DE2938511A1

DE2938511A1 - Praeparat zum faerben von bakterien und verfahren zum nachweis von bakterien

Info

Publication number: DE2938511A1
Application number: DE19792938511
Authority: DE
Inventors: Joseph L Melnick; Craig Wallis
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1978-09-25
Filing date: 1979-09-24
Publication date: 1980-03-27
Also published as: GB2031457B; GB2031457A; DE2953720C2; IT1164706B; FR2436993A1; FR2436993B1; CA1112987A; IT7950319A0; DE2938511C2; SE7907581L; BR7906097A

Description

DR.-ING. WALTER ABITZ DR. DIETER F. MORF DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER

Patentanwälte

Münch >n.

Postanschrift / Foatal Address Postfadi 8ΘΟ109, 8OOO München ββ

Plenzenauerstraße 28

Telefon 98 33 33

Telegramme: ChemlndusMünchen

Telex: (0)523903

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BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE Texas Medical Center, Houston, Texas, V.St-A.

Präparat zum Färben von Bakterien und Verfahren zum Nachweis von

Bakterien

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Beschreibt] η _y

Die Erfindung betrifft ein Präparat zum Anfärben von Bakterien und Verfahren zur Analyse von gram-negativen und grampositiven Bakterien. Das Präparat enthält ein chelatbildendes Mittel und einen basischen Farbstoff,die jeweils bei einem pH-Wert über etwa 7,0 wirksam sind.

Das Anfärben von Bakterien kann durchgeführt werden, indem man entweder konzentrierte oder in einem fluiden Mittel suspendierte Bakterien mit dem Präparat bei einem neutralen oder basischen pH-Wert in Kontakt bringt. Bakterien, die mit diesem Präparat angefärbt und durch Filtration, Zentrifugation oder dergleichen konzentriert worden sind, sind leicht sichtbar, so dass ihre Anwesenheit in einer Probe auf diese Weise rasch nachgewiesen werden kann. Die Farbabstufungen der gefärbten, konzentrierten Bakterien entsprechen der Anzahl der Bakterien. Bei Vergleich mit einem Standard kann eine halbquantitative Bakterienanalyse durchgeführt werden. Eine Unterscheidung von gram-negativen und gram-positiven Bakterien lässt sich erreichen, indem man die gefärbten Bakterien mit einer organischen Säure mit ei nenn pH-Wert von etwa 2,5 bis 2,6 wäscht. Bei einem derartigen Waschvorgang werden nur die angefärbten, grampositiven Bakterien entfärbt. Schliesslich wird erfindungsgemäss ein Verfahren zur Bestimmung der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber antimikrobiel len Mitteln zur Verfügung gestellt, bei dem die Bakterien mit einem antimikrobiellen Mittel inkubiert und angefärbt werden und anschliessend die Farbabstufung der gefärbten, konzentrierten Bakterien mit einer Kontrollprobe oder einem Standard verglichen wird.

Es besteht ein Bedarf zum raschen Nachweis von Bakterien in Flüssigkeiten bzw. fluiden Mitteln aus verschiedenen Quellen. Insbesondere besteht ein Bedarf zum raschen Nachweis von pathogenen Bakterien in physiologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Urin und dergleichen. Ferner besteht ein Bedarf zur raschen Bestimmung der Empfindlichkeit von infektiösen Bakterien.

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Urinproben bilden im allgemeinen den Hauptteil des Arbeitsanfalls in diagnostischen, mikrobiologischen Laboratorien. Infektionen des Harntrakts sind die bei weitem am stärksten verbreiteten urologischen Erkrankungen. In vielen Krankenanstalten stellen Bakteriurien die häufigste Form von krankenhausspezifischen Infektionen dar, die häufig nach der Verwendung von Verweilkathetern und nach verschiedenen operativen Eingriffen auftreten. Die Anzahl der Proben, bei denen eine Untersuchung auf Bakteriurie erforderlich ist, wird noch dadurch erhöht, dass eine Wiederholung der Tests zur Gewährleistung einer sicheren Diagnose notwendig ist, wenn die Gefahr besteht, dass die Zuverlässigkeit der Tests durch eine Verunreinigung der Proben während der Probennahme herabgesetzt worden ist. Ein weiteres Problem bei der Diagnose und Behandlung von Dakteriurie ist die Tatsache, dass häufig eine Beziehung zwischen der syinptoma ti sehen Reaktion des Patienten auf eine antimikrobielIe Behandlung und einer erfolgreichen Behandlung besteht. Um sicherzustellen, dass das verschriebene antimikrobielle Mittel tatsachlich wirksam ist, müssen während der Therapie wiederholte Testf; durchgeführt werden. Hieraus ergibt sich ein Bedürfnis nach einem einfachen, raschen Bakteriurietest. Im Hinblick auf das häuficje, unerwartete, asymptoinatische Auftreten von Infektionen der Harnwege bei Kindern, schwangeren Frauen, Diabetikern und älteren Patienten, für deren Diagnose die Gewinnung und Untersuchung von mehreren Proben erforderlich sein kann, müssen Hakteriurietests so einfach und billig auszuführen sein, dass sie routinemässig vorgenommen werden können. Auch hieran:; ergibt sich die Hotwendicjkeit für einen raschen, billigen Test um die Diagnose von Infektionen der Harnwege zu erleichtern und ihre angemessene Behandlung zu gewährleisten.

Im Hinblick auf die hohe Sterblichkeit bei Septikämie und Bakteriämie besteht auch ein Bedarf an raschen Tests zum

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Nachweis von Bakterien im Blut. Der sofortige Nachweis der Erkrankung erlaubt eine frühzeitige Verabfolgung eines entsprechenden Antibiotikums, wodurch die Uberlebensaussichten stark verbessert werden.

Gemäss herkömmlichen Verfahren werden bakterielle Infektionen in Proben, wie Blut, Urin, Rückenmarkf liissigkeit und dergleichen, nachgewiesen, indem man die Proben mit einem Kulturmedium verdünnt und bei 36°C inkubiert. Das Auftreten einer Trübung zeigt Bakterienwachstum an. Jedoch sind dazu relativ lange Inkubationszeiten erforderlich, da eine auf Bakterienwachstum zurückzuführende Trübung schwer von einer auf Blutzellen oder Verunreinigungen in der Probe zurückzuführende Trübung oder von einer Trübung, die durch Bildung von Niederschlag hervorgerufen wird, zu unterscheiden ist. Eine wesentliche Trübungszunahme nach Inkubationszeiten von etwa 24 Stunden zeigt Bakterienwachstum an.

Ein weiteres wichtiges Verfahren im klinischen Laboratorium ist die Bestimmung der antimikrobiellen Empfindlichkeit. Zu den wichtigsten Verfahren, die gegenwärtig zur Bestimmung der Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber einem Antibiotikum angewendet werden, gehören die Verdünnungstests, beispielsweise die Verfahren mit Gärröhrchen und Agarplatten, sowie die Agardiffusionstests, bei denen mit einem Antibiotikum imprägnierte Scheiben verwendet werden. Üblicherweise erfordern derartige» Verfahren Inkubationszeiten von 16 bis Stunden, bevor die Hemmwirkung eines antimikrobiellen Wirkstoffs genau bestimmt werden kann. Diese Tests sind häufig zeitraubend und relativ teuer und müssen von geschultem Laborpersonal durchgeführt werden.

Anrärbetechniken sind in der klinischen Mikrobiologie zwar bekannt, werden im allgemeinen aber mehr zum Anfärben von

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getrockneten Abstrichen auf Objektträgern als für flüssige Proben verwendet. In der Praxis wird bei einem derartigen herkömmlichen Anfärbeverfahren ein getrockneter, bakterieller Abstrich auf einem Objektträger mit einem Reagens behandelt, das die Bakterien auf solche Weise anfärbt, dass eine mikroskopische Prüfung des Abstrichs möglich wird. Somit können derartige Analysen nur von ausgebildeten Mikrobiologen unter Einsatz einer teuren Ausrüstung vorgenommen werden.

Neben einer bakteriellen Untersuchung von Körperflüssigkeiten ist es häufig auch notwendig, den Bakteriengehalt von anderen fluiden bzw. flüssigen Proben, wie Wasser und pharmazeutischen Produkten, zu analysieren.

Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein rasches, einfaches, billiges und genaues Verfahren zum Nachweis und zur Analyse von Bakterien in Körperflüssigkeiten und anderen fluiden oder flüssigen Proben zur Verfugung zu stellen.

Erfindungsgemäss wurde überraschenderweise festgestellt, dass sich sowohl gram-negative als auch gram-positive, lebende Bakterien zur Durchführung einer einfachen, raschen Analyse bei Verwendung eines speziellen Präparats anfärben lassen. Mit diesem Präparat angefärbte Bakterienkonzentrate sind leicht sichtbar und können somit auch von nicht speziell dafür ausgebildetem Personal ohne mikroskopische Untersuchung erkannt werden. Ausserdem lässt sich erfindungsgemäss die antimikrobielle Empfindlichkeit von Bakterien rasch und einfach ermitteln. Ferner lässt sich das erfindungsgemässe Färbepräparat zur Durchführung von billigen, einfachen und raschen quantitativen Analysen von Bakterien anwenden. Schliesslich ist es erfindungsgemäss möglich, zwischen gram-negativen und gram-positiven Bakterien zu unterscheiden.

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Das erfindungsgemässe Präparat zum Anfärben von gram-negativen und gram-positiven Bakterien enthält ein im basischen pH-Bereich wirksames, chelatbildendes Mittel und einen zum Anfärben von Bakterien bei basischen pH-Werten geeigneten, basischen Farbstoff. Die Bakterien werden angefärbt, wenn sie bei einem pH-Wert über etwa 7,O mit dem erfindungsgemässen Präparat in Kontakt gebracht werden. Bakterien, die mit dem Präparat angefärbt und eingeengt worden sind, werden leicht sichtbar und lassen sich somit nachweisen.

Ein semiquantitatives Analysenverfahren für Bakterien lässt sich so vornehmen, dass man die Farbabstufung von angefärbten, eingeengten Bakterien mit einem Nomogramm oder einem anderen geeichten Standard vergleicht. Eine semiqualitative Analyse von angefärbten Bakterien kann durch Waschen mit einer organischen Säure vom pH-Wert etwa 2,5 oder 2,6 durchgeführt werden, da nur bei gram-positiven Bakterien, die mit dem erfindungsgemässen Präparat angefärbt sind, eine vollständige Entfärbung eintritt.

Inkubiert man Bakterien vor dem Anfärben mit dem erfindungsgemässen Präparat mit einem antimikrobiellen Wirkstoff, so lässt sich die Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber dem Wirkstoff bestimmen. Die relative Intensität der Färbung von auf diese Weise behandelten, angefärbten, konzentrierten Bakterien steht in Beziehung zur Wirksamkeit des verwendeten Mittels.

Die Erfindung ist besonders zur Untersuchung von Körper— flüssigkeiten und anderen physiologischen Flüssigkeitsproben in Laboratorien geeignet.

Somit betrifft die Erfindung Präparate, die sich zum Anfärben von gram-negativen und gram-positiven Bakterien eignen, sowie verschiedene Verfahren zum Nachweis und zur Analyse von

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Bakterien in Flüssigkeiten. Wie bereits erwähnt, enthält das erfindungsgemässe Präparat, allgemein ausgedrückt, ein chelatbildendes Mittel und einen Farbstoff. Bakterien, die mit diesem Präparat bei einem pH-Wert über etwa 7, O in Kontakt gebracht werden, werden angefärbt und nach einem Konzentrationsvorgang leicht sichtbar.

Da die Farbintensität der angefärbten, konzentrierten Bakterien mit der Anzahl der Bakterien in einer Probe in Beziehung steht, kann, wie bereits erwähnt, eine semiquantitative Bakterienanalyse vorgenommen werden, indem man die Farbentwicklung der angefärbten, konzentrierten Bakterien mit einem Nomogramm oder einem anderen bekannten Standard vergleicht. Wenn der Konzentrationsvorgang der Bakterien durch Ablagerung der Bakterien auf einer semipermeablen Membran durchgeführt wird,kann nicht mit den Bakterien assoziierter Farbstoff, der einen genauen Nachweis und eine quantitative Ermittlung von Bakterien stören könnte, durch Waschen mit einer organischen Säure mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 2,7 bis 4,0 entfernt werden. Werden Bakterien vor dem Kontakt mit dem Anfärbepräparat kurzzeitig mit einem antimikrobiellen Wirkstoff inkubiert, lässt sich die Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber dem Wirkstoff bestimmen, indem man die Farbintensität der angefärbten, konzentrierten Bakterien mit einer Kontrollprobe vergleicht. Eine Unterscheidung der Gramfärbung von Bakterien kann durchgeführt werden, indem man die gefärbten Bakterien mit einer organischen Säure mit einem pH-Wert von etwa 2,5 bis 2,6 wäscht. Gram-positive Bakterien werden bei einem derartigen Waschvorgang vollständig entfärbt, während dies bei gram-negativen Bakterien nicht der Fall ist.

Das erfindungsgemässe Präparat und die erfindungsgemässen Verfahren lassen sich insbesondere zum Nachweis und zur Analyse von Bakterien in physiologischen Flüssigkeitsproben, insbeson-

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dere Harnproben, verwenden. Erfindungsgemäss ist ein rascher und billiger Nachweis und infolgedessen eine zweckmässige Behandlung von bakteriellen Infektionen möglich.

Genauer gesagt, wurde erfindungsgemäss festgestellt, dass durch Kombination eines chelatbildenden Mittels, das im basischen pH-Bereich wirksam ist, mit einem Farbstoff, der zur Färbung von Bakterien bei einem pH-Wert über etwa 7,O geeignet ist, ein Präparat entsteht, mit dem sowohl gram-negative als auch gram-positive Bakterien angefärbt werden können. In Abwesenheit des chelatbildenden Mittels sind Farbstoffe, insbesondere basische Farbstoffe zur Färbung von gram-negativen Bakterien nicht geeignet. Bakterien können gefärbt werden, indem man sie einfach mit konzentrierten oder in einer Flüssigkeit suspendierten Bakterien mit dem Präparat aus dem chelatbildenden Mittel und dem Farbstoff bei einem nahezu neutralen oder basischen pH-Wert in Kontakt bringt.

Erfindungsgemäss können beliebige Farbstoffe verwendet werden, die zum Anfärben von Bakterien bei einem basischen oder neutralen pH-Wert geeignet sind. Da der Färbevorgang bei einem pH-Wert von etwa 7 oder darüber durchgeführt wird, müssen die Farbstoffe in diesem pH-Bereich wirksam sein. Generell sind basische oder kationische Farbstoffe zum erfindungsgemässen Anfärben von Bakterien geeignet. Bevorzugt werden die Farbstoffe Safranin-O,Toluidinblau, Methylenblau, Kristallviolett und Neutralrot. Besonders bevorzugt wird Safranin-O.

Die erfindungsgemäss verwendbaren chelatbildenden Mittel sind ebenfalls auf solche beschränkt, die bei dem pH-Wert, bei dem der Anfärbevorgang vorgenommen wird, d.h. etwa 7,0 oder darüber, wirken. Beispielsweise können Salze von Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Citronensäure verwendet werden. Bevorzugt werden verschiedene Natriumsalze dieser beiden Säuren, insbesondere die Di- und Tetranatriumsalze von EDTA

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und die Di- und Trinatriumsalze von Citronensäure. Tetranatrium-EDTA wird als chelatbildendes Mittel besonders bevorzugt.

Die Mengen an chelatbildendem Mittel und Farbstoff, die zum Anfärben von Bakterien erforderlich sind, betragen etwa O,0Ol bis etwa 0,1m chelatbildendes Mittel und Farbstoff in einer Verdünnung von 1 : lOOO bis 1 : 300 000. Diese Mengen beziehen sich auf die endgültigen Konzentrationen, wobei Verdünnungen, die durch das Material, in denen die Bakterien vorliegen, hervorgerufen werden, berücksichtigt sind.

Die spezielle Konzentration an Farbstoff und chelatbildendem Mittel kann teilweise vom Zustand der Bakterien, die mit dem Anfärbepräparat in Kontakt gebracht werden, abhängen. Wird beispielsweise eine Färbung von Bakterien durchgeführt, die in relativ konzentrierter Form oder frei von störenden Substanzen vorliegen, so treten in der Regel konkurrierende chemische oder physikalische Reaktionen in verringertem Masse ein und es können konzentriertere Präparate verwendet werden. Sind die Bakterien andererseits in einem fluiden Medium, das andere Materialien enthält, suspendiert, so kann es erforderlich sein, die Konzentration an Farbstoff und/oder chelatbildendem Mittel nach oben oder unten zu korrigieren, um Reaktionen mit diesen zusätzlichen Materialien zu kompensieren. Beispielsweise sollten in Urinproben verringerte Farbstoffkonzentrationen eingesetzt werden, um die Bildung von Niederschlagen mit Urinverbindungen, die bei einer Farbstoffverdünnung von 1 : lOOO auftreten, zu verhindern. Im allgemeinen ist eine Farbstoffverdünnung in der Grössenordnung von 1 : 25ΟΟ oder mehr ausreichend, um eine derartige Niederschlagsbildung zu verhindern. Verdünnungen von 1 : IO OOO oder mehr werden besonders bevorzugt. Im allgemeinen lassen sich Bakterien besonders wirksam anfärben, wenn Präparate mit einem Gehalt an etwa O,O5 m che-

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latbildendem Mittel und einer Farbstoffverdünnung von 1 : lOOO oder darüber bei Vorliegen von relativ reinen oder konzentrierten Bakterien verwendet werden. Liegen die Bakterien zusammen mit störenden Materialien vor, so wird vorzugsweise das chelatbildende Mittel in einer Konzentration von O,O5 m und der Farbstoff in einer Verdünnung von 1 : IO OOO oder darüber eingesetzt.

In der Praxis können die Anfärbepräparate in konzentrierter Form gelagert werden. Beispielsweise können steriles Safranin-O und EDTA bei den Konzentrationen Safranin = 1 : lOOO und EDTA . Na₄ = O,5 m gelagert werden. Bei der Verwendung wird dieses Gemisch auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Beispielsweise erhält man bei Zusatz von 1 ml dieses Präparats zu 9 ml Testmaterial eine Endkonzentration von 1 : IO OOO Safranin und 0,05 m EDTA. Die Lagerstabilität des Anfärbepräparats wird erhöht, wenn der zur Herstellung des Präparats verwendete Farbstoff in unverdünnten organischen Medien in Lösung gebracht worden ist.

Wie vorstehend erwähnt, eignet sich das Präparat zum Anfärben von konzentrierten Bakterien sowie von in einer Flüssigkeit suspendierten Bakterien. Das Anfärben von Bakterien wird durchgeführt, indem man einfach das Präparat zu einer flüssigen Probe mit einem angenommenen Bakteriengehalt gibt oder eine Lösung des Präparats mit konzentrierten Bakterien in Kontakt bringt. Beispielsweise können Bakterien in physiologischen Flüssigkeitsproben angefärbt werden, indem man einfach das Präparat zur Probe gibt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Bakterien zunächst an einer semipermeablen Membran niederzuschlagen. Anschliessend lässt sich die Färbung der Bakterien erreichen, indem man eine Lösung des Präparats durch die Membran gibt.

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Der Färbegrad ist in gewissem Umfang von der Farbstoffkonzentration und der Kontaktzeit abhängig. Bei höheren Konzentrationen kann die Kontaktzeit herabgesetzt werden. Umgekehrt sind bei geringeren Farbstoffkonzentrationen längere Kontaktzeiten erforderlich. Ferner besteht eine umgekehrte Beziehung der Kontaktzeit zur Kontakttemperatur. Beispielsweise erfordert eine optimale Bakterienfärbung in flüssigen Proben bei einer Farbstoffverdünnung von 1 : 5000 Kontaktzeiten von 45 Minuten bei 4°C, 15 Minuten bei 25°C, 5 Minuten bei 37°C und 1 bis 2 Minuten bei 50°C. Im allgemeinen ist bei Raumtemperatur eine Kontaktzeit von mindestens 15 Minuten erforderlich, um eine maximale Bakterienfärbung in Urinproben zu erreichen. Nach IO Minuten wird keine weitere Färbung mehr beobachtet. Werden die Bakterien jedoch vor dein Anfärben an semipermeablen Membranen konzentriert, so sind Kontaktzeiten von nur 15 bis 6O Sekunden erforderlich, da Färbepräparate mit einer Farbstoffverdünnung von 1 : lOOO verwendet werden können. Erfindungsgemäss angefärbte Bakterien lassen sich leicht nachweisen, wenn sie in konzentrierter Form vorliegen. Ist der Färbevorcjang an konzentrierten Bakterien derart vorgenommen worden, dass die Bakterien nicht in flüssiger Phase dispergiert werden, so lässt sich die Anwesenheit der Bakterien sofort feststellen. Angefärbte Bakterien, die in flüssiger Phase dispergiert sind, werden nach dem Konzentrieren leicht sichtbar.

Die mit dem erfindungsgemässen Verfahren nachweisbare Bakterienkonzentration hängt in gewissem Umfang vom Bakterientyp ab. Im allgemeinen lassen sich gram-negative Bakterien in Konzentrationen von 10 CFU/ml nachweisen, während beim Nachweis von gram-positiven Bakterien eine Konzentration von IO CFU/ml erforderlich sein kann. Selbstverständlich lassen sich geringere Bakterienkonzentrationen nachweisen, indem man grössere FLüssigkeitsmengen einengt.

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Das Einengen bzw. Konzentrieren von Bakterien kann beispielsweise durch Sedimentation oder Filtration vorgenommen werden. Bei Durchführung einer Sedimentation machen sich die in der Probe vorhandenen Bakterien als Niederschlag bemerkbar, dessen Färbung der Farbe des verwendeten Farbstoffs entspricht. Dei der Anwendung von Fi!trationstechniken lagern sich die Bakterien auf semipermeabLen Membranen ab, wobei ihre Anwesenheit durch die sich auf der Membran entwickelnde, auf den Farbstoff zurückzuführende Färbung sichtbar wird.

Zur Durchführung einer Sedimentation kann man sich herkömmlicher Verfahren, beispielsweise der Zentrifugation, bedienen. Zum Beispiel lassen sich Bakterien in einer physiologischen Flüssigkeitsprobe mit einem Volumen von 1OO ml durch 15- bis 3O-minütige Zentrifugation bei 30OO U/min in einer herkömmlichen chemischen Zentrifuge sed iiuentieren. Anschliessend werden sie in Kontakt mit dem erfindungsgemassen Präparat gebracht. Die Anwesenheit von Bakterien wird durch eine Färbung des Pellets entsprechend der Farbe dos Farbstoffs angezeigt.

Bei der Durchführung von Fi Ltrationstechniken ist eine semipermeable Membran mit einer Porengrösse, die ausreicht, um die Bakterien zurückzuhalten, erforderlich. Im allgemeinen können Membranen mit einem Porendurchmesser von etwa O, 2 bis Ι,Ο,λιπι verwendet werden. Die Membran kann aus herkömmlichen Materialien bestehen, wie Glasfasern, Epoxyharze, Nitrocellulose, Celluloseacetat, Asbest oder Kombinationen davon. Bevorzugt werden Epoxy-Glasfaser-Filter mit guten StrömuncjsgeschwindLgkeiten und einer solchen Tieft,», dass Verstopfungen möglichst gering gehalten werden. Bei Untersuchung von sehr ttiiben Proken, wie Urin, spielen die Strömungscjeschwind icjkeit und die Tiefe einer Membran eine besonders wichtige Rolle.

Ferner werden vorzugsweise solche Membranen verwendet, die kei-

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ne wesentlichen Mengen des Farbstoffs, der nicht mit den Bakterien assoziiert ist, zurückhalten. Die Retention von freiem Farbstoff durch die Membran ist vorzugsweise so gering, dass zwischen den Färbungen, die auf der Membran entstehen, wenn einerseits nur freier Farbstoff vorhanden ist und wenn andererseits zusätzlich gefärbte Bakterien vorliegen, unterschieden werden kann. Im allgemeinen müssen Membranen verwendet werden, die keine elektrostatische negative Nettooberflächenladung aufweisen. Die relative Eignung von Membranen kann ermittelt werden, indem man lediglich den zu verwendenden Farbstoff in der entsprechenden Konzentration durch die verschiedenen Membranen leitet und die Intensitäten der gebildeten Färbungen vergleicht.

Bevorzugt werden Membranen, die keinen freien Farbstoff oder nur geringe Mengen davon adsorbieren. Ist jedoch die Kombination aus Farbstoff und Membran so beschaffen, dass der freie Farbstoff teilweise die Membranoberfläche färbt, so lässt sich erfindungsgemäss die Anwesenheit von gefärbten Bakterien exakt nachweisen, indem man die Intensität dieser partiellen Färbung als Hintergrund subtrahiert. Um einen genauen Nachweis von Bakterien zu gewährleisten, wird ein Kontrollversuch durchgeführt, wobei die bei Verwendung einer Flüssigkeitsprobe, die ein Färbepräparat aber keine Bakterien enthält, entwickelte Färbung mit der Färbung verglichen wird, die bei einem ähnlichen Versuch unter Verwendung des Färbepräparats und einer pathologischen Menge an Bakterien entsteht.

Membranen, die durch freien Farbstoff gefärbt werden, können teilweise oder vollständig durch Waschen mit einer organischen Säure entfärbt werden. Bei Kontakt bestimmter Membranen mit diesen organischen Säuren werden die durch das Färbepräparat in Abwesenheit von Bakterien gefärbten Oberflächen zumindest teilweise von dem adsorbierten freien Farbstoff befreit, ohne dass der mit den auf der Membran abgelagerten Bakterien assozi-

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ierte Farbstoff entfernt wird. Durch einen derartigen Waschvorgang mit einer Säure wird somit die Menge des durch die Membranen festgehaltenen freien Farbstoffs verringert und dadurch die Genauigkeit, mit der Bakterien auf derartigen Membranen nachgewiesen werden können, verbessert.

Der durch Waschen mit einer Säure erzielte Entfärbungsgrad hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, unter anderem von der Membranart, der verwendeten Säure, dem pH-Wert der Säure und dem Material, in dem der Farbstoff gelöst ist. Die durch den freien Farbstoff auf den Membranen mit einem Gehalt an verschiedenen Materialien, wie Glasfasern, Nitrocellulose, Celluloseacetat, Asbest und Epoxyharze, gebildete Färbung lässt sich im allgemeinen in gewissem Umfang durch Waschen mit einer organischen Säure entfernen. Organische Säuren, wie Citronensäure und Essigsäure bewirken im allgemeinen eine Entfernung von freiem Farbstoff von den Membranoberflächen, ohne dass Farbstoff, der mit den Bakterien verbunden ist, entfernt wird, sofern der pH-Wert der Säure im Bereich von etwa 2,7 bis 4,0 liegt. pH-Werte unter etwa 2,7 sollten vermieden werden, da dabei auch eine Entfärbung der angefärbten Bakterien auftreten kann. Essigsäure mit einem pH-Wert von etwa 3 wird als Waschmedium bevorzugt.

Der Haftungsgrad des freien Farbstoffs an den Membranen kann verringert und die Entfernung des Farbstoffs durch Waschen mit einer Säure kann verstärkt werden, wenn der im Färbepräparat angewendete Farbstoff in organischen Medien gelöst wird. Basische Farbstoffe, die in Wasser oder in Gegenwart von anorganischen Salzen gelöst sind, neigen zu einer Haftung an den Membranen und werden im allgemeinen durch Waschen mit organischen Säuren nicht entfärbt.

Eine besonders wirksame Entfernung des freien Farbstoffs er-

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reicht man in den Fällen, in denen ein basischer Farbstoff vollständig in einem Medium mit einem hohen organischen Anteil in Lösung gebracht ist. Der Grad der Auflösung kann bestimmt werden, indem man eine Testlösung des basischen Farbstoffs über ein Kationenaustauscherharz gibt und anschliessend das Eluat durch eine Membran, die zur Adsorption des Farbstoffs geeignet ist, filtriert. Der Auflösungsgrad ergibt sich aus der an der Membran adsorbierten Farbstoffmenge. Ist ein Farbstoff vollständig in Lösung gegangen, so wird auf der Membran kein Farbstoff sichtbar, während bei geringeren Auflösungsgraden eine Zunahme der auf der Membran entwickelten Farbintensität zu beobachten ist.

Die Auflösung von basischen Farbstoffen kann in Medien mit einem hohen organischen Anteil, wie sie zur Züchtung von Bakterien verwendet werden, durchgeführt werden. Beispiele für derartige Medien sind Trypticase-SojabrühcTrypitosephosphntbrühe, Glucoselösung oder Hirn-t^rz-Infusion. Bevorzugt werden unverdünnte Trypticase-Sojabrühe, Tryptosephosphatbrühe, Hirn-Herz-Infusion oder Medien von ähnlicher Beschaffenheit, da derartige Medien nicht nur ein Minimum an falsqhen positiven Ergebnissen bewirken, sondern auch Färbepräparate ercjeben, die auch noch nach längerer Zeit eine verringerte Neigung zur Fällungsbildung oder Trübung zeigen und somit eine höhere Lagerstabilität aufweisen.

Eine bevorzugte Kombination zur möglichst vollständigen Entfernung von an der Membranoberfläche adsorbiertem freiem Fiirbstoff ist nachstehend angegeben: Glasfaser-Epoxy-Filter mit einer positiven Nettooberflächenladung, wobei die Poren- und Fliesseigenschaften insbesondere denen der G-2-Seri.e der Finite Filter Corp. (Detroit, Michigan) entsprechen, Essigsäure vom pH-Wert etwa 3 und ein basischer Farbstoff, vorzugsweise? Safranin-O, gelöst in unverdünntem Züchtungsmedium

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Bei Verwendung dieser Kombination lässt sich im wesentlichen der gesamte freie Farbstoff an einer Membranoberfläche entfärben -

Die zum Zwecke der Entfärbung vorgenommene Waschung mit der Säure kann durchgeführt werden, indem man einfach die gefärbte Membranoberfläche kurzzeitig mit der Säure in Kontakt bringt und anschliessend die Waschflüssigkeit absaugt oder auf andere Weise von der Membran entfernt. Die günstigste Dauer und Anzahl der Waschvorgänge lässt sich empirisch bestimmen. Im allgemeinen sind bei einer Säure vom pH-Wert 3 1 bis 3 Waschvorgänge von jeweils weniger als 5 Minuten Dauer ausreichend.

Die Anwesenheit von Bakterien kann unter Verwendung des erfindungsgemässen Färbepräparats semiquantitativ nachgewiesen werden. Eine derartige quantitative Analyse wird durchgeführt, indem man die Bakterien auf die vorstehend erläuterte Weise anfärbt und konzentriert. Die Farbintensität der gefärbten, konzentrierten Bakterien, die in Beziehung mit der Bakterienpopulation steht, kann sodann mit einem Standard verglichen werden, dessen Eichung unter Verwendung von bekannten BakterLenmengen vorgenommen worden ist. Zur Durchführung der quantitativen Analyse können herkömmliche Verfahren, wie Nomographie, Colorimetrie und Photometrie, angewendet werden. Das Bakterienwachstum in Flüssigkeiten lässt sich nach dem vorstehend erläuterten Verfahren messen, indem man die Intensität der in Proben, die zu verschiedenen Zeitpunkten aus der Flüssigkeit entnommen worden sind, entwickelten Färbung vergleicht.

Wie bereits erwähnt, kann mit dem erfindungsgemässen Präparat auch eine Unterscheidung der Gram-Färbung vorgenommen werden. Wie ebenfalls bereits ausgeführt, neigen zum Waschen verwendete

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organische Säuren mit einem pH-Wert unter etwa 2,7 dazu, sowohl die angefärbten Bakterien als auch den auf der Membranoberfläche befindlichen freien Farbstoff zu entfärben. Wird jedoch der pH-Wert der Säure auf einen Wert von etwa 2,5 bis 2,6 gehalten, so werden gram-positive Bakterien vollständig entfärbt. Bei einem pH-Wert unter etwa 2,5 werden sowohl gram-positive als auch gram-negative Bakterien entfärbt. Auf diese Weise ist es möglich, zwischen gram-negativen und grampositiven Bakterien zu unterscheiden. Verwendet man zum Waschen eine organische Säure der Art, wie sie auch zur Entfärbung des freien Farbstoffs auf der Membran verwendet wird, wobei der pH-Wert der Säure jedoch nur etwa 2,5 bis 2,6 beträgt, so lässt sich eine semiqualitative Analyse von mit dem erfindungsgemässen Präparat gefärbten Bakterien durchführen.

Erfindungsgemäss ist es auch möglich, die antimikrobielle Empfindlichkeit von Bakterien zu bestimmen. Behandelt man Bakterien vor ihrem Kontakt mit dem erfindungsgemässen Anfärbepräparat mit einem antimikrobiellen Mittel, gegenüber dem die Bakterien empfindlich sind, so ergibt sich eine Verringerung der Anzahl der Bakterien. Infolgedessen ist die Färbung von auf diese Weise behandelten angefärbten, konzentrierten Bakterien geringer als bei resistenten Kulturen oder unbehandelten Kontrollproben. Die Verringerung der Farbintensität verläuft in groben Zügen parallel zum Empfindlichkeitsgrad gegenüber dem antimikrobiellen Wirkstoff. Werden somit Bakterien vor ihrem Kontakt mit dem erfindungsgemässen Färbepräparat mit einem antimikrobiellen Wirkstoff behandelt, so steht die Farbintensität der gefärbten, konzentrierten Bakterien in Beziehung zur Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber dem Wirkstoff. Werden Bakterien vor dem Anfärben mit einem antimikrobiellen Mittel, das eine bakteriostatische oder bakterizide Wirkung aufweist, behandelt, so ergibt sich eine geringere Farbintensität der gefärbten, konzentrierten Bakterien im Ver-

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gleich zu gefärbten, konzentrierten Bakterien, die keiner Behandlung mit dem Mittel unterzogen worden sind. Vergleicht man die entwickelte Färbung von Bakterien, die mit verschiedenen antimikrobiellen Mitteln oder mit verschiedenen Mengen eines einzelnen Mittels behandelt worden sind, so lässt sich die relative Hemmwirkung dieser Mittel bewerten.

Die Behandlung von Bakterien mit einem antimikrobiellen Mittel kann durchgeführt werden, indem man einfach entweder konzentrierte oder in Flüssigkeit suspendierte Bakterien im allgemeinen höchstens 1 bis 3 Stunden mit dem Mittel in Kontakt bringt. Das Verfahren kann mit Bakterien in einer flüssigen Probe oder mit Bakterienkolonien von einer Kulturplatte, die in einer organischen Brühe suspendiert worden sind, durchgeführt werden. Die bei diesen Verfahren eingesetzte Wirkstoffmenge entspricht bekannten Standardwerten, beispielsweise den von der FDA genehmigten Standardwerten für antimikrobielle Scheiben.

Gegebenenfalls kann eine Bakterienprobe vor der Behandlung mit dem antimikrobiellen Mittel inkubiert werden. Durch die Inkubation wird die Genauigkeit erhöht, mit der sicti die Empfindlichkeit gegenüber dem Mittel bestimmen lässt, was darauf zurückzuführen ist, dass die Kultur die logarithmische Wachstumsphase erreicht. Da Bakterien bei Inkubation bei 35 bis 36 C rasch wachsen, müssen mit Bakterien infizierte Proben nur etwa 3O Minuten bis 1 Stunde inkubiert werden, um sehr genaue Ergebnisse zu gewährleisten. Eine derartige Inkubation ist wünschenswert, wenn die relative Hemmwirkung von verschiedenen antimikrobiellen Mitteln mit ähnlichen Aktivitäten bestimmt werden soll.

Das Präparat und die Verfahren der Erfindung eignen sich besonders zum Anfärben und Analysieren von Bakterien in physiologischen Flüssigkeitsproben. Beispielsweise kann Urin, der auf herkömmliche Weise geklärt worden ist, die in Nährbrühe

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gelöstes Safranin-0 in einer Verdünnung von 1 : IO 0OO und 0,05 m Tetranatrium-äthylendiamintetraacetat enthält, behandelt werden. Der Urin wird sodann durch ein bakteriologisches Filter mit einer positiven Nettoladung gegeben, wobei die angefärbten Bakterien leicht erkannt werden können. Gegebenenfalls kann das Filter anschliessend mit Essigsäure oder Citronensäure vom pH-Wert 3 gewaschen werden.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Urin durch die bakteriologische Membran zu geben, was zur Ablagerung der Bakterien aus dem Urin auf der Membranoberfläche führt. Anschliessend werden die abgelagerten Bakterien mit einer ausreichenden Menge eines Gemisches aus 1 : lOOO-basischein Farbstoff und 0,05 m-EDTA-Salz behandelt, um die Membranoberfläche zu bedecken. Nach 15 bis 60 Sekunden (oder gegebenenfalls langer) wird der Farbstoff durch die Membran abgesaugt. Gegebenenfalls kann die Membran sodann mit Essigsäure vom pH-Wert 3 gewaschen werden.

In einigen Fällen können im Urin von an Bakteriurie leidenden Patienten Niederschläge enthalten sein, die zu einer Verstopfung der erfindungsgemäss verwendeten Membranen führen. Derartige Urinproben werden zunächst geklärt, beispielsweise mit einer 5^um-Klärvorrichtung, um die Niederschläge zu entfernen und die Filtration des Urins zu verbessern. Gelegentlich kann Urin gram-positive Bakterien in Form von Aggregaten enthalten, die durch die 5 ^um-Klärvorrichtung entfernt werden. Ohne Klärung ist an derartigen Urinproben ein Nachweis von Bakteriurie nach dem erfindungsgemassen Verfahren nicht möglich.

Um die Fliessgeschwindigkeit des Urins durch erfindungsgemäss verwendete 0,65 ,um-Filter zu erhöhen, können im Urin vorhandene Sedimente, wie Urate, in Lösung gebracht werden. Essigsäure ist ein für diesen Zweck geeignetes Lösungsmittel. Urinproben,

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die mit gleichen Volumina Essigsäure der pH-Werte 2,O, 2,5, 3,0, 3,5 und 4,0 vermischt sind, weisen eine erhöhte optische Transmission bei 540 nm nur bei einem pH-Wert von 2,5 oder darunter auf. Ferner ergeben Gemische aus Essigsäure vom pH-Wert 2, 5 und Urin in den meisten Fällen einen endgültigen pH-Wert von 3,5 bis 4,5 und erweisen sich bei der Färbereaktion der Bakterien nicht als nachteilig, d.h. die Bakterien behalten ihre Fähigkeit zur Reaktion mit Safranin.

Die als Verdünnungsmittel verwendete Essigsäure erhöht die Fliessgeschwindigkeit der Urinproben. In vielen Fällen ist die Färbungsintensität von mit Essigsäure verdünnten Urinproben grosser als die von entsprechenden Proben ohne Essigsäure. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass suspendierte Feststoffe, die durch die Essigsäure in Lösung gebracht werden, nicht mehr auf die am Filter festgehaltenen Bakterien auftreffen und dabei eine Anfärbung verhindern können.

Obgleich, wie vorstehend erwähnt, Essigsäure als Verdünnungsmittel die Fliessgeschwindigkeit von Urinen mit einem Gehalt an Feststoffen verbessert, bewirken stark pigmentierte Urine mit einem Gehalt an löslichen organischen Bestandteilen häufig eine Verstopfung von Membranen, was auf die Adsorption von Pigmenten an den O, 65 ^am-Filtern zurückzuführen ist. Zur Entfernung von Urinpigmenten können anionische Austauscherharze verwendet werden. Besonders bevorzugt wird das Austauscherharz A1O9-D (Diamond Shamrock; Cl~-form) , da mit diesem Harz der Urin fast farblos wird. Die Fliessgeschwindigkeiten von Urinen durch 0,65 ^m-Filter werden stark erhöht, wenn man den Urin zunächst über das anionische Austauscherharz gibt. Die Urinproben können dabei folgendermassen mit einem derartigen Harz behandelt werden: 3 ml einer Urinprobe werden über eine mit 5 g Austauscherharz gepackte Säule gegeben. Man gewinnt 2,5 ml der Probe im Harzfiltrat. Dieses Filtrat wird sodann mit einem gleichen Volumen Essigsäure als Verdünnungsmittel vermischt und über den Filter gegeben. An-

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schliessend wird, wie vorstehend erläutert, angefärbt und gewaschen.

Eine derartige Harzbehandlung erleichtert eine rasche Filtration der Probe durch den Filter. Die durchschnittliche Fliessgeschwindigkeit von derartigen Proben beträgt O, 2 min. Bestimmte positive Bakteriurie-Proben, die ohne eine derartige Harzbehandlung ein negatives Ergebnis vortäuschen, zeigen bei der Harzbehandlung positive Ergebnisse. Ausserdem passieren Urinproben, die ohne eine derartige Harzbehandlung eine Verstopfung der Filter bewirken würden, nach der Behandlung mit dem Harz leichter das Filter.

Im erfindungsgemässen Verfahren kann die Behandlung mit dem Kunstharz folgendermassen vorgenommen werden: Elkay-Filter (Serumseparatoren), d.h. 10 ml fassende Kunststoffröhrchen mit Filtern (30 bis 4O μτα) am Ende des Röhrchens und einem rund um das Ende hervorstehenden Rand, der eine Dichtung im Separator bildet, werden mit 5 g Kunstharz, das in Wasser mit einem Gehalt an 1 : 25O Formalin suspendiert ist, beschickt und in 16 mm-Reagenzgläser, die jeweils 2,5 ml Essigsäure vom pH-Wert 2,5 enthalten, gegeben. Die flüssige Phase der Kunstharzsuspension wird sodann unter vermindertem Druck abgezogen, wobei eine feuchte, mit Kunstharz gepackte Säule innerhalb des Separators zurückbleibt. Das verbleibende Formalin gewährleistet die Sterilität der Säule. Der Separator wird sodann in das 16 mm-Reagenzglas, das die Essigsäure enthält, gebracht, indem man den Rand des Elkay-Röhrchens in das 16 mm-Reagenzglas drückt und das Plastikröhrchen in die Essigsäure hineinführt. Diese Röhrchen können vor ihrer Verwendung vorbereitet und gelagert werden. Zum Verwendungszeitpunkt werden 3,O ml Urin in das Elkay-Röhrchen (das oberhalb der Kunstharzsäule ein Vorratsvolumen von etwa 4,5 ml aufweist) ge-

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2*

geben. Das Elkay-Röhrchen wird sodann ergriffen und langsam aus dem Reagenzglas entfernt. Dies bewirkt im Reagenzglas aufgrund des Elkay-Randes, der gegen die Seitenwand des Reagenzglases drückt, einen Unterdruck. Auf diese Weise wird die Urinprobe durch das Kunstharz gesaugt und in die Essigsäure eingebracht. Als Endergebnis erhält man eine 5 ml-Probe aus Urin und Essigsäure, die sodann nach dem erfindungsgemässen Verfahren filtriert, angefärbt und gewaschen werden kann.

Obgleich die als Verdünnungsmittel verwendete Essigsäure und das Austauscherharz die Leistungsfähigkeit des Verfahrens zum Nachweis von Bakteriurie erhöhen, gibt es doch gelegentlich Urinproben, bei denen aufgrund der Anwesenheit von Pigmenten, die durch das anionische Austauscherharz nicht entfernt werden, Schwierigkeiten auftreten. Blut Hämoglobin, bestinmte basische Arzneistoffe und basische Pigmente im Urin von Patienten mit bestimmten pathologischen Störungen bewirken eine Beschichtung des 0,65 ^um-Filters und verhindern ein Anfärben der Bakterien. Beispielsweise passieren bei Bearbeitung einer bluthaltigen Urinprobe die Erythrozyten das Kunstharz, da die Zellen mit diesem in keinen Austauschvorgang eintreten können. Beim Vermischen mit Essigsäure werden die Blutzellen lysiert und das basische Hämoglobin auf dem Filter in Form eines grünlichen Pigments konzentriert, was das Anfärben von Bakterien stört. Werden derartige Filter mit Wasserstoffperoxid behandelt, lässt sich diese Schwierigkeit lösen. Eine 3O-sekundige Behandlung eines Filters mit einem Gehalt an Hämoglobin mit 0, 2 ml 30-prozentigem H₂O₂ bewirkt eine vollständige Klärung der Filterfärbung. Eine Färbung des Filters mit Safranin-EDTA und eine nachfolgende Waschung zeigen, dass das Peroxid keine Wirkung auf die Färbbarkeit der Bakterien ausübt. Tatsächlich wird durch die Peroxidbehandlung häufig die Färbung der Bakterien verstärkt. Deshalb kann in allen Fällen, in denen auf den 0,65 ^m-Filtern überschüssiges Pigment (nach

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Behandlung mit Kunstharz und Essigsäure) auftritt, die vorbeschriebene Behandlung mit H_0_ 30 Sekunden vorgenommen werden. Anschliessend wird gemäss den vorstehenden Ausführungen angefärbt und gewaschen.

Bei sehr trüben, blutigen oder dunkel gelbbraun gefärbten Urinen lagert sich gelegentlich ein Niederschlag oder eine pigmentierte Verbindung auf der Membran ab. Eine Färbung von derartigem Material würde zu falschen positiven Ergebnissen führen. In derartigen Fällen, in denen die Urinproben so schwerwiegend mit Niederschlägen, wie Phosphaten, Carbonaten, Uraten oder Blut, verunreinigt sind, ist es möglich, sich des erfindungsgemässen Verfahrens zu bedienen, wenn die Probe bei niedrigen Tourenzahlen zentrifugiert wird, wobei eine Sedimentation der genannten Materialien ohne Sedimentation von Bakterien eintritt. Eine Zentrifugation bei Tourenzahlen in der Grössenordnung von 5OO U/min ist für diesen Zweck im allgemeinen ausreichend. Nach einer derartigen Zentrifugation passiert der Bakterien enthaltende Überstand leichter das Filter. Dieses Verfahren verringert die Möglichkeit von falschen positiven Ergebnissen und führt zur Entdeckung von positiven Ergebnissen, die sonst aufgrund von überschüssigen Pigmentablagerungen maskiert worden wären.

Das Präparat und die Verfahren der Erfindung können in ähnlicher Weise zum Anfärben, Nachweisen und Analysieren von gram-negativen und gram-positiven Bakterien in anderen Flüssigkeiten und fluiden Medien, wie Züchtungsmedien, Blut, Rückenmarkflüssigkeit und Wasser, sowie zum Anfärben von Bakterien, die aus derartigen Flüssigkeiten bzw. fluiden Medien auf Membranen abgelagert worden sind, verwendet werden.

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Beispiel 1

Eine loo ml-Probe von normalem, bakterienfreiem Urin wird mit E. coli (gram-negative Bakterien) versetzt, wobei die Endkonzentration 10 kolonienbildende Einheiten (CFU)/ml beträgt. Eine zweite Urinprobe wird in entsprechender Weise mit Staphylococcus aureus (gram-positive Bakterien) versetzt. Anschliessend werden die Urinproben mit Safranin-O (roter, basischer Farbstoff) in einer Verdünnung von 1 : 2OO OOO versetzt. Zur Kontrolle wird eine nicht mit Bakterien versetzte Urinprobe ebenfalls mit Farbstoff behandelt.

Die Proben werden 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) belassen. Sodann werden die 1Ό0 ml-Urinproben in Zentrifugenröhrchen 3O Minuten bei 3OOO U/min zentrifugiert. Sodann werden die Röhrchen auf die Anwesenheit von gefärbten Bakterien untersucht. Das Röhrchen mit einem Gehalt an E. coli zeigt ein Pellet (Niederschlag) am Boden des Röhrchens. Es lässt sich jedoch keine rote Färbung erkennen, sondern es ist nur die beim Pelletisieren von ungefärbten Bakterien typische graue Masse zu sehen. Im Röhrchen mit einem Gehalt an Staphylococcus aureus weist das Pellet eine rote Färbung auf. Das Kontrollröhrchen enthält keine pelletisierte Masse.

Der Versuch wird mit Kristallviolett und Toluidinblau wiederholt. In beiden Fällen ist das im E. coli-Röhrchen abgelagerte Pellet nicht gefärbt, während das Staphylococcus aureus enthaltende Röhrchen ein Pellet mit der Färbung des verwendeten Farbstoffs aufweist: Dunkelblau bei Verwendung von Toluidinblau, und Purpurrot bei Verwendung von Kristallviolett.

Beispiel 2

100 ml-Proben von normalem, gesammeltem Urin werden mit IO CFU/ml E. coli und Safranin-0 in einer Verdünnung von 1: 2OO OOO behandelt. Die Kontrollproben werden mit Farbstoff aber nicht

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mit Bakterien versetzt. Sämtliche Proben werden mit dem Tetranatriumsalz von EDTA in den nachstehend angegebenen Konzentrationen behandelt. Die Proben werden 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen und sodann in 100 ml-Zentrifugenröhrchen 30 Minuten bei 3OOO U/min zentrifugiert, um die Bakterien abzulagern.

Das am Boden der Röhrchen gebildete Bakterien-Pellet wird im Hinblick auf die darin vorhandene Menge an Safranin bewertet. O = keine Färbung der pelletisierten Bakterien; + = Spuren an Rotfärbung; +, ++, +++ und ++++ bedeuten steigende Mengen an Farbstoff, der an den Bakterien haftet. Ferner wird der nach dem Zentrifugieren erhaltene Flüssigkeitsüberstand auf seine Absorption bei der Wellenlänge des Farbstoffs (520 nm) untersucht, um den prozentualen Anteil des durch die Bakterien entzogenen Farbstoffs zu ermitteln. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Tabelle I

endgültige EDTA- E. coli enthaltender

Konzentration Urin

im Urin (m)

Kontrollurin

Pellet

Absorption

% ent fernt

Pellet Absorp- % enttion fernt

ohne
0,Ol
O, 02
O,O3
0,04
O.O5
0,06
O,O7

O,423 0,390 0,320 0,280 0,190 0,185 O,196 0,199

O
0
0
0
0
O
O
0

O.42O 0.415 O, 424 0.409 0.416 O.421 O,4O9 O.424

O 0 O O O O O O

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Die Ergebnisse von Tabelle I zeigen, dass in Anwesenheit von EDTA beträchtliche Farbstoffmengen an die Bakterien gebunden werden und im Pellet auftreten.

Bei Wiederholung des vorstehenden Versuchs mit den folgenden basischen Farbstoffen werden die gleichen Ergebnisse erhalten: Kristallviolett, Toluidinblau, Methylenblau und Neutralrot.

Beispiel 3

Gemäss Beispiel 2 werden mit verschiedenen Mikroorganismen unter Verwendung von Safranin-0 als Modellfarbstoff Untersuchungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestelIt.

Tabelle II

TestOrganismus

Gram- Farbstoffhaftunq

Färbung kein EDTA O,O5 m EDTA

E. coli
S. aureus
Proteus vulgaris
Pseudomonas
Group A Strep.
Group D Strep.
Klebsieila pn.

O 0

Es ergibt sich, dass bei gram-negativen Mikroorganismen zur Bindung des basischen Farbstoffs an die Bakterien im Urin die Anwesenheit eines chelatbildenden Mittels erforderlich ist, während gram-positive Bakterien durch den Farbstoff sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines chelatbildenden Mittels gefärbt werden.

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Weitere Versuche zeigen, dass basische Farbstoffe in einer Verdünnung von 1 : 50OO bei der Bildung von gefärbten Pellets aus Urin wirksamer sind als dies bei dem vorstehend verwendeten Farbstoff in verdünnter Form (d.h. 1 : 2OO OOO) der Fall ist. Auch bei den höheren Farbstoffkonzentrationen ist EDTA zur Haftung von Farbstoff an gram-negativen Mikroorganismen erforderlich.

Beispiel 4

In den nachstehend aufgeführten Verdünnungsmitteln werden 1 :

500-Suspensionen von Safranin-0 hergestellt. Die Proben wer-

2 den sodann 3O Minuten bei 1,06 kg/cm (15 psi) autoklavisiert. Nach dem Abkühlen werden die autoklavisierten Proben durch ein 0,22 >im-Millipore-Filter filtriert. Das Filtrat wird sodann mit dem gleichen Volumen 0, 1 m EDTA vermischt, wodurch eine endgültige Safranin-Verdünnung von 1 : lOOO und eine EDTA-Konzentration von 0,05 m entsteht.

IO ml-Proben von normalem Urin werden sodann durch Glasfaser-Epoxy-Finite-Filter von 13 mm Durchmesser und einer Porosität von 0,65^Um gegeben. Die Membranen, durch die der Urin passiert, sind mit den nachstehend angebenen Farbstoff-EDTA-Vorrats lösungen behandelt worden, indem man die Vorratslösungen 1 Minute lang mit den Membranen in Kontakt bringt. Anschliessend wird das Färbepräparat durch die Membran gesaugt. Sodann wird die Membran zur Entfärbung 2 mal mit je 5 ml Essigsäure vom pH-Wert 3 gewaschen.

Die Membranen werden folgendermassen bewertet: O = vollständige Entfärbung der Membran, die weiss aussieht; + = schwach rotstichig; ++ - rot bis purpurfarben gefärbt. Sämtliche Ergebnisse mit Ausnahme von "O" stellen falsche positive Ergebnisse dar. Ferner wird die Trübung der Vorratslösungen bewertet: O = keine Trübung und +, ++, +++ und ++++ = zunehmende

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Trübung. Die Farbstoffe werden sodann bei Umgebungstemperatur gelagert. Die Qualität der Suspension wird auf ähnliche Weise nach 24 Stunden bewertet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Verdünnungsmittel für den Membran-Farbstoff bewertung

Trübung der Farbstoff-EDTA-Vorratslösung nach O Std. 24 Std.

Destilliertes Wasser Kochsalzlösung

Trypticase-Soj abrühe (unverdünnt)

l:lO-Brühe in Wasser 1:1OO Brühe in Wasser Tryptosephosphatbrühe 1:IO Brühe in Wasser 1:1OO Brühe in Wasser

Trypticase-Sojabrühe 1:IO in Kochsalzlösung

Tryptosephosphatbrühe 1:10 in Kochsalzlösung

5% Glucose in Wasser 10% Kälberserum in Wasser 1% Natriumacetat

(nicht durchgeführt)

Die Ergebnisse zeigen, dass nur bei Verwendung von unverdünnter Tryptosephosphatbrühe, Trypticase-Sojabrühe und GlucoselÖsung ein gefärbtes Produkt entsteht, das durch Waschen mit Säure vollständig von der Membran entfernt werden kann. Sämtliche anderen Verdünnungsmittel, unter Einschluss von Verdünnungen der Brühen in Wasser oder Kochsalzlösung, ergeben in gewissem Umfang eine Färbung der Membran. Ferner tritt bei Lagerung

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C326-O3O , . .

2938b11 3 S"

über Nacht bei sämtlichen Farbstoff-EDTA-Gemischen, mit Ausnahme derer in unverdünnten Brühen, eine zumindest beginnende Fällung ein.

Beispiel 5

IO ml-Urinproben werden mit O,05 m EDTA und Safranin-O in einer Verdünnung von 1 : 10 OOO in Trypticase-Sojabrühe behandelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Die Proben werden sodann durch 13 mm-O,65 ^im-bakteriologische Membranen (Epoxy-Glasfasern) gegeben. Die Membranen werden sodann entsprechend den nachstehenden Angaben mit 5 ml Säure gewaschen. Anschliessend werden die Membranen bewertet, wobei O keine Färbung auf der Membran bedeutet und die Zeichen +, ++, +++ und ++++ eine zunehmende Membranfärbung bedeuten. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Tabelle IV

Waschagens normaler Urin (keine Bakterien)

Färbung vor dem Waschen Färbung nach dem

Waschen

Essigsäure, pH-Wert 3 4 4 O

Citronensäure, pH-Wert 3 4 + O

HCl, pH-Wert 3 4+ +4-

H SO., pH-Wert 3 4+ +

Salpetersäure, pH-Wert 3 44 44

Ähnliche Versuche werden mit Proben, die mit Bakterien versetzt sind, unter Verwendung von Essigsäure vom pH-Wert 3 durchgeführt. Die Ergebnisse werden entsprechend wie in Tabelle IV bewertet und sind in Tabelle V zusammengestellt.

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Tabelle V

zum Urin zugesetzte Urin + Bakterien

Testbakterien Färbung vor dem Färbung nach dem

Waschen Waschen

E. coli ++++ ++++

S. aureus +++ +++

Pseudomonas ++ ++

Group A Strep. ++++ ++++

Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass der an den Bakterien haftende Farbstoff durch Waschen mit einer organischen Säure nicht entfernt wird, während der freie, an der Membran adsorbierte Farbstoff durch eine derartige Waschung entfernt wird.

Beispiel 6

Nachstehend wird die Untersuchung von Patientenurin auf Bak- teriurie in einem pathognomisehen Ausmass (d.h. die Bakterien— konzentration im Urin beträgt 10 CFU/ml oder mehr) erläutert. Eine 9 ml Urinprobe wird mit 1 ml eines ΙΟ-fachen Safranin-O/ EDTA-Konzentrats versetzt, vermischt und 3O Minuten bei 25°C stehengelassen. Anschliessend wird die Probe in ein Gefäss gebracht, das der Reihe nach mit einem klärenden 5 ^im-Polypropylenfilz-Filter von 25 mm Durchmesser und einem Bakterienfilter von 13 mm Durchmesser (0,65 Jim weisses Glasfaser-Epoxy-Filter, das mit Essigsäure vom pH-Wert 3 entfärbt werden kann) verbunden ist. Der Urin wird durch das Polypropylenfilter und sodann mittels Unterdruck durch das Bakterienfilter geleitet. Nachdem die gesamte Probe die Filter passiert hat, werden die Filter mit 5 ml Essigsäure vom pH-Wert 3, die Formalin in einer Verdünnung von 1 : 5OO enthält, behandelt, wobei dieses Flüssigkeitsgemisch mittels Unterdruck durch beide Filter gesaugt wird. Das 13 mm-Glasfaser-Epoxy-Filter wird sodann

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auf seine Färbung untersucht. Die Färbung wird mit einem Nomogramm verglichen, wobei sich unter Zugrundelegung der Farbintensität der Membranen die erwartete Bakterienanzahl ergibt.

Bei Anwendung des vorstehenden Verfahrens in einem tatsächlichen klinischen Versuch färbt sich die Membranoberfläche orange:

zeigt.

orangerot, was etwa 10 CFU/ml Bakterien im Patientenurin an-

Beispiel 7

Um festzustellen, ob ein Patient auf ein Antibiotikum gut anspricht oder nicht, kann das Verfahren von Beispiel 6 in Abständen wiederholt werden. Eine antibiotische Wirkung zeigt sich, wenn sich nach dem Beginn der antibiotischen Therapie keine Bakterien feststellen lassen oder die Farbintensität verringert wird. Andererseits zeigt eine gleichbleibende oder zunehmende Farbintensität eine bakterielle Resistenz gegenüber dem verabfolgten Antibiotikum an.

Der Patient von Beispiel 6 erhält eine Therapie mit Keflin (Antibiotikum vom Penicillin-Typ)· Am folgenden Tag wird der Urin nochmals gemäss Beispiel 6 untersucht. Die Ergebnisse sind wiederum positiv. Es ergibt sich eine orangerote Färbung, die eine Bakterienkonzentration von etwa 10 CFU/ml anzeigt. Somit ergibt sich eine Resistenz der Mikroorganismen gegenüber Keflin. Sodann wird Gentamycin verabfolgt. Nach einer Untersuchung des Urins am folgenden Tag zeigt die Filteroberfläche eine nicht ganz weisse Färbung, was eine Abwesenheit von Bakterien oder eine sehr geringe Bakterienkonzentration anzeigt. Das letztgenannte Antibiotikum erweist sich somit als wirksam.

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^c326-°³⁰ 2338511

Beispiel 8

Alternativ zum Verfahren von Beispiel 6 kann eine Untersuchung auf Bakteriurie in pathogenen Konzentrationen auch folgendermassen vorgenommen werden: Eine 10 ml-Urinprobe wird durch ein bakteriologisches 0,65 ^m-Glasfaser-Epoxy-Filter von 13 mm Durchmesser (vgl. Beispiel 6) gegeben, um die im Urin enthaltenen Bakterien abzulagern. Die Membran wird sodann 30 Sekunden bis 1 Minute mit 0,5 ml eines Gemisches aus 1 : 1000 Safranin-0/0,05 m EDTA behandelt. Der Farbstoff wird sodann durch die Membran abgesaugt. Die Membran wird gemäss Beispiel 6 mit Essigsäure in Portionen von 3 bis 5 ml gewaschen. Eine Portion kann durch eine seitliche Ableitung entfernt werden, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Die anderen Portionen werden durch den Filter entfernt. Die Membranfärbung wird sodann zur Bestimmung des Bakteriuriegrads mit einem Nomogramm verglichen.

Beispiel 9

Septikämie oder Bakteriämie lässt sich folgendennassen feststellen: Eine Blutkultur wird hergestellt, indem man eine Blutprobe mit Kulturbrühe ΙΟ-fach verdünnt. Die Probe wird bei 36°C inkubiert. In stündlichem Abstand (erstmals 3 Stunden nach der ersten Inkubationsdauer bei 36°C) werden aus der Blutkultur Proben von 3 ml Volumen entnommen. Die Proben werden durch eine 2um-Klärmembran gegeben, um Blutzellen und Zellbruchstücke zu entfernen. Das Filtrat wird sodann gemäss Beispiel 6 mit Farbstoff und EDTA behandelt, mit der Ausnahme, dass die 3 ml-Probe nur mit 0, 3 ml Farbstof f-EDTA-Testlösung versetzt wird. Die Probe wird sodann 30 Minuten bei 25°C stehengelassen und anschliessend gemäss Beispiel 6 nacheinander durch das Klärfilter und das Glasfaser-Epoxy-Filter gegeben. Nach Waschen mit 5 ml Essigsäure/Formalin wird die Färbung des Filters ermittelt und mit einem Nomogramm verglichen.

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0 3.0 01 3/09 4

Die bei Untersuchung eines Patientenurins erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

	Tabelle VI
Std. nach	Färbung der
Züchtunasbeqinn	Membran
3	weiss
4	schwach rosa
5	orangefarben
6	orangerot
7	dunkelrot

Bewertung des Bakterienwachstums

* Bewertung wie in Beispiel 5

Die Ergebnisse zeigen, dass erfindungsgemäss nach einer Inkubationsdauer von nur 4 bis 5 Stunden eine Bakterienkonzentration von mindestens 10 CFU/ml in der Kultur nachgewiesen werden kann. Diese Inkubationszeit ist im Vergleich zu der Mindestdauer, die zur Bildung einer Trübung auch bei klaren (blutfreien) Flüssigkeiten erforderlich sind, kürzer. Derartige Trübungen treten im allgemeinen erst nach 24 Stunden auf.

Beispiel IO

5 ml Rückenmarkflüssigkeit eines Patienten mit septischer Meningitis werden zu 50 ml Kulturbrühe gegeben und bei 36°C inkubiert. In den nachstehend angegebenen Zeitabständen werden 3 ml-Proben aus der Kultur gewonnen und gemäss Beispiel 9 bearbeitet. Zu den gleichen Zeitpunkten wird die Kultur auf das Auftreten einer starken Trübung, die ein Bakterienwachstum anzeigen würde, beobachtet. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

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Mt

Tabelle VII

Std. nach Züchtungsbeginn	sichtbare Trübung der Kultur	Bewertung Färbung der des Bakte- Membran rienwachstums
3	O	weiss O
4	O	rosastichig- + orangefarben
5	O	orangefarben +
6	O	orangerot ++
7	+	rot +++
8	+	dunkelrot ++++

Die Anwesenheit von Bakterien lässt sich erfindungsgeinäss 3 Stunden vor dem Auftreten einer Trübung in den Züchtungsmedien feststellen. Dies bedeutet einen beträchtlichen Vorteil für Patienten mit ernsten Erkrankungen, wie Meningitis.

Beispiel 11

Die antimikrobielle Empfindlichkeit von Bakterien lässt sich folgendermassen bestimmen: Eine Bakteriensuspension in einer an organischen Bestandteilen reichen Brühe wird verdünnt und in Aliquotmengen eingeteilt (jeweils eine Aliquotmenge für das zu untersuchende Antibiotikum und eine Kontrolle) und in Vertiefungen in einer Küvette in Kontakt mit einer antimikrobiellen Elutionsscheibe gebracht. Eine Kontrolle entsprechend dem Zeitpunkt O wird hergestellt, indem man das ursprüngliche Inokulum mit Formalin versetzt und unter den Testbedingungen inkubiert und abliest. Die Küvetten werden durch kurzfristiges Drehen mit 200 U/min in einem Inkubator von 36 C bewegt und sodann inkubiert, bis mehrere Wachstumsgenerationen auftreten, das heisst 1 1/2 bis 3 Stunden. Die Kulturen werden sodann gemäss Beispiel 6 angefärbt und filtriert. Die Farbintensität der die antimikrobiellen Wirkstoffe enthaltenden Kulturen wird mit dem Kontrollwert verglichen. Resistente Kulturen zeigen die gleiche Farbintensität wie die Kontrollprobe,

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ORIGINAL INSPECTED

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während empfindliche Kulturen eine geringere Färbung zeigen. Die Färbung von teilweise resistenten Kulturen liegt dazwischen.

Beispiel 12

Die Antibiotikakonzentrationen in Blut lassen sich folgendermassen bestimmen: Aus Blut eines Patienten wird Serum gewonnen und in Kulturmedien einer 2-fach-Reihenverdünnung unterzogen. 1 ml-Proben der verschiedenen Serumverdünnungen werden in Röhrchen gegeben und jeweils mit 0,1 ml einer Suspension der ursprünglichen, vom Patienten isolierten Bakterien (etwa 10 CFU/ml) behandelt. Die Röhrchen werden sodann 2 bis 3 Stunden bei 36°C inkubiert.

Gleichzeitig wird ein Versuch mit einer zweiten Serie Röhrchen durchgeführt. In die Röhrchen dieser zweiten Serie werden 1 ml-Proben, die das im Blut des Patienten vorhandene Antibiotikum in bekannten Konzentrationen enthalten, gegeben. Die serienmässig verdünnten Antibiotikaproben werden sodann gemäss den vorstehenden Erläuterungen mit 0, 1 ml Bakteriensuspension behandelt und inkubiert.

Eine Kontrollprobe wird hergestellt, indem man eine 1 ml-Probe ohne Antibiotikum in ein Röhrchen gibt, mit 0,1 ml Bakteriensuspension behandelt und inkubiert.

Nach der 2-bis 3-stündigen Inkubationsdauer werden die Proben gemäss Beispiel 8 angefärbt, filtriert und gewaschen. Die Membranfärbungen werden bewertet, um die am stärksten verdünnte Serumprobe und die am geringsten konzentrierte Antibiotikaprobe (minimale Hemmkonzentration = MIC) , die eine Hemmwirkung des Bakterienwachstums zeigen, zu ermitteln. Dies bedeutet, dass die am wenigsten konzentrierte Serumprobe, die eine im Ver-

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gleich zur Kontrollprobe geringere Färbungsintensität aufweist bzw. die geringste Antibiotikakonzentration, bei der eine im Vergleich zur Kontrollprobe weniger intensive Färbung auftritt, ermittelt wird. Durch Multiplikation des Verdünnungsgrads mit der minimalen Hemmkonzentration erhält man die Konzentration des Antibiotikums im Blut des Patienten.

Beispiel 13

Mehrere Urinproben mit positiver Reaktion auf Bakteriurie (bestimmt durch Ausstreichen und Kolonienzählung) , die au-fgrund von suspendierten Feststoffen schwierig in der Vorrichtung zum Nachweis von Bakteriurie handzuhaben sind, werden mit einem gleichen Volumen Verdünnungsmittel aus Essigsäure vom pH-Wert 2,5 mit einem Gehalt an O,05 m Glycin versetzt. Zur Kontrolle werden jeweils entsprechende Urinproben mit einem gleichen Volumen an sterilem Wasser vermischt. Die gesamten Proben (2,5 ml Urin + 2,5 ml Essigsäure oder 2,5 ml steriles Wasser) werden sodann durch ein 0,65 ^m Filter von IO mm Durchmesser filtriert. Die Fliessgeschwindigkeit wird festgestellt. Die Filter werden sodann angefärbt und gemäss den vorstehenden Ausführungen mit Essigsäure vom pH-Wert 3 gewaschen. Die Farbintensitäten der Membranen werden ermittelt. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Tabelle VIII

Patient Nr.	Infektion durch	CFU/ml	Färbungsintensität des Filters/Fliessgeschwindig keit*	Urin + Essigsäure
			Urin + Wasser	+/1,7 ++/0,9 +/1,4 +/1,6
IO 11 12 13	Proteus E. coli E. coli Pseudomonas	ίο⁶ ίο⁶ 3xlO⁵ 5xlo⁵	verstopft +/1.9 verstopft verstopft

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H3

Tabelle VIII (Forts. )

Patient Nr.	Infektion durch	CFU/ml	Färbungsintensität des Filters/ Fliessaeschwindiqkeit	Urin + Essig säure
14	S. aureus	3xlO⁵	Urin + Wasser	+/O,7
15	Entero- cocci	6xlO⁵	0/1,8	O/l, 7
16	Entero- cocci	2xlO⁵	verstopft	+/O, 9
17	S. epider- midis	8xlO⁵	0/1,9	O/l, 4
18	K. pneu- moniae	10⁶	0/1,9	++/O.9
19	S. marces- cens	ίο⁶	+/2,0	+/O, 8
+/1,8

X Der Zähler gibt die Farbintensität der Filteroberfläche an, während der Nenner die zur Filtration der gesamten Probe erforderliche Zeit in Minuten angibt.

Beispiel 14

Eine Urinprobe, die einen übermässig hohen Präzipitatgehalt aufweist und stark pigmentiert ist, wird gemäss Beispiel 13 unter Verwendung von Essigsäure als Verdünnungsmittel bearbeitet. Obgleich die Urinprobe frei von sichtbarem Präzipitat ist, tritt doch eine Verstopfung der Membran ein, so dass der Test nicht beendet werden kann. Der Test wird wiederholt, indem 3 ml Urin über eine mit 5 g anionischem Austauscherharz (A1O9-D, Diamond Shamrock, Cl~-Form) gepackte Säule gegeben werden und 2,5 ml Eluat in 2,5 ml Essigsäure als Verdünnungsmittel aufgenommen werden. Die 5 ml-Probe wird sodann durch ein O,65 ^im-Filter gegeben, wofür lediglich O,2 Minuten erforderlich sind. Nach dem Anfärben und Waschen mit Essigsäure vom pH-Wert 3, wie vorstehend erläutert, ergibt sich eine

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rotgefärbte Filteroberfläche, was Bakteriurie anzeigt.

Bei Bearbeitung einer anderen Urinprobe, die beim Ausstreichen ein negatives Bakteriurieergebnis ergibt, wird das Filter bei blosser Verwendung von Essigsäure als Verdünnungsmittel verstopft. Wird die vorstehend erläuterte Behandlung mit dem Austauscherharz und die Aufnahme in Essigsäure als Verdünnungsmittel durchgeführt, so ergibt sich nach dem Anfärben und Waschen eine nicht ganz weisse Färbung der Membran, was ein negatives Ergebnis anzeigt.

Somit lassen sich bei gleichzeitiger Verwendung von Essigsäure vom pH-Wert 2,5 als Verdünnungsmittel und dem Austauscherharz Verstopfungsprobleme lösen. Bakteriurieuntersuchungen lassen sich somit sofort durchführen. Somit entfallen die bis 48-stündigen Wartezeiten, die sich beim Ausstreichen und Untersuchen des Kolonienwachstums ergeben.

Beispiel 15

Bluthaitiger Urin wird über das Anionenaustauscherharz von Beispiel 14 gegeben. 2,5 ml Eluat werden in 2,5 ml Essigsäure vom pH-Wert 2,5 als Verdünnungsmittel aufgenommen. Die gesamte Probe mit einem Volumen von 5 ml wird sodann über ein O, 65 ^im-Filter von 10 mm Durchmesser gegeben. Es ergibt sich ein grünlicher Pigmentüberzug auf der Membran. Eine Färbung des Filters mit Safranin/EDTA und ein Waschvorgang vom pH-Wert 3 ergibt eine hellgrüne Filteroberfläche. Eine Urinprobe wird sodann wieder nach dem vorstehend erläuterten Verfahren bearbeitet, mit der Ausnahme, dass das Filter 3O Sekunden vor dem Anfärben mit 0, 2 ml 30-prozentigem Wasserstoffperoxid behandelt wird. Nach dieser Behandlung wird das Peroxid durch das Filter abgesaugt. Sodann wird angefärbt und das Filter.mit Essigsäure vom pH-Wert 3 gewaschen. Die Ergebnisse zeigen eine stark positive Bakteriurie, da die Membranoberfläche keine

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Hf

Rotfärbung aufweist. Ein Ausstrichtest zeigt, dass die Urinprobe E. coli in einer Menge von 10 CFU/ml enthält.

Ein weiterer bluthaltiger Urin wird nach dem vorstehend erläuterten Verfahren bearbeitet, wobei jedoch die Peroxidbehandlung unterbleibt. Aufgrund des Pigmentgehalts ist es unmöglich festzustellen, ob Bakterien vorhanden sind. Nach Durchführung der vorstehend erläuterten Behandlung der grünlichen Filteroberfläche mit H₃Op zeigt sich kein Pigment auf der Membran. Nach dem Anfärben und Waschen mit Essigsäure ergibt sich eine typische, nicht ganz weisse Färbung, was ein negatives Testergebnis anzeigt. Beim Ausstreichen lassen sich keine Bakterien nachweisen.

Eine weitere Urinprobe, die ein fluoreszierendes gelbes Pigment enthält, ergibt eine gelbe Filteröberflache. Mit der Harzbehandlung ist eine Entfernung des Pigments nicht möglich. Nach dem Anfärben ergibt sich eine stark gelbe Färbung auf der Filteroberfläche. Durch Behandlung mit H-O₂ lässt sich das Pigment entfernen. Die übliche erfindungsgemässe Behandlung ergibt eine Rotfärbung. Die Probe enthält somit Bakterien, was sich anschliessend durch Ausstreichen bestätigen lässt.

Ende der Beschreibung

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Claims

C326-O3O 24. September 1979 Patentansprüche

1. Präparat zum Färben von Bakterien bei einem pH-Wert über etwa 7,0, enthaltend

(a) ein bei einem pH-Wert über etwa 7,O wirkendes, chelatbildendes Mittel und

(b) einen zum Anfärben von Bakterien bei einem pH-Wert über etwa 7,0 geeigneten Farbstoff.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als chelatbildendes Mittel ein Salz von Äthylendiamintetraessigsäure enthält.

3. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es als chelatbildendes Mittel ein Natriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure enthält.

4. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es als chelatbiIdendes'Mittel das Tetranatriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure enthält-

5. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als chelatbildendes Mittel ein Salz der Citronensäure enthält.

6. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als Farbstoff einen basischen Farbstoff enthält.

7. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als Farbstoff Safranin-0 , Toluidinblau, Methylenblau, Kristallviolett oder Neutralrot enthält.

8. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als Farbstoff Safranin-0 enthält.

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ORIGINAL INSPECTED

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9. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Tetranatriummäthylendiamintetraacetat in einer Konzentration von 0,001 bis 0,1m und Safranin-O in einer Verdünnung von 1 : 1000 bis 1: 3OO 0OO enthält.

10. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoff in nährstoffreichen organischen Medien gelöst ist.

11. Präparat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Medien um bakterielle Züchtungsmedien handelt.

12. Verfahren zum Färben von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bakterien bei einein pH-Wert von oder über etwa 7,0 mit einem Präparat in Kontakt bringt, das ein bei einem basischen pH-Wert wirkendes, chelatbildendes Mittel und einen zum Anfärben von Bakterien bei einem basischen pH-Wert geeigneten Farbstoff enthält.

13. Verfahren nach Anspruch L2, dadurch gekennzeichnet, dass man als chelatbildendes Mittel ein Salz von Äthylendiamintetraessigsäure verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man als Salz das Tetranatriumsalz verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man einen basischen Farbstoff verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man Safranin-0 als Farbstoff verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bakterien in einer fluiden Probe in Kontakt brinqt.

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18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man als fluide Probe Urin verwendet.

19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man den Kontakt der Bakterien auf einer seraipermeablen Membran durchführt, deren Porengrösse zum Zurückhalten von Bakterien ausreicht und die keine wesentlichen Mengen an freiem Farbstoff zurückhält.

20. Verfahren zum Nachweisen von Bakterien in Fluiden, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) die Bakterien mit einem Präparat färbt, das ein bei einem pH-Wert von über etwa 7,O wirkendes chelatbildendes Mittel und einen zum Anfärben von Bakterien bei einem pH-Wert über etwa 7,0 geeigneten Farbstoff enthält und

(b) die Bakterien konzentriert, wobei der mit den Bakterien assoziierte Farbstoff leicht sichtbar wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man als chelatbildendes Mittel ein Salz von Äthylendiamintetraessigsäure verwendet.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass man als Salz das Tetranatriumsalz verwendet.

23. Verfahren nach Anspruch 2O, dadurch gekennzeichnet, dass man einen basischen Farbstoff verwendet.

24. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man Safranin-0 als Farbstoff verwendet.

25. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man den Kontakt der Bakterien durch Zentrifugieren durchführt.

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26. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man das Konzentrieren der Bakterien durchführt, indem man die Bakterien auf einer semipermeablen Membran ablagert, die einen durchschnittlichen Porendurchmesser von etwa
0,2 bis etwa 1,0 um aufweist und keine wesentlichen Mengen an freiem Farbstoff adsorbiert.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass man als Membran einen Epoxy-Glasfaser-Filter mit einer
positiven Nettooberflächenladung verwendet.

28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoff in organischen Medien gelöst wird.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoff in bakteriellen Züchtungsmedien gelöst wird.

30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass man die Membran nach dem Ablagern der angefärbten Bakterien mit einer organischen Säure mit einem pH-Wert von etwa 2,7 bis 4,0 wäscht.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass man als organische Säure Essigsäure verwendet.

32. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass man die Membran mit einer organischen Säure mit einem
pH-Wert von etwa 2,5 bis 2,6 Wäscht.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass man als Säure Essigsäure verwendet.

34. Verfahren zum quantitativen Nachweis von Bakterien in einer fluiden Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man

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(a) die Bakterien mit einem Präparat anfärbt, das ein
bei einem pEI-Wert über etwa 7,O wirkendes, chelatbildendes Mittel und einen zum Anfärben von Bakterien
bei einem pH-Wert über etwa 7,0 geeigneten Farbstoff
enthält,

(b) die Bakterien konzentriert und

(c) anschliessend die Intensität der Färbung der Bakterien mit einem bekannten Standard vergleicht.

35. Verfahren zur Bestimmung der Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Mitteln, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) die Bakterien mit einem antimikrobiellen Mittel behandelt,

(b) anschliessend die Bakterien mit einem Präparat anfärbt, das ein bei einem pH-Wert über etwa 7,O wirkendes,
chelatbiIdendes Mittel und einen zum Anfärben von Bakterien bei einem pH-Wert über etwa 7,O geeigneten Farbstoff enthält,

(c) die Bakterien konzentriert und

(d) die reLative Intensität der Färbung der angefärbten,
konzentrierten Bakterien bestimmt, um ein Mass für
die reLative Wirksamkeit des antimikrobiellen Mittels zu erhalten.

}6. Verfahren zum Unterscheiden von qra,m-noqat iven und qrampositiven Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass man
(a) die Bakterien mit einem Präparat anfärbt, dis ein bei
tiiru.Mii pH-Wert über etwa 7,0 wirkender;, chelatbildend*!:;

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Mittel und einen zum Anfärben von Bakterien bei einem pH-Wert über etwa 7,0 geeigneten Farbstoff enthält,

(b) die Bakterien auf einer semipermeablen Membran ablagert, deren Porengrösse zum Zurückhalten von Bakterien ausreicht und die keine wesentlichen Mengen an freiem Farbstoff absorbiert, und

(c) anschliessend die Membran mit einer organischen Säure mit einem pH-Wert von etwa 2,5 bis 2,6 wäscht.

O.in-fl 1 3 /OiU 7