NO760275L - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en prøvestrimmel for påvisning

av sukker i kroppsvæsker, særlig for påvisning av glukose eller galaktose i kroppsvæsker, spesielt i urin, idet prøvestrimmelen omfatter et absorberende material impregnert med en oppløsning av sukker-oksydase, peroksydase, kromogen og celluloseacetatftalat.

Hittil har det for diagnose av diabetes vært anvendt forskjellige prøvestrimler under anvendelse av et enzymatisk system omfattende en glukose-oksydase, en peroksydase, og et kromogen, anvendt for klinisk påvisning. Det er imidlertid påpekt enkelte ulemper ved disse tidligere prøvestrimler og at følsomheten for prøvestrimlen ikke er tilstrekkelig på grunn av ustabiliteten av de deri inneholdte enzymer eller nærværet av inhibitorer som f.eks. en reduserende substans (f.eks. ascotoinsyre, creatinin, urinsyre, gluconsyre)

i prøvematerialet. For tiden tilføres ofte. vitamin G (ascorbinsyre) i form av medikamenter eller leskedrikker for terapeutiske eller sunnhets-formål og følgelig er ofte ascorbinsyre tilstede i urinen eller blodet i stor mengde. Det er derfor nødvendig å finne <en enkel metode for fjernelse av disse reduserende substanser eller å nedsette den uønskede virkning av dem ved fargereaksjonen.

Da ascorbinsyre lett oksyderes og dette uønsket påvirker fargereaksjonen som er basert på en oksydasjons-reduksjonsreaksjon for påvisning av glukose eller galaktose, kan pålitelige prøveresultater ikke oppnås når ascorbinsyre forefinnes i prøven. Det er således ønskelig å fjerne disse inhibitorer før fargereaksjonen, eller å nedsette den inhiberende effekt til et minimum. En prøvestrimmel som fås i handelen for urin-glukose er slik at enden av prøve-strimlen dyppes ned i en prøve i noen minutter og prøven impregneres kromatograf isk inn i prøvestrimmelen; hvoretter fargereaks jonen bestemmes ved å iaktta den fargede linje mellom den impregnerte del og den resterende del som ikke har adsorbert prøven. I denne type av prøvestrimler vil hele den del som er blitt impregnert med prøven ikke gi en fargereaksjon, men bare en del av prøve-strimlen, dvs. grenselinjen vil gi en positiv fargereaksjon.

I denne type av prøvestrimler er det således ganske vanskelig å bestemme fargereaksjonen tydelig. Denne metode vil videre kreve heller lang tid for å oppnå prøveresultatet, på grunn av at prøven må stige kromatografisk opp i strimmelen. Det er således ikke fordelaktig å anvende slike kjente prøvestrimler i kombinasjon med andre prøvestrimler for diagnose av forskjellige sykdommer.

Prøvestrimlen i henhold til den foreliggende oppfinnelse gir pålitelige prøveresultater selv i nærvær av et stort innhold av ascorbinsyre, og til forskjell fra de kjente prøvestrimler som er nevnt ovenfor, kan prøvestrimlen i henhold til oppfinnelsen anvendes ved å dyppe hele strimmelen som inneholder de reaktive komponenter ned i prøven, slik at det oppnås en homogen og tydelig fargereaks jon i løpet av kort tid. Når en urinprøve ikke inneholder en stor mengde ascorbinsyre kan prøvestrimlen i henhold til oppfinnelsen

- påvise halvTkvantitativt urin-glukose på 25 til 2000 mg/100 ml.

I det tilfelle når medikamenter eller læskedrikker tilføres og

det følgelig utskilles en stor mengde ascorbinsyre (20 til 100 mg/ 100 ml) gir videre prøvestrimlen i henhold til oppfinnelsen en positiv fargereaksjon overfor urin-glukose på mer enn 100 mg/lOOml. Ved anvendelse av cellulose-asetatftalat tilveiebringes det en forbedret prøvestrimmel for påvisning av glukose eller galaktose, spesielt urin-glukose.

Det er følgelig et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret prøvestrimmel for påvisning av et sukker i kroppsvæskene, som pålitelig og tydelig viser nærværet av glukose eller galaktose uten å bli påvirket av en reduserende substans som f.eks. ascorbinsyre.

Prøvestrimmelen i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles på følgende måte. Et absorberende material impregneres først med en løsrring av sukker-oksydase og peroksydase ved romtemperatur og tørkes så i luften eller under redusert trykk. De nevnte enzymer oppløses vanlig i en buffer ved omtrent pH 5.0 - 8.0 og om nødvendig kan polyvinylalkohol tilsettes. Polyvinylalkoholen kan dekke sukker-oksydasen og peroksydasen slik at enzymene effektivt stabiliseres. Det således oppnådde absorberende material dyppes så ned i en annen oppløsning av kromogen og celluloseasetat-

ftalat, hvoretter det impregnerte absorberende material tørkes

og gir den ønskede prøvestrimmel. Celluloseasetatftalatet anvendes vanlig i en konsentrasjon på 1 til 10% (vekt/volum), foretrukket omtrent 5% (vekt/volum) og det kan dekke enzymene og kromogenene, hvorved en uønsket virkning med en reduserende substans som f.eks. ascorbinsyre effektivt unngås.

Eksempler på det absorberende material som dyppes ned i impregnerings-løsningen kan være et papirark, et stykke tekstil eller en pinne av porøst trevirke. Typiske eksempler på papirtyper er filterpapir, trekkpapir, absorberende papir,(f.eks.fosfometyl cellulosepapir, sulfoetyl cellulosepapir, aminoetyl cellulosepapir, polyetylen-

imin cellulosepapir) og ionevekslingspapir, f.eks. "Sephadex"-papir. Andre absorberende materialer med tilsvarende egenskaper kan også anvendes. Blant slike absorberende materialer anvendes foretrukket ioneveksler-cellulosepapirer, spesielt dietylamino-

etyl cellulosepapir.

En impregneringsløsning kan fremstilles ved å oppløse hver komponent i vann eller et organisk løsningsmiddel, f .eks., et løsningsmiddel med lavt kokepunkt som metanol, etanol eller aceton, eller et blandet løsningsmiddel derav. Denne løsning innstilles vanlig til omtrent pH 5 - 8 med en buffer. Eksempler på buffere er fosfater, eitrater, karbonater, borater og andre egnede buffere. Ved fremstilling av impregneringsløsningen foretrekkes det å innstille løsningen til pH 5 - 7 når det anvendes glukoseoksydase. Når galaktose-oksydase anvendes er det ønskelig å anvende en buffer som kan holde pH ved 6-8, foretrukket omtrent pH 7.0. Når et organisk løsningsmiddel eller et vandig løsningsmiddel for dette anvendes absorberes reaksjonskomponenten homogent i et absorberende material og gir således en homogen farve når anvendt ved en farvereaksjon. I tillegg forenkles tørketrinnet for fremstillingen av prøvestrimmelen.

Sukker-oksydasen kan være en substans som kan oksydere et sukker spesifikt og derved utvikle hydrogenperoksyd. Slik sukkeroksydase kan være glukoseoksydase og gallaktoseoksydase. Ved påvisning av glukose og galaktose anvendes henhv. glukoseoksydase og galaktose-oksydase.

Som peroksydase kan anvendes en hvilken som helst substans som kan katalysere oksydasjonen av kromogenet med det hydrogenperoksyd som utvikles ved oksydasjonen av glukose eller galaktose. Typiske eksempler på peroksydase.,er dem som utvinnes fra dyr, planter, mikroorganismer og leucocyter. Det foretrekkes å anvende peroksydase fra pepperrot.

Kromogen.er en substans som endrer farve ved oksydasjon med det hydrogenperoksyd'som er utviklet ved oksydasjonen av glukose eller galaktose og inhiberer ikke den enzymatiske reaksjon. Eksempler på kromogener er o-tolidin, m-tolidin, guajac, o-dianisidin, benzidin, o-metylbenzidin, 4,4<1->diaminodifenyl, o-fenylendiamin, m-f enylendiamin, p-f enylendiamin, 2, 3-toluylendiamin, 2-, 4-toluylendiamin, 2,5-toluylendiamin, 2,6-toluylendiamin, gallussyre, pyrogallussyre, hydrokinon, benzidiner hvor aminogruppen eller gruppene erlalkylert med en lavere alkylgruppe med 1 til 4 karbonatomer, ,og salter derav, som f.eks. hydrokloridet, hydrobromidet, hydrofluoridet, sulfatet, nitratet. Blant disse foretrekkes en kombinasjon av o-tolidin og guajac. o-tolidin inneholdes foretrukket i den første impregnerende løsning og det foretrekkes å anvende guajac i kombinasjon med celluloseacetatftalatet som en komponent i den annen impregneringsløsning. Denne kombinasjon gir en tydelig farveendring ved den ønskede farvereaksjon. Når guajacol anvendes foretrekkes det å anvende en kloroformløsél.ig fraksjon.

Sukkeroksydasen og peroksydasen anvendes vanlig i overskuddsmengde. Der er ingen spesiell begrensning i mengden av sukker-oksydase og peroksydase og de kan anvendes ved en konsentrasjon på mer enn 0.1% (vekt/volum) henhv. 0.01% (vekt/volum) i forhold til den totale mengde av den første impregneringsløsning. En overskuddsmengde av kromogen anvendes også ved fremstillingen av den ønskede prøvestrimmel. Prøvestrimmelen i henhold til oppfinnelsen er egnet for påvisning av sukkeret i urin og blod, spesielt uringlukose. Selv når en stor mengde reduserende inhibitorer som f.eks. ascorbinsyre er tilstede i en prøve gir prøvestrimmelen en god følsomhet uten i særlig grad å påvirkes av disse inhibitorer og gir en korrekt diagnose for diabetikere.

Prøvestrimmelen i henhold til oppfinnelsen anvendes ved at den dyppes ned i en prøve og påviselig farveendring foregår da iløpet av 30 sekunder. Prøvestrimmelen kan anvendes i en lettere anvendbar form, f.eks. fastholdt på et plastark.

De følgende eksempler illustrerer eksempelvise og foretrukne utførelsesformer for oppfinnelsen.

Eksempel 1

Et stykke (5 x 10 cm) av dietylaminoetyl cellulosepapir (DE-81, Whatman) dyppes ned i følgende løsning ved romtemperatur

Det absorberende material impregnert med den ovennevnte løsning tørkes under redusert trykk ved romtemperatur og dyppes deretter ned i den følgende løsning ved romtemperatur.

Prøvestrimmelen impregnert med den ovennevnte løsning tørkes, festes på et polyvinylklprid-ark og kuttes opp i passende størrelser til å gi den ønskede prøvestrimmel.

Forsøksresultatene ved påvisning av urin-glukose i fravær av ascorbinsyre er vist i den følgende tabell.

Bemerk: Y= gult, GY = grønngult. Farven uttrykkes på grunnlag av standard farveprøver (JIS(Japanese Industrial Standard)Z 8721). Farvereaksjonen ble bestemt 30 sekunder etter at prøvestrimmelen var dyppet ned i en prøve og trukket opp fra.urinløsningen.

Det fremgår av tabellen at prøvestrimmelen i henhold til oppfinnelsen viser en tydelig farveendring (fra gult til grønngult) ved en konsentrasjon av uringlukose på mer enn 50 mg/100 ml.

Prøveresultatene ved påvisning av uringlukose i nærvær av ascorbinsyre gis i den følgende tabell.

Den følgende tabell viser den tid som kreves for fårvereaksjonen under anvendelse av en prøvestrimmel i henhold til oppfinnelsen, en prøvestrimmel uten celluloseacetatftalat og en prøvestrimmel fremstilt ved å belegge alle komponenter med celluloseftalat.

Bemerk: N-L/M betyr "nyanse-lyshet/metning", GY = grønngult.

Prøvestrimmel 1: Prøvestrimmelen ble fremstilt på en måte som beskrevet ovenfor.

Prøvestrimmel.. 2: Prøvestrimmelen ble fremstilt på en måte som beskrevet ovenfor, uten anvendelse av celluloseacetatftalat.

Denne prøvestrimmel ble anvendt for sammenligning.

Prøvestrimmel 3: Prøvestrimmelen ble fremstilt ved å impregnere

et absorberende material med en løsning inneholdende alle de nødvendige komponenter, hvori komponentene og deres konsentrasjon er den samme som for prøvestrimmel 1. Prøvestrimmel 3 ble anvendt for sammenligning.

Av forsøksresultatene kan det ses at endog i nærvær av 50 mg ascorbinsyre er prøvestrimmelen i henhold til oppfinnelsen ikke påvirket, mens prøvestrimlene 2 og 3 krever lenger tid for oppnåelse av en ønsket fargereaksjon. Dette viser det forhold at forsinkelsen av farvereaksjonen for prøvestrimmel 2 skyldes den inhiberende virkning av ascorbinsyre. Farvereaksjonen i prøvestrimmel 3 finner ikke sted jevnt på grunn av for stor dekkende virkning av celluloseasetatftalatet, selv om celluloseacetatftalat i seg selv har den virkning at det dekker de reaksjonskomponenter som tilsettes.

Den tid som kreves for farvereaksjonen har betydning for oppnåelse

av hurtige forsøksresultater. I og med at 3 til 4 diagnosestrimler for påvisning av forskjellige sykdommer markedsføres i en kombinasjons-form på et eneste ark, er det ønskelig å anvende prøvestrimler med samme lengde på farvereaksjonstiden. Når farvereaksjonstiden for hver prøvestrimmel er forskjellig i en slik kombinasjonstype av prøvestrimler er det ganske vanskelig å bestemme farvereaksjonen slik at man kan stole på denne. Farveendringen i de fleste prøve-stimler bedømmes vanlig 3 0 sekunder etter at de har vært dyppet ned i en prøve. Prøvestrimmelen i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan derfor anvendes uten vanskelighet for en kombinasjonstype av prøvestrimler.

Claims (7)

1. Prøvestrimmel for påvisning av sukker i kroppsvæsker, karakterisert ved at den omfatter et absorberende material impregnert med en løsning av sukkeroksydase, en peroksydase, et kromogen, og et celluloseacetatftalat.

2. Prøvestrimmel som angitt i krav 1, karakterisert ved at sukkeroksydasen er valgt fra gruppen bestående av glukoseoksydase og galaktoseoksydase.

3. Prøvestrimmel som angitt i krav 1, karakterisert ved at kromogenet er valgt fra gruppen bestående av o-tolidin, m-tolidin, guajac, o-dianisidin, benzidin, o-metylbenzidin, 4,4'-diaminodifenyl, o-fenylendiamin, m-fenylendiamin, 2,3-toluylendiamin, 2,4-toluylendiamin, 2,5-toluylendiamin, 2,5-toluylendiamin, gallussyre, pyrogallussyre, hydrokinon, benzidiner hvor aminogruppen eller gruppene er alkylert med en lavere alkylgruppe med 1 til 4 karbonatomer, og salter derav.

4. Fremgangsmåte f or., f remstilling av den prøvestrimmel som er angitt i krav 1, karakterisert ved å dyppe et absorberende material ned i en løsning av en sukkeroksydase, en peroksydase og en buffer, det impregnerte absorberende material tørkes, og det absorberende material dyppes ned i en løsning av celluloseacetatftalat og et kromogen, og det absorberende material tørkes.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at det som sukkeroksydase anvendes glukoseoksydase eller galaktoseoksydase.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at det som kromogen anvendes o-tolidin, m-tolidin, guajac, o-dianisidin, benzidin, o-metylbenzidin, 4,4'-diaminodifenyl, o-fenylendiamin, m-fenylendiamin, p-fenylendiamin, 2,3-t.oluylendiamin, 2,4-toluylendiamin, 2, 5-toluylendiamin, 2,6-to.luylendiamin, pyrogallussyre, hydrokinon, benzidiner hvorav aminogruppen eller -gruppene er alkylert med en lavere alkylgruppe med 1-4 karbonatomer og salter derav.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at impregneringsoppløsningen som inneholder enzymet innstilles til pH 5.0 - 8.0.