DE2850501A1 - Verfahren und vorrichtung zur chemischen spot-test-analyse - Google Patents

Description

DAMON CORPORATION, Needham Heights, Massachusetts,

V.St.A.

Verfahren und Vorrichtung zur chemischen Spot-Test-Analyse

Die Erfindung betrifft eine Weiterbildung des Verfahrens und der Vorrichtung zur analytischen Bestimmung löslicher Bestandteile in Fasermaterialien als Trägermedien der DE-OS 25 36 886 (US-PS 4 059 405). Die Erfindung bezieht sich demgemäß auf das in dieser DE-OS · angegebene Verfahren sowie die entsprechende Vorrichtung (vgl. auch die US-Anmeldung Serial No. 498,646 vom 19.Ö.74 sowie die US-Patentanmeldung Serial No. 243,068 vom 11. 4. 1972).

Der Erfindung liegt die allgemeine Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren sowie eine verbesserte Vorrich-

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tung einschließlich allen Zubehörs zur chemischen Spot-Test-Analyse bei einer optisch dünnen Konzentration des zu vermessenden Reaktionsprodukts anzugeben, bei denen die Analysengenauigkeit gesteigert ist, wobei die Analysen zugleich leicht durchführbar und in einem erweiterten Anwendungsbereich anwendbar sein sollen. Dabei soll ein verbessertes faserförmiges oder anderes poröses Medium zur Verwendung bei der chemischen Spot-Test-Analyse angegeben werden, das in der Weise vorbehandelt ist, daß es mindestens einige Reagenzien zur Erzeugung des Reaktionsprodukts für die Messung bei optisch dünner Konzentration enthält; gleichzeitig solleneine Einweg-Vorrichtung zur Erleichterung der Flüssigkeitszugabe zum Reaktionsmedium zur Verwendung bei der obigen chemischen Spot-Test-Analyse sowie ein verbesserter Meßaufbau zur Steigerung der Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der chemischen Spot-Test-Analyse bei optisch dünnen Konzentrationen des zu vermessenden Reaktionsprodukts angegeben werden.

Die chemische Spot-Test-Analyse bei einer optisch dünnen Konzentration des zu vermessenden Reaktionsprodukts wird mit einem faserförmigen oder anderen porösen Medium durchgeführt, das mit einem Mittel vorbehandelt ist, durch dessen Einwirkung das Medium mehr flüssige Reaktanten aufnehmen kann. Durch ein derartiges Konditionierungsmittel wird der Benetzungsgrad des Mediums mit den flüssigen Reaktanten an einer fleckartigen Reaktionsstelle erhöht. Bei der Vorbehandlung des Mediums werden ferner vorzugsweise mindestens einige Reagenzien eingeführt. Bei einem typischen Beispiel wird ein vorbehandeltes Medium, das das Aussehen eines einfachen, trockenen Papierstreifens hat, in einfacher Weise so angewendet, daß die zu analysierende Probe mit einer Flüssigkeitsmenge zugegeben wird, die aus-

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reicht, um die Reaktanten an der betreffenden ausgewählten Stelle zu lösen bzw. in flüssigen Zustand überzuführen. Die Vorbehandlung des Mediums mit Reagenzien sowie mit dem Konditionierungsmittel ist im allgemeinen aus praktischen sowie wirtschaftlichen Gründen auf die Reaktionsstellen beschränkt.

Das Konditionierungsmittel erhöht die Flüssigkeitsaufnahmekapazität des Mediums, das die Reaktanten an der betreffenden Stelle in flüssigem Zustand enthält, ohne daß eine störende Ausbreitung oder ein Verfließen auftreten. Das Konditionierungsmittel führt zu solchen Flüssigkeitsaufnahmeeigenschaften des Mediums, daß flüssige Reaktanten bei einem höheren Flüssigkeitsgehalt pro Einheitsfläche des Mediums, jedoch unterhalb der Sättigung, festgehalten werden, als dies ohne derartige Konditionierungsmittel der Fäll wäre. Aufgrund des höheren Benetzungsgrads an der Reaktionsstelle ist ein gegebenes Flüssigkeitsvolumen demgemäß in einem kleineren Fleck enthalten, als dies sonst der Fall wäre, wodurch die Genauigkeit der analytischen Messung erheblich gesteigert wird.

Es wird davon ausgegangen,daß geeignete Konditionierungsmittel ausgewogene Mengen an hydrophoben und hydrophilen Molekülen entweder einzeln oder als Bestandteile eines Polymeren enthalten. Der hydrophobe Anteil dient wahrscheinlich zur Abstoßung der Flüssigkeit von den Teilchen oder Fasern des Mediums, während der hydrophile Anteil unterstelltermaßen zur Erleichterung des Eindringens der Flüssigkeit in die freien Zwischenräume im Medium beiträgt.

Typische Konditionierungsmittel enthalten ein Verdickungsmittel sowie ein grenzflächenaktives Mittel bzw.

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entsprechende Bestandteile. Geeignete verdickend wirkende Konditionierungsmittel sind Polyäthylenoxide (Polyox) (vgl. k 059 405), Albumin, Gummiarabicum, Guargummi sowie etwa Mannit. Geeignete grenzflächenaktive Mittel können unter den derzeit verfügbaren grenzflächenaktiven Mitteln ausgewählt werden; hierzu gehört beispielsweise Brij. ⁺ die US-PS

Erfindungsgemäß sind ferner niedermolekulare grenzflächenaktive Mittel auf Polyolbasis (Pluronics und Tetronics der BASF Corporation) vorteilhaft als Konditionierungsmittel verwendbar.

Derartige Produkte liegen in zahlreichen polymeren Formen mit verschiedenen Verhältnissen der hydrophoben und hydrophilen Bestandteile vor.

Der Vorteil des erfindungsgemäß eingesetzten Konditionierungsmittels beruht wahrscheinlich mindestens zum Teil darauf, daß Messungen an reaktiven Flüssigkeiten während der Entstehung des Reaktionsprodukts vorteilhaft innerhalb eines bestimmt gewählten Bereichs von Feuchtigkeit in der Struktur des Reaktionsmediums durchgeführt werden. Derartige Messungen erlauben die Erzielung einer höheren Genauigkeit als bei anderen Feuchtigkeitsbedingungen. Durch das erfindungsgemäße Konditionierungsmittel lassen sich erwünschte, relativ hohe und gleichbleibende Feuchtigkeitsbedingungen während der Messung erzielen. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Konditionierungsmittel in flüssiger Form mit mindestens einigen der Reaktanten für die entsprechende analytische Reaktion versetzt. Das resultierende flüssige Reagenssystem wird auf ein blattförmiges Pasermaterial wie etwa auf Testpapier (Schleicher & Schüll, Typ 903-C) aufgebracht. Das resultierende vorbehandelte Papier, das

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nach der Trocknung außerordentlich lagerbeständig ist, wird zur Spot-Test-Analyse wie beispielsweise zur Analyse von Blutserum in der Weise eingesetzt, daß verdünntes Serum sowie die zur entsprechenden Analyse erforderlichen weiteren Reagentien an einer vorbehandelten Stelle des Papiers aufgebracht werden. Die resultierende Reaktion wird verfolgt, typischerweise mit einem Fluorometer oder einem anderen Photometer, wobei das dem zu bestimmenden Bestandteil entsprechende Reaktionsprodukt gemessen wird.

Nach einer anderen Ausbildungsform der Erfindung wird das Reaktionsmedium in der Weise mit den jeweilig ' erwünschten Reagentien sowie dem Konditionierungsmittel so hergestellt, daß die verschiedenen Reagentien in verschiedenen Zonen jeder Teststelle aufgebracht werden. Dieses zonenförmige Aufbringen der Reagentien wird beispielsweise dann angewandt, wenn verschiedene Reagentien im wesentlichen voneinander getrennt bleiben sollen, bis die analytische Reaktion stattfindet, oder wenn einfach die physikalische Verteilung der Reagentien kontrolliert werden soll. Verschiedene Reagentien können erfindungsgemäß dadurch zonenförmig aufgebracht werden, daß zunächst eines oder mehrere Reagentien, die zusammen stabil sind, zusammen mit einem geeigneten Konditionierungsmittel in flüssiger Form in der Mitte einer entsprechenden Reaktionsstelle aufgebracht· werden, wonach die Lösung ausbreiten gelassen wird. Anschließend wird ein bestimmtes Volumen Wasser oder einer anderen Flüssigkeit in der Mitte dieser Stelle aufgebracht, um das zuvor aufgebrachte Reagens aus dem Zentrum des entsprechenden Flecks nach außen auszuwaschen. Im Anschluß daran, typischerweise nach dem Trocknen des Mediums, wird das weitere Rea-

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gens in der Mitte des Flecks mit einem ausreichend kleinen Flüssigkeitsvolumen derart aufgebracht, daß keine Ausbreitung außerhalb des vorher vom zuvor aufgebrachten Medium befreiten Mittelbereichs auftritt. Nach dem Trocknen kann das Medium mit den in verschiedenen Teilen eines jeden Flecks auf die angegebene Weise in Zonen aufgebrachten Reagentien bis zur Verwendung in derselben Weise wie oben angegeben aufbewahrt werden. Wenn die Reagentien ohne eine derart hohe Trennung voneinander in Zonen aufgebracht werden sollen, kann der Waschschritt auch entfallen. Nach dem Aufbringen des ersten Reagens wird allerdings im allgemeinen getrocknet, bevor das zweite Reagens aufgebracht wird.

Die Probe wird auf dem vorbehandelten Medium analysiert, indem die Probe und die Flüssigkeit auf die Reaktionsstelle aufgebracht und die resultierende, dem zu bestimmenden Bestandteil entsprechende Reaktion verfolgt wird. Die zur überführung der Reaktanten in den flüssigen Zustand erforderliche Flüssigkeit wird üblicherweise mit der Probe als Verdünnungsmittel eingebracht. Wenn das Medium ein faserförmiges, papierartiges Plachmaterial ist oder aber auch eine andere Porenstruktur aufweist, ist es vorteilhaft, die Flüssigkeit mit kontrollierter Geschwindigkeit zuzugeben. Es wurde festgestellt, daß eine zu langsame Zugabe der Flüssigkeit zu einer Abreicherungstendenz im Zentrum der Reagentienstelle führt, während eine zu rasche Flüssigkeitszugabe unregelmäßige und daher nicht reproduzierbare Flecken ergibt.

Nach einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung wird bei optimaler Plüssigkeitszugäbegeschwindigkeit mit einer Pipette ein gleichmäßiger, jedoch kleiner und gleichbleibender Flüssigkeitsvorrat auf dem Medium in der Nähe der Pipettenspitze erzeugt. Bei optimaler Zugabegeschwin-

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digkeit wird dieser Vorrat aufrechterhalten, dh frische Flüssigkeit mit etwa im wesentlichen derselben Geschwindigkeit zugegeben, mit der das Medium Flüssigkeit aus diesem Flüssigkeitspool abzieht. Das Verschwinden des Flüssigkeitspools zeigt entsprechend eine zu langsame Flüssigkeitszugabe an, -während zu schnelle Zugabe zu einem instabilen Flüssigkeitsvorrat führt, so daß Flüssigkeit aus dem Pool austritt und über die Oberfläche des Mediums fließt.

Die Erfindung erleichtert die Kontrolle der Zugabe der Probenflüssigkeit zu einer entsprechenden Stelle des Reaktionsmediums mit erwünschter Geschwindigkeit durch eine dochtartige Einrichtung zur Kontrolle der Flüssigkeitszufuhr im Zentrum des betreffenden Flecks, durch die die Flüssigkeit zugeführt wird. Diese Einrichtung weist vorzugsweise die Form einer zylindrischen Scheibe auf. Sie ist bedeutend kleiner als der Fleck, den die Reaktanten an der Teststelle bilden, und bedeckt entsprechend lediglich deren Mittelbereich. Es wurde festgestellt, daß beispielsweise zylindrische Dochtscheiben von 1 bzw. 1,5 bis 3 mm Durchmesser vorteilhaft verwendbar sind; in diesem Fall bildeten die Reaktanten einen Fleck von etwa 10 mm Durchmesser. Die Scheibe weist eine faserige oder andere poröse Struktur auf und kann typischerweise aus der gleichen Art von Blattmaterial ausgestanzt werden, wie es für das Reaktionsmedium verwendet wird. Zur Messung wird die Scheibe in der Mitte der Reaktionsstelle aufgelegt, worauf die verdünnte Probe oder eine andere Flüssigkeit direkt darauf aufgebracht wird. Die Flüssigkeit gelangt demgemäß von der Scheibe in das Reaktionsmedium. Die Dochtscheibe stellt dementsprechend ein Art Puffervolumen für überschüssige Flüssigkeit dar und scheint eine künstliche Plüssigkeitszuführungszone zu schaffen, die dem kleinen, oben erwähnten Flüssig-

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keitsvorrat ähnelt, wie er zum direkten Aufbringen der Flüssigkeit auf das Medium erwünscht ist.

Nach der Zugabe der Flüssigkeit über die Scheibe kann diese vor Meßbeginn leicht von der Reaktionsstelle entfernt werden.

Alternativ dazu kann das Meßgerät die Scheibe aufnehmen. .

Ein anderes geeignetes Dochtelement läßt sich beispielsweise aus porösem, hydrophilem Polyäthylen herstellen.

Die Dochtscheibe kann zum Einbringen des Reagens an der Reaktionsstelle zusammen mit der Probe oder einer anderen .Flüssigkeit mit dem Reagens vorbehandelt werden. Die Zufuhr eines Reagens in dieser Weise ist oft von Vorteil, wenn dieses in Gegenwart anderer Reagentien instabil ist oder aus anderen Gründen vor dem Meßbeginn von den anderen Reaktanten getrennt gehalten werden muß. Die Vorbehandlung der Scheibe mit einem Reagens umfaßt die Absorption einer flüssigen Lösung oder Suspension des entsprechend ausgebildeten Reagens in der Scheibe, die Trocknung der Scheibe sowie ggf. die Verpackung zur Konservierung des Reagens. Durch Zufuhr von Flüssigkeit auf einer Reaktionsstelle durch eine derartige vorbehandelte Scheibe wird das Reagens automatisch aus der Scheibe auf die Reaktionsstelle gewaschen. Auf diese Weise gelangt das zuvor in der Scheibe vorliegende Reagens zum gewünschten Zeitpunkt zu den anderen Reagentien^ wobei zugleich die erwünschte, kontrollierte Flüssigkeitszugabegeschwindigkeit erzielt wird.

Alternativ zur Durchführung analytischer Messungen am feuchten Reaktionssystem kann die Erfindung auch, zumindest

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bei einigen analytischen Verfahrens durch Vermessung des Reaktionsprodukts bei getrocknetem Reaktionsfleck durchgeführt werden.

Die Erfindung kann ferner in manchen Fällen mit einer Ein-Punkt-Messung, dh einer einzigen Messung des Feaktionsprodukts, durchgeführt werden, was allerdings mit einem Verlust an Genauigkeit verbunden ist. Derartige Einzelmessungen können durchgeführt werden, wenn die zur Bestimmung des jeweiligen Bestandteils dienende Reaktion im wesentlichen abgelaufen . ist^oder danach, wenn die Reaktanten trocken sind. Derartige Einzelpunktmessungen des in optisch dünner Konzentration vorliegenden Reaktionsprodukts beruhen darauf, daß das interessierende Signal in ausreichender Weise von Schwankungen in der Untergrundcharakteristik des Mediums sowie der Reaktanten unterschieden -werden kann. Derartige empfindliche Nachweise des Reaktionsprodukts gegenüber dem Untergrund sowie anderen, nicht reproduzierbaren Signalen sind durch verbesserte analytische Verfahren zur Erzeugung entsprechender Reaktionsprodukte sowie verbesserte Durchführungsweisen möglich, bei denen Schwankungen des Uhtergrundsignals verringert werden. P^ierdurch kann bei der Analyse durch- Ein-Punkt-Messungen eine Genauigkeit von mindestens 5 % erzielt werden.

Die Erfindung umfaßt ferner Verbesserungen der Photometereinrichtung zur Durchführung von Spot-Test-Messungen von Reaktionsprodukten in optisch dünnen Konzentrationen. Bei dieser Vorrichtung wird das Reaktionsmedium in den Strahlengang des optischen Systems zwischen eine Lichtquelle und einen Detektor gebracht, wobei die Probe zwischen einem optischen Fenster und einer gegenüberliegenden Fläche eingebracht wird, die entweder ein zweites optisches

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Fenster oder eine Fläche mit einer anderen ausgewählten optischen Eigenschaft ist, beispielsweise mit selektivem Reflexionsvermögen. In beiden Fällen befinden sich die beiden zur Reaktionsstelle hin liegenden Flächen in der Nähe des Mediums, sind jedoch meßbar davon abgesetzt. Der hierdurch entstehende, dazwischenliegende Zwischenraum ist vorzugsweise ausreichend groß, daß ein mechanischer Kontakt zwischen dem Medium und der entsprechenden Oberfläche unter allen normalen Feuchtigkeitsbedingungen verhindert wird. Es wurde festgestellt, daß hierdurch die Reproduzierbarkeit und Gleichmäßigkeit der optischen Verbindung mit dem Medium verbessert wird.

Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die Zeichnung näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1: eine vereinfachte Darstellung eines Teils einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;

Fig. 2: eine Querschnittsansicht der Vorrichtung von Fig. 1;

Fig. 3' ein blattartiges Medium sowie eine entsprechende Dochtscheibe gemäß der Erfindung

sowie

Fig. 4 bis 8: graphische Darstellungen von erfindungsgemäß erhaltenen Ergebnissen von Pluoreszenzmessungen.

In Fig. 1 ist eine optische Vorrichtung 10 zur Durchführung einer chemischen Spot-Test-Analyse sowie zur Erläuterung der erfindungsgemäßen Verbesserungen gegenüber der DE-OS 25 36 886 (US-PS H 059 *105) dargestellt.

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Die Vorrichtung weist ein Unterteil 12 mit einer oberen Platte 12a auf, die ein blattförmiges, faseriges Reaktionsmedium 14 zur Messung eines entsprechenden Reaktionsprodukts an einer Reaktionsstelle l*Ja aufnimmt. Das Paserblatt 14 ist typischerweise ein Streifen mit zahlreichen voneinander getrennten und in einer Reihe vorgesehenen Reaktionsstellen. Der Streifen weist an einer Längskante, in der Fig. 1 an der hinten liegenden Kante, zur Positionierung dienende Aussparungen 16 auf. Bei der dargestellten Anordnung befindet sich jeweils eine derartige Aussparung 16 in Längsrichtung zwischen jeweils zwei aufeinanderfolgenden Reaktionsstellen I¹Ia. Durch ein optisches Fenster 18 in der oberen Platte der Vorrichtung kann mit einer geeigneten optischen Einrichtung in der Vorrichtung elektromagnetische Strahlung auf die Reaktionsstelle l4a gerichtet werden, wobei die resultierende elektromagnetische Strahlung, beispielsweise die bei der gewählten Einstrahlungswellenlänge reflektierte Strahlung oder die Fluoreszenz, mit weiteren optischen Einrichtungen innerhalb der Vorrichtung aufgenommen wird.

Die Vorrichtung 10 weist ferner auf der Platte 12a Justierstifte 20 und 22 für das Faserblatt sowie eine zurückspringende Fläche 2¹J im Gegenkopf 26 der Vorrichtung auf, der oberhalb des optischen Fensters 18 auf dem Faserblatt 1*1 aufsitzt. Die beiden Justierstufte 20, 22 sind auf der Platte 12a des Gehäuses in bezug auf das optische Fenster 18 in bestimmter Weise derart vorgesehen, daß sich eine Reaktionsstelle l4a in optischer Ausrichtung direkt oberhalb des Fensters 18 befindet, wenn die Aussparungen 16 an den beiden Stiften 20 und 22 anliegen. Auf diese Weise wird das Faserblatt längs beiden Seitenachsen mit Hilfe der Justierstifte so festgelegt, daß sich

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die entsprechende Meßstelle in der richtigen Meßposition in bezug auf das Fenster 18 der Vorrichtung befindet.

Wie in der oben genannten DE-OS angegeben, ist die obere Außenfläche des optischen Fensters 18 vertieft vorgesehen, um die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts mit dem Faserblatt l4 zu verringern. Dies kann dadurch erreicht werden, daß das Fenster unter die Oberfläche der oberen Platte 12a gelegt wird oder ein zylindrischer Rand 28, wie in der Zeichnung dargestellt, vorgesehen wird, der über das Fenster 18 hinaus auf der oberen Platte nach oben vorspringt. Der Gegenkopf 26 ist ferner typischerweise klappbar oder schwenkbar^ oder mit einer Gelenkeinrichtung an der Vorrichtung angebracht, damit er von der oberen Platte abgehoben sowie alternativ dazu zur Aufnahme des Paserblatts 14 gegenüber dem Fenster 18 abgesenkt werden kann. Der Gegenkopf weist erfindungsgemäß eine plane Fläche 24 auf, die ausgerichtet oberhalb des Fensters 18 direkt über dem Blatt 14.liegt und diesem gegenüber etwas zurückgehet zt ist.

In der in Fig. 2 dargestellten Betriebsstellung ist die Fläche 24 des Gegenkopfs parallel zum Fenster 18. Ein vorstehender zylindrischer Rand 30 auf dem Gegenkopf 26 steht über die Fläche 24 in Richtung auf die Platte 12a des Gehäuses vor und liegt bei gleichzeitiger Ausrichtung zum Umfang des Fensters 18 am· Faserblatt an; bei der dargestellten Ausführungsform drückt der obere Rand 30 das Blatt an den direkt gegenüberliegenden zylindrischen Rand 28,

Durch die in den Fig. 1 und 2 dargestellte Ausbildung der Vorrichtung 10 läßt sich das Reagensblatt für wiederholte, reproduzierbare und genaue Messungen in geeigneter Weise festlegen. Die Vorrichtung klemmt das Blatt am Umfang

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des vermessenen, fleckartigen Bereichs, der sich im Meßfeld des Geräts befindet, leicht ein. Durch dieses Einklemmen, das bei der erläuterten Vorrichtung durch die einander gegenüberliegenden Ränder 28 und 30 erfolgt, wird ein Verlust von Flüssigkeit beispielsweise durch Verdampfung, Absorption oder andere Stoffübertragungsvorgänge aus dem Meßfeld verringert, wobei das Blatt zugleich in einem festen Abstand relativ zum optischen Fenster 18 sowie zur Fläche 2h des Gegenkopfs sicher festgelegt ist. Durch den Zwischenraum zwischen dem Blatt und dem zurückspringenden Fenster 18 sowie der zurückspringenden Fläche 2H wird ein Kontakt des Blatts mit beiden Flächen vermieden, wodurch die Reproduzierbarkeit des optischen Strahlengangs zwischen der Vorrichtung und dem eingesetzten Faserblatt verbessert wird, wie experimentell festgestellt wurde.

Die Fläche 24 des Gegenkopfs J>6 kann ferner auch die Oberfläche eines optischen Fensters der Vorrichtung 10 sein und allgemein ein ausgewähltes optisches Reflexionsvermögen, ein bestimmtes Absorptionsvermögen oder eine andere geeignete Eigenschaft aufweisen. Das innere optische System der Vorrichtung umfaßt ferner allgemein Elemente, mit denen das Gesichtsfeld bzw. Meßfeld gewählt werden kann, das typischerweise im Bereich von 6 bis 10 mm Durchmesser liegt, wobei ein Durchmesser von 8 mm für das im folgenden beschriebene Beispiel bevorzugt ist.

Alternativ dazu kann ein bestimmtes Meßfeld auch durch Auflegen eines dünnen, opaken Blatts mit einer entsprechenden Öffnung auf dem Fenster 18 vorgegeben werden.

Die dargestellte Vorrichtung 10 weist beispielsweise ein Meßfeld von 8 mm Durchmesser auf und besitzt ein opti-

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sches Fenster von 12,5 min Durchmesser, das um 0,25 mm unterhalb der Ebene liegt, auf der die Unterseite des Blatts festgeklemmt ist, beispielsweise unterhalb der Oberseite des Rands 28; die Vorrichtung weist ferner eine kreisförmige, plane Fläche 24 gleichen Durchmessers auf, die gegenüber der Oberfläche des Rands 30 um den gleichen Abstand zurückliegend vorgesehen ist. Der vorstehende Rand ist typischerweise 1 bis 2 mm breit.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die chemische Spot-Test-Analyse mit einem anfänglich trockenen Medium^ das mit den Reagentien vorbehandelt ist, so daß das Aufbringen, einer verdünnten Probe die analytische Reaktion in Gang setzt. Zur Erleichterung des Aufbringens der Flüssigkeit auf das Medium mit bestimmt gewählter Geschwindigkeit, wie oben erläutert, wird erfindungsgemäß eine kleine Dochtscheibe 32 verwendet, wie aus Fig. 3 hervorgeht. Die Scheibe wird direkt auf das Reaktionsmedium 3** im Zentrum der Reaktionsstelle 3^a aufgelegt, an der die Analyse ausgeführt werden soll. Die zum Ingangsetzen oder zur Durchführung der Analyse an dieser Stelle zuzuführende Flüssigkeit wird eher auf die Scheibe als auf das Medium aufgebracht, wobei die Scheibe die Flüssigkeit mxfc der erwünschten, ausgewählten Geschwindigkeit auf die Reaktionsstelle überträgt.

Fig. 3 zeigt die Zufuhr der Flüssigkeit mit einer Pipette, von der lediglich die Spitze 36 dargestellt ist, auf die Oberseite einer zylindrischen Scheibe 32. Die Scheibe 32 kontrolliert, wie oben erläutert, die Übertragung der Flüssigkeit, wodurch die erwünschte Zuführungsrate der Flüssigkeit auch durch relativ unerfahrenes Personal sowie ohne spezielle Pipettenausrüstung erheblich erleichtert wird.

Beispiel I

Glucose-Endpunktbestimmung

In diesem Beispiel wird ein erfindungsgemäßes Glucose-Reagenssystem eingesetzt, aus dem einige erfindungsgemäß wichtige Charakteristika hervorgehen. Ein wesentliches Merkmal besteht darin, daß das System für eine Endpunktbestimmung herangezogen wird, wobei der Test im einzelnen mit mindestens zwei Messungen an einer einzigen Reaktionsstelle durchgeführt wird, von denen die erste vor der Erzeugung des Reaktionsprodukts und die andere Messung nach vollständigem Ablauf der produkterzeugenden Reaktion, dh am Endpunkt, durchgeführt werden. Das Reagenssystem wird als Gemisch folgender Bestandteile hergestellt:

	Tabelle I	Sigma	Nr.	T-3253
	Glucose-Reagens	Sigma	Nr.	T-1503
Pestandteil		Sigma	Nr.	.S-75OI
Tris-HCl		Baker	Nr.	3506
Tris-Base		Sigma	Nr.	M-0250
Bernsteinsäure		Sigma	Nr.	A-3127
NaHCO3		Sigma	Nr.	N-0505
MgCl2		Sigma	Nr.	A-4378
Adenosin- triphosphat (ATP)	Konzentration Handelsbezeichnung	Sigma	Nr.	G-6378
Nicotinamid- adenin- dinucleotid- phosphat. (NADP)	0,563 mmol/ml	Sirana	Nr.	H-4502
Rinder-Serum albumin	0,437 mmol/ml
Glucose-6- phosphat- dehydrogenase (G-6-PDH)	0,017 mmol/ml
Hexokinase	0,024 mmol/ml
O9039 mmol/ml
' 0s033 mmol/ml
0,034 mmol/ml
0,513 g % (G/V)
20,5 IU (Internationale Einheiten)
25,6 IU (Internationale

Brij-35

Einheiten) 0,03 % (G/V) Sigma Nr. 430 AG6

Das obige Reakgenssystem enthält relativ hohe Konzentrationen an ATP und NADP sowie Albumin in Form von Rinder-Serumalbumin, zusammen mit einer Spur eines grenzflächenaktiven Mittels (Brij-35).

Dieses Reagenssystem enthält entsprechend sowohl die Reagenzien zur Durchführung des Tests als auch Konditionierungsmittel zur Behandlung des Mediums und umfaßt Verdickungsmittel und grenzflächenaktives Mittel. Das grenz-

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flächenaktive Mittel des Konditionierungsmittels dient dabei zur Förderung der Absorption der verdünnten Probe an der Reaktionsstelle. Ohne das grenzflächenaktive Mittel dauert das Eindringen der Lösung in das Medium langer, wobei zugleich die Tendenz zur-Ausbildung ungleichmäßiger Flecken besteht. Die Reaktionsstellen werden unter Verwendung dieses Reagenssystems so hergestellt, daß 25 ,ul der flüssigen Zusammensetzung auf trockenes, ungeleimtes Papier (Typ 903-C) aufgebracht werden. Das behandelte Papier wird danach in einem Exsdkkatöi·. im Vakuum b~is zur Gewichtskonstanz getrocknet und in Folienpackungen eingeschweißt. Die resultierenden Reagentien sind bei Lagerung in gefrorenem Zustand mindestens 6 Monate stabil, bei Lagerung bei Raumtemperatur mindestens 3 Monate.

Zur Durchführung einer Glucose-Bestimmung wird eine frische Reaktionsstelle über das Fenster eines Fluorometers der oben angegebenen DE-OS 25 36 886 gelegt, das die in den Fig. 1 und 2 erläuterten Verbesserungen aufweist. Im Fluorometer wird die Reaktionsstelle mit Licht einer Wellenlänge von 3^0 nm beleuchtet, wobei die Fluoreszenz bei 460 nm gemessen wird.

Eine Blutserumprobe wird 1 : 25 in Wasser verdünnt, das 1 VoIrJ? Brij-35 (3O$5ige Lösung) enthält. 12 _/ul der verdünnten Lösung werden auf diese Reaktionsstelle aus.den oben angegebenen Gründen und in der oben genannten Weise mit kontrollierter Zufuhrgeschwindigkeit aufgebracht. Die verdünnte Probe wird demgemäß mit einer Pipette mit kontrollierter Rate aufgebracht, bei der im Zentrum der Reaktionsstelle ein sichtbarer Flüssigkeitsvorrat von 1 bis 2 mm Durchmesser bestehen bleibt. Plierzu werden die 12 ,ul typischerweise in 0,5 bis 1 s aufgebracht.

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Alternativ dazu kann das Reagenesystem auch unter Verwendung einer Dochtscheibe zugeführt werden, wie sie oben unter Bezug auf Pig. 3 erläutert ist.

Die Reaktion beginnt im wesentlichen nach dem Aufbringen des verdünnten Serums und ist nach etwa 2 min vollständig, was signifikant schneller ist als die in der DE-OS 25 36 886 (US-PS 4 059 *»05) beschriebene Glucose-Bestimmungsreaktion. Die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit beruht darauf, daß die Reaktionsstelle durch das Aufbringen des Konditionierungsmittels an jeder Stelle eine höhere Plüssigkeitskonzentration aufweist, also feuchter ist.

Meßergebnisse zur mit diesem erfindungsgemäßen Reaktionssystem und der entsprechenden Verfahrensweise erzielbaren Genauigkeit sind in der Tabelle II angegeben, in der die Ergebnisse von sechs reproduzierten Proben aus einem Mittelbereichs-Blutplasmapool mit einer Glucosekonzentration von 110 mg/dl angeführt sind. Die an jedem Fleck, dh für jede Probe, gemessene Fluoreszenz fällt am Anfang vom relativ hohen Untergrundwert des trockenen Mediums bei Zugabe der Probe ab und erreicht etwa 6 s nach Reaktionsbeginn einen Minimalwert. Der Maximalwert, der der vollständigen Umsetzung entspricht, wird innerhalb von 2 min erreicht.

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Tabelle II Fleck Nr. gemessenes Minimum gemessenes Maximum Differenz

1 1,05

2 1,12

3 1,11

4 1,37 -

5 1,22

6 1,16

Mittelwert

Standardabweichung

Standardabweichung
(mg/dl)

Mittelwert
(mg/dl)

1,17 0,112

7,5

2,77	1,72
2,87	1,75
2,86	1,75
3,16	1,79
3,01	1,77
2,93	1,76
2,93	1,76
0,137	0,027
9,1	1,8
	110

⁺Meßwerte ausgedrückt als Relativwerte des Fluoreszenzsignals.

Aus Tabelle II geht hervor, daß die Standardabweichung für die sechs reproduzierten Proben 1,8 mg/dl beträgt, wenn die Differenz zwischen dem gemessenen Minimum und dem gemessenen Maximum des Fluoreszenzsignals als Meßgröße herangezogen wird. Im Gegensatz dazu betragen die Standardabweichungen der gemessenen Maxima und der gemessenen Minima 7,5 bzw. 9,1 mg/dl, was signifikant höher ist. Standardkurven, die durch Auftragen der gemessenen Differenzen in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration erhalten sind, sind von 0 bis 300 mg/dl linear, wobei Korrelationskoeffizienten von typischerweise 0,98 oder darüber vorliegen.

Korrelationsuntersuchungen unter Anwendung von üblichen Routineverfahren bei 95 Proben im Bereich von 50 bis

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400 mg/dl Glucose zeigten ausgezeichnete Übereinstimmung mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,989· Proben mit einer Konzentration von über 300 mg/dl werden mit höherer Verdünnung nochmals vermessen, wodurch ebenfalls Linearität erzielt wird.

Das erfindungsgemäße System liefert vergleichbar gute Ergebnisse bei höherer Verdünnung (beispielsweise 1 : 50), wenn ein anderes Medium wie beispielsweise Whatman-Papier Nr. 3 verwendet wird, das eine vergleichbare effektive Schichtlänge wie 903-C-Papier, jedoch nur etwa den halben Fluoreszenzuntergrund aufweist. Unter solchen verbesserten Bedingungen läßt sich der lineare Bereich auf bis zu 600 mg/dl ausdehnen.

Das Einbringen des Konditionierungsmittels mit Albumin oder einem anderen Verdickungsmittel in das Glucose-Reagenssystem von Tabelle I sowie in zahlreiche andere Reagenssysteme zur Spot-Test-Änalyse erwies sich aufgrund der Stabilisierung des Reagens über längere Lagerzeit sowie der Verringerung der kapillaren Ausbreitung der Reagensflüssigkeit auf dem Reaktionsmedium als sehr vorteilhaft.

Es wird davon ausgegangen, daß Polyäthylenoxide (Polyox), Albumin und andere Verdickungsmittel austauschbar eingesetzt und je nach Belieben entweder im Reagenssystem selbst oder durch separate Vorreagensbehandlung des Reaktionsmediums vorgesehen werden können. Hierbei erscheint von Bedeutung, daß das Reaktionsgemisch im Gegensatz zu Fällen ohne Verwendung von Konditionierungsmittelri innerhalb eines kleineren Durchmessers auf dem Medium verbleibt, wobei zugleich die örtliche Flüssigkeitskonzentration erhöht ist. Hierauf beruht wiederum die höhere Stabi-

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lität in der effektiven optischen Schichtlänge, wodurch wiederum eine erhöhte Heßgenauigkeit erzielt wird.

Es wurde allerdings festgestellt, daß die mit dem oben genannten Glucose-System gemessene Fluoreszenz einen leichten zeitlichen Anstieg zeigt, wobei die finderungsgeschwindigkeit mit und ohne Glucose im Reaktionsmedium etwa gleich ist. Dieser Anstieg scheint von einem allmählichen Flüssigkeitsverlust aus dem vermessenen, 8 mm Durchmesser aufweisenden Meßfeld durch Ausbreitung der Flüssigkeit auf etwa 10 bis 12 mm Durchmesser sowie anderen Vorgängen wie beispielsweise Verdampfung. zu beruhen, die zu Flüssigkeitsverlusten führen. Hierdurch wird die Feuchtigkeit des Papiers verringert, da das Papier allmählich trocken wird. Die übertragung von Flüssigkeit aus dem 8 mm Durchmesser aufweisenden Meßfeld in die angrenzende ringförmige Zone des Mediums ist vorteilhaft, da hierdurch die Reaktionsstelle gewissermaßen zur Auswahl des Flüssigkeitsvolumens in der Lage ist, wodurch entsprechend eine verminderte Abhängigkeit vom jeweils aufgebrachten Volumen erzielt wird. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die meisten ungleichmäßigen Ringbildungen außerhalb des Meßfelds liegen können.

Beispiel II Glucose-Einzelpunkttest

Die Reproduzierbarkeit der Maximalmessungen von Beispiel I ist durch Unterschiede der Untergrundfluoreszenz des als Reaktionsmedium verwendeten Papiers (903-C) von Fleck zu Fleck begrenzt, jedoch wurden auch andere geeignete Reaktionsmedien wie beispielsweise Whatman-Papier Nr. 3

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und Schleicher & Schüll-Papier Nr. 2316 und 2O4OB als geeignet gefunden, die nur etwa die halbe Untergrundfluoreszenz von 903-C-Papier aufweisen. Die letztgenannten Pasermedien weisen aufgrund der Wechselwirkung mit den Pasern durch optische Mehrfachstreuung effektive optische Schichtlängen auf, die etwa gleich sind wie bei 903-C-Papier. Durch Verwendung derartiger alternativer Papiere zur Durchführung des Glucosetests von Beispiel I können entsprechend die Abweichungen von B'leck zu Fleck auf unter 5 % der reaktionsbedingten Änderung verringert werden, so daß die gemessenen Maximalwerte allein verwendet werden können.

Diese Verfahrensweise erlaubt Ein-Punkt-Bestimmungen nach Vervollständigung der Reaktion, die das zu vermessende Reaktionsprodukt liefert. Messungen an verschiedenen Proben werden selbstverständlich unter denselben Bedingungen durchgeführt, unter denen der Test geeicht wurde, beispielsweise bei festgelegter Zeit nach Reaktionsbeginn. Da diese Meßbedingung nach dem Beginn der Reaktion zunehmend verzögert wird, so daß die optische Weglänge an der Meßstelle erhöht wird, wird die Reaktion mit einer zunehmend verdünnten Probe durchgeführt, um optisch dünne Verhältnisse im Meßfeld aufrechtzuerhalten.

Zur Erläuterung dieser Verfahrensweise wurde eine Glucosetablette (Eskalab Glucose tablet, Vertrieb durch Smith, Kline and French) in lediglich einem Fünftel des üblichen Flüssigkeitsvolumens gelöst, wobei eine Tablette in 0,6 ,ul entionisiertem Wasser gelöst wurde. 15 /Ul dieser so hergestellten Reagenslösung wurden auf die betreffenden Meßstellen auf Schleicher & Schüll-Filterpapier No. 2316 aufgebracht und eintrocknen gelassen. Es wird ange-

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nommen, daß das inerte Bindemittel der Tablette bei diesem Papiermedium eine tihnliche Rolle wie das Verdickungsmittel bzw. der verdickende Bestandteil eines Konditionierungsmittels spielt. Die Probe sowie die Standards wurden 1 : 50 in entionisiertem Wasser verdünnt und hintereinander auf die Teststellen aufgebracht. Die Teststellen wurden anschließend während des Ablaufs der Reaktion 15 min abgedeckt, um die Verdampfung zu begrenzen, und danach an offener Luft getrocknet; durch diese Verfahrensweise wird gewährleistet, daß die verschiedenen Teststellen in gleicher Weise trocknen.

Die absoluten Fluoreszenz-Meßwerte der vermessenen 8-nm-Bereiche der Testflecken wurden mit entsprechenden Meßwerten verglichen, die an anderen Teststellen unter Verwendung von Standard-Analysenlösungen erhalten worden waren.

Das Meßgerät wurde wie in Beispiel I bei Wellenlängen von 3¹JO bzw. 460 nm betrieben, wobei jedoch die Pluoreszenzemission nach Durchgang durch das Filterpapier in der zu Fig. 7 der DE-OS 25 36 886 (US-PS H 059 405) beschriebenen Weise gemessen wurde.

Die Ergebnisse zeigten eine Standardkurve, die bis zu einer Glucosekonzentration von 200 mg/dl linear ist. Acht Wiederholungen eines Standards mit 100 mg/dl ergaben eine Standardabweichung von 3 ^ mg/dl.

Gleichzeitig ergaben Messungen der Trockenfluoreszenz von 36 reagenshaltigen Flecken eine Standardabweichung von 1 mg/dl (ausgedrückt in klinischen Einheiten), was etwa einem Drittel der Gesamtmenge entspricht. Diese letztgenannte Genauigkeit entspricht einem vom Glucosegehalt unabhängigen festen Fehler. Pie Standardabweichung von 3_S4 mg/dl setzt sich aus diesem festen Fehler sowie einem Proportional-

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fehler zusammen, der sich als Quadratwurzel der Summe der "Fehlerquadrate hinzuaddiert. Demgemäß beträgt der anzunehmende Proportionalfehler (3*¹* - 1^)^χ/ = 3,25 mg/dl bzw. 3j25 % der Glucosekonzentration.

Wenn die Verdünnung auf 1 : 100 erhöht wird, steigt der feste Fehler auf 2 % an; -in Kombination mit dem Proportionalfehler von 3j 25 % resultiert dann eine Gesamtgenauigkeit von etwa 4 % bei 100 mg/dl. Der Linearbereich des Tests erstreckt sich dann bis zu 400 mg/dl.

Durch die Pufferzone des Reaktionsmediums außerhalb der Meßfelder wird wie in Beispiel I erreicht, daß die erhaltenen Ergebnisse in geringerem Maße von Unterschieden im Volumen der an den betreffenden Stellen aufgebrachten verdünnten Probe abhängig sind.

Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß quantitative Messungen mit einem Reagenssystem erhältlich sind, das optisch dünn ist, wodurch der Einfluß von Ringbildungen auf ein Minimum zurückgedrängt werden kann und zugleich eine ausreichend hohe Konzentration vorliegt, um im Vergleich zur Änderung des jeweils gewählten Untergrunds von Fleck zu Fleck große Änderungen hervorzurufen.

Es wir de ferner festgestellt, daß die gleichen trockenen Flecken auch mit Geräten vermessen werden können, die auf die reflektierte Strahlung bei 3^0 nm ansprechen. Wie bei optisch dünnen Konzentrationen zu erwarten ist, zeigt das reflektierte Signal bei 340 nm mit steigendem Glucosegehalt einen linearen Abfall, was gut mit dem linearen Anstieg der gemessenen Fluoreszenz übereinstimmt. Unter Bezug auf eine Konzentration von 100 mg/dl ergibt sich hierbei eine etwa

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doppelt so hohe Genauigkeit wie bei entsprechenden Fluoreszenzmessungen .

Beispiel III

Das vorgenannte Glucosesystem stellte ein Beispiel eines Reagenzsystems dar, bei dem eine relativ hohe, jedoch noch im wesentlichen optisch dünne Konzentration an NADH entsteht. Beispiel III erläutert demgegenüber die Analyse von Blutserum auf Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), bei der die relativen Änderungen der NADH-Konzentration während der Reaktion erheblich kleiner sind und bei der durch die Reaktion das fluoreszierende NADH nach folgender schematischer Reaktionsgleichung in das nichtfluoreszierende NAD umgewandelt wird:

POT

ot -Ketoglutarat + L-Aspartat ——* L-Glutamat + Oxalacetat Oxalacetat + NADH Malatdehydrogenase_> NAD + L-Malat

Ein erfindungsgemäßes Reagenzsystem zur GOT-Analyse, das sich zum Auftrag auf entsprechende Reaktionsstellen

auf Reaktionsmedien eignet, weist folgende Zusammensetzung auf:

Tabelle III Bestandteil Konzentration

Phosphatpuffer pH 7,¹I 0,2 mol/1

L-Aspartat 0,144 mol/1

«HKetoglutarat 0,026 mol/1

Malatdehydrogenase 1332 IU/1

Lactatdehydrogenase 1332 IU/1

Polyäthylenoxidharz (Polyox) 10 mg/ml

Brij-35 0,03 % (G/V)

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Das Reagenzsystem kann unter Verwendung eines im Handel erhältlichen SGOT-Testsets (SGOT kit, stat-Pack, Hersteller Calbiochem, 10933 N. Torrey Pines Road, LaJolla, California 92037) hergestellt werden.

Flasche A dieses Test sets wird mit 3,9 ml der Polyoxlösung, die 0,1 Vol.-Si der Brij-35 Lösung enthält, aufgefüllt. Das resultierende Reagens ist vierfach konzentrierter als für die nach den Richtlinien des Herstellers angegebene standardisierte Verwendung.

Die Reaktionsstellen werden durch Aufbringen von 20 ,ul dieses Reagens systems auf Whatman-Papier Nr. 3 sowie anschließendes Trocknen bis zur Gewichtskonstanz im Vakuum hergestellt. Das Gemisch enthält alle erforderlichen Bestandteile außer NADH, das wie unten erläutert separat zugegeben wird.

Beispiel IIIA

Der Test wird durch 1 : 10-Verdünnung der Blutserumprobe in gepuffertem Verdünnungsmittel, dae das fehlende NADH enthält, und Aufbringen von 17 /Ul der verdünnten Lösung auf die zuvor hergestellte Reaktionsstelle durchgeführt. Die Abnahme der Fluoreszenz wird gemessen.

Das Verdünnungsmittel weist folgende Zusammensetzung auf:

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Tabelle IV

Bestandteil

Konzentration

Bezugsquelle bzw. Handelsbezeichnung

Ultra-Tris-Puffer 0,05 mol/1 pH 7,8

NADH

Glycerin

0,08 mmol/1

1 %

Lactatdehydrogenase 600 IU/1 Brij-35 0,02 % (G/V)

Leon Labs, Charge

Nr. 611015

Calbiochem Stat-Pak, Flasche B

Mallinckrodt Nr. 5091 Sigma 1,-1254
Sigma Nr. 430 AG6

In diesem Test wird LDH zur möglichst weitgehenden Ausschaltung von Störungen verwendet, die durch von Probe zu Probe variierende endogene Serumbestandteile hervorgerufen werden. LDH im Verdünnungsmittel wird durch Zusatz von 2,9 ml 50£igem Glycerin zur Sigma-Plasche (die LDH in 5035 Glycerin enthält), 1 : 1000-Verdünnung der resultierenden Lösung mit 40 % Glycerin und Zusatz von 0,1 bis 4,9 ml der NADH-Lösung hergestellt.

Zur Stabilisierung der Pluoreszenzdrift der gemessenen Reaktion ist es günstig, eine teilweise reflektierende Rückfläche aus poliertem rostfreiem Stahl zu verwenden. Bei der in den Fig. 1 und 2 dargestellten Vorrichtung ist diese Rückfläche die zurückspringende Fläche 24. Ihr Reflexionsvermögen relativ zu einer hochpolierten Aluminiumoberfläche wurde durch Vergleich der jeweiligen Zunahme der Untergrundfluoreszenz gegenüber einer schwarzen Rückfläche auf etwa 40 % geschätzt.

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Aus den Pig. 4a und 4b ist der Einfluß der drei Rückflächen auf die Empfindlichkeit der Fluoreszenz gegenüber Feuchtigkeit ersichtlich. Die Meßwerte beider Figuren wurden unter Verwendung von Whatman-Papier Nr. 3 erhalten; bei Fig. 4a wurde ein unbehandeltes Papier verwendet, während sich die Ergebnisse von Fig. 4b auf ein Papier beziehen, das mit einem Konditionierungsmittel aus Polyäthylenoxid (Polyox) behandelt war. Aus den mit Polyäthylenoxid behandeltem Papier erhaltenen Ergebnissen geht die höhere Empfindlichkeit gegenüber NADH, insbesondere bei niedrigerem Feuchtigkeitsgehalt, klar hervor.

Die eingezeichneten Punkte sind auf die relative Fluoreszenz i der Untergrundfluoreszenz des eingesetzten trockenen Mediums bezogen. Die Untergrundfluoreszenz des Whatman-Papier Nr. 3 ist mit und ohne den Polyäthylenoxidzusatz gleich und beträgt die Hälfte der Untergrundfluoreszenz von 9O3~C-Papier.

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die Rückfläche mit intermediärer / · einen weiten Bereich für einen stabilen Betrieb ergibt. Die blanke Aluminiumrückfläche liefert einen apparenten Signalabfall, wenn die Scheiben zu trocknen beginnen, da dann das Medium weniger transparent wird, wobei weniger Licht austritt, das von der Rückfläche reflektiert werden kann. Bei dünneren Medien ist zur Erzielung der gewünschten Stabilität ein kleineres Reflexionsvermögen erforderlich.

In diesem Zusammenhang dient das Polyäthylenoxid (Polyox), Albumin oder ein anderer Verdickungsbestandteil im Konditionierungsmittel dazu, eine gewünschte, ausgewählte Feuchtigkeit der Reaktionsstelle während der Me£dauer leichter zu erzielen. Der für die Messungen gewählte Feuchtigkeitsbereich ergibt eine maximale Stabilität der effektiven optischen Weglänge sowie des Untergrund-Fluores-

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zenzsignals für den Test. Diese Rolle des Verdickungsbestandteils geht aus Messungen hervor, die zeigen, daß bei weniger feuchtigkeitsabhängigen Ergebnissen die besten Analysenresultate erzielt werden.

Die erwünschte Wirkung wird bei anderen Testsystemen auch durch Einstellung des Gesamtgehalts des auf den Reaktionsstellen angebrachten Reagens an Peststoffen erzielt, so daß der Durchmesser des durchscheinenden Bereichs nach Aufbringen der Flüssigkeit etwa 10 bis 20 % und typischerweise etwa 15 % kleiner ist als beim unbehandelten Papier. Eine ähnliche Abnahme der Fleckgröße und/oder eine ähnliche Steigerung der örtlichen Dichte an Flüssigkeit werden auch bei anderen Medien festgestellt, beispielsweise an Glasfaserpapieren (Whatman GEA und GFC), dünnschichtchromatographischen Platten aus mikrokristalliner Cellulose (TLC-Platten Avicel üniplate brand der Firma Analtech, Inc.), Schichten aus Diatomeenerde (Voradsorptionsschicht auf LQ TLC-Platten von Quantum Industries) und Elektrophoresemembranen aus Celluloseacetat (Instrumentation Laboratories). Im Gegensatz dazu tritt bei TLC-Medien aus Silicagel oder Instant-TLC-Medien (ITLC SA der Gelman Instrument Co.) lediglich eine kleine Verringerung der Fleckgröße auf.

In Fig. 5 ist das Fluoreszenzverhalten beim Ablauf der SGOT-Reaktionen schematisch dargestellt. Die von der Reaktion herrührenden Änderungen sind, wie aus der Figur hervorgeht, erheblich kleiner als beim Glucosesystem von Beispiel Ferner ist festzustellen, daß die Fluoreszenz bei der Ausbreitung des NADH in der verdünnten Probe außerhalb des Meßfelds zunächst rasch abfällt.

Das für diese Messungen verwendete Fluorometer weist eine Einrichtung zur Temperaturkontrolle bzw. Thermostati-

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sierung auf 30 ⁰C auf, wie dies unter Bezug auf die Fig. 6 und 7 der DE-OS 25 36 886 (US-PS 4 059 405) beschrieben ist. Die Fluoreszenz nimmt demgemäß auch ab, wenn das Reaktionsgemisch mit der Temperatur von 30 ⁰C des Fensters und der Rückplatte ins Gleichgewicht kommt. Die Temperaturänderung von Raumtemperaturniveau von etwa 25 ⁰C auf 30 ⁰C führt zu einer meßbaren Abnahme des Meßsignals sowohl für den Untergrund als auch für NADH. Durch die Thermostatisiereinrichtung wird die Temperatur von 30 ⁰C mit einer Genauigkeit von besser als _+ 0,1 ⁰C konstantgehalten. Die oben genannte Temperaturabhängigkeit ist hinsichtlich ihrer Größe mit der bekannten Erhöhung der Reaktonsgeschwindigkeit enzymatischer Reaktionssysteme zu vergleichen, wobei jedoch umgekehrte Richtung vorliegt, so daß sich beide Effekte teilweise kompensieren. Eine genaue Fehlerbetrachtung erweist jedoch, daß die NADH-Konzentration (zB"die Gesamtfluoreszenz) minimal gehalten werden kann, so daß deren Änderungen mit der Temperatur nur einen kleinen Teil der reaktionsbedingten Änderungen ausmachen.

In Fig. 6 ist die Abhängigkeit des Fluoreszenzsignals von verschiedenen GOT-Mengen sowie für verschiedene reproduzierte Proben in einem mittleren Bereich in überhöhter Darstellung angegeben. Unter Verwendung von reinem GOT als Bezug wurde ein Variationskoeffizient von 5 % bei sieben Wiederholungen festgestellt.

In Fig. 7 sind die Ergebnisse von Vergleichsversuchen angegeben, bei denen ein eingeführtes Routineverfahren bei zwölf Patienproben herangezogen wurde. Der Korrelationskoeffizient der gezeichneten Ergebnisse beträgt 0,988 %.

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Beispiel IIIB

In Pig. 5 ist eine relativ große anfängliche Abnahme des Fluoreszenzsignals mit der Ausbreitung des NADH enthaltenden Verdünnungsmittels über die Reaktionsstelle dargestellt. Es wurde festgestellt, daß die Ergebnisse jedes Tests, wobei Glucose und GOT typisch sind, durch die Auftraggeschwindigkeit der verdünnten Probe beeinflußt werden. Wenn die verdünnte Lösung zu rasch zugesetzt wird, erreicht der Mittelbereich einen relativ höheren Feuchtigkeitsgrad, der sich allmählich über den Fleck hin ausgleicht. Bei zu langsamer Zugabe dringt die Lösung über einen kleinen Mittelbereich in das Medium ein, wobei die chromatographische Ringbildung erhöht wird.

Die Erfahrung zeigt, daß besser reproduzierbare Ergebnisse erhältlich sind, wenn die verdünnte Lösung mit einer Geschwindigkeit zugegeben wird, bei der ein kleiner, sichtbarer Flüssigkeitspool auf dem Fleck in der Nähe der Pipettenspitze bestehen bleibt. Dieser Flüssigkeitsvorrat hat typischerweise einen Durchmesser von 2 bis 3 nun. In der Praxis entspricht dies einer Aufgabemenge von 10 bis 20 yul Lösung in Zeiten von größenordnungsmäßig etwa 1 s.

Wie bereits angegeben, wurde ferner festgestellt, daß die Empfindlichkeit gegenüber der Zufuhrgeschwindigkeit in günstiger Weise durch Verwendung eines aus einem dünnen Blatt aus hydrophilem, porösem Polyäthylen oder 903-C- oder Whatman-Papier Nr. 3 ausgestanzten, dazwischengeschalteten Kissens oder einer entsprechenden Scheibe auf ein Minimum reduziert werden kann. Der Scheibendurchmesser entspricht etwa dem des oben erwähnten sichtbaren Flüssigkeitsvorratsj ein Scheibendurchmesser von 1,5 bis mindestens 3 mm erwie* sich als vorteilhaft. Die Scheibe dient dabei als Mittelpunkt

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-■41 - .

für die Ppolbildung sowie als Reservoir zur Aufnahme überschüssiger Flüssigkeit, bis die reagensbeladene Stelle die Flüssigkeit abzieht»

Bei der praktischen Durchführung wurden solche Dochtscheiben auf die Mitte der Teststelle aufgelegt, worauf die Lösung auf die Scheiben pipettiert wurde, wie in Fig. 3 dargestellt ist. Nach Zugabe der Lösung wurde die Scheibe entfernt und die Reaktionsstelle mit dem Fluorometer vermessen. Die erhaltenen Ergebnisse entsprachen denen von Fig. 5 und 6. Die Dochtscheiben lassen sich auch bei anderen Tests vorteilhaft einsetzen.

Die Verwendung von NADH als Bestandteil des Verdünnungsmittels kann nachteilig sein. Bei einer alternativen Durchführungsweise wurden die Dochtscheiben in das NADH enthaltende Verdünnungsmittel von Tabelle IV eingetaucht und im Vakuum zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die Probe wurde anschließend allein mit Puffer verdünnt und durch diese NADH enthaltenden Scheiben hindurch auf die Reaktionsstellen aufgebracht. Die Konzentration des NADH im Verdünnungsmittel wurde für jede Scheibenart so eingestellt, daß sie das gleiche Fluoreszenzinkrement sowie die gleiche Flachheit der Kurve der Blindprobe wie in den Fig. 5 und 6 ergaben. Die bevorzugten Scheiben wurden aus einem kontinuierlichen Flachmaterial aus porösem Polyäthylen (hydrophiles Polyäthylen HDPE der Bolab Corp., Porengröße 35 ,um, Dicke 1,6 mm (1/16 Inch), Durchmesser 3,2 mm (1/8 Inch)) ausge·* stanzt und ergaben nach dem Eintauchen in das Verdünnungsmittel von Beispiel IIIA äquivalente Ergebnisse. Das gleiche Volumen an verdünnter Probe wurde in Beispiel IIIA verwendet.

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Vergleichbar gute Resultate wurden für das Glucosesystem durch Zerreiben einer Glucosetablette (Eskalab tablet) und Verpressen einer kleinen Menge des resultierenden Pulvers zu einer kleinen Tablette im Zentrum einer Reaktionsstelle erzielt. Die verdünnte Probe wurde anschließend zu dieser Stelle hinzugegeben, wobei das Reagens durch das in die Reaktionsstelle eindringende Verdünnungsmittel aus dem verpreßten Pulver eluiert wurde.

Beispiel IHC

Als weitere Alternative zur Verwendung von NADH im Verdünnungsmittel wurde eine in Zonen aufgeteilte Reagensstelle durch Zusatz des NADH zu den zuvor wie in Beispiel IHA hergestellten Reaktionsstellen erzeugt. Das NADH befand sich im Verdünnungsmittel der Tabelle IV, das jedoch gegenüber Beispiel IHA eine zehnfach höhere NADH-Konzentration aufwies; ein kleines Volumen, beispielsweise 3 /Ul, wurde in der Mitte der zuvor hergestellten Reaktionsstelle als Zweitfleck darüber aufgebracht. Die Stellen wurden anschließend 1 s im Vakuum getrocknet. Das Volumen von 3 /Ul wurde danach ausgewählt, daß es etwa dem Durchmesser des bevorzugten Plüssigkextsvorrats entsprach, der sich bei Zugabe der verdünnten Probe bildet.

Der Test wurde durch Aufbringen von 17 /Ul einer Serumprobe in der Mitte der in Zonen aufgeteilten Stelle durchgeführt, wobei die Serumprobe 1 : 10 im Verdünnungsmittel von »Beispiel IHA, das jedoch demgegenüber kein NADH enthielt, verdünnt war.

Fig. 8 zeigt bei gleicher Skalierung wie Fig. 6 das beim Zusatz von Proben verschiedener Konzentration resultie-

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rende Fluoreszenzsignal. Die Empfindlichkeit ist mit der von Beispiel IIIA vergleichbar, jedoch sind die Ergebnisse unterschiedlicher und zeigen bei frühen Reaktionszeiten steilere Steigung.

Wenn für den NADH-Zweitfleck größere Volumina eingesetzt werden oder das vollständige, NADH enthaltende Reagens zur anfänglichen Herstellung der Reaktionsstellen verwendet wird, ist die anfängliche Steigung noch größer und bleibt länger, so daß ein für Messungen geeigneter linearer Bereich nur schwierig zu erzielen ist, was darauf beruht, daß NADH unter diesen Bedingungen einen extrem ringartigen Fleck innerhalb des Meßfelds des Geräts bildet.

Die oben sowie in der DE-OS 25 36 886 beschriebenen Reagenssysteme weisen relative Komponentenkonzentrationen auf, die sich beträchtlich von den üblichen Mengenverhältnissen unterscheiden, wie sie zur herkömmlichen Anwendung in flüssiger Lösung optimiert worden sind. Allgemein liegen die Reagentien mit hohem Molekulargewicht, beispielsweise Enzyme, in höheren Konzentrationen vor als zur herkömmlichen in-vitro-Verwendung. Die niedermolekularen, leichter diffundierenden Bestandteile liegen in noch höherer Konzentration vor. Typischerweise ist das Anreicherungsverhältnis für niedermolekulare Substanzen 2-bis 4mal höher als für die Bestandteile mit hohem Molekulargewicht, die ihrerseits typischerweise 3- bis 5mal konzentrierter vorliegen, in extremen Fällen bis zu 2Ofach konzentrierter.

Es wird angenommen, daß die aktiven Enzymreagentien sowie andere hochmolekulare Bestandteile mehr als zur Üb-

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lichen Anwendung konzentriert werden müssen, um die effektive Diffusionsbarriere zu überwinden, die in einem porösen Medium aus der Ungesättigtheit der Reaktionsstelle und/oder der gegenüber den Verhältnissen in vitro relativ höheren Oberfläche der Grenzfläche zwischen Flüssigkeit und den die Flüssigkeit aufnehmenden Flächen resultiert. Gleichzeitig sind die diffundierbaren niedermolekularen Bestandteile relativ höher konzentriert, damit sie nach der differentialchromatographischen Trennung, die durch den Zusatz der verdünnten Probe hervorgerufen wird, bei dann optimalen Werten ins Gleichgewicht kommen.

Die oben bezüglich des SGOT-Tests angegebene NADH-Konzentration stellt insofern eine bemerkenswerte Ausnahme dar, als sie zur möglichst weitgehenden Ausschaltung des Beitrags der Temperatur- und Feuchtigkeitsdrift zum gesamten Testfehler niedrig gehalten wurde. In diesem Fall sind die reaktionskinetischen Verhältnisse so, daß die Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber der genauen NADH-Konzentration nicht empfindlich ist und lediglich die Obergrenze der Linearität hierdurch beeinflußt wird; so zeigt das System beispielsweise Linearität, bis das NADH im Reaktionsgemisch verbraucht ist.

In einem weiteren Beispiel läuft die Reaktion des oben erwähnten Glucose-Reagenssystems extrem rasch vollständig ab, wenn es in einer herkömmlichen flüssigen Lösung verwendet wird, da hohe Enzymkonzentrationen vorliegen. Es wurde festgestellt, daß die maximalen Änderungsgeschwindigkeiten, die in optimierten Enzymtests auf porösen Medien gemäß der Erfindung erzielt wurden, die entsprechenden Maximalgeschwindigkeiten für dieselben, für in-vitro-Verwendung optimierten Reagentien erzielt werden, wenn die Geschwindigkeit in Mol umgesetztes Substrat pro Zeit- und Volumeneinheit ausgedrückt wird; dies ist jedoch

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lediglich bei den beschriebenen höheren Konzentrationen der Fall.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäß eingesetzten Konditionierungsmittels besteht darin, daß hierdurch eine bessere Trennung der Enzyme von der Struktur des Mediums erzielt und entsprechend durch die Nachbarschaft großer Oberflächen im Medium induzierte Konfigurationsänderungen der Enzymmoleküle unterdrückt werden. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, daß die optimierte Maximalgeschwindigkeit für enzymatische Reaktionen mit steigender Konzentration des Konditionierungsmittels sowie der Feuchtigkeit ansteigt.

Die Vorteile der erfindungsgemäßen Verfahrensweise zur chemischen Spot-Test-Analyse können auch bei Verwendung anderer poröser Medien mit niedrigerem Fluoreszenzuntergrund erzielt werden. Weitere Verbesserungen lassen sich durch Verwendung fluoreszierender Moleküle mit einem höheren Verhältnis von Fluoreszenzquantenausbeute zu molarem Extinktionskoeffizienten als bei NADH erzielen; Beispiele für derartige Substanzen sind etwa Methylumbelliferon, Orthophthalaldehyd, Fluorescamin und Fluorescein.

Die Erfindung ist in den Beispielen anhand der Verwendung eines Photometers beschrieben, bei dem eine Reaktionsstelle in eine bestimmt gewählte Position im Meßfeld eines Photometers hoher Reproduzierbarkeit und leichter Bedienbarkeit eingebracht wird. Durch die Reproduzierbarkeit und genaue Festlegbarkeit der Reaktionsstellen sowie durch die gegenüber der Reaktionsstelle zurückgesetzten optischen Flächen des Geräts wird eine maximale Gleichmäßigkeit in der optischen Kopplung aufeinanderfolgend untersuchter

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Reaktionsstellen mit der Meßoptik des Geräts erzielt. Es kann ferner in manchen Fällen wünschenswert sein, daß die zurückspringende Fläche ein mittleres Reflexionsvermögen aufweist, wie oben im einzelnen erläutert ist.

Die Reaktionsstellen aus einem faserigen oder einem anderen porösen Medium werden ferner vorzugsweise mit einem einen höheren Feuchtigkeitsgehalt fördernden Konditionierungsmittel vorbehandelt. Das Mittel kann vor den Reagentien aufgebracht werden; es ist jedoch günstiger, das Mittel zusammen mit der Reagens-Vorhandlung des Mediums anzuwenden.

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung wird die Flüssigkeit beispielsweise durch eine poröse Scheibe oder ein anderes Dochtelement zugeführt, um die Flüssigkeitszufuhr so zu kontrollieren, daß ein in der Geschwindigkeit zwar begrenztes, jedoch kontinuierliches Aufbringen im Mittelbereich der Reaktionsstelle erfolgt. Das Dochtelement erleichtert an der Stelle der Flüssigkeitsaufgabe die Erzielung eines poolartigen Flüssigkeitsvorrats in ähnlicher Weise, wie dies natürlicherweise auftritt, wenn die Flüssigkeit ohne Verwendung eines Dochtelements mit genau der richtigen Geschwindigkeit aufgebracht wird. Bevorzugte Dochtscheiben weisen demgemäß Durchmesser von 1,5 bis 2 mm auf, jedoch können auch andere Größen im Bereich von etwa 1 bis 3 mm verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Spot-Test-Analyse kann als Zweipunkt- oder andere Geschwindigkeitsmessung während des Ablaufs der interessierenden Reaktion durchgeführt werden. Insbesondere in Fällen, in denen das vermessene Signal im Vergleich zu ungleichmäßigen und anderen nichtreproduzier-

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baren Untergrundsignalen ausreichend groß ist, kann der Test erfindungsgemäß auch in Form einer Endpunktbestimmung durchgeführt werden. In manchen Fällen können derartige Messungen auch nach dem Trocknen der Reaktionsstelle vorgenommen werden.

Bei der erfindungsgemäßen chemischen Spot-Test-Analyse werden herkömmliche analytische Reaktionen angewandt. Demgemäß können auch die Bestandteile der erfindungsgemäß eingesetzten Reagenssysteme konventionelle Substanzen sein, die jedoch gemäß der Erfindung, wie oben erläutert, in signifikant höheren Konzentrationen eingesetzt werden.

Die Erfindung ist nicht auf die angegebenen speziellen Ausführungsbeispiele beschränkt, sondern umfaßt auch sämtliche analogen Ausführungsformen, die dem Erfindungskonzept entsprechen.

Die Erfindung betrifft zusammengefaßt die chemische Analyse von Proben ait Reagentien, die fleckartig auf einem faserigen oder porösen Medium aufgebracht sind, wobei ein mit den Reagentien sowie einem Konditionierungsmittel vorbehandeltes Medium eingesetzt wird. Das Konditionierungsmittel erhöht die Befeuchtbarkeit des Mediums mit der Reaktantenflüssigkeit. Nach einer Weiterbildung umfaßt das erfindungsgemäße vorbehandelte Medium verschiedene Reagentien, die sich überwiegend innerhalb unterschiedlicher, ausgewählter Zonen befinden.

Die Flüssigkeit wird typischerweise in Form einer verdünnten Probe mit einer Geschwindigkeit auf das Medium aufgebracht, die so gewählt ist, daß die Bildung reprozierbarer Flecken ermöglicht wird. Nach einer erfindungsgemäßen Weiterbildung wird die Flüssigkeit durch Auffließenlassen auf ein auf dem Medium aufliegendes Dochtelement aufgebracht. Der Docht ist beispielsweise scheibenförmig

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und klein in bezug auf den Fleck, den die Reaktanten auf dem Medium bilden. Die Scheibe kann ferner so vorbehandelt sein, daß sie reagenshaltig ist, wobei dann das Reagens durch die Flüssigkeit auf das Medium übertragen wird.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist so ausgebildet, daß sie das Reaktionsmedium zwischen in bestimmter Weise zurückliegenden oberen und unteren Flächen aufnimmt, die an dem zu untersuchenden Reaktionsfleck einander gegenüberliegend aufeinander ausgerichtet sind.

Die Analyse kann je nach der betreffenden analytischen Reaktion, dem Medium sowie der geforderten Genauigkeit entweder bei nassen Reaktanten oder auch durch Messung des Reaktionsprodukts nach dem Trocknen der Reaktanten durchgeführt werden. Erfindungsgemäß ist ferner auch eine Einzelpunktanalyse möglich.

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'It'

L e e r s e i t e

Claims (33)

1. Ansprüche

   I.) Verfahren zur chemischen Spot-Test-Analyse flüssiger Proben auf einen ihrer Bestandteile durch Umsetzung mit
   einem oder mehreren Reagentien, die an einer Teststelle
   eines porösen Mediums enthalten sind, unter Änderung der
   Konzentration einer dem zu bestimmenden Bestandteil zugeordneten Reaktionskomponente, wobei die an der Teststelle erzeugte Änderung der Konzentration dieser Reaktionskomponente während zumindest eines Meßintervalls nur
   optisch dünn ist,
   durch folgende Schritte:

   (1) Bestrahlung der Reaktionsstelle mit einer einfallenden elektromagnetischen Strahlung zur Erzeugung einer nachweisbaren, aus der Probe austretenden elektromagnetischen Strahlung, von der sich ein Parameter in Abhängigkeit von Änderungen der Konzentration der Reaktionskomponente ändert;

   (2) Aufnahme der Änderungen des auf die zu bestimmende
   Komponente bezogenen Parameters der von der Teststelle ausgehenden Strahlung, die aus der Wechselwirkung der einfallenden Strahlung mit den Reaktionskomponenten
   an.der Reaktionsstelle zu mindestens zwei Zeitpunkten während des Meßintervalls, zwischen denen die Reaktion abläuft, resultiert,

   und

   (3) Erzeugung eines Meßwerts für den entsprechenden Probenbestandteil aus den registrierten Änderungen des verfolgten Parameters,

   65-(853 ^35/DAH 357)-SP-Sl

   ¹ INSPECTED

   gekennzeichnet durch

   (A) Verzögerung des Flüssigkeitsverlusts von der Teststelle des Mediums zwischan den Zeitpunkten der Messung der Strahlung

   und

   (B) Verringerung von Änderungen des verfolgten Parameters der Strahlung, die durch Änderungen des Feuchtegehalts des Mediums an der Analysenstelle bedingt sind.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, (A) daß das Medium mit der darauf befindlichen Teststelle relativ zur Beleuchtungseinrichtung für diese Stelle und relativ zur Nachweiseinrichtung für die von der Probe ausgehende Strahlung durch geeignete Einrichtungen gehaltert und örtlich selektiv festgelegt wird

   (B) daß ein blattförmiger Träger zwischen zwei einander gegenüberliegenden Flächen aufgenommen wird, auf dem sich die Teststelle befindet, wobei jeweils eine der Flächen einer der beiden Seiten des blattförmigen Trägers gegenüberliegt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Flächen von dem blattförmigen, zwischen ihnen aufgenommenen und örtlich festgelegten Träger beabstandet werden, wenn der Träger an seiner Teststelle . flüssigkeitsfeucht ist.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der blattförmige Träger zwischen zwei einander gegenüberliegenden zylindrischen Rändern aufgenommen und örtlich festgelegt wird, die jeweils von der entsprechenden Fläche in Richtung auf die andere Fläche hin vorspringen und miteinander fluchten, wobei die beiden Sei-

   909821/0773 ^{0RIGINALINSPECTES}

   ten des blattförmigen Trägers zwischen den zylindrischen Ringen eingeklemmt werden, wodurch der Verlust von Flüssigkeit aus dem Medium in peripherer Richtung nach außen von der Teststelle verringert wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine der beiden Flächen im Strahlengang der elektromagnetischen Strahlung zwischen der Strahlungsquelle und der Strahlungsmeßeinrichtung vorgesehen und ihre Oberfläche mit einem solchen Reflexionsvermögen für elektromagnetische Strahlung versehen wird, daß Änderungen des aufgenommenen Strahlungsparameters minimiert werden, die durch Änderungen der Feuchtigkeit an der Teststelle bedingt sind.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teststelle auf einem Medium vorgesehen wird, das im wesentlichen aus Papierfasern besteht, die--minimale Feuchtigkeitsabsorption aufweisen und durch Behandlung mit einem Verdickungsmittel in Form eines relativ hochmolekularen Polymeren sowie mit einem grenzflächenaktiven Mittel hergestellt ist, wobei die Behandlung vor oder gleichzeitig mit der Zugabe des Reaktantenmedium» zur Erzeugung des Reaktionsprodukts vorgenommen wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche JL bis 6, dadurch gelennzeich-

   net, daß die Flüssigkeit--an der'Teststel-le^für'-die Reaktion, die das betrachtete Reaktionsprodukt liefert, aufgegeben wird, wobei die Flüssigkeit lediglich an einer zentralen Stelle der Teststelle sowie mit einer bestimmt ausgewählten, kontrollierten Geschwindigkeit zugeführt wird, die im wesentlichen derjenigen Geschwindigkeit entspricht, mit der die der zentralen Stelle zugeführte Flüssigkeit in das Medium eindringt und darin von der zentralen Stelle nach außen absorbiert wird.

   S09821/0773
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß

   (A) ein Dochtelement auf dem Medium zentral auf der Teststelle aufgebracht wird, das lediglich einen Teil dieser Stelle überdeckt, sowie

   (B) die Flüssigkeit dem Dochtelement zugeführt wird, durch das hindurch sie auf die Reaktionsstelle übertragen wird.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlung, die der Konzentration des Reaktionsprodukts entspricht, zu einem Zeitpunkt aufgenommen wird, zu dem die Bildung des Reaktionsprodukts im wesentlichen beendet ist.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß das Medium mit einem Reagenssystem behandelt wird, das dieselben Bestandteile wie für die in-vitro-Analyse des gleichen zu analysierenden Bestandteils, jedoch demgegenüber erhöhte Konzentrationen der Bestandteile aufweist, wobei die Konzentrationen der Bestandteile mit relativ hohem Molekulargewicht größenordnungsmäßig 3- bis 5fach höher sind als die Konzentrationen für die übliche in-vitro-Analyse und die Konzentrationen für die relativ niedermolekularen Bestandteile größenordnungsmäßig 2- bis 4mal höher sind als die Konzentrationen für die hochmolekularen Bestandteile.
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium vor dem Beginn der Reaktion,

    das
    durch die/Reaktxonsprodukt erzeugt wird, so behandelt wird, daß innerhalb einer ersten Umfangszone der Teststelle ein erstes Reagens und in einer davon verschiedenen zweiten,

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    zentral an der Teststelle innerhalb der ersten ümfangszone lokalisierten zweiten Zone ein zweites Reagens vorgesehen wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und zweite Zone der Reagentien an der Teststelle durch sequentielles Aufbringen der Reagentien in der Mitte der Reaktionsstelle erzeugt werden.
13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest die Teststelle des Mediums einem flüssigen Konditionierungsmittel ausgesetzt wird, das ausgewogene hydrophobe und hydrophile Eigenschaften aufweist, um die Ausbreitung der Flüssigkeit im Medium zu verzögern

    das

    und die Konzentration an in/Medium einzubringender Flüssigkeit zu erhöhen, wobei die Behandlung mit einer Menge an Konditionierungsmittel vorgenommen wird, die dafür ausreicht, daß die Absorption der Flüssigkeit durch die poröse Struktur des Mediums nach dem Trocknen verringert ist.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Konditionierungsmittel ein Verdickungsmittel oder einen Verdickungsbestandteil und ein grenzflächenaktives Mittel oder einen grenzflächenaktiven Bestandteil enthält.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Konditionierungsmittel einen Verdickungsbestandteil enthält, der unter hochmolekularen kristallinen Äthylenoxidpolymeren, Albumin, Gummiarabicum, Guargummi und Mannit ausgewählt ist.

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16. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15» dadurch gekennzeichnet, daß als Konditionierungsmittel ein niedermolekulares grenzflächenaktives Mittel auf Polyolbasis mit ausgewählten hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften verwendet wird.
17. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufnahme der Flüssigkeit und zur Kontrolle der Zuführungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit zur Teststelle ein Dochtelement verwendet wird, das lediglich einen zentralen Teil der Teststelle überdeckt.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Dochtelement scheibenförmig ist.
19. 19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß als Dochtelement ein zylindrisches, scheibenförmiges Element verwendet wird, dessen Durchmesser im wesentlichen etwa 1 bis 3 mm beträgt.
20. 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das vom Dochtelement aufgenommene chemische Reagens von diesem durch Fließen der Flüssigkeit durch das Dochtelement hindurch auf die Teststelle übertragen wird.
21. 21. Vorrichtung zur chemischen Spot-Test-Analyse unter Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 20, gekennzeichnet durch

    (A) eine Einrichtung (28, 30) zur Verringerung des Flüssigkeitsverlustes von der Teststelle (l^a^pSss Mediums (14) zumindest während der Meßdauer

    und

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    (B) eine Einrichtung (32, 36) zur Verringerung von Änderungen des registrierten Strahlungsparameters, die durch Änderungen der Feuchtigkeit des Mediums an der Teststelled^a, 34a) bedingt sind.
22. 22. Vorrichtung nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch

    (A) eine Einrichtung (20, 22, 28, 30) zur Aufnahme des

    Mediums und zur selektiven örtlichen Festlegung der

    (14a)

    darauf befindlichen Teststelle/relativ zur Beleuchtungseinrichtung für die Teststelle sowie relativ zur Nachweiseinrichtung für die austretende Strahlung

    und

    (B) zwei einander gegenüberliegende Flächen (18, 24), die so angeordnet sind, daß zwischen ihnen ein blattartiger Träger/miT; der Reaktionsstelle',aufgenommen werden kann, wobei die Flächen jeweils einer Seite des blattförmigen Trägers (14) gegenüberliegen.
23. 23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Flächen (l8, 24) von dem dazwischen aufgenommenen und örtlich festgelegten, mit der Flüssigkeit an seiner Teststelle (l4a>/15ereuchteten Träger (14, 34) beabstandet '· sind.
24. 24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der blattförmige Träger (14, 34) zwischen zwei einander gegenüberliegenden zylindrischen Rändern (28, 30) aufgenommen und örtlich festgelegt ist, die jeweils von der entsprechenden Fläche (l8, 24) in Richtung auf die andere Fläche hin vorspringen und miteinander fluchten, wobei die beiden Seiten des blattförmigen Trägers (14, 34) zwischen den zylindrischen Ringen eingeklemmt sind, wodurch ein Verlust von Flüssigkeit aus dem Medium in peripherer Richtung nach außen von der Teststelle (14a, 34a) verringert wird.

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25. 25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine der beiden Flächen (18, 24) im Strahlengang der elektromagnetischen Strahlung zwischen der Strahlungsquelle und der Strahlungsmeßeinrichtung vorgesehen ist und ihre Oberfläche ein solches Reflexionsvermögen für die elektromagnetische Strahlung aufweist, daß Änderungen des registrierten Strahlungsparameters minimiert werden, die durch Änderungen des Feuchtigkeit? an der Teststelle (14a, 3¹Ja) bedingt sind.
26. 26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium (14, 34) an der Teststelle (I¹Ja, 34a) Faserstruktur aufweist und im wesentlichen aus Papierfasern besteht, die minimale Feuchtigkeitsabsorption aufweisen, und durch Behandlung mit einem Verdickungsmittel in Form eines relativ hochmolekularen Polymeren sowie mit einem grenzflächenaktiven Mittel hergestellt ist, wobei die Behandlung vor oder zusammen mit der Reaktantenzugabe zum Medium zur Erzeugung des Reaktionsprodukts vorgenommen ist.
27. 27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium (14,34) zumindest an der Teststelle (l4a, 34a) ein Konditionierungsmittel aufweist, das durch Zusammenbringen des Mediums mit einer Lösung des Konditionierungsmittels und nachfolgende Trocknung erhalten ist, wobei das Konditionierungsmittel ausgeglichene hydrophobe und hydrophile Eigenschaften aufweist, um eine Ausbreitung der Flüssigkeit in das Medium (14, 34) zu verzögern und eine erhöhte Flüssigkeitsaufnahme im Medium (14, 34) zu ermöglichen.

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28. 28. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das zumindest an der Teststelle (14a, 34a) des Mediums (I¹I, 34) vorgesehene Konditionierungsmittel ein Verdickungsmittel und ein grenzflächenaktives Mittel oder einen verdickenden Bestandteil und einen grenzflächenaktiven Bestandteil aufweist.
29. 29» Vorrichtung nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Konditionierungsmittel ein Verdickungsmittel bzw. einen Verdickungsbestandteil aufweist, der unter hochmolekularen,kristallinen Äthylenoxidpolymeren, Albumin, Gummiarabicum, Guargummi und Mannit ausgewählt ist.
30. 30. Vorrichtung nach Anspruch 27» dadurch gekennzeichnet, daß das Konditionierungsmittel ein niedermolekulares grenzflächenaktives Mittel auf Polyolbasis mit ausgewählten hydrophilen und ausgewählten hydrophoben Eigenschaften ist.
31. 31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Dochtelement 32 aufweist, das lediglich auf dem Mittelteil der Teststelle (I¹Ia, 3¹Ia) des Mediums (14, 3¹O aufliegt und die Flüssigkeit aufnimmt sowie die Zuführungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit zur Teststelle (IMa₉ 34a) kontrolliert.
32. 32. Vorrichtung nach Anspruch 31» dadurch gekennzeichnet, daß das Dochtelement scheibenförmig ist.
33. 33. Vorrichtung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Dochtelement ein zylindrisches, scheibenförmiges Element mit einem Durchmesser von etwa 1 bis 13 mm ist.

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