststreifen zum Nachweis von Glucose oder Galaktose, insbesondere von Glucose im Urin, erhalten.

Der erfindungsgemäße Teststreifen kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Ein adsorbierendes Material wird zuerst mit einer Lösung einer Zuckeroxidase und einer Peroxidase bei Rauntemperatur getränkt und anschließend an der Luft oder unter vermindertem Druck ge-

609832/0855

trocknet. Die Enzyme werden gewöhnlich in einem Puffer mit einem pH-Wert von etwa 5» O "bis 8,0 gelöst und gegebenenfalls mit Polyvinylalkohol versetzt. Der Polyvinylalkohol kann die Zuckeroxidase und die Peroxidase unter wirksamer Stabilisierung dieser Enzyme abdecken. Das so erhaltene adsorbierende Material wird anschließend in eine zweite Lösung einer chro'mogenen Verbindung und von Celluloseacetatphthalat eingetaucht und nach dem Tränken zum gewünschten Teststreifen getrocknet. Das Celluloseacetatphthalat wird gewöhnlich in einer Konzentration von 1 bis 10, vorzugsweise etwa 5% (Gewicht/Volumen) verwendet und kann die Enzyme und die chromogenen Verbindungen abdecken, wobei unerwünschte Nebenwirkungen durch reduzierende Verbindungen, wie Ascorbinsäure, wirksam verhindert werden.

Spezielle Beispiele für adsorbierende-Materialien, die in die tränkende Lösung eingetaucht werden, sind Papier, Textilgewebe, oder Stäbchen aus porösem Holz. Spezielle Beispiele für Papier ■sind Filterpapier, Löschpapier, Adsorptionspapier, wie Phosphomethylcellulose-, Sulfoäthylc'ellulose-, Aminoäthylcellulose- oder Polyäthylenimincellulosepapier, und Papier auf der Basis von Sephadex-Ionenaustauseher (dreidimensional vernetztes, modifiziertes Dextran). Weitere adsorbierende Materialien mit entsprechenden Eigenschaften können ebenso verwendet werden. Bevorzugt sind Ionenaustauschcellulosepapier, insbesondere Diäthylaminoäthylcellulosepapier.

Die Tränklösung kann durch Auflösen jeder Komponente in Wasser, einem organischen Lösungsmittel, wie einem niedrigsiedenden

609832/0855

Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, Äthanol oder Aceton, oder ihren Gemischen hergestellt werden. Diese Lösung wird gewöhnlich mit einem Puffer auf einen pH-Wert von etwa 5 his 8 eingestellt. Spezielle Beispiele für Puffer sind Phosphat-, Citrat-, Carbonat- und Boratpuffer. Bei Verwendung von Glucoseoxidase wird die tränkende Lösung vorzugsweise auf¹ einen pH-Wert von 5 "bis 7 eingestellt. Bei Verwendung von Galaktoseoxidase wird vorzugsweise ein Puffer in solchen Mengen eingesetzt, um einen pH-Wert von 6 bis 8, insbesondere etwa 7»0 ^zu- erhalten. Bei Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder deren Gemischen mit Wasser wird das Reagens homogen am adsorbierenden Material adsorbiert, wobei sich bei einer Farbreaktion eine homogene Farbe ergibt. Zusätzlich ist der Trοcknungsschritt zur Herstellung des Teststreifens vereinfacht.

Als Zuckeroxidase kann eine Substanz verwendet werden, die Zucker oxidieren kann und dabei Wasserstoffperoxid produziert. Als Zuckeroxidasen kommen dabei Glucose- oder Galaktoseoxidase in Frage. Zum Nachweis von Glucose bzw. Galaktose wird Glucose- bzw. Galaktoseoxidase verwendet.

Als Peroxidase kann jede Verbindung verwendet werden, die die ' Oxidation der chromogenen Verbindung mit Wasserstoffperoxid, das aus der Oxidation von Glucose oder Galaktose stammt, katalysieren kann. Spezielle Beispiele für Peroxidasen sind Peroxidasen von Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen und Leukozyten. Vorzugsx^eise wird Peroxidase aus Meerrettich verwendet.

609832/0855

Als chromogene Verbindung kommt eine Verbindung in Frage, die die Farbe bei der Oxidation mit Wasserstoffperoxid wechselt, das durch Oxidation von Glucose oder Galaktose entsteht, und dabei nicht die enzymatische Reaktion hemmt. Spezielle Beispiele für chromogene Verbindungen sind o-Tolidin, m-Tolidin, Guajakol, o-Dianisidin, Benzidin, o-Methylbenzidin, 4,4'-Diaminodiphenyl, o-Phenylendiamin, m-Hienylendiamin, p-Phenylendiamin, 2,3-Toluylendiamin, 2,4-Toluylendiamin, 2,5-Toluylendiamin, 2,6-Toluylendiamin, Gallussäure, Pyrogallussäure, Hydrochinon, Benzidine, deren Aminogruppe(n) mit einem Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen alkyliert sind (vgl. JA-OS 27 298/1974) und deren Salze, wie Hydrofluoride, Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate oder Nitrate. Vorzugsweise wird eine Kombination von o-Tolidin· und Guajakol verwendet. o-Tolidin ist vorzugsweise in der ersten tränkenden Lösung enthalten, während Guajakol in Verbindung mit Celluloseacetatphthalat als Komponente der zweiten tränkenden Lösung vorzugsweise verwendet wird. Eine derartige Kombination ergibt einen genauen Farbwechsel bei der gewünschten Farbreaktion. Bei Verwendung von Guajakol wird vorzugsweise eine chloroformlösliche Fraktion verwendet.

Die Zuckeroxidase und die Peroxidase werden gewöhnlich im Überschuß ohne besondere Begrenzung verwendet. Sie können in einem Konzentrationsbereich von mehr als 0,1.bzw. 0,01% (Gewicht/Volumen), bezogen auf die erste tränkende Lösung, verwendet werden. Die chromogene Verbindung wird ebenso im Überschuß verwendet.

Der erfindungsgemäße Teststreifen eignet sich zum Nachweis von

609832/0855

Zuckern im Urin oder Blut, insbesondere von Glucose in Urin. Auch wenn eine große Menge von reduzierenden Hemmstoffen, wie Ascorbinsäure, in einer Testprobe vorhanden ist, v/eist der Teststreifen eine gute Empfindlichkeit ohne signifikante Beeinflussung durch derartige Hemmstoffe auf und ergibt ein korrektes Diagnoseergebnis bei Diabetes. ^s

Der erfindungsgemäße Teststreifen wird zum Eintauchen in eine Testprobe verwendet, wobei sich ein erkennbarer Farbwechsel innerhalb von 30 Skunden ergibt. Die Teststreifen lassen sich auch auf Kunststoffolien aufbringen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ein Stück Diäthylaminoäthylcellulosepapier DE-81 (Whatman) der Abmessungen 5 x 10 cm wird in folgende Lösung bei Raumtemperatur getaucht:

Glucoseoxidase (Sigma, Typ II) Peroxidase (Sigma, Typ II) 0,5m Gitratpuffer (pH 5,0)

1% (Gewicht/Volumen) Tartrazin/lthanol (gelöst in etwa 0_?05 η Natronlauge und anschließend mit Äthanol verdünnt)

10% (Gewicht/Volumen) -wäßrige Polyvinylalkohollösung 500

Das mit der vorstehenden Lösung adsorbierte Material wird unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet und anschlie-

609832/0855

200	mg
20	mg
10	ml
2	ml
4	ml

10	ml
250	mg
2	ml

ßend in folgende Lösung bei Raumtemperatur getaucht:

5% (Gewicht/Volumen) Celluloseacetatphthalat/ Aceton

o-Tolidin

20% (Gewicht/Volumen) einer chloroformlöslichen Fraktion von Guajakol (Marukawa Kagaku Kogyo, Japan) in Aceton

Der mit der vorstehenden Lösung getränkte Teststreifen wird getrocknet, auf eine PVC-IFolie geklebt und zu Teststreifen geschnitten.

Die Testergebnisse zum Nachweis von Glucose in Urin in Abwesenheit von Ascorbinsäure sind in der Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Konzentration von Glucose FärbSättigung

in Urin, mg/100 ml

0 ' 5Y-8/10

25 7,5Y-7/8

50 2,5GY-7/6

100 7

250 7

500 10GX-4/6

1000 10GY-4A

Anmerkungen:

Y = gelb, GY = grünlichgelb. Die Farbe wird gemäß, den Standard-Colour Chip (JIS (Japanese Industrial Standard) Z 8721) angege-

609832/0865

-9- 7603158

ben. Die Farbreaktion wird 30 Sekunden nach dem Eintauchen des Teststreifens in eine Testprobe und Entfernen des Teststreifens aus der uranhaltigen Lösung bestimmt.

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäße Teststreifen einen genauen Farbwechsel von gelb nach grünlichgelb bei einer Konzentration von Glucose in Urin von mehr als 50 mg/ 100 ml ergibt.

Die Testergebnisse zum Nachweis von Glucose in Urin in Gegenwart von Ascorbinsäure sind in der Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Glucose in Urin, mg/100 ml	Farbsättigung L-Ascorbinsäure, mg/100 ml	0	20	50	100
	7,5GT-6/8	7,5GI-6/8	2,5GY-7/8	negativ
100	7,5GY-5/8	7,5GI-5/8	7,5GY-5/8	7,5GY-5/8
250	10GY-V6	' 10GY-V6	10GY-4/6	10GY-V6
500

In der Tabelle III ist die Zeit angegeben, die zur Farbreaktion mit dem erfindungsgemäßen Teststreifen, einem Teststreifen ohne Celluloseacetatphthalat und einem Teststreifen benötigt wird, der durch Abdecken aller Komponenten mit Celluloseacetatphthalat hergestellt wurde.

609832/0855

	ml	-A.se orbinsäure mg/100 ml	- 10 -	III	GY-6/10	He Fr	rste! . 1	2603158	30
		0	Tabelle	Färbsattigung	GY-5/8		30		30
glucose ag/100		0		10	GX-5/8		30	längsverfahren Nr. 2 Fr. 3 (Sek.)	60
100		50		10	GX-5/8		30	30	70
250		100	10			50	39
250		10				40
25O					60

Anmerkungen:

Herstellungsverfahren Fr. 1 : Der Teststreifen wird auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt.

Herstellungsverfahren Fr. 2: Der Teststreifen wird auf die vorstehend, beschriebene Weise, jedoch ohne Verwendung von Celluloseacetatphthalat hergestellt. Dieser Teststreifen wird zu Vergleichszwecken verwendet.

Herstellungsverfahren Fr. 3: Der Teststreifen wird durch Tränken eines adsorbierenden Materials mit einer Lösung hergestellt, die sämtliche nötigen Komponenten enthält. Die Komponenten und deren Konzentrationen entsprechen denen des Herstellungsverfahrens 1. Der Teststreifen wird zu Vergleichszwecken verwendet.

Aus den Testergebnissen ist ersichtlich, daß sogar in Gegenwart von 50 mg Ascorbinsäure die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Teststreifens nicht beeinflußt wird, während die nach dem Herstellungsverfahren Fr. 2 und Fr. 3 hergestellten Teststreifen eine längere Zeit zur Herstellung der gewünschten Farbreaktion benötigen. Die Verlangsamung der Farbreaktion des gemäß Herstel-

609 83 2/0855

lungsverfahren Έτ. 2 hergestellten Teststreifen ist auf die hemmende Wirkung der Ascorbinsäure zurückzuführen. Bei dem gemäß Herstellungsverfahren 3 hergestellten Teststreifen findet keine glatte !Farbreaktion wegen der zu großen abdeckenden Wirkung von Celluloseacetatphthalat statt, obwohl Celluloseacetatphthalat auf die zuzusetzenden Verbindungen abdeckend wirk"Ö.

Die für die Farbreaktion benötigte Zeit ist signifikant, um Testergebnisse auf schnelle Weise zu erhalten. Da 3 bis 4 Diagnosestreifen zum Nachweis verschiedener Krankheiten jetzt in kombinierter Form auf einer Folie verkauft werden, soll jeder Teststreifen die gleiche zur Farbreaktion benötigte Zeit aufweisen. Wenn sich die zur Farbreaktion benötigte Zeit eines jeden' Teststreifens in einer derartigen Kombinationsform unterscheidet, ist eine zuverlässige Bestimmung der Farbreaktion ziemlich schwierig. Der Farbumschlag in den meisten Teststreifen wird gewöhnlich 30 Sekunden nach dem Eintauchen in eine Testprobe beobachtet. Deshalb kann der erfindungsgemäße Teststreifen ohne Schwierigkeiten in einer Kombinationsform von Teststreifen angewandt werden.

609832/0805

Claims

Patentansprüche

} 1.J Teststreifen zum Nachweis von Zuckern in Körperflüssigkeiten, gekennzeichnet durch ein adsorbierendes Material, das mit einer Lösung einer Zuckeroxidase, einer Peroxidase, einer chromogenen Verbindung und von Celiuloseacetatphthalat getränkt ist.

2. Teststreifen zum Nachweis von Glucose oder Galaktose in Urin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Zuckeroxidase Glucose- oder Galaktoseoxidase enthalten.

3· Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als chromogene Verbindung o-Tolidin, m-Tolidin, Guajakol, o-Dianisidin, Benzidin, o-Methylbenzidin, 4,4'-Diaminodiphenyl, o~Phenylendiamin, m-Phenylendiamin, p-Phenylendiamin, 2,5-Toluylendiamin, 2,4-Toluylendiamin, 2,5-Toluylendiamin, 2,6-Toluylendiamin, Gallussäure, Pyrogallussäure, Hydrochinon, Benzidine, deren Aminogruppe(n) mit einer Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen alkyliert sind, oder deren Salze enthalten.

4. Verfahren zur Herstellung der Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein-adsorbierendes Material in eine Lösung einer Zuckeroxidase, einer Peroxidase und eines Puffers taucht, nach dem Tränken trocknet, anschließend wiederum in eine Lösung von Celluloseacetatphthalat und einer chromogenen Verbindung taucht und danach nochmals trocknet.

609832/0805

5. Verfahren zur Herstellung der Teststreifen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zuckeroxidase die in Anspruch 2 angegebenen Oxidasen verwendet.

6. Verfahren zur Herstellung der Teststreifen nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man als chromogene'Verbindungen die i. Anspruch 3 angegebenen Verbindungen verwendet.

7· Verfahren zur Herstellung der Teststreifen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymhaltige Tränklösung auf einen pH-Wert von 5»O bis 8,0 einstellt.

6098 3 2/UöbS