DE3237233C2

DE3237233C2 - Testvorrichtung für die quantitative Analyse von Substanzen in Körperflüssigkeiten

Info

Publication number: DE3237233C2
Application number: DE3237233A
Authority: DE
Inventors: Yuzo Tokyo Kosaka; Mikio Machida Tokyo Ohtani; Hiroshi Chigasaki Kanagawa Wada
Original assignee: Eiken Kagaku Kk Tokyo Jp
Current assignee: Eiken Kagaku Kk Tokyo Jp
Priority date: 1982-08-02
Filing date: 1982-10-07
Publication date: 1984-06-20
Also published as: US4476222A; JPS5926061A; JPH0146029B2; CA1198661A; DE3237233A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Teststück zur quantitativen Analyse einer Substanz in einer Körperflüssigkeit, insbesondere im Blut, wobei dieses Teststück aus einem Absorbensträger, der Reagentien zum Messen der Substanz enthält und mit einer Mischung aus Methylpolymethacrylat und Polyvinylformal überzogen ist, aufweist. Dieses Teststück ermöglicht die wirksame und glatte quantitative Analyse der Substanz in der Körperflüssigkeit, insbesondere im Blut, in einer kurzen Zeitspanne ohne vorherige Abtrennung des Serums vom Blut.

Description

Die Erfindung betrifft eine Testvorrichtung für die quantitative Analyse einer Substanz in einer Körperflüssigkeit gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Bisher war es zum Messen einer spezifischen Substanz oder spezifischer Substanzen In Körperflüssigkeiten, insbesondere im Blut, notwendig, Serum von dem Blut abzutrennen und ein frisch hergestelltes Meßreagens diesem Serum zuzusetzen. Diese Maßnahmen waren kompliziert und zeitraubend. Ließ man ferner das Blut oder das Serum während einer langen Zeitspanne vor Beginn der Analyse stehen oder dauerte es eine bestimmte Zeit, die Serumproben herzustellen, dann wurden die zu messenden Substanzen oft zerstör! oder verändert, so daß keine genauen quantitativen Analysen durchgeführt werden konnten. Ferner waren viele der für die Messungen eingesetzten Rcagentien mit dem Problem behaftet, daß sie nach der Herstellung nicht stabil waren, so daß diese Reagentien In einem erheblichen Ausmaße verworfen werden mußten.

Zur Lösung dieser verschiedenen Probleme wurden in breitem Umfange Testvorrichtungen eingeführt, in denen Reagentien zum Aufsprühen der gesuchten Substanzen In einem absorptionsfähigen Träger, wie Filterpapier, enthalten sind. Von derartigen Testvorrichtungen ist eine bekannt, in welcher der absorptionsfähige Träger, der mit einem Meßreagens Imprägniert ist, mit einem geeigneten Überzugsmaterial überzogen ist, so daß dann, wenn der beschichtete Träger In Kontakt mit Blut gebracht wird, die zu messende Substanze sich von dem Blut abscheidet, d. h., daß die Substanz in den Träger eindringt, während die Blutzellen auf der beschichteten Oberfläche zurückbleiben, und eine Reaktion der Substanz mii dem Meßreagens erfolgt. Bei Verwendung einer derartigen Testvorrichtung können die Ergebnisse der Reaktion unmittelbar nach der Reaktion In der Weise ermittelt werden, daß die Blutzellen von der TrägeroberflBche durch Waschen mit Wasser entlernt werden. Auf diese Weise is¹ die Messung in einer extrem kurzen Zeitspanne unter Einsatz einer geringen Menge Blut ohne Abtrennung von Serum möglich.

Beispielswelse wird es Im Falle von Diabetikern als therapeutisch wichtig angesehen. Glukose Im Blut des Patienten zu messen und die Dosierung des zu verabreichenden Arzneimittels auf der Grundlage der Meßergebnisse zu bestimmen. Dieser Zweck kann durch Verwendung der vorstehend beschriebenen Testvorrichtung erfüllt werden.

Wie bereits erwähnt, sind Testvorrichtung, welche die Verwendung des ganzen Blutes als Probe gestatten, für eine schnelle Analyse geeignet Die technische Schwierigkeit, derartige Testvorrichtungen in der Praxis einzu-

Ki setzen, liegt jedoch darin, daß bisher kein geeignetes ■Überzugsmaterial bekannt war, welches die leichte und wirksame Abtrennung der in dem Blut zu messenden Substanz ermöglicht.

Aus der US-PS 30 92 465, der DE-AS 15 98 048 und der DD-PS 48 717 sind Testvorrichtungen für die quantitative Analyse einer Substanz in einer Körperflüssigkeit, bestehend aus einem ah sorptionsfähigen Träger, der mit Reagentien imprägniert ist, und einem für die zu messende Substanz permeablen Überzug, welcher die Oberfläche des Trägers bedeckt, bekannt, wobei im Falle der erwähnten US-PS Cellulosederivate verwendet werden und im Falle der DE-AS hydrophobe Substanzen eingesetzt und im Falle der DD-PS Celluloseester, Polyvinylalkohol oder Polyvinylacetat angewendet werden. Bei Verwendung dieser bekannten Überzüge ist es jedoch schwierig, die Permeabilität bezüglich der zu messenden Substanz (Glukose) einzustelk'i. Das gleiche gilt auch für die Verwendung von hydrophoben Überzügen, wie Fetten, Ölen, Wachsen, Silikon etc., gemäß der JP-OS

3» 15 669/1970.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, die Nachteile der vorstehend beschriebenen bekannten Überzüge zu beseitigen, d. h., Überzüge zu schaffen, die bezüglich der Permeabilität der zu messenden Substanzen unproblematisch sind.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung durch eine Testvorrichtung gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst. Demgemäß ist es erfindungswesentllch, als Überzug ein Gemisch aus Polymethylmethacrylat und Polyvinylformal zu verwenden. Ein derartiges Gemisch wird in der erwähnten DD-PS 48 717 nur als Verklebungsmittel für den Träger beschrieben, sein Einsatz als Überzug war daher nicht naheliegend.

Mittels der erlindungsgemäßen Testvorrichtung ist es möglich, eine quantitative Analyse von Substanzen in Körperllüssigkeiten, insbesondere im Blut, in einer kurzen Zeitspanne ohne vorherige Abtrennung des Serums vom Blut durchzuführen, wobei die Substanzen ohne Schwierigkeiten in die Testvorrichtung einzudringen vermögen.

Erforderlichenfalls kann die Permeabilität gegenüber den in die Testvorrichtung einzudringenden Substanzen eingestellt werden, so daß eine Steuerung der Reaktionsgeschwindigkeit der Substanzen mit dem Meßreagens in der Testvorrichtung möglich ist.

Vorzugsweise liegt das Verhältnis von Polymethylmethacrylat zu Polyvinylformal in dem Überzug zwischen 9 : 1 und 1 : 9.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnung

näher erläutert, die eine Eichkurve darstellt, die unter Verwendung der Testvorrichtung A gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist, wobei auf der Ordinate die Reflexion bei 700 nm und auf der Abszisse die Konzentration der Glukose Im Blut aufgetragen sind.

^b> Wie bereits erwähnt, ermöglicht der erlindungsgemäß verwendete Überzug aus einem Gemisch von Polymethylmethacrylat und Polyvlnyllormal eine wirksame Abtrennung der zu untersuchenden Substanzen im Blut

und ein schnelles Eindringen derselben in den Absorptionsi'ähigen Träger.

Da eri'indungsgemäß das relativ hydrophile PoIy-.nethylmethacrylat und das hydrophobe Polyvinyllormal in Kombination eingesetzt werden, kann durch Variation des Mischungsverhältnisses der beiden Komponenten die Permeabilität des Überzugs gegenüber der zu messenden Substanz gesteuert werden.

Wird Polymethylmethacrylat als alleiniges Beschichtungsmaterial verwendet, dann dringen die Blutzeiisn leicht in den absorptionsfähigen Träger durch die Schnittebene der Testvorrichtung, wie im Falle der bekannten Verwendung eines Cellulosederivats, ein, während in dem Falle, in welchem Polyvinyllormal allein als Überzug verwendet wirc^!, die Blutzellen nicht in geeigneter Weise entfernt werden können. Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen sind die ausgezeichneten Wirkungen, die durch Vermischen der beiden Komponenten erzielt werden, überraschend.

Die Substanzen im Blut, die mit der erfindungsgemäßen Testvorrichtung gemessen werden können, können aus Glukose, Galaktose, Brenztraubensäure, Aminosäuren, Milchsäure, Alkohol, Harnstoff etc. bestehen. Die Reagentien, die für die Messung eingesetzt werden, lassen sich leicht in Abhängigkeit von der jeweils zu messenden Substanz auswählen. Beispielsweise enthält eine Testvorrichtung zum Messen von Glukose im Blut GIukoseoxidase, eine Substanz mit Peroxidaseaktivität sowie einen oxidierbaren Indikator als Grundreagentien. In ähnlicher Weise enthält ein Teststück zum Messen von Galaktose im Blut Galaktoseoxidase, eine Substanz mit Peroxidaseaktivität sowie einen oxidierbaren Indikator. In dem Falle, in dem der Alkoholspiegel im Blut gemessen werden soll, wird ein Teststück mit einem Reagens aus Alkoholdehydrogenase, Nikotinadenindinukleotid, Diaphorase und einem Tetrazoliumsalz imprägniert. In den meisten Fällen ist das ^vsrlahren zum Messen einer spezifischen Substanz nicht auf eine Methode beschränkt, vielmehr steht eine große Anzahl von Methoden zur Verfügung. Jede Methode kann angewendet werden, solern das Reagens in dem Träger in einem stabilen Zustand vorliegt. Ferner ist es bekannt, eine Substanz zum Pulfern der Reagensmasse auf einen konstanten pH, eine Substanz zur Stabilisierung, eine Substanz zur Einstellung der Reaktionsgeschwindigkeit etc. zuzusetzen, so daß die Erfindung leicht in Kenntnis der herkömmlichen Modifikationen abgeändert weiden kann.

C^s erfindungsgemäß verwendete Polymethylmethacry'dt ist ein Har? mit ausgzeichneter Transparenz und Stabilität, das als organisches Glas eingesetzt wird. Das verwendete Polyvinyllormal wird in der Praxis als elektrisches Isolationsmaterial verwendet. Geeignete Molekulargewichte der beiden Substanzen werden im Hinblick auf die Entfernung der Blutzellen aus dem Gesamtblut ausgewählt. Durch Verändern des Mischungsverhältnisses der beiden Substanzen läßt sich das jeweils angestrebte Blutzellenabtrennungsvermögen variieren. Vorzugsweise werden die beiden Substanzen in ungefähr gleichen Mengen eingesetzt.

Die erfindungsgemäße Testvorrichtung kann durch Imprägnieren eines absorplionsfähigen Trägers mit einem Reagens für die Messung und Überziehen mit dem Überzugsmaterial hergestellt werden. Beispiele für absorptlonslühige Trager sind Filterpapier. Baumwolle, HoIzschnitzel. synthetisches Fuserpapier. Glaslasern, poröse Kunststoffe eic. wobei Filterpapier das bevorzugte Material darstellt.

Bei der Herstellung tier erfindungsgemäßen Testvorrichtungen können die Imprägnierunsstufe und die Überziehungsstufe entweder in einer Stufe oder in zwei oder mehreren Stufen ausgeführt werden. Das Überzugsmaterial wird vorzugsweise in der Endstufe aufgebracht, und zwar in Lösungen in einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Methylenchlorid, Chloroform oder dgl. In diesem Falle ist es auch möglich, einen Teil des Reagenses in die Lösung des Überzugsmaterials einzumischen. Nach dem Imprägnieren wird der absorptionsfähige Träger unter geeigneten Bedingungen getrocknet. Der erhaltene Träger wird mit einem geeigneten Stützbogen, gegebenenfalls unter Verwendung eines Klebebandes, verbunden und für die praktische Verwendung zu geeigneten Größen zerschnitten.

Die auf diese Weise zurechtgeschnittenen Testvorrichtungen werden im wesentlichen nicht mit Blut durch die Schnitlebene hindurch imprägniert. Der Grund dalür dürfte wie folgt zu erklären sein:

Wird Polymethylmethacrylat allein verwendet, dann werden wahrscheinlich der Überzug auf der Schnittebene und die Stellen in seiner Nachbarschaft beim Schneiden zerbrochen. Folglich können Blutzellen in dem absorptionsfähigen Träger durch die Schnittebene eindringen. Wird andererseits eine Mischung aus Polymethylmethacrylat und Polyvinylformal verwendet, dann bilden beide Bestandteile einen elastischen Überzug, wobei sie untereinander in ausreichendem Maße verbunden sind. Daher wird das Ausmaß, in welchem der Überzug auf der Schniltebene zerbrochen wird, herabgesetzt und das Blut im wesentlichen daran gehindert, in den Träger über die Schnittebene einzudringen.

Als Stützbogen können Materialien verwendet werden, die in zweckmäßiger Weise eine geringe Wasserabsorption besitzen. Holz, Papier, Tuch, Metall, Glas und vorzugsweise Kunststoffmaterialien, wie Polystyrol, Polyethylen oder Polyvinylchlorid, können verwendet werden. Diese Bögen dienen lediglich c'.azu, die Testvorrichtungen zu schützen und gleichzeitig ihre Gebrauchsfähigkeit zu erhöhen, sind jedoch nicht unbedingt erforderlich.

Beim Messen der Substanzen im Blut wird die Reaktion in der Weise durchgeführt, daß eine bestimmte Menge an Blut, das aus dem Ohrläppchen oder der Fingerspitze entnommen wird, auf eine Testvorrichtung getropft und während einer vorherigen Zeitspanne stehen gelassen wird. Nach einem Abwaschen des Blutes mit Wasser und einem Abwischen des restlichen Wassers mit einem sauren Papier oder dgl., kann die Konzentration der Substanz durch Vergleich der durch diese Weise erzeugten Farbdichte mit einer Standardfarbtafel, die getrennt hergestellt wird, bestimmt werden. Wahlweise ist es auch möglich, das Reflexionsvermögen der erzeugten Farbe bei einer vorherbestimmten Wellenlänge mittels eines geeigneten Meßinstrumentes zu messen und die Konzentration der Substanz unter Bezugnahme auf die Konzentrations/Reflexions-Kurve, die getrennt hergestellt wird, zu bestimmen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
Testvorrichtungen zum Messen von Glukose im Blut

Um die Wirksamkeit des eriindungsgemäß eingesetzten Reschichtungsmaicrials zu zeigen, werden Testvorrii/htungcn zum Messen von Glukose im Blut hergestellt.

Filterpapier Nr. 2316, hergestellt von der Schleicher und Schüll AG. wird in die folgende erste Lösung eingetaucht und bei 60 C 30 min getrocknet:

Erste Lösung

Glukoseoxidase (12 000 IU/g) 0,83 g

Peroxidase (105 IU/mg) 0,038 g

Polyvinylpyrollidon 5 g
(Molekulargewicht 40 000)

O-Tolidindihydrochlorid 0,3 g

2,7-Diaminonuorendihydrochlorid 0,2 g

Zitronensäure 1,98 g

Natriumeitrat 5,22 g

EDTA ■ 2NA 0,1 g

Ethanol 28 ml

Destilliertes (Destilliertes Wasser wird zugc-

Wasser setzt, so daß das Gesamtvolumen

100 ml betragen kann)

Das erhaltene Testpapier wird In vier Abschnitte zerteilt, wobei einer in die folgende zweite Lösung eingetaucht und bei 40° C 10 min getrocknet wird.

Zweite Lösung

Polymethylmethacrylat
Polyvinylforma!

0,75 g
0,75 g

Methylenchlorid (Methylenchlorid wird in einer solchen Menge zugesetzt, daß das Gesamtvolumen 10 ml betragen kann).

Das auf diese Weise erhaltene Testpapier wird mit einer Polystyrolstützlolie verbunden. Dann wird es zur Herstellung einer Testvorrichtung mit einem Testabschnitt von 5 mm χ 10 mm zerschnitten. Dieses wird als Teststück A (erfindungsgemäß) bezeichnet. Die restlichen drei Abschnitte, die mit der ersten Lösung imprägniert sind, werden ähnlichen Methoden unterzogen, mit der Ausnahme, daß die Überzugsmaterialien verändert werden. Anstelle der Mischung aus Polymethylmethacrylat und Polyvinyl formal in der zweiten Lösung werden nur 1,5 g Polymethylmethacrylat, nur 1,5 g PoIyvinyllörmal und 1,5 g Ethylcellulose zur Herstellung der Teststücke, die mit B, C und D (Verglcichsproben) bezeichnet werden, verwendet.

Frisches Blut wird auf den Testteil eines jeden Teststückes aufgetropft. 60s nach dem Auftropfen wird gewaschen und das restliche Wasser durch Absorption mit einem sauberen Filterpapier entfernt. Anschließend wird der Zustand eines jeden Testabschnittes beobachtet. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle I hervor.

Tabelle I	Entfernung von Blutzellen von der Oberfläche	Permeation der Blutzellen durch die Schnittebene
Testvorrichtung	vollständig entfernt	keine
A (Erfindung)	Hauptmenge entfernt	beobachtet
B (Vergleich)	unzureichend entfernt	keine
C (Vergleich)	Hauptmenge entfernt	beobachtet
D*) (Vergleich)

Wie vorstehend gezeigt, ist die erfindungsgemäße Testvorrichtung bezüglich der Entfernung von Blutzellen von seiner überlläche ausgezeichnet und verhindert in ausreichendem Ausmaße die Permeation von Blutzellen

■> durch die .Schnittebene.

Anschließend wird die in Beispiel 1 beschriebene Testvorrichtung Λ der Reaktion mit einigen Blutproben mit verschiedenen Konzentrationen an Glukose exakt 60s unterzogen und mit Wasser gewaschen und das restliche

ίο Wasser mit einem sauberen Filterpapier abgewischt. Unmittelbar danach werden die Reflexionsfaktoren unter Verwendung eines Color Analyzers (Modell 607) bei einer Wellenlänge von 700 ηm gemessen. Eine Eichkurvc, wie sie in der beigefügten Figur gezeigt wird, wird

is aus der Rellexion und den entsprechenden gemessenen Glukosekonzentralionen mittels eines Glukoseanalysers (YSI Glukosenanalyser Modell 23-A) erhalten.

Be iüpiel 2

Testvorrichtung zum Messen von Brenztraubensäure im

Blut

Filterpapier wird in die folgende erste Lösung eingetaucht und sofort gefriergetrocknet.

Erste Lösung

Monokaliumphosphat
Dinatriumphosphat

Brenztraubensäureoxidase
(15 IU/mg)

Peroxidase (105 IU/mg)

Gummikumarabikum

Flavinadenindinukleotid

3,408 g 0,852 g 2 g

0,143 g

2 g 0,25 g

Destilliertes (Destilliertes Wasser wird zuge-

Wasser setzt, daß das Gesamtvolumen

100 ml betragen kann).

Anschließend erfolgt ein Eintauchen in die folgende zweite Lösung und ein Trocknen um Vakuum.

Zweite Lösung

3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin 0,35 g

Polymethylmethacrylat 0,6 g

Polyvinylformal 0,6 g

Methylenchlorid

(Methylenchlorid wird in einer solchen Menge zugesetzt, daß

däS Gesamtvolumen 100 nil

betragen kann).

Eine Testvorrichtung, die an einem Kunststoff anhaftet, wird nach einer Methode hergestellt, die der In Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist. Diese Testvorrichtung wird dann einer Reaktion mit Blut, das Brenztraubensäure enthält, während 120 s unterzogen und mit Wasser gewaschen. Dabei wird eine klare blaue Farbe beobachtet. Die Dichte dieser Farbe ist proportional dem Gehalt an Brenztraubensäure.

·) US-PS 30 92 465 und 32 98 789

Beispiel 3 Testvorrichtung zum Messen von Galaktose im Blut

Die folgende erste Lösung und die zweite Lösung werden aufeinanderfolgend auf ein Filterpapier aufgebracht.

Das Trocknen erfolgt bei 50° C während 30 min bzw.
während 5 min nach der Aulbringung der ersten und der
zweiten Lösung. Anschließend werden Methoden, die
denjenigen in Beispiel 1 ähnlich sind, zur Gewinnung
einer Testvorrichtung durchgeführt.

Erste Lösung
Galaktoseoxidase (250 IU/mg) 0,1 g

Peroxidase (105 IU/mg) 0,095 g

Monokaliumphosphat 2,177 g

Dinatriumphosphat (Dodecahydrat) 1,433 g

Gelatine 0,5 g

Zweite Lösung
2,7-DiaminoOuoren
Polymethylmethacrylat
Polyvinylformal

Destilliertes
Wasser

(Destilliertes Wasser wird in
einer solchen Menge zugesetzt,
daß ein Gesamtvolumen von
ml erreicht werden kann)

0,5 g 0,4 g 0,6 g

Chloroform (Chloroform wird in einer sol

chen Menge zugesetzt, daß das Gesamtvolumen 100 ml betragen kann).

Die Testvorrichtung zeigt eine blaue Farbe mit Blut, das Galaktose enthält, wobei die Dichte dem Galaktosegehalt entspricht.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen.

Claims

Patentansprüche:

1. Testvorrichtung für die quantitative Analyse einer Substanz in einer Körperflüssigkeit, bestehend aus einem absorptionsfähigen Träger, der mit Reagentlen imprägniert ist, und einem für die zu messende Substanz permeablen Überzug, welcher die Oberfläche des Trägers bedeckt, dadurch gekennzeichnet, daß der Überzug aus einem Gemisch von Polymethylmethacrylat und Polyvinylformal besteht.

2. Testvorrichtung nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Polymethylmethacrylat zu Polyvinylformal in dem Überzug zwischen 9 : 1 und 1 : 9 liegt.

3. Testvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis etwa 1 : 1 beträgt.

4. Testvorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der absorptionsfählge Träger aus Filterpapier, Baumwolle, Holzstücken, synthetischem Faserpapier, Glasfasern und/oder porösen Kunststoffen besteht.