DE3206723A1 - Film fuer die quantitative analyse - Google Patents

Description

Film für die quantitative Analyse

Die vorliegende Erfindung betrifft einen quantitativ arbeitenden Analysenfilm für die quantitative Untersuchung der Transaminase-Aktivität und insbesondere einen Film für die quantitative Analyse, der eine Reagensschicht aufweist, die ein Substrat für Transaminase, Brenztraubensäure-Oxidase und eine Farbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis von Hydrogenperoxid enthält, und der für quantitative Untersuchungen der Transaminase eingesetzt wird.

Bekannt und z.B. in der JP-OS 13068/80 offenbart sind Methoden zur analytischen Untersuchung verschiedener Transaminase-Aktivitäten; diese Methoden umfassen die direkte Erzeugung von Brenztraubensäure durch Reaktionen verschiedener Transaminasen mit den entsprechenden

Substraten oder die Erzeugung von Brenztraubensäure auf indirektem Wege durch chemische Reaktion(en), an denen ein oder mehrere andere Enzyme beteiligt sind oder durch chemische Reaktion(en), an denen kein Enzym beteiligt ist, die Reaktion der so gebildeten Brenztrau-

bensäure mit Brenztraubensäure-Oxidase und einer Farbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis von Hydrogenperoxid, die Peroxidase enthält, und die anschließende kolorimetrische Bestimmung der Brenztraubensäure. Die in der genannten Anmeldung offenbarte Methode umfaßt

eine Reihe chemischer Reaktionen in wäßriger Lösung und erfordert genaue Wägungen oder Volumenmessungen und die komplizierte Handhabung einer wäßrigen Lösung und bedingt dementsprechend relativ lange Zeitspannen für die analytischen Arbeiten. Eine derartige Methode ist als

Methode für klinische Analysen, bei denen es auf kurze Analysenzeiten, aber auch auf hohe Genauigkeit der Analysenergebnisse, ankommt, unzureichend.

Verschiedenartige Filme für die quantitative Analyse, insbesondere aus mehreren Schichten bestehende Analysenfilme, die kolorimetrische Methoden der analytischen Bestimmung von Hydrogenperoxid auf trockenem Wege möglich machen, wurden vorgeschlagen, und einige von ihnen werden auch praktisch eingesetzt. Unter ihnen gibt es quantitativ arbeitende Analysenfilme für die Analyse von Glucose, Harnsäure, Cholesterin, Cholinesterase, Kreatin etc. im lebenden Organismus mittels eines trockenanalytischen Verfahrens, das die nachstehende Sequenz umfaßt:

Reaktion der betreffenden Substanz mit dem entsprechenden oxydierenden Enzym oder Reaktion des im Laufe einer Enzymreaktion gebildeten Reaktionsprodukts mit dem entsprechenden oxydierenden Enzym, Reaktion des dadurch freigesetzten Hydrogenperoxids mit einem Farbindikator unter Bildung einer Färbung und

anschließende Messung der enstandenen Färbung. Die Zielsetzungen der Erhöhung der Geschwindigkeit der Untersuchung, der Vermeidung komplizierter Arbeitsgänge und der Verminderung der Kosten haben eine steigende Nachfrage nach trocken arbeitenden Analysenfilmen für quantitative Analysen, insbesondere auf dem Gebiet klinischer Untersuchungen, bewirkt. Infolgedessen wurden quantitativ arbeitende Analysenfilme, nach Art der Test-Papierstreifen, entwickelt, die für die quantitative Analyse vorgesehen sind, hohe Analysengenauigkeit aufweisen und eine einzige Schicht oder mehrere Schichten umfassen.

Insbesondere werden aus mehreren Schichten bestehende, verbundstoffartige Filme für die quantitative Analyse in der JP-OS 53888/74 (entsprechend der US-PS 3 992 158) offenbart; diese Filme weisen gegenüber konventionellen AnaIysenfilmen für quantitative Analysen von der Art der Test-Papierstreifen, die eine einzelne '· Schicht oder eine Doppelschicht besitzen, eine erheblich verbesserte Analysengenauigkeit auf. Zum Zwecke der weiteren Verbesserung der Analysengenauigkeit und

entsprechend dem zu untersuchenden Analyten wurden auch Hydrogenperoxid-Indikatoren mit hoher Nachweisempfindlichkeit in Form solcher mehrschichtiger, verbundstoffartiger Filme für die quantitative Analyse hergestellt; Beispiele für solche Indikatoren zum Nachweis von Hy-

drogenperoxid und für Schichtstrukturen für solche mehrschichtigen Analysenfilme wurden in den JP-OSen 40191/76, 131089/78, 29700/79, 124499/80 etc. offenbart.

Die in diesen, nach einem Verfahren auf trockenem Wege
arbeitenden Filmen für die quantitative Analyse verwendeten Indikatoren zum Nachweis des Hydrogenperoxids basieren auf denjenigen Indikatoren zum Nachweis des Hydrogenperoxids, die in der üblichen quantitativen Analyse mittels Trockenverfahren angewandte werden, und die zugrundeliegenden Prinzipien sind die gleichen.

Beim normalen Menschen liegt der Bereich der Normalwerte für den Transaminase-Gehalt etwa so, daß sie im gesamten Blut maximal 20 Iü/1 betragen; die Substratmenge, die eine katalytische Transaminase-Wirkung während
einer Zeit von einigen zehn Minuten, wie sie für die üblicherweise eingesetzten Meßmethoden erforderlich ist, erleiden, liegt auch unter günstiqon Beclinqunqon

i* «# t»

— 6 —

bei einer Konzentration in der Größenordnung von

-4

10 mol/1. Um eine kolorimetrische Messung einer derartigen Spurenmenge eines Substrats durch gekoppelte Enzymreaktionen zu ermöglichen, ist es erforderlich, daß

(1) die betreffende Reaktion in ausreichendem Umfang stattfindet,

(2) die Licht-Extinktion eines dabei gebildeten Farbstoffs groß ist,

(3) der Farbstoff bis zur Beendigung der Messung stabil

ist und
(4) in dem Fall, in dem die kolorimetrische Bestimmung unter Verwendung eines Films für die quantitative Analyse durchgeführt wird, vor der Beendigung der Messung keine Verluste eines erzeugten Farbstoffs infolge Mobilisierung oder Diffusion eintreten.

Aufgrund eingehender Untersuchungen seitens der Anmelderin wurde nunmehr gefunden, daß ein hoher Reaktionswirkunsggrad, eine große Licht-Extinktion eines erzeugten kationischen Farbstoffs und eine ausgeprägt hohe Empfindlichkeit der Messung der Transaminase-Aktivität dadurch erreicht werden, daß ein System gewählt wird, in dem ein Reaktionsprodukt durch eine Transaminase-Enzymreaktion oder eine Kombination einer Transaminase-Enzymreaktion mit einer oder mehreren anderen Enzymreaktionen, die mit dieser gekoppelt sind, auf dem Wege über die Brenztraubensäure in Hydrogenperoxid umgewandelt wird, daß als Farbindikator-System zum Nachweis des Hydrogenperoxids ein solches System gewählt wird, bei dem ein kationischer Farbstoff gebildet wird, und daß eine Kombination aus 4-Aminoantipyrin oder einem Ν,Ν-disubstituierten p-Phenylendiamin als Wasserstoff-Donator und einem Ν,Ν-disubstituierten Anilin-Derivat als Kuppler verwendet werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Film für die quantitative Analyse, der zur Bestimmung dor Tr.msaminase-Aktivität auf trockenem Wege befähigt ist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein zur Bestimmung der Transaminase-Aktivität befähigter Film für die quantitative Analyse mit hoher Nachweisempfindlichkeit, bei dem ein kationischer Farbstoff mit hoher Licht-Extinktion gebildet wird, der als Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids dient, und die
Färbung kolorimetrisch bestimmt wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein zur Bestimmung der Transamina se-Aktri vität mit hoher Genauigkeit befähigter Film für die quantitative Analyse mit hoher Nachweisempfindlichkeit, bei dem ein kationischer Farbstoff mit hoher Licht-Extinktion gebildet wird, der als Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids dient, und die Mobilisierung und Diffusion des entstandenen Farbstoffs verhindert wird.

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf

(1) einen Film für die quantitative Analyse, der eine

Brenztraubensäure-Oxidase enthaltende Reagensschicht enthält.

Die hauptsächlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind

(2) der in (1) genannte Film für die quantitative Analyse, in dem weiterhin ein Substrat für Transaminase in der Reagensschicht enthalten ist;

(3) der in (1) oder (2) genannte Film für die quantitative Analyse, in dem die Reagensschicht weiterhin eine als Phosphat-Quelle dienende Substanz, Flavinadenin-dinucleotid, Thiaminpyrophosphat, ein zwei-

5 oder dreiwertiges Metallion und eine Farbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthält;

(4) der in (3) genannte Film für die quantitative Analyse, in dem die Farbindikator-Zusammensetzung zum

Nachweis des Hydrogenperoxids eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität, einen Wasserstoff-Donator und einen Kuppler enthält;

(5) der in (4) genannte Film für die quantitative Analyse, in dem der Wasserstoff-Donator und der Kuppler aus einer zur Bildung eines kationischen Farbstoffs befähigten Kombination bestehen und die Reagensschicht weiterhin ein anionisches Polymerisat enthält;

(6) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (5) genannte Film für die quantitative Analyse, bei dem die Reagensschicht aus einer einzigen Schicht besteht;

(7) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (5) genannte Film für die quantitative Analyse, bei dem die Reagensschicht mindestens aus zwei Schichten 5 zusammengesetzt ist, von denen ein eine Transaminase-Substratschicht ist, die ein Substrat für Transaminase enthält;

(8) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (5) genannte Film für die quantitative Analyse, bei dem die Reagensschicht mindestens aus zwei Schichten zusammengesetzt ist, von denen eine eine Farbstoff-

Fixierschicht ist, die ein Substrat für Transaminase enthält;

(9) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (5) genannte Film für die quantitative Analyse, bei dem die Reagensschicht aus mindestens drei Schichten zusammengesetzt ist, von denen eine eine Transaminase-Substratschicht, die ein Substrat für Transaminase enthält, und eine eine Farbstoff-Fixierschicht, die ein anionisches Polymerisat enthält, ist; und

(10) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (9) genannte Film für die quantitative Analyse, bei dem auf einer Seite der Reagensschicht ein Träger und auf der anderen Seite der Reagensschieht eine poröse Schicht angebracht ist, wobei die poröse Schicht an der Reagensschieht in fließfähiger Berührung in Form eines einheitlichen Verbundstoffes haftet.

Verschiedene Transaminasen, deren Aktivitäten gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen werden können, sindbekannt. Von diesen sind die Glutamyl-Pyruvat-Transaminase (GPT) und die Glutamyl-Oxaloacetat-Transaminnse (GOT)von Bedeutung.

GPT und GOT sind Enzyme, die jeweils die nachstehend bezeichneten Reaktionen katalysieren:

GPT
o< -Ketoglutarsäure + L-Alanin -

Brenztraubensäure + L-Glutaminsäure (3)

GOT
οι -Ketoglutarsäure + L-Asparaginsäure —-»»

Oxalessigsäure + L-Glutaminsäure (4)

Die quantitative analytische Bestimmung der Aktivitäten von GPT und GOT spielt eine bedeutsame Rolle bei der Diagnose von Lebererkrankungen, da erhöhte GPT- und GOP-Konzentrationen im Blut Maßzahlen für Lebererkrankungen sind.

Als in der vorliegenden Erfindung verwendete Bernsteinsäure-Oxidase (im folgenden als "POP" bezeichnet) kann jedes Enzym verwendet werden, sofern es Reaktionen katalysiert, die Acetylphosphat, Kohlenstoffdioxid und Hydrogenperoxid aus Brenztraubensäure, anorganischem

Phosphat und Sauerstoff bilden; zu den bevorzugten Beispielen gehören POP, das durch Kultivierung von zur Gattung Pediococcus gehörigen Bakterien, zur Gattung Streptococcus gehörigen Bakterien und zur Gattung Aerococcus gehörigen Bakterien erhalten werden. Eine Me-

thode zur Sammlung von POP wird beispielsweise in der JP-OS 13068/80 beschrieben. POP ist im Handel erhältlich und leicht zugänglich.

POP benötigt (1) eine als Phosphat-Quelle dienende Verbindung, (2) Coenzyme (Thiaminpyrophospat und Flaviniidenin-dinucleotid) und (3) Schwermetallionen, wie in

der Fachwelt wohlbekannt ist. Um die POP-Aktivität hervorzurufen, müssen neben dem POP diese drei Bestandteile anwesend sein. In der Beschreibung wird ein Gemisch, das eine als Phosphat-Quelle dienende Verbindung, Coenzyme, Schwermetallionen und POP enthält, als POP-Gemisch bezeichnet.

Als Phosphat-Quelle dienende Verbindungen sind Verbindungen, die befähigt sind, Phosphat-Ionen zu liefern oder freizusetzen und in der Fachwelt wohlbekannt sind.

Als Phosphat-Quellen können Phosphat-Ionen PO. ~, sau-

2-ren Wasserstoff enthaltende Phosphat-Ionen (HPO. , H₂PO. ), deren Säuren oder deren Salze eingesetzt werden. Phosphorsäureester oder -komplexe, die durch Hydrolyse Phosphat-Ionen oder sauren Wasserstoff enthal-

tende Phosphat-Ionen freisetzen können, können ebenfalls eingesetzt werden. Zu speziellen Beispielen für als Phosphat-Quellen dienende Verbindungen zählen Phosphorsäure (H₃PO.), Trinatriumphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Trikaliumphos-

phat, Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Aluminiumhydrogenphosphat, Calciumhydrogenphosphat, Manganphosphat, Manganhydrogenphosphat, Magnesiumhydrogenphosphat, Eisenhydrogenphosphat, Cobalthydrogenphosphat, etc.. Als Phosphat-Quellen fungierende

Verbindungen können auch in Form von Pufferlösungen verwendet werden. Die als Phosphat-Quellen dienenden Verbindungen können in einem Bereich von 0,1 μπιοί bis 10 μπιοί, vorzugsweise von 0,3 μΐΐιοί bis 5 μπιοί, berechnet als Phosphat-Ionen, bezogen auf 1 U POP, eingesetzt werden (eine Aktivität, bei der 1 μπιοί Hydrogenperoxid im Laufe von 1 min bei 37⁰C gebildet wird, wird als 1 Einheit (U) definiert).

Flavin-adenindinucleotid (im folgenden kurz als "PAD" bezeichnet) kann in einem Bereich von 0,1 nmol bis 50 nmol, vorzugsweise von 0,3 nmol bis 30 nmol, bezogen auf 1 U POP, eingesetzt werden.

Als Thiaminpyrophosphat (TPP) können Thiamindiphosphat (TDP) und Thiamintriphosphat (TTP) eingesetzt werden; von diesen Thiamindiphosphat bevorzugt. Thiaminpyrophosphat kann in einem Bereich von 5 nmol bis 500 nmol, vorzugsweise von 10 nmol bis 300 nmol, bezogen auf 1 U POP, eingesetzt werden.

Zwei- oder dreiwertige Metallionen sind solche zwei- oder dreiwertigen Metallionen, die die POP-Wirkung ak-

2+ tivieren können; spezielle Beispiele hierfür sind Ca ,

2+ 2+ 3+
Co , Mg und Al . Diese Metallionen können auch in Form ihrer Salze oder Komplexe, die diese Metallionen enthalten und freisetzen, verwendet werden. Falls Phosphate oder Hydrogenphosphate in Form von Salzen, die zwei- oder dreiwertige Metallionen enthalten, verwendet werden, können die als Phosphat-Quelle dienende Verbindung und die Metallionen in Form-einer einzigen Verbindung eingesetzt werden, die beide Bestandteile gemeinsam enthält. Zu Beispielen für Salze, die zwei- oder dreiwertige Metallionen enthalten, zählen Chloride, Sulfate, Nitrate, Phosphate, Hydrogensulfate, Hydrogenphosphate, Carbonate, Hydrogencarbonate und Acetate.

2+ 2+

Bevorzugte Metallionen sind Mn und Mg , und bevorzugte Metallsalze sind Chloride, Phosphate und Hydrogenphosphate. Spezielle Beispiele bevorzugter Metallsalze sind Mangan(II)chlorid, Mangan(II)phosphat, Mangan(II)hydrogenphosphat, Magnesium(II)chlorid und Magnesium (II) hydrogenphosphat. Die zwei- oder dreiwertigen Metallionen können in einer Menge von 5 nmol bis

10 μπιοί, vorzugsweise von 10 nmol bis 5 μπιοί, bezogen auf 1 U POP, eingesetzt werden.

Die Farbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis des Hydrogenperoxids kann in geeigneter Weise unter solchen
Indikatoren, die für die kolorimetrisch^ Messung einer gebildeten Färbung (Auftreten oder Veränderung einer Färbung) oder einer Fluoreszenz geeignet sind, ausgewählt und für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Bei dem Film für die quantitative Analyse gemäß

der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise ein einen kationischen Farbstoff bildender Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids, der zur Bildung eines kationischen Farbstoffs aufgrund einer chemischen Wechselwirkung in Gegenwart von Hydrogenperoxid befähigt

ist, und in Verbindung mit diesem ein anionisches Polymerisat eingesetzt.

In der vorliegenden Beschreibung wird der Begriff "Reagensschicht" zur Bezeichnung einer solchen Schicht verwendet, in der ein Analyt in eine chemisch nachweisbare Species umgewandelt wird und die zu einer Verbesserung der Nachweisbarkeit der chemisch nachweisbaren Species beiträgt. Die Reagensschicht enthält eine einen kationischen Farbstoff bildende Farbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis von Hydrogenperoxid und ein anioni-

sches Polymerisat.

Der Begriff "Farbbildungsreaktions-Schicht" bezeichnet eine Schicht, in der ein Analyt in eine chemisch nachweisbare Species umgewandelt wird.

Der Begriff-"Farbstoff-Fixierschicht" bezeichnet eine
Schicht, die zur Verbesserung der Nachweisbarkeit der chemisch nachweisbaren Species beiträgt.

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Die Reagensschicht kann eine ein TA-Substrat (wie es im Folgenden definiert wird) enthaltende, Farbbildungsreaktions- und Farbstoff-Fixierschicht sein, wenn diese Reagensschicht aus einer einzigen Schicht besteht; die Reagensschicht kann jedoch auch in zwei oder mehr Schichten unterteilt sein, von denen eine eine TA-Sub- i strat-Schicht ist und eine oder mehrere andere eine ^ Farbstoff-Fixierschicht, Farbbildungsreaktions-Schicht | etc. ist/sind. Mit anderen Worten können eine TA-Sub- |- strat-Schicht, eine Farbbildungsreaktions-Schicht, eine Farbstoff-Fixierschicht etc. auch gemeinsam als "Reagensschicht" bezeichnet werden. t

Die chemisch nachweisbare Species ist direkt oder indirekt eine Nachweisgröße für die Anwesenheit und/oder Konzentration eines interessierenden Analyten oder eines Reaktions- oder Zersetzungsproduktes des Analyten.

Der Begriff "Substanz mit Peroxidase-Aktivität" ist so zu verstehen, daß er eine Substanz bezeichnet, die die Oxidation eines Wasserstoff-Donators mit Hydrogenperoxid (als Substrat) katalysiert, und. in der Fachwelt j wohlbekannt (I. Yamazaki et al, Molecular & Cellular ^!i

Biochemistry, Band 2(1), Seiten 39-52 (1973)). Die Sub- j; stanz mit Peroxidase-Aktivität nimmt an der Oxidation ;: eines Wasserstoff-Donators mit Hydrogenperoxid nach dem folgenden Reaktionsschema teil:

Peroxidase H₃O₂ + Wasserstoff-Donator *·

oxydierter Wasserstoff-Donator (OHD) + 2 H-O

Der Begriff "Wasserstoff-Donator" bezeichnet eine Ver-

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bindung, die ein Sauerstoff-Akzeptor ist, der im oxydierten Zustand mit den Ν,Ν-disubstituierten Anilinen der Formel (1) (vgl. Seite 21) kuppelt.

Die kationische farbstoffbildende Färbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis des Hydrogenperoxids, die einen Bestandteil enthält, der zur Bildung eines kationischen Farbstoffs durch chemische Wechselwirkung in Gegenwart von Hydrogenperoxid befähigt ist (im folgenden als "Farbindikator zum Nachweis von Hydrogenperoxid" bezeichnet), ist eine Indikator-Zusammensetzung, die als Hauptbestandteile eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität, einen Wasserstoff-Donator und ein N,N-disubstituiertes Anilin enthält.

Beispiele für Substanzen mit Peroxidase-Aktivität sind
unter anderen Peroxidase, die aus verschiedenartigen Organismen extrahiert wurde, synthetisierte Peroxidase sowie andere, aus Organismen extrahierte chemische Substanzen, die eine Aktivität zeigen, die derjenigen der Peroxidase ähnlich ist, wie sie in der JP-OS 137192/75
(entsprechend, der US-PS 3 983 005) offenbart wurden. Von diesen wird Peroxidase bevorzugt.

Als Wasserstoff-Donatoren, die in den Farbindikatoren enthalten sind, können 4-substituierte Antipyrine (4-substituierte 2,3-Dimethyl-l-phenyl~3-pyrazolin-5-one), wie sie in der JP-OS 50991/74 (entsprechend der US-PS 3 886 045) offenbart wurden, sowie andere bekannte 4-substituierte Antipyrine, N,N-disubstituierte o- oder p-Phenylendiamine, wie sie in der JP-OS 137192/75 offenbart wurden, sowie andere bekannte N,N-disubstitu-

ierte o- oder p-Phenylendiamine, 2-Hydrazonobenzothiazoline, wie sie in der JP-OS 20471/80 offenbart wurden,

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und andere bekannte 2-Hydrazonobenzothiazoline, p-Halogenophenole, wie sie in der JP-OS 148100/80 offenbart wurden, sowie andere p-Halogenophenole und N,N-disubstituierte Phenylendiamine der Formel (2)

eingesetzt werden, in der R und R gleich oder verschieden sein können und für Alkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxyalkyl, Cyanoalkyl, Halogenoalkyl oder Acylaminoalkyl stehen und R Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy oder Halogen bezeichnet.

Spezielle Beispiele für einsetzbare 4-substituierte Antipyrine sind (in Klammern ist die CAS-Registriernummer angegeben):

4-Aminoantipyrin (83-07-8),

4-(Dimethylamine)antipyrin (Pyramidon) (58-15-1), 4-Ethylaminoantipyrin (15166-10-6),

4-Methylaminoantipyrin (Noramidopyrin) (519-98-2), 4-(Natriumsulfonatomethylamino)antipyrin

(Sulphamipyrine) (129-89-5) , 4-(Natriumsulfonatomethyl)(isobutyl)aminoantipyrin

(Dibupyrone) (1046-17-9), 4-Natriumsulfonatomethyl)(methyl)aminoantipyrin

(Methampyrone) (5907-38-0)

und 4-Isopropylantipyrin (Propiphenazon)(479-92-5). Als andere Verbindungen mit ähnlicher Struktur kommen 4-Amino-2,S-dimethyl-l-p-tolyl-S-pyrazolin-S-on

(56430-10-5)

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und 4-Amino-l, S-diphenyl^-methyl-S-pyrazolin-S-on

(52744-73-7) in Betracht. Auch

2-Dimethylamino-5-phenyl-2~oxazolin-4-on (Tozalinone) (1046-17-9) kann verwendet werden.

In den Fällen, in denen ein oder beide Substituenten R und R in den durch die Formel (2) dargestellten N,N-disubstituierten p-Phenylendiaminen Alkyl-Gruppen sind, können diese Alkyl-Gruppen geradkettige oder kettenverzweigte niedere Alkyl-Gruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen sein; Beispiele hierfür sind eine Methyl-Gruppe, Ethyl-Gruppe, Propyl-Gruppe, Butyl-Gruppe, Pentyl-Gruppe, Isopropyl-Gruppe, Isobutyl-Gruppe, Isoamyl-Gruppe, t-Butyl-Gruppe und Neopentyl-Gruppe. Im Falle einer Substitution durch Alkoxyalkyl-Gruppen besteht die betreffende Alkoxyalkyl-Gruppe aus einer niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstof f-Atomen, die durch eine niedere Alkoxy-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoff-Atomen substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine Methoxymethyl-Gruppe, 2-Methoxyethyl-Gruppe, 1-Methoxyethyl-Gruppe, 3-Methoxypropyl-Gruppe, 2-Methoxypropyl-Gruppe, Ethoxypropyl-Gruppe und 2-Ethoxyethyl-Gruppe. Im Falle einer Substitution durch Hydroxyalkyl-Gruppen besteht die betreffende Hydroxyalkyl-Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine Hydroxy-Gruppe substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine Hydroxymethyl-Gruppe, 2-Hydroxyethyl-Gruppe, 1-Hydroxyethyl-Gruppe, 3-Hydroxypropyl-Gruppe, 2-Hydroxypropyl-Gruppe, 4-Hydroxybutyl-Gruppe und 5-Hydroxypentyl-Gruppe. Im Falle einer Substitution durch eine Cyanoalkyl-Gruppe besteht die betreffende Cyanoalkyl-Gruppe aus einer geradkettigen oder kettcnver-

it m · · · *

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zweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine Cyano-Gruppe substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine Cyanomethyl-Gruppe, 2-Cyanoethyl-Gruppe, 1-Cyanoethyl-Gruppe, 3-Cyanopropyl-Gruppe, 2-Cyanopropyl-Gruppe und 5-Cyanopentyl-Gruppe.Im Falle einer Substitution durch eine Halogenoalkyl-Gruppe besteht die betreffende Halogenoalkyl-Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iod-Atom als Halogen-Atom substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine Fluoromethyl-Gruppe, Chloromethyl-Gruppe, Bromomethyl-Gruppe, 2-Fluoroethyl-Gruppe, 1-Chloroethyl-Gruppe, 2-Chloroethyl-Gruppe, 2-Bromoethyl-Gruppe und 3-Chloropropyl-Gruppe. Im Falle einer Substitution durch eine Acylamino-Gruppe besteht die betreffende Acylamino-Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine Acetamido-Gruppe, Propionamido-Gruppe, Benzamido-Gruppe, Toluamido-Gruppe, Methansulfonamido-Gruppe, Benzolsulfonamido-Gruppe oder Toluolsulfonamido-Gruppe als Acylamino-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoff-Atomen substituiert ist; Beispiele hierfür sind eine Acetamidomethyl-Gruppe, Propionamidomethyl-Gruppe, Benzamidomethyl-Gruppe, p-Toluamidomethyl-Gruppe, Methansulfonamidomethyl-Gruppe, Ethansulfonamidomethyl-Gruppe, Benzolsulfonamidomethyl-Gruppe, p-Toluolsulfonamidomethyl-Gruppe, 2-Acetamidoethyl-Gruppe, 2-Propionamidoethyl-Gruppe, 2-Benzamidoethyl-Gruppe, 2-p-Toluamidoethyl-Gruppe, 2-Methansulfonamidoethyl-Gruppe, 2-(Ethansulfonamido)ethyl-Gruppe, 2- (Benzolsulf onamido)ethyl-Gruppe, 2-(p-Toluolsulfonamido)-ethyl-Gruppe, 3-Acetamidopropyl-Gruppe und 3-Benzamidopropy1-Gruppe.

Zu den bevorzugten Substituenten R und R zählen beispielsweise die nachstehenden Gruppen:

Methyl, Ethyl, Methoxymethyl, 2-Methoxyethyl, Ethoxymethyl, 2-Ethoxyethyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl,
1-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl, Acetamidomethyl, 2-Acetamidoethyl, Methansulfonamidomethyl, 2-Methansulfonamidoethyl, Chloromethyl, 2-Chloroethyl, Cyanomethyl und 2-Cyanoethyl.

In dem Fall, in dem der Substituent R in den durch die Formel (2) dargestellten Ν,Ν-disubstituierten p-Phenylendiaminen eine Alkyl-Gruppe ist, sind spezielle Beispiele hierfür die gleichen wie die speziellen Beispiele in den Fällen, in denen R und R Alkyl-Gruppen sind. In dem Fall, in dem R eine Alkoxy-Gruppe ist,
enthält die betreffende Alkoxy-Gruppe eine geradkettige oder kettenverzweigte niedere Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen; spezielle Beispiele hierfür sind eine Methoxy-Gruppe, Ethoxy-Gruppe, Propoxy-Gruppe, Isopropoxy-Gruppe, Butoxy-Gruppe, Isobutoxy-Gruppe,
Pentyloxy-Gruppe und Isoamyloxy-Gruppe. In dem Fall, in dem R ein Halogen-Atom ist, sind spezielle Beispiele ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iod-Atom.

Als Substituenten R bevorzugt werden ein Wasserstoff-Atom, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen
und ein Halogen-Atom; hiervon werden eine Methyl-, Ethyl- und Propyl-Gruppe als Alkyl-Gruppe und ein Fluor- oder Chlor-Atom als Halogen-Atom besonders bevorzugt.

Spezielle Beispiele für die Ν,Ν-disubstituierten p-Phenylendiamine der Formel (2) sind die folgenden Verbindungen :

N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin,
N,N-Diethyl-p-phenylendiamin,

N-Ethyl-N-(ß-hydroxyethyl)-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(ß-ethoxyethyl)-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(ß-methansulfonylaminoethyl)-3-methyl-4-

aminoanilin,

N-Ethyl-N-(ß-hydroxyethyl)-3-methyl-4-aminoanilin,
N-Ethyl-N-(ß-cyanoethyl)-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(ß-chloroethyl)-p-phenylendiamin,
N,N-Diethyl-3-chloro-4-aminoanilin,
Ν,Ν-Bis(ß-cyanoethyl)-p-phenylendiamin.

Als Wasserstoff-Donatoren werden 4-substituierte Antipyrine und N,N-disubstituierte p-Phenylendiamine der Formel (2) bevorzugt. Von diesen werden 4-Aminoantipyrin, N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin und N,N-Diethyl-pphenylendiamin besonders bevorzugt.

• *

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Das Ν,Ν-disubstituierte Anilin ist eine Verbindung, die durch die nachstehende Formel (1) bezeichnet wird:

(D

1 2

In der Formel (1) stehen R und R jeweils für ein Wasserstoff-Atom, eine Alkyl-Gruppe oder eine Alkoxy-Grup-

1 2
pe, und R und R können gleich oder voneinander ver-

3 4

schieden sein. R und R stehen jeweils für eine Alkyl-Gruppe, eine Alkoxyalkyl-Gruppe, eine Hydroxyalkyl-Gruppe, eine Aminoalkyl-Gruppe, eine Cyanoalkyl-Gruppe, eine Halogenoalkyl-Gruppe oder eine Acylaminoalkyl-

3 4
Gruppe, und R und R können gleich oder voneinander verschieden sein.

1 2
In dem Fall, in dem die Substituenten R und R in dem durch die Formel (1) dargestellten N,N-disubstituierten Anilin eine Alkyl-Gruppe oder Alkoxy-Gruppe bezeichnen, sind spezielle Beispiele dafür die gleichen Gruppen, die als spezielle Beispiele für Alkyl- bzw. Alkoxy-Gruppen bei den Substituenten R und R des durch die Formel (2) dargestellten Ν,Ν-disubstituierten p-Phenylendiamins angeführt wurden.

3 4
In dem Fall, in dem die Substituenten R und R eine Alkyl-Gruppe, Alkoxyalkyl-Gruppe, Hydroxyalkyl-Gruppe, Cyanoalkyl-Gruppe, Halogenoalkyl-Gruppe oder Acylaminoalkyl-Gruppe bezeichnen, sind spezielle Beispiele dafür

* It

• m · ·

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die gleichen Gruppen, die als spezielle Beispiele für Alkyl-, Alkoxyalkyl-, Hydroxyalkyl-, Cyanoalkyl, HaIogenoalkyl- bzw. Acylaminoalkyl-Gruppen bei den vorgenannten Substituenten R und R angeführt wurden. In

3 4

dem Fall, in dem R und R eine Aminoalkyl-Gruppe bezeichnen, besteht die Aminoalkyl-Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine Amino-Gruppe substituiert ist? spezielle Beispiele hierfür sind eine Aminomethyl-Gruppe, 2-Aminoethyl-Gruppe, 1-Aminoethyl-Gruppe, 3-Aminopropyl-Gruppe und 2-Aminopropy1-Gruppe.

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Als Substituenten R und R bevorzugt werden ein Wasserstoff-Atom, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, eine Alkoxy-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoff-Atomen; spezielle Beispiele für die Alkyl-Gruppen sind Methyl, Ethyl und Propyl, und spezielle Beispiele für Alkoxy-Gruppen sind Methoxy und Ethoxy.

3 4
Als Substituenten R und R bevorzugt werden eine Alky1-Gruppe, eine Alkoxyalky1-Gruppe, eine Hydroxyalkyl-Gruppe, eine Cyanoalkyl-Gruppe und eine Halogenoalkyl-Gruppe; zu den speziellen Beispielen' hierfür zählen Methyl, Ethyl, Propyl, Methoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 3-Methoxypropyl, Ethoxymethyl, 2-Ethoxyethyl, Hydroxymethyl, l-?Iydroxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, Cyanomethyl, 2-Cyanoethyl, ChIoromethyl, 1-Chloroethyl, 2-Chloroethyl, 2-Chloropropyl, 3-Chloropropyl, Bromomethyl, 2-Bromoethyl, Fluoromethyl und 2-Fluoroethyl.

Spezielle Beispiele für die durch die Formel (1) dargestellten Ν,Ν-disubstituierten Aniline sind die folgenden Verbindungen:

N,N-Dimethylanilin,
N,N-Diethylanilin,

N-Methyl-N-hydroxymethylanilin, N-Methyl-N-(2-hydroxyethyl)anilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)anilin, N-Methyl-N-(2-methoxyethyl)anilin, N-Ethyl-N-(2-methoxyethyl)anilin, N-Ethyl-N-(2-ethoxyethyl)anilin, N,N-Dimethy1-m-toluidin, Ν,Ν-Diethyl-m-toluidin, N,N-Bis(hydroxymethyl)-m-toluidin, Ν,Ν-Bis(2-hydroxyethyl)-m-toluidin, Ν,Ν-Bis(2-hydroxypropyl)-m-toluidin, Ν,Ν-Bis(3-hydroxypropyl)-m-toluidin, N-Methyl-N-hydroxymethy1-m-toluidin, N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin, N-Ethyl-N-hydroxymethyl-m-toluidin, ' N-Methyl-N-methoxymethy1-m-toluidin, N-Ethyl-N-methoxymethy1-m-toluidin, N-Ethyl-N-(2-methoxyethyl)-m-toluidin, N-Cyanomethy1-N-hydroxymethy1-m-toluidin, N-Methyl-N-(2-chloroethyl)-m-toluidin, ;

N-Ethyl-N-(2-chloroethyl)-m-toluidin, N-(2-Cyanoethyl)-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin, N,N-Dimethy1-m-anisidin, Ν,Ν-Diethyl-m-anisidin.

Von diesen Verbindungen sind bevorzugte N,N-disubstitu-

ierte Aniline die folgenden: :

- 24 -

Ν,Ν-Bis(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,

N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,

N- (2-Cyanoethyl)-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,

N,N-Dimethyl-m-anisidin,

N,N-Diethy!~m-anisidin.

Das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte anionische Polymerisat ist ein Polymerisat, das die anionische Gruppierung in dem Polymerengerüst selbst oder in Form eines Atoms bzw. einer Atom-Gruppierung enthält,

die an das Polymerengerüst gebunden ist. Neben den üblichen anionischen Polymerisaten können auch Kationenaustauschharze des Säure-Typs als anionische Polymerisate eingesetzt werden; vorzugsweise sind die üblichen anionischen Polymerisate oder Kationenaustauschharze

wasserlösliche Polymere oder solche Polymere, die mit Wasser quellbar sind. Die anionischen Polymerisate können einzeln oder in Form einer Kombination aus zweien oder mehreren verwendet werden. Es können sowohl anionische Polymerisate mit der Fähigkeit zur Filmbildung als auch solche ohne diese Fähigkeit eingesetzt werden, jedoch wird bevorzugt, Polymerisate ohne die Fähigkeit zur Filmbildung in Kombination mit als Bindemitteln wirkenden Polymerisaten einzusetzen, die die Fähigkeit zur Filmbildung besitzen.

Zu speziellen Beispielen für derartige anionischen Polymerisate zählen Polymerisate oder Copolymerisate mit einer Struktur, an der eine Carboxylat-Gruppe (-COO ), eine Sulfonat-Gruppe (-SO, ) oder eine Phosphonat-Grup-

2-pe (-P0- ) als anionische Atomgruppierung gebunden ist, oder aber die genannte anionische Atomgruppierung ist zusammen mit einem Gegen-Kation an sämtliche der

sich wiederholenden Strukturennheiten (im folgenden .-ils "CRU" bezeichnet) der hochmolekularen Kette oder einen Teil der CRU gebunden, wobei die Anordnung eine geordnete oder zufällige sein kann. Gegen-Kationen sind Al-

kalimetall-Ionen (z.B. Li , Na , K , Cs ) , Erdalkali-

2+ 2+ 2+ 2+

metall-Ionen (z.B. Mg ,Ca ,Sr ,Ba ) und Ammonium-Ionen (NH. ).

Diese anionischen Polymerisate werden durch die Formel (AP) dargestellt

Org - Q - Z~ A⁺ (AP),

in der Org eine organische Gruppe bezeichnet, die pinen -■ Teil des Polymerengerüsts bildet, Q für eine (oder mehrere) chemische Bindung(en) oder eine chemische Gruppe steht, die Z mit Org verbindet, Z eine Carboxylat-

Gruppe (-COO ) , eine Sulfonat-Gruppe (-SO-, ) oder eine

2- +

Phosphonat-Gruppe (-PO- ) bezeichnet und A ein Gegen-Kation wie oben erwähnt ist.

Zu speziellen Beispielen für die anionischen Polymerisate, die die vorgenannten CRU enthalten, zählen die
folgenden: :

Alkali-Hydrolysate eines Methylvinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymerisats (wobei das Copolymere ü;nt Dilithium-, Dinatrium oder Dikalium-ethylen-1,2-dicarboxylat als CRU enthält);

Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz einer Polyacrylsäure;

Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz eines PoIy-N-(ß-sulfo-<So(-dimethylethyl) acrylamids;

Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz einer PoIystyrol-p-sulfonsäure;

Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz eines Copolymerisate aus Styrol-p-sulfonsäure und einem hydrophilen Vinyl-Monomeren; Beispiele für solche hydrophilen Vinyl-Monomeren sind:

Acrylsäure, Acrylsäure-alkylester (z.B. Methacrylat), Acrylsäure-hydroxyalkylester (z.B.

ß-Hydroxyethylacrylat), Acrylamide (z.B. Acrylamid, N-Methylacrylamid, N-Isopropylacrylamid, N- (ß-Sulfonato-oi,o(.-dimethylethyl) acrylamid,
N-Ethyl-N-isopropyl-acrylamid, Acrylmorpholid
( H₂C=CH-CO-N j \ 0 ), N-Acryloylpiperidin,

N-Acryloylpiperadin, N-Acryloylpiperazin), Methacrylsäure-hydroxyalkylester (z.B. ß-Hydroxyethyl-methacrylat), Methacrylamide (z.B. Methacrylamid, Methacrylmorpholid);

Alkalimetallsalze einer Polyvinylphosphonsäure der Formel

C RU-CH-CH₂-

OsP-θθ

* JM®

in der M Lithium, Natrium oder Kalium ist;

Carboxymethylcellulose;
Carboxyethylcellulose;

Alginsäure und ihre Alkalisalze.

Typische Beispiele für bevorzugte anionische Polymerisate sind die folgenden:

Kalium-Polystyrol-p-sulfonat;

Kalium-Styrol-p-sulfonat-Acrylmorpholid-Copolymerisat;

Kalium-Styrol-p-sulfonat-Acrylamid-Copolymeri-

sat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-N-Isopropylacrylamid-

Copolymerisat
Kalium-Styrol-p-sulfonat-N-Ethyl-N-isopropyl-

acrylamid-Copolymerisat;

Kalium-Poly-N- (ß-sulfonato-oi,o(-dimethyl) acrylamid,
Kalium-N- (ß-Sulfonato-o^oc-dimethyl) acrylamid-ß-Hy-

droxyethylacrylat-Copolymerisat;

Kalium-N-(ß-Sulfonato-o(,o(-dimethyl) acrylamid-N-Ethylacrylamid-Copolymerisat.

Von diesen anionischen Polymerisaten werden anionische

Polymere des Polystyrol-Typs (bei denen in der Formel ;

. (AP) Q eine Phenylen-Gruppe darstellt) besonders bevor- f

zugt. ^:

Das anionische Polymerisat kann in eine Schicht, die den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthält, eingearbeitet werden, oder eine Farbstoff-Fixierschicht, die das anionische Polymerisat - jedoch

keinen anderen Reagens-Bestandteil - enthält, kann auch in Form einer getrennten Schicht von derjenigen Schicht, die den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthält, eingesetzt werden. Weiterhin kann das anionische Polymerisat auch sowohl in eine den

Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthaltende Schicht als auch in die Farbstoff-Fixierschicht

- 28 -

eingearbeitet werden. Das anionische Polymerisat kann auch, falls erwünscht oder erforderlich, als eine Kombination zweier oder mehrerer Schichten eingesetzt werden, obwohl nur eine solche im allgemeinen ausreichend ist.

In dem Falle, in dem das anionische Polymerisat sowohl in die den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthaltende Schicht als auch in die Farbstoff-Fixierschicht eingearbeitet ist, können die betreffenden anionischen Polymerisate gleich oder voneinander verschieden sein. Weiterhin kann das anionische Polymerisat auch in eine andere Schicht als eine den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthaltende Schicht oder eine Farbstoff-Fixierschicht eingearbeitet werden.

Zur quantitativen Bestimmung der Transaminase-Aktivität sind verschiedene Substrate für Transaminase (im folgenden als "TA-Substrate" bezeichnet) oder Zusammensetzungen, die TA-Substrat enthalten (im folgenden als "TA-Substrat-Zusammensetzung" bezeichnet) in den Analysenfilmen der vorliegenden Erfindung enthalten. In dem Fall, in dem die Transaminase Glutamyl-Pyruvat-Transaminase (GPT) ist, wird das TA-Substrat in Form einer Kombination aus Alanin und oO-Ketoglutarsäure, und in dem Fall, in dem die Transaminase Glutamyl-Oxaloacetat-Transaminase (GOT) ist, in Form einer Kombination aus Asparaginsäure und oi-Ketoglutarsäure eingesetzt; in dem Fall, in dem die GOT-Aktivität quantitativ untersucht werden soll, wird außerdem zusätzlich Oxaloacetat-Decarboxylase eingesetzt, durch die GOT auf ihr Substrat als ein Katalysator wirkt, und die entstandene Oxalessigsäure (oder ein Salz derselben) wird dann unter RiI-

dung von Brenztraubensäure (oder eines Salzes dersel- : ben) decarboxyliert. Das TA-Substrat oder die ΤΛ-Substrat-Zusammensetzung (im folgenden gemeinsam unter der letzteren Bezeichnung zusammengefaßt) kann in die gleiehe Schicht, die auch die POP-Zusammensetzung enthält, oder in eine getrennte Schicht eingearbeitet werden. Wenn TA-Substrat-Zusammensetzung und POP-Zusammensetzung in die gleiche Schicht eingearbeitet sind, können beide Zusammensetzungen einfach miteinander vermischt
werden, oder beide Zusammensetzungen können in die gleiche Schicht eingebracht werden, nachdem sie einzeln für sich pulverisiert wurden.

In dieser Darlegung wird der Begriff "Reagensschicht" so verwendet, daß er sowohl eine einzelne Schicht, die

die vier Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und anionisches Polymerisat enthält, bezeichnet, als auch als Sammelbegriff für eine Vielzahl von Schichten gebraucht wird, die irgendeine der vorgenann- ;^:

ten Zusammensetzungen enthalten und weiterhin eine j (oder mehrere) strukturunterstützende Schicht (en) ;' und/oder eine (oder mehrere) die analytische Funktion i unterstützende(n) Schicht(en) einschließen können, die \ gegebenenfalls nach Bedarf vorgesehen werden. Im allge- _: ^:

meinen bezeichnet der Ausdruck "Schicht" in dieser Beschreibung, daß in dieser Schicht eine Zusammensetzung oder Verbindung enthalten ist; das heißt, daß eine die TA-Substrat-Zusammensetzung enthaltende Schicht als eine TA-Substrat-Schicht, eine die POP-Zusammensetzung

enthaltende Schicht als eine POP-Schicht, eine den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende ■ Schicht als Farbbildungsreaktions-Schicht, eine eine anionische Polymerisat-Schicht enthaltende Schicht als -

- 30 -

Farbstoff-Fixierschicht, eine die drei Bestandteile POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und ein anionisches Polymerisat enthaltende Schicht als POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht, eine die POP-Zusammensetzung und den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende Schicht als POP-Farbbildungsreaktions-Schicht, eine den Hydrogenperoxid-Farbindikator und ein anionisches Polymerisat enthaltende Schicht als Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht, eine die drei Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung und Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende Schicht als TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-Schicht bezeichnet wird, und dergleichen.

Bei den Analysenfilmen der vorliegenden Erfindung kann eine, ,einzelne Schicht verwendet werden, die die vier Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids und anionisches Polymerisat enthält, aber es können auch mindestens vier Schichten zur Anwendung gelangen, die sich aus einer TA-Substrat-Schicht, die die TA-Substrat-Zusammensetzung enthält, einer POP-Schicht, die die POP-Zusammensetzung enthält, einer Farbbildungsreaktions-Schicht, die den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthält, und einer Farbstoff-Fixierschicht, die das anionische Polymerisat enthält, zusammensetzen. Weiterhin können zwei Schichten, die sich aus einer TA-Substrat-Schicht und einer POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht, die die drei 0 Bestandteile POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und anionisches Polymerisat enthält, zum Einsatz gelangen. Die Zahl der Reagensschichten als solche (von einer einzigen Schicht bis zu

vier oder mehr Schichten) und ihre Anordnung können in geeigneter Weise je nach den Arten der zu analysierenden Transaminasen, der in dem Analysenfilm enthaltenen Stoffe und der von dem Analysenfilm verlangten Leistungsfähigkeit oder Genauigkeit gewählt werden.

Sofern eine in dem Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung enthaltene Kombination aus dem Wasserstoff-Donator und dem Kuppler zur Bildung eines kationischen Farbstoffs befähigt ist, wird ein kationischer Farbstoff gebildet, der durch die Formel (CD)

(CD)

1 4

dargestellt wird, in der R bis R die gleichen Bedeutungen wie in Formel (1) haben, X für ein Anion steht und OHD die oxydierte W&sserstoff-Donator-Struktureinheit bezeichnet, wenn eine flüssige Probe auf den Analysenfilm getropft wird, und dieser kationische Farbstoff wird dann durch das anionische Polymerisat fixiert, das weiterhin in dem Analysenfilm enthalten ist.

Bei dem Analysenfilm gemäß der vorliegenden Efindung
wird bevorzugt ein Bindemittel-Polymerisat in eine (oder mehrere) Schicht(en) eingearbeitet, die frei von anionischen Polymeren ist(sind). Jedoch kann ein als Bindemittel dienendes Polymerisat auch in eine (oder mehrere) anionische Polymere enthaltende Schicht(en)
eingearbeitet werden. Als Bindemittel-Polymerisate

können bekannte hydrophile Polymerisate eingesetzt werden. Spezielle Beispiele für hydrophile Polymerisate sind Gelatine, Casein, Agarose, Stärke, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, Polyethylenglycol etc.. übliche Härter (Härtungsmittel oder Vernetzungsmittel) können ebenfalls zusammen mit hydrophilen Polymeren verwendet werden. Jede der vorbeschriebenen Schichten kann dadurch hergestellt werden, daß eine die entsprechende Zusammensetzung oder Komponente(n) enthaltende Lösung oder Dispersion mittels bekannter Beschichtungstechniken auf einen Träger aufgetragen und die Beschichtung anschließend getrocknet wird. Weiter kann auch die Oberfläche oder das Innere eines porösen Trägers mit einer die entsprechende Zusammensetzung oder Komponente(n) enthaltenden Lösung oder Dispersion getränkt oder imprägniert werden, wodurch ein ähnlicher Effekt erzielt wird. In diesem Falle können als Bindemittel dienende Polymerisate oft fortgelassen werden. Wenn die Schichten mit Hilfe von Beschichtungstechniken auf einen Träger aufgebracht werden, liegt die Dicke einer Reagensschicht im allgemeinen zwischen 3 um und 100 μπι, vorzugsweise zwischen 5 \xm und 50 pm, wenn es sich um eine Einzelschicht handelt; im Falle einer Kombination von zwei oder mehr Schichten liegt die Dicke jeder Schicht im allgemeinen zwischen 1 um und 50 μπι, vorzugsweise zwischen 2 um und 30 μπι.

Der Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung kann, je nach der vorgesehenen Verwendung, der für die quantitative Untersuchung geforderten Genauigkeit etc. verschiedenartige Schichtstrukturen aufweisen. Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert, die bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.

Fig. 1 zeigt einen Analysenfilm, der aus einem mit dem Reagens imprägnierten Träger 25 besteht, der durch Imprägnieren der Oberfläche und des Inneren eines selbsttragenden porösen Trägers mit sämtlichen der Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und einem anionischen Polymerisat erhalten wurde.

Als selbsttragende poröse Träger können bekannte film-, folien- oder blattartige Träger wie Filterpapier, ge-

wohnliches Papier, Vliestuch, Membranfilter, poröse Kunststoffolie etc. eingesetzt werden. Wenn der Film für die quantitative Analyse mit einem Diapositiv-Rahmen eingefaßt werden soll, wie dies in den JP-OSen 156079/79 und 160296/79, der JP-GBM-Anmeldung 41787/80

und der JP-Patentanmeldung 131800 etc. offenbart wurde, können neben den oben genannten Materialien auch biegsame Materialien wie Textilstoffe als poröse Träger " verwendet werden. Ein derartiger Film für die quantita- _: tive Analyse kann in der Weise verwendet werden, daß er an einem film-, folien- oder blattartigen Tröger haftend befestigt wird, Und die Schichtstruktur ist in diesem Falle ähnlich derjenigen eines in Fig. 2 dargestellten Films für die quantitative Analyse, wie er im Folgenden beschrieben wird.

Fig. 2 zeigt einen Film für die quantitative Analyse mit einer solchen Struktur, bei der die Reagensschicht 20, die die vier Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und anionisches Polymerisat enthält,

auf einem film-, folien- oder blattartigen Träger 10 vorliegt. Der Träger 10 kann entweder durchsieht:iy oder lichtundurchlässig sein.

Fig. 3 zeigt einen Film für die quantitative Analyse mit einer solchen Struktur, bei der die POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht 21, die die drei Bestandteile POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und anionisches Polymerisat enthält, und die TA-Substrat-Schicht 23, die die TA-Substrat-Zusammensetzurig enthält, in dieser Reihenfolge auf einen film-, folien- oder blattartigen Träger aufgebracht vorliegen. Der Träger kann entweder durchsichtig oder lichtundurchlässig sein, ist jedoch vorzugsweise ein durchsichtiger Träger.

Bei den Filmen für die quantitative Analyse, wie sie in den Fig. 4 bis 8 dargestellt sind, werden eine Reagensschicht, eine TA-Substrat-Schicht, eine Farbbildungsreaktions-Schicht, eine Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht oder eine Farbstoff-Fixierschicht zwischen einem Träger und einer porösen Schicht aufgebracht, und die poröse Schicht wird in "fließfähige Berührung" (die Definition dieses Begriffs wird in der im Vorstehenden erwähnten JP-OS 40191/76 gegeben) mit der Reagensschicht, der TA-Substrat-Schicht, der Farbbildungsreaktions-Schicht, der Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht oder der Farbstoff-Fixierschicht gebracht; vorzugsweise besitzt der Analysenfilm ine solche Struktur, daß diese Schichten in Form einer Einheit aneinander haften.

Die poröse Schicht wird in Form einer porösen Spreitungsschicht (porous spreading layer) oder einer porösen Schicht konstanter Fläche (constant area porous layer) eingesetzt, die die nachstehende Funktion besitzen: Wenn eine flüssige Probe aufgetüpfelt wird, wird diese Flüssigkeitsprobe einer darunter liegenden Schicht zugeführt, und die Funktion besteht vorzugswei-

se darin, daß die Menge der Flüssigkeitsprobe pro Flächeneinheit annähernd konstant gehalten wird (im Falle der porösen Spreitungsschicht) , oder daß sie bis auf die gleiche Größe ihrer Form ausgebreitet wird und dadurch die Menge der Flüssigkeitsprobe pro Flächeneinheit annähernd konstant gehalten wird (im Falle der porösen Schicht mit konstanter Fläche), wobei in beiden Fällen die Flüssigkeitsprobe einer darunter liegenden Schicht zugeführt wird.

Eine andere Ausführungsform kann darin bestehen, daß das Innere einer porösen Schicht (einer porösen Spreitungsschicht oder einer porösen Schicht bestimmter Flächengröße) mit der TA-Substrat-Zusammensetzung imprägniert wird, ohne daß eine TA-Substrat-Schicht in Form

einer unabhängigen, separaten Schicht aufgebracht wird. Die poröse Schicht hat eine definierte Flächengröße, die so festgelegt wird, daß ihr eine Flüssigkeitsprobe in einer Menge zugeführt werden kann, die größer ist ■. als die Menge des Wassers, das in der porösen Schicht

gehalten werden kann; sie wird oft als "poröse Schicht definierter Flächengröße" bezeichnet.

Fig. 4 zeigt einen Analysenfilm mit einer Schichtstruktur, der aus einem film-, folien- oder bleittartigen Träger 10 besteht, auf den, in dieser Reihenfolge, die
die vier Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und ein anionisches Polymerisat enthaltende Reagensschicht 20 und die poröse Spreitungsschicht 31 aufgebracht sind.

Fig. 5 zeigt einen Analysenfilm mit einer Schichtstruktur, der aus einem film-, folien- oder blattartigcn

• ·

- 36 -

Träger 10 besteht, auf den, in dieser Reihenfolge, die POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht 21, die die drei Bestandteile POP-Zusammensetzung, Farbindikator und ein anionisches Polymerisat enthält, die die TA-Zusammensetzung enthaltende TA-Substrat-Schicht 23, eine licht-reflektierende oder licht-blockierende Schicht 40 und die poröse Spreitungsschicht 31 aufgebracht sind.

Als poröse Spreitungsschicht des in Fig. 4 oder Fig. 5 dargestellten Films für die quantitative Analyse können verschiedenartig aufgebaute poröse Schichten Verwendung finden, so eine poröse Schicht, in der in einem als Bindemittel wirkenden Polymerisat feinteilige poröse Pulver wie allgemein sogenannte "Trübpolymerisate" (blush polymers, Membranfilter), Diatomeenerde, mikrokristalline Stoffe (z.B. mikrokristalline Cellulose wie "Avicel", Handelsbezeichnung der FMC Corporation) dispergiert sind, poröse Aggregate, die dadurch gebildet werden, daß man kleine kugelförmige Perlen aus Glas oder Polymeren dazu bringt, in Punkt-zu-Punkt-Berührung aneinander zu haften, eine nicht-faserförmige isotrope poröse Schicht wie eine aggregierte dreidimensionale Teilchen-Gitterstruktur, die dadurch gebildet wird, daß man kleine kugelförmige Teilchen aus in Wasser nichtquellbaren organischen Polymerisaten unter Verwendung eines wasserunlöslichen Klebstoffs dazu bringt, in Punkt-zu-Punkt-Berührung aneinander zu haften etc., wie sie in der JP-OS 90589/80 offenbart wurde, eine faserförmige anisotrope Schicht aus hydrophil gemachten Textilstoffen, wie sie in der JP-OS 164356/80 offenbart wurde, Textilstoffe, die auf physikalischem Wege hydrophil gemacht wurden (z.B. durch Glimmentladung, Plasma-Behandlung, Corona-Entladung, Ultraviolett-Bestrahlung,

Flainmenbehandlung etc., wie sie in der JP-OS 140532/80 offenbart wurden, Filterpapier etc..

Das Aufbringen einer nicht-faserförmigen isotropen porösen Schicht als poröse Spreitungsschicht auf die Reagensschicht 20 oder die lichtreflektierende Schicht 40 kann mittels einer Arbeitsweise erfolgen, wie sie in den oben erwähnten JP-OSen 53888/74 und 90589/80 etc. beschrieben wurde, und das Aufbringen der faserförmigen anisotropen porösen Spreitungsschicht auf die Reagensschicht 20 oder die lichtreflektierende Schicht 40 kann mittels einer Arbeitsweise erfolgen, wie sie in der oben erwähnten JP-OS 164356/80 und der genannten JP-Patentanmeldung 140532/80 beschrieben wurde.

Die poröse Schicht mit konstanter Fläche kann unter

Verwendung von Materialien (z.B. Textilstoffen, Papier, Membranfiltern) und mittels der Arbeitsweise hergestellt werden, die für die poröse Schicht in der JP-GBM-Anmeldung 120299/80 offenbart wurden. Als Materialien für die poröse Schicht mit konstanter Fläche kön-

nen die gleichen Materialien wie für die poröse Spreitungsschicht verwendet werden, und darüber hinaus kann jedes Material verwendet werden, dessen Inneres porös ist und eine Flüssigkeit wie etwa Wasser zurückhalten kann und dessen Poren sich durchgehend von der einen

Hauptoberfläche zu der anderen Hauptoberfläche hin erstrecken. Das Aufbringen der porösen Schicht mit konstanter Fläche auf eine Reagensschicht, eine lichtrcflektierende Schicht oder dergleichen kann mittels des Verfahrens erfolgen, das in der JP-GBM-Anmeldung

120299/80 offenbart wurde, oder mittels des oben beschriebenen Verfahrens zum Aufbringen der porösen Spreitungsschicht.

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Als licht-reflektierende (oder licht-blockierende) Schicht 40 können verschiedene Schichten eingesetzt werden, so etwa eine Schicht, in der in einem hydrophilen Bindemittel ein oder mehrere weiße Pigmente wie
feinteiliges Titandioxid-Pulver, feinteiliges Bariumsulfat-Pulver oder dergleichen dispergiert sind, wie sie in den JP-OSen 53888/74, 40191/76, 164356/80 etc. offenbart wurde, eine Trübpolymerisat-Schicht (Membranfilter) , in der ein oder mehrere weiße Pigmente wie

feinteiliges Titandioxid, feinteiliges Bariumsulfat oder dergleichen dispergiert sind, wie sie in der JP-OS 53888/74 etc. offenbart wurde, eine Trübpolymerisat-Schicht, wie sie in der JP-OS 53888/74 etc. offenbart wurde, eine wasserdurchlässige, aus einer porösen Me-

tallschicht bestehende Schicht, wie sie in der JP-OS 26428/80 offenbart wurde, oder eine wasserdurchlässige, ein oder mehrere Metallpulver enthaltende Schicht, wie sie in der JP-OS 26429/80 etc. offenbart wurde; die Arbeitsweisen zur Herstellung dieser Schichten können

den Verfahren entsprechen, die in den vorgenannten Veröffentlichungen beschrieben wurden.

Fig. 6 zeigt einen Analysenfilm mit einer Schichtstruktur, die auf einem Träger 10, in dieser Reihenfolge, die TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-Schicht 22,

die die drei Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung und Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthält, die ein anionisches Polymerisat enLha.11 ende Farbetof f-Fixierschicht 24, die lichtrefloktierende Schicht 40 und die poröse Spreitungs-

schicht 31 umfaßt. Sofern in dem Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids nicht eine solche kationische Verbindung enthalten ist, die die kolorimetri-

— 39 —

sehe Analyse durch Lichtabsorption in dem Wellenlängen-

bereich stört, in dem der entstehende kationische Farbstoff absorbiert, kann die relative Lage der Schicht, die die TA-Substrat-Zusammensetzung, die POP-Zusammensetzung und den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthält, zu der Farbstoff-Fixierschicht frei gewählt werden. Dementsprechend ist die in Fig. 6 dargestellte Schichtstruktur insbesondere in dem Falle von Vorteil, in dem die Schicht, die die TA-Substrat-Zusammensetzung, die POP-Zusammensetzung und den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthält, als eine untere Schicht vorliegen soll, damit sie nicht mit der Luft in Berührung gelangt, etwa weil der Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis einen (oder mehrere) Be-

standteil(e) enthält, die durch Luft oxydiert werden können.

Fig. 7 zeigt einen Analysenfilm mit einer Schichtstruktur, die auf einem Träger 10, in dieser Reihenfolge, die ein anionisches Polymerisat enthaltende Farbstoff-

Fixierschicht 24, die TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-Schicht 22, die die drei Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung und Farbindikator .zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthält, sowie weiterhin, in dichter Berührung mit dieser, eine poröse Schicht 32 mit definierter Flächengröße umfaßt; letztere Schicht ist so bemessen, daß sie der darunter liegenden Schicht eine Flüssigkeitsprobe in einer Menge zuführen kann, die größer ist als die Wassermenge, die in der porösen Schicht zurückgehalten werden kann. In

einzelnen wird die Fläche der porösen Schicht so festgelegt, daß die Menge einer in der porösen Schicht gehaltenen Flüssigkeitsprobe durch die betreffende Fläche definiert wird, und die auf diese Weise festgelegte

- 40 -

Menge der Flüssigkeitsprobe wird, in der gleichen Menge und auf der gleichen Fläche, auf die darunter befindliche Schicht (gewöhnlich eine Reagensschicht) übertragen, da eine mögliche Ausdehnung der porösen Schicht infolge des Gehalts der Flüssigkeitsprobe in Richtung ihrer Breite, im Vergleich zu ihrer Dicke, vernachlässigbar ist.

Es genügt, wenn die poröse Schicht Leerräume besitzt, um den Transport der Flüssigkeitsprobe zu ermöglichen, jedoch wird im allgemeinen bevorzugt, daß das Leerraum-Volumen der porösen Schicht in einem Bereich von etwa 30 % bis etwa 85 % liegt. Das Leerraum-Volumen kann mittels einer von Chalkley, Journal of the National Cancer Institute £, S. 47 (1943) , beschriebenen Arbeitsweise berechnet werden und durch direkte Wägung und Bestimmung des Verhältnisses des tatsächlichen Gewichts der betreffenden Struktur und des Gewichts eines gleichen Volumens des kompakten festen Stoffes.

Der eine poröse Schicht definierter Flächengröße aufweisende Analysenfilm ist besonders geeignet für die quantitative Analyse der Transaminase-Aktivität in einer wäßrigen Lösung, die Transaminase nur in kleinerer Menge enthält. Eine licht-reflektierende Schicht (oder eine licht-blockierende Schicht) kann zwischen der TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-Schicht und der porösen Schicht mit definierter Flächengröße eingefügt werden. Weiterhin kann die relative Lage der TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-Schicht zu der Farbstoff-Fixierschicht umgekehrt werden, wie in dem Fall des in Fig. 6 dargestellten Analysenfilms. An Stelle dor TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktionsschicht 22

kann eine POP-Farbbildungsreaktions-Schj cht, dir- die POP-Zusammensetzung und den Farbindikator zum Nachweis von Hydrogenperoxid enthält, eingesetzt werden.

Fig. 8 zeigt einen Analysenfilm mit einer Schichtstruktür, die auf einem Träger 10, in dieser Reihenfolge, die POP-Farbbildungsreaktion-s-Farbstof f -Fixier schicht 21, die die drei Bestandteile POP-Zusammensetzving, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und anionisches Polymerisat enthält, die licht-reflektierende

(oder licht-blockierende) Schicht 40 und die poröse Schicht 32 definierter Flächengröße umfaßt. Es ist, im Falle eines Analysenfilms zur Bestimmung von GOT, auch möglich, das TA-Substrat in die poröse Schicht definierter Flächengröße und die Oxaloacetat-Decarboxylase

in die POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht einzuarbeiten. In den Fig. 7 und 8 ist die poröse Schicht definierter Flächengröße so dargestellt, daß sie kleiner ist als die übrigen Schichten. Es ist jedoch ausreichend, wenn die Schicht definierter Flä-

chengröße nach Form und Größe so beschaffen ist, daß sie nicht breiter als die Dimensionen einer der Reagensschichten ist; dementsprechend kann sie ohne Schwierigkeiten die gleiche Form und Größe wie jede der Reagensschichten besitzen.

Als Träger für die in den Fig. 2 bis 8 dargestellten Filme für die quantitative Analyse können Filme oder Folien aus einer Vielzahl von Polymerisaten verwendet werden, wie etwa Polyethylenterephthalat, Celluloseester (Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat,

Celluloseacetat-propionat etc.), Polycarbonate (Poly-

carbonate des Bisphenols A etc.), Polymethylmethacrylat, Polystyrol etc.; die Dicke dieser Folien beträgt etwa 25 μΐη bis 0,3 mm, vorzugsweise etwa 50 μπι bis etwa 0,2 mm.

Träger, die farblos und durchsichtig sind oder für Licht der betreffenden Wellenlängen durchlässig sind, bei denen der aus dem Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis gebildete kationische Farbstoff absorbiert, können verwendet werden. Außerdem können auch Träger verwendet werden, die durch Einarbeiten von Pigmenten (z.B. feinteiliges Titandioxid-Pulver, feinteiliges Bariumsulfat-Pulver, feinteiliges Zinkoxid-Pulver, Ruß etc.) licht-blockierend gemacht worden sind. Wenn licht-blockierende Träger verwendet werden, kann die kolorimetrische Messung durchgeführt werden, nachdem der Träger im Anschluß an die kolorimetrische Bestimmung des von der trägerfreien Seite reflektierten Lichts abgetreift und entfernt wurde. Die Verwendung eines licht-blockierenden Trägers ist von Vorteil in denjenigen Fällen, in denen Reagensbestandteile, die der Gefahr unterliegen, durch Licht zersetzt zu werden, in eine Reagensschicht, eine Farbbildungsreaktions-Schicht oder eine Farbstoff-Fixierschicht eingearbeitet sind.

Zu bevorzugten Ausführungsformen des Analysenfilms gemäß der vorliegenden Erfindung zählen eine Schichtstruktur aus zwei Reagensschichten, die aus einer TA-Substrat-Schicht und einer POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht bestehen, und eine Schichtstruktur aus drei Reagensschichten, die aus einer TA-Substrat-Schicht, einer POP-Farbbildungsreaktions-

Schicht und einer Farbstoff-Fixierschicht bestehen. Bei der letzteren ist vorzugsweise das anionische Polymerisat nur in der Farbstoff-Fixierschicht oder aber sowohl in der POP-Farbbildungsreaktions-Schicht als auch in
der Farbstoff-Fixierschicht enthalten.

In den Fällen, in denen der Film für die quantitative Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung, einsch.1 ioßlich der in den Fig. 2 bis 8 dargestellten Aus f. Uhrungsformen, aus einer mehrschichtigen Verbundstoff-

Struktur besteht, können zur Herstellung derselben die Verfahren eingesetzt werden, die in den vorerwähnten JP-OSen 53888/74, 40191/76, 90859/80 und 164356/80, der JP-Patentanmeldung 140352/80, den JP-OSen 26428/80 und 26429/80, der JP-GBM-Anmeldung 120299/80 etc. beschrieben wurden. Andernfalls kann der Film für die quantitative Analyse auch mit Hilfe der verschiedenen Beschichtungsverfahren hergestellt werden, die zur Herstellung gebräuchlicher lichtempfindlicher Materialien für die Farbphotographie oder lichtempfindlicher Materialien

für die Schwarzweiß- oder Color-Sofortbildphotographio eingeführt sind,.wobei diese Verfahren als solche oder mit geringfügigen Abänderungen eingesetzt werden.

Im Anschluß an die vorstehende allgemeine Beschreibung wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden
Beispiele weiter erläutert.

- 44 Beispiel 1

Ein farbloser transparenter Film aus Polyethylenterephthalat (PET) als photographischer Träger wurde mit einer wäßrigen Lösung, die eine isoelektrische Menge Gelatine und Kalium-polystyrol-4-sulfonat enthielt, beschichtet, so daß die Dicke der trockenen Schicht 5 um betrug. Nach dem Trocknen wurde eine Farbstoff-Fixierschicht darauf aufgebracht.

Eine die POP-Zusammensetzung und den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende Eeschichtungs-Lösung der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:

Zusammensetzung der Beschichtungslösung für die POP-Farbbildungsreaktions-Schicht:

Ν,Ν-Bis(ß-hydroxyethyl)-m-toluidin 15 4-Aminoantipyrin

Gelatine

Peroxidase

Brenztraubensäure-Oxidase

FAD ;■ ■ . 7,5

20 . Thiaminpyrophosphat (TDP) Mangan(II)chlorid Na₃HPO₄ . 12 H₂O NaH₂PO₄ . 2 H₂O

Wasser
25 Oberflächenaktives Mittel 10G^R Bis(vinylsulfonylmethyl)ether,

1 gew.-proz. wäßrige Lösung 500 mg

Die Besohichtungslösung für die POP-Farbbildungsreaktionr.-Schicht wurde auf die Farbstoff-Fixierschicht aufgetragen, so daß die Dicke der trockenen Schicht 15 um betrug, und getrocknet.

5	,6	mg
8	,0	mg
500		mg
300		Einheiten
80		Einheiten
χ 10	-3	mg
3		mg
2	,9	mg
109		mg
30		mg
3000		mg
4		mg

Eine eine GPT-Substrat-Zusammensetzung enthaltende Lösung der nachstehenden Formulierung wurde hergestellt:

Zusammensetzung der Lösung für die GPT-Substrat-

Schicht:	150	mg
ot-Ketoglutar säure	3	g
L-Alanin	2	,18 g
Na3HPO4 . 12 H2O	0	,60 g
NaH3PO4 . 2 H2O
Polyacrylamid,	5	g
5 gew.-proz. wäßrige Lösung	45	g
Wasser

gp g

Wasser
Oberflächenaktives Mittel 10G^R,

50 gew.-proz. wäßrige Lösung 200 mg

Ein Filterpapier mit glatter Oberfläche (Dicke 200 μπι,'
Gewicht 3.3 g/m²) für die Elektrophorese wurde mit der Lösung für die GPT-Substrat-Schicht imprägniert. Danach wurde die überschüssige Lösung dadurch abgequetscht, daß das Filterpapier zwischen Walzen aus Silikongummi mit einem Walzenabstand von 300 μπι hindurchgeschickt
wurde. Das Filterpapier wurde auf die Oberfläche einer ebenen Glasplatte gelegt und trocknen gelassen. Die GPT-Substrat-Zusammensetzung, mit der das Filterpapier getränkt worden war, war gleichmäßig in demselben verteilt.

Das mit der GPT-Substrat-Zusammensetzung imprägnierte Filterpapier wurde auf die POP-Farbbildungsreaktions-Schicht, die zuvor mit einer 50-fach verdünnten wäßrigen Lösung des oberflächenaktiven Mittels 1OG befeuchtet worden war, gelegt und leicht angedrückt, um da-

0 durch das Filterpapier als die TA-Substrat-Zusammenset-

zung enthaltende poröse Schicht zu befestigen. Auf diese Weise wurde ein Analysenfilm für die analytische Bestimmung von GPT erhalten.

Dieser Analysenfilm wurde in kreisförmige Testblättchen mit einem Durchmesser von 9 mm zerschnitten, und zur Durchführung der Analysen wurden auf die poröse Schicht (Filterpapier) wäßrige Lösungen verschiedener Konzentrationen des GPT-Enzyms aufgetropft.

Die analytische Bestimmung wurde folgendermaßen durchgeführt: 20 μΐ einer Kochsalzlösung, die GPT im Mengenverhältnis 46 IU/1 enthielt, wurden auf den Analysenfilm aufgetropft. Der Analysenfilm wurde in einen verschließbaren Diapositivrahmen mit Kunststoffenstern hineingebracht, um eine Verdunstung der Feuchtigkeit zu verhindern, und bei 37°C inkubiert. Die Farbdichte änderte sich im Laufe der Zeit und wurde mittels eines Reflexions-Densitometers gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angeführt.

	Tabelle 1	Optische Dichte
Inkubationszeit	(min)	0,35 0,49 0,61 0,74
5 10 15 20

Weiterhin wurden jeweils 20 μΐ einer Kochsalzlösung mit verschiedenen GPT-Aktivitäten auf den Analysenfilm aufgetropft, und der Analysenfilm wurde 10 min bei 37⁰C

inkubiert. Nach weiteren 10 min wurde die reflektierte optische Dichte gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2
GPT-Aktivität (Iü/1) Optische Dichte (Reflexion)

20 0,33

46 0,49

72 0,68

100 0,82

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu entnehmen, daß zwischen der GPT-Aktivität und der mittels Reflexion gemessenen optischen Dichte eine annähernd lineare Beziehung besteht. Es ist somit klar, daß die GPT-Äktivität unter Verwendung dieses Analysenfilms mittels der

kolorimetrischen Methode der Messung des reflektierten

Lichtes quantitativ bestimmt werden kann. ;:

Beispiel 2

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurden ein Filterpapier, ein Glasfaser-Filterpapier, ein Baumwolltuch,

ein Tuch aus einer PET-Baumwolle-Mischung, ein Membranfilter etc. mit der Lösung der GPT-Substrat-Zusammensetzung getränkt und jeweils auf die POP-Farbbildungsreaktionsschicht des Analysenfilms, der aus der Farbstoff-Fixierschicht und der POP-Farbbildungsreaktions-Schicht bestand und gemäß Beispiel 1 hergestellt worden war, gelegt und mit der Schicht in Haftverbindung gebracht. Auf diese Weise wurden mehrschichtige Analysenfilme zur Analyse der GPT-Aktivität erhalten.

Auf jedem der Analysenfilme bildete sich die Färbung in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1. Es wurden optische Reflexionsdichten gemessen, die mit den GPT-Aktivitäten korrelierten.

Beispiel 3

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurde ein aus der Farbstoff-Fixierschicht und der POP-Farbbildungsreaktions-Schicht zusammengesetzter Analysenfilm hergestellt. Eine wäßrige Dispersion von feinteiligem Titandioxid-Pulver in Gelatine wurde auf die POP-Farbbildungsreaktions-Schicht als licht-blockierende Schicht mit einer Dicke der trockenen Schicht von 5 μΐη aufgetragen und anschließend getrocknet.

Zusammensetzung der wäßrigen Dispersion für die licht-blockierende Schicht:

feinteiliges TiO^-Pulver 19,5 g

Gelatine ;.·■ 6,8 g

Oberflächenaktives Mittel 10G^R 0,9 g

Wasser „ 87 g

Danach wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1' ein Analysenfilm zur quantitativen Bestimmung der GPT-Aktivität hergestellt. Kochsalzlösungen, die GPT in verschiedenen Konzentrationen enthielten, wurden wie in Beispiel 1 auf die Analysenfilme aufgetropft, damit sich die Färbung bildete. Die Fabbildung konnte auf dem weißen Hintergrund beobachtet werden. Die Messungen der optischen Reflexionsdichte lieferten fast die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1.

- 49 Beispiel 4

Zu einer Beschichtungslösung für die POP-Farbbildungsreaktions-Schicht mit der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 wurden 400 μΐ einer 5-proz. wäßrigen Lösung eines anionischen Polymerisats vom pH 6,5 bis 7,0, das durch Hydrolyse eines Methylvinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymerisats (Gantrez AN 169 **-■', hergestellt von der GAF Corporation) zusammen mit einer äquimolaren Menge Kaliumhydroxid hinzugefügt.

Danach wurde mit der Beschichtungslösung

(A) ein photographischer Träger, der aus einem

farblosen transparenten PET-FiIm bestand, dessen Oberflächenhaftung verbessert worden war, beschichtet;

(B) die Farbstoff-Fixierschicht wie in Beispiel 1
beschichtet; und

(C) ·, zu Vergleichszwecken wurde eine Beschichtungslösung für die POP-Farbbildungsreaktions-Schicht der gleichen Zusammensetzung wie in

Beispiel 1 auf den gleichen photographischen

Träger wie bei (A) aufgebracht.

Weiterhin wurde eine licht-blockierende Schicht in gleicher Weise wie in Beispiel 3 auf die mehrschichtigen Analysenfilme (A), (B) und (C) aufgebracht, und
anschließend wurden diese getrocknet, wodurch einsetzbare Analysenfilme (A), (B) und (C) erhalten wurden.

Jeder dieser Analysenfilme wurde in quadratische Blättchen von 15 mm Seitenlänge geschnitten, und darauf wurden kreisförmige Scheibchen aus Filterpapier (Dicke 200 μπι) mit einem Durchmesser von 9 mm (als poröse
Schicht mit definierter Fläche) gelegt. Auf jeden dieser Analysenfilme wurden jeweils 20 μΐ einer wäßrigen Lösung von Kaliumpyruvat einer Konzentration von

— 3

10 mol/1 getropft. Nach 10 min Stehenlassen bei Raumtemperatur (25⁰C) wurde die optische Reflexionsdichte
der gebildeten Färbung gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.

	Tabelle 3	Optische Dichte
Analysenfilm		1,05 1,23 0,54
(A) (B) (C)

Bei dem Analysenfilm (A) wurde der gebildete kationische Farbstoff durch das aniqnische Polymerisat in der POP-Farbbildungsreaktions-Schicht oder in der Farb-

stoff-Fixierschicht fixiert. Bei dem Analysenfilm (B) wurde der gebildete kationische Farbstoff durch das anionische Polymerisat in der Farbstoff-Fixierschicht fixiert. Dementsprechend diffundierten kaum Anteile des kationischen Farbstoffs in das Filterpapier (die poröse Schicht definierter Fläche), so daß die durch Messung des reflektierten Lichts bestimmte optischen Dichten hoch waren. Bei dem Analysenfilm (C) diffundierte jedoch ein Teil des gebildeten kationischen Farbstoffs in das Filterpcipier. Dieser in das Filterpapier abdiffun-

dierte Teil lieferte keinen Beitrag zu der optischen

Dichte der entstandenen Färbung, so daß die durch Messung des reflektierten Lichts bestimmte optische Dichte ausgeprägt niedrig war. Aus diesem Experiment geht klar hervor, daß anionische Polymerisate, die in dem Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten sind, in wirkungsvoller Weise kationische Farbstoffe zu fixieren vermögen.

Beispiel 5

Eine Beschichtungslösung einer Enzym-Substrat-Zusammensetzung wurde auf einen mehrschichtigen Analysenfilm (B) (einen solchen, bei dem kein Filterpapier auf die licht-blockierende Schicht aufgebracht worden war), der in Beispiel 4 erhalten worden war, in einer Dicke der trockenen Schicht von 80 μπι aufgebracht und anschließend getrocknet, wodurch eine GOT-Substrat-Schicht gebildet wurde.

Zusammensetzung der Lösung für die GOT-Enzym-Substrat-Schicht:

L-Asparaginsäure 2,5 g

Of-Ke toglutar säure 120 mg

Na₃HPO₄ . 12 H₂O 1,09 g [

NaH₂PO₄ . 2 H₂O 0,30 g

Polyacrylamid,

5 gew.-proz. wäßrige Lösung 100 g

Nichtionisches oberflächenaktives

Mittel (Isooctylphenyl-polyethoxyethanol, Handelsbezeichnung

"Triton X-100", hergestellt von Rohm und Haas Co., Ltd.) 100 mg

Die GOT-Substrat-Schicht des so hergestellten mehrschichtigen Films wurde mit einer 1 Gew.-% Triton X-IOO enthaltenden wäßrigen Lösung befeuchtet, und ein Membranfilter einer Dicke von 180 μπι und einer Fläche von 50 mm² wurde leicht angedrückt und in haftende Verbindung mit der GOT-Substrat-Schicht gebracht, wodurch ein Analysenfilm zur Bestimmung der GOT-Aktivität erhalten wurde.

Auf die poröse Schicht mit definierter Fläche der so hergestellten Analysenfilme wurden jeweils 10 μΐ einer wäßrigen Kochsalzlösung, die GOT (in Konzentrationen von 40, 70, 105 und 205 IU/1) enthielt, aufgetropft, und anschließend wurde 20 min bei 37⁰C inkubiert. Danach wurden die optischen Reflexionsdichten auf der Seite des PET-Films gemessen. Die optischen Dichten sind in der nachstehenden Tabelle, aufgeführt.

Tabelle 4 GOT-Aktivität (IU/1) Optische Dichte (Reflexion)

40 0,31

70 0,62

105 0,78

205 1,18

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu entnehmen, daß zwischen der GOT-Aktivität und der mittels Reflexion gemessenen optischen Dichte eine Korrelation besteht und die GOT-Aktivität unter Verwendung dieses Analysenfilms mittels der kolorimetrischen Methode der Messung der optischen Reflexionsdichte auf der Grundlage einer Eichkurve quantitativ bestimmt werden kann.

- 53 Beispiel 6

Menschliches Blutserum wurde jeweils auf die Analysenfilme für die analytische Bestimmung der GPT-Aktivität und der GOT-Aktivität, die in den Beispielen 1 bzw. 5
erhalten wurden, aufgetropft, und die Untersuchung wurde durchgeführt. Als Ergebnisse wurden mit η = 5 ein Mittelwert der optischen Reflexionsdichte von 0,30 für die GPT-Aktivität und ein Mittelwert der optischen Reflexionsdichte von 0,28 für die GOT-Aktivität erhalten.

Beispiel 7

Vier verschiedenartige poröse Materialien, nämlich ein Filterpapier mit einer Dicke von 185 μΐη, ein Membranfilter (mittlere Porengröße 5 μΐη, hergestellt von der Fuji Photo Film Co., Ltd., Handelsbezeichnung "Micro-

filter FM 500") mit einer Dicke von 150 μΐη, ein Baumwolltuch (Popelingewebe, broad cloth) und ein Glasfaser-Filterpapier mit einer Dicke von 200 μηι, wurden mit einer wäßrigen Lösung einer GOT-Substrat-Zusammensetzung der nachstehenden Formulierung imprägniert .; und dann getrocknet.

• ·

2	,5	g
120		mg
1	/09	g
0	,30	g
5		g
40		g

- 54 -

Zusammensetzung der Lösung für die GOT-Enzym-Substrat-Schicht;
L-Asparaginsäure
ö<-Ketoglutarsäure
Na₃HPO₄ . 12 H₂O
NaH₃PO₄ . 2 H₃O
Polyacrylamid,

5 gew.-proz. wäßrige Lösung
Wasser
Oberflächenaktives Mittel 1OG

50-proz. wäßrige Lösung 200 mg

Danach wurde der Analysenfilm (B) (der mehrschichtige Analyenfilm (B) , bei dem kein Filterpapier auf der licht-blockierenden Schicht aufgebracht wurde), der in Beispiel 4 erhalten wurde, mit einer-50-fach verdünnten wäßrigen Lösung des oberflächenaktiven Mittels 1OG befeuchtet, und nach Zerschneiden der mit der GOT-Substrat-Zusammensetzung imprägnierten porösen Materialien in Stücke von 100 mm^a wurden diese jeweils leicht da-

rauf gedrückt und so daran befestigt, wodurch mehrschichtige Analysenfilme· für die Bestimmung der GOT-Aktivität, die poröse Schichten mit definierter Flächengröße imprägniert mit der GOT-Substrat-Zusammensetzung aufwiesen, hergestellt wurden.

Auf die porösen Schichten mit definierter Flächengröße jedes dieser vier Analysenfilme wurde jeweils eine wäßrige Kochsalzlösung mit einer GOT-Konzentration von 50 Iü/1 aufgetropft, und zwar in einer Menge von 40 μΐ auf poröse Schicht definierter Flächengröße aus dem

Popel ingewebe und von jeweils 20 μΐ auf die poröaen Schichten definierter FlMohengröße aus den drei anderen Materialien. Die Inkubation erfolgte 60 min bei

37°C; während dieser Zeit wurden die optischen Dichten der entstandenen Färbungen in Intervallen von jeweils 5 min auf der Seite des PET-Films gemessen. Es wurde festgestellt, daß bei allen vier Analysenfilmen die
5 optischen Dichten der entstandenen Färbungen während der Inkubationszeit von 5 min bis 30 min linear zunahmen.

Aus den vorstehenden Ergebnissen wird deutlich, daß unter Verwendung dieser vier mehrschichtigen Analysenfilme für GOT die GOT-Aktivitäten während einer Inkubationszeit im Bereich von 5 min bis 30 min auf der Grundlage einer Eichkurve quantitativ bestimmt werden können.

»••β · ♦ * ♦· *

- 56 -

Die Fig. 1 bis 8 zeigen Querschnitte von Ausführungsformen des Analysenfilms der vorliegenden Erfindung. In den Fig. 1 bis 8 haben die Bezugszahlen die nachstehend angegebenen Bedeutungen:

10: Träger

20: Reagensschicht

21 : POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-

Fixlerschicht

22: TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-Schicht

23: TA-Substrat-Schicht

24: Farbstoff-Fixierschicht

25: Mit dem Reagens imprägnierter Träger

31: Poröse Spreitungsschicht

32: Poröse Schicht mit definierter Flächengröße

40: Lichtreflektierende Schicht.

Claims (1)

1. VON KREISLER SCHONWALD EISHOLD VON KREISLER KELLER SELTING WERNER

   ■_ÜE--· -5-2067

   Fuji Photo Film Co., Ltd. Kanagawa, Japan

   PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973

   Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. SelHng, Köln Dr. H.-K. Werner, Köln

   DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

   D-5000 KOLN 1

   24.Februar 1982

   W/GF 152

   Patentansprüche

   Analysenfilm enthaltend eine Brenztraubensäureoxidasehaltige Reagensschicht.

   Analysenfilm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht weiterhin ein Transaminase-Substrat enthält.

   Analysenfilm nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht weiterhin eine als Phosphatquelle dienende Verbindung, Flavin-adenin-dinucleotid, Thiamin-pyrophosphat, ein zwei- oder dreiwertiges Metallion und eine Farbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis von Hydrogenperoxid enthält.

   Analysenfilm nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis von Hydrogenperoxid eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität, einen Wasserstoff-Donator und einen Kuppler umfaßt.

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   5. Analysenfilm nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoff-Donator und der Kuppler eine zur Bildung eines kationischen Farbstoffs befähigte Kombination sind und die Reagensschicht weiter ein anionisches Polymerisat enthält.

   6. Analysenfilm nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht aus einer einzelnen Schicht besteht.

   7. Analysenfilm nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht aus mindestens zwei Schichten zusammengesetzt ist, von denen eine eine Transaminasesubstratschicht ist, die ein Transaminasesubstrat enthält.

   8. Analysenfilm nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht aus mindestens zwei Schichten zusammengesetzt ist, von denen eine eine Farbstoff-Fixierschicht ist, die ein anionisches Polymerisat enthält.

   9. Analysenfilm nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht aus mindestens drei Schichten zusammengesetzt ist, von denen eine eine Transaminasesubstratschicht, die ein Transaminasesubstrat enthält, und eine eine Farbstoff-Fixierschicht, die ein anionisches Polymerisat enthält, ist.

   10. Analysenfilm nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht auf ihrer einen Oberfläche einen Träger und auf ihrer anderen Oberfläche eine poröse Schicht besitzt, wobei die poröse Schicht rin der Roagenfischicht in fließfähiger Berührung in Form einer Einheit haftet.