-
Gebiet der
Erfindung
-
Diese
Erfindung betrifft Verfahren zum Züchten von Mikroorganismen und
Verfahren zum Nachweis von Viren. Insbesondere betrifft diese Erfindung Verfahren
und Vorrichtungen zum Nachweis von Bakteriophagen.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Die
Mengenbestimmung von bakteriellen Viren ist für eine Anzahl von Fachgebieten
wichtig. Zum Beispiel handelt es sich bei der Gegenwart von Bakteriophagen
in einer Probe um ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder
Abwesenheit von Bakterien in dieser bestimmten Probe. Die Gegenwart
dieser Indikatororganismen wird allgemein zum Überprüfen von bakterieller Kontamination
in verschiedenen Produkten verwendet. Sowohl Wasser– als auch
Nahrungsmittelqualität
sind teilweise durch die Gegenwart oder Abwesenheit von Vertretern
der „Coliform"-Gruppe, einschließlich der
Gegenwart von Escherichia coli in einer Probe, definiert. Coliformen schließen Vertreter
der Enterobacteriaceae-Gruppe ein und weisen die Fähigkeit
auf, Lactose unter Gaserzeugung zu fermentieren. Die Gattungen Citrobacter,
Enterobacter, Klebsiella und Escherichia sind allgemein aufgelistete
Vertreter der Coliform-Gruppe.
-
Zudem
werden Bakteriophagen in molekularen Untersuchungen zur Genmanipulation
verwendet, wie durch die umfangreiche wirtschaftliche Verwendung
von genetisch modifizierten Bakteriophagenvektoren gezeigt. Genetisch
modifizierte Bakteriophagen sind von Händlern, einschließlich, jedoch nicht
beschränkt
auf, Stratagene (La Jolla, Kalifornien), Invitrogen (San Diego,
Kalifornien) und New England Biolabs (Beverly, MA) erhältlich.
Eine schnelle Mengenbestimmung von Bakteriophagen ist zum Beschleunigen
der Biotechno logieforschung wichtig.
-
Lytische
bakterielle Viren replizieren in der Bakterienzelle, was unter Freisetzung
von Virenvermehrung zu Bakterienlyse führt. Lytische Bakteriophagen
bilden im Wesentlichen klare Plaques auf einem Bakterienrasen (d.h.
einer zusammenfließenden
Bakterienbedeckung). Nicht lytische Bakteriophagen können eine
Zelle nicht lysieren. Stattdessen verlangsamt sich die Geschwindigkeit
des Wachstums von Bakterienzellen, und die Viren bilden trübe Plaques
auf einem Bakterienrasen.
-
Standardtests
vom Petrischalentyp für
Bakteriophagen sind auf dem Fachgebiet bekannt. In diesen Tests
wird agarhaltiges Medium in Petrischalen gegossen.
-
Eine
Probe, die im Verdacht steht, Bakteriophagen zu enthalten, oder
von welcher bekannt ist, dass sie Bakteriophagen enthält, wird
mit Bakterien kombiniert, die für
eine Infektion durch diesen Bakteriophagentyp in einem deckagarhaltigen
Medium empfänglich
istsind. Der Deckagar wird auf die Agarschale gegossen, man lässt esihn
verfestigen, und die Schale wird inkubiert, bis Flächen von
bakterieller Lysis, Plaques genannt, auf dem Bakterienrasen beobachtet
werden. Die Plaques werden gezählt,
und die Anzahl der Plaques wird im Hinblick auf die ursprüngliche
Probenverdünnung
eingestellt, um die Bakteriophagenkonzentration in der Probe zu
erhalten. Beispiele für
diese Verfahren sind zum Beispiel in Sambrook et al. (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY) offenbart. Die Ergebnisse werden
allgemein als plaquebildende Einheiten (pfu)/ml ausgedrückt.
-
Standardtests
mit Petrischalen für
Bakteriophagen sind langwierig und beschwerlich mühsam und
erzeugen häufig
ungenaue Ergebnisse, da es häufig
schwierig ist, sämtliche
Virusplaques auf dem Bakterienrasen zu sehen. Außerdem weisen agarhaltige Standardpetrischalen
eine relativ kurze Lagerhalbwertszeit auf. Der Agar kann austrocknen, und
die Schalen erfordern im Allgemeinen Tiefkühlung. Eine Fertigvorrichtung
zum Erleichtern für
der Bakteriophagenmengenbestimmung wird benötigt.
-
Der
Stand der Technik stellte mehrere Vorrichtungen bereit, die zum
Testen von flüssigen
Proben auf Bakterien und Schimmelpilze nützlich sind. Die Deutsche Patentanmeldung
Nr. 2055741, veröffentlicht
am 19. Mai 1971, offenbart ein mikrobielles Wachstumsmedium, das
aus einer inerten Karte oder einem inerten Band zusammengesetzt
ist, die/das mit einem trockengelierten Medium beschichtet. Die US-Patentschriften
Nr. 4,565,783, 5,44,963, 5,462,860 und 5,232,838 stellen eine Vorrichtung
eines Kulturmediums bereit, die ein in kaltem Wasser lösliches
Trockenpulver umfasst, das ein Geliermittel und mikrobielle Nährstoffe
für das
Mikrobenwachstum enthält,
die auf einer wasserundurchlässigen Oberfläche aufgetragen
sind, und Beispiele für
diese Vorrichtungen sind im Handel als „PETRI-FILM"-Vorrichtungen von
Minnesota Mining and Manufacturing Co., St. Paul, MN, erhältlich.
In diesen Quelltexten ist eine transparente Durchlese-Deckfolie
oben auf einer Oberfläche
positioniert. Das Aufbringen einer flüssigen Probe auf die Vorrichtung
hydratisiert das Geliermittel auf der Oberfläche unter Bildung eines gelartigen
Mediums zum Wachstum von Mikroorganismen. Diese Quelltexte stellen
plane Wachstumsoberflächen
mit Bedeckungen, die mit der den Mikroorganismus enthaltenden Oberfläche in Kontakt
sind. Solche Vorrichtungen sind zur Mengenbestimmung von Bakteriophagen
nicht geeignet, da ein direkter Kontakt einer Bedeckung mit einem
mit Bakteriophagen infizierten Bakterienrasen die Plaques verwischen
und ungenaue Ergebnisse für
die Bakteriophagenmengenbestimmung erzeugen würde.
-
US-Patentschrift
Nr. 5,089,413 offenbart eine Vorrichtung zum Wachstum von Mikroorganismen,
einschließlich
aeroben Mikroorganismen, wie Schimmelpilzen. Diese Vorrichtung setzt
eine luftdurchlässige
Membran ein, um das Wachstum von aeroben Organismen zu gewährleisten.
Ein Abstandhalter ist in der Vorrichtung offenbart, um die Wachstumsregion
zu definieren und eine wässerige
Probe von der Wachstumsregion des Mediums abzugrenzen. In dieser
Patentschrift ist, wie in den vorstehend genannten, die Abdeckung
so aufgebaut, dass sie mit der Wachstumsoberfläche in Kontakt ist, um die Probe über der
Wachstumsoberfläche
der Vorrichtung zu verteilen.
-
Es
besteht immer noch Bedarf nach einer Vorrichtung und einem Verfahren
zum schnellen und leichten Nachweis von Bakteriophagen ohne den
Bedarf von erheblichen Vorbereitungsschritten zur Herstellung und
Beibehaltung eines Vorrats von mit festem Medium beschichteten Schalen,
die zur Bakteriophagenreplikation auf einem Bakterienrasen geeignet
sind.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Diese
Erfindung beinhaltet die Verwendung eines fällbaren Farbstoffs und eines
Gegenfärbungsfarbstoffs
miteinander zur Verbesserung der Sichtbarmachung von von Bakteriophagen
abgeleiteten Plaques in zusammenfließenden Bakterienrasen in Bakteriophagentests.
-
In
einem Aspekt dieser Erfindung betrifft die Erfindung ein Verfahren
zum Nachweis von Bakteriophagen, umfassend die Schritte: Kombinieren
einer Bakteriophagen umfassenden Testprobe mit Bakterien, die die
Replikation der Bakteriophagen unterstützen können, unter Bildung einer flüssigen Probe;
Aufbringen der flüssigen
Probe des Kombinierungsschritts auf eine wasserfeste Oberfläche, wobei
die Oberfläche
mit der flüssigen
Probe mindestens einen Gegenfärbungs farbstoff,
mindestens einen fällbaren Farbstoff
und Nährstoffe
und Salze, die das Wachstum der Bakterien unterstützen können, umfasst,
wobei ein Niederschlag aus dem fällbaren
Farbstoff aus der enzymatischen Spaltung des fällbaren Farbstoffs durch ein
Enzym aus der flüssigen
Probe gebildet wird; Bilden eines Bakterienrasens auf einem Träger, positioniert
auf der Oberfläche;
und Nachweis von auf der Oberfläche
des Bakterienrasens gebildeten Plaques. In einer Ausführungsform
dieses Verfahrens umfasst die flüssige
Probe einen verfestigungsfähigen
Träger
in flüssiger
Form. Alternativ dazu kann die Oberfläche des Aufbringungsschritts
einen hydratisierbaren verfestigenden Träger umfassen. In einer Ausführungsform
umfasst die Oberfläche
des Aufbringungsschritts einen halbfesten Träger. Der Träger dieser Erfindung kann eine
Vielzahl an Geliermitteln, einschließlich Guar, Agar, Methylcellulose und
dergleichen, einschließen.
In diesem Verfahren kann die flüssige
Probe des Kombinierungsschritts Nährstoffe und Salze umfassen,
um das Wachstum eines zusammenfließenden Bakterienrasens zu gewähren, und
kann die Testprobe eine Verdünnung
einer ursprünglichen
Bakteriophagen enthaltenden Probe, sein. Vorzugsweise umfasst der
Aufbringungsschritt das Gießen
der flüssigen
Probe auf die Oberfläche.
-
In
einer Ausführungsform
dieses Verfahrens kann der Bakteriophage in Bakterien, ausgewählt aus
der Gruppe von E. coli, Enterobacter, Salmonella, Staphylokokken,
Listeria und Mycobacterium, replizieren.
-
Das
Verfahren dieser Erfindung setzt einen fällbaren Farbstoff und einen
Gegenfärbungsfarbstoff ein.
Vorzugsweise ist der Gegenfärbungsfarbstoff Kristallviolett.
Ebenso vorzugsweise ist der fällbare Farbstoff
chromogen und bildet vorzugsweise einen blauen Niederschlag. In
einer Ausführungsform
umfasst die Oberfläche
mit der flüssigen
Probe ferner einen pH- empfidlichen
Farbstoff, und in einer bevorzugten Ausführungsform ist der pH-empfindliche Farbstoff
Neutralrot. In einer Ausführungsform
ist der fällbare
Farbstoff 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure.
-
In
einer anderen Ausführungsform
dieser Erfindung schließt
die Oberfläche
mit der flüssigen
Probe ein Induktionsmittel für
das zur enzymatischen Spaltung des fällbaren Farbstoffs fähige Enzym
ein. Vorzugsweise ist das Induktionsmittel ausgewählt aus
der Gruppe von 1-O-Methyl-β-D-glucuronid,
Isopropyl-β-D-thioglucuronsäure, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid,
3-O-Methyl-α-D-glucopyranosid und 1-O-Methyl-β-D-glucopyranosid.
Das Induktionsmittel kann in der Oberfläche, im Träger, in der flüssigen Probe
oder in einer Kombination davon eingeschlossen sein. In einer Ausführungsform
ist das den Farbstoff spaltende Enzym ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus einer β-D-Glucuronidase,
einer β-D-Galactosidase,
einer alkalischen Phosphatase und einer sauren Phosphatase. Der
Durchschnittsfachmann erkennt, dass ein bestimmtes Induktionsmittel
zum Unterstützen
der Herstellung eines bestimmten Enzyms verwendet werden kann.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst die flüssige
Probe einen Gegenfärbungsfarbstoff,
den fällbaren
Farbstoff und Nährstoffe
und Salze für
das Bakterienwachstum, und in einer anderen Ausführungsform umfasst der halbfeste
Träger
den Gegenfärbungsfarbstoff,
den fällbaren
Farbstoff und Nährstoffe
und Salze für
das Bakterienwachstum. In noch einer anderen Ausführungsform
umfasst der hydratisierbare verfestigende Träger den Gegenfärbungsfarbstoff,
den fällbaren
Farbstoffe und Nährstoffe
und Salze für
das Bakterienwachstum.
-
Ein
anderer Aspekt dieser Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum
Durchführen
eines Bakteriophagenplaquetests, wobei die Verbesserung den Nachweis
von Bakteriophagen auf einem Bakterienrasen auf einem Träger umfasst,
wobei der Träger
einen Gegenfärbungsfarbstoff
und einen fällbaren Farbstoff
umfasst, wobei ein Niederschlag aus der enzymatischen Spaltung des
Farbstoffs durch ein im Bakterienrasen vorliegendes Enzym gebildet
wird; und das Identifizieren von Plaques auf dem Bakterienrasen.
-
In
einem anderen Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis
von Bakteriophagen offenbart, umfassend die Schritte: Kombinieren
von Bakterien und Bakteriophagen unter Bildung einer flüssigen Probe,
wobei die Konzentration von Bakterien zur Bildung eines Bakterienrasens
ausreichend ist; Zugabe der flüssigen
Probe zu einer Mulde, umfassend im Wesentlichen senkrechte Seiten
und eine wasserfeste Oberfläche
mit einem darauf dispergierten wasserhydratisierbaren Material,
wobei das wasserhydratisierbare Material einen Gegenfärbungsfarbstoff
und einen fällbaren
Farbstoff umfasst, und wobei die flüssige Probe in der Mulde einen
Träger bildet,
der zur Bildung und Sichtbarmachtung von von Bakteriophagen abgeleiteten
Plaques geeignet ist; und Inkubieren der Probe, bis mindestens eine
gesonderte Plaque sichtbar ist.
-
In
einer Ausführungsform
kann der Bakteriophage in Bakterien, ausgewählt aus der Gruppe E. coli,
Enterobacter, Salmonella, Staphylokokken, Listeria und Mycobacterium,
wachsen. In einer anderen Ausführungsform
umfasst die flüssige
Probe des Kombinierungsschritts Nährstoffe und Salze für das Bakterienwachstum.
Alternativ dazu umfasst das hydratisierbare Material ferner Nährstoffe
und Salze für das
Bakterienwachstum. In einer Ausführungsform ist
der Gegenfärbungsfarbstoff
Kristallviolett, und in einer anderen erzeugt der fällbare Farbstoff
einen blauen Niederschlag. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
umfasst das hydratisierbare Material ferner einen pH-empfindlichen
Farbstoff, und vorzugsweise ist der pH-empfindliche Farbstoff Neutralrot.
In einer Ausführungsform
ist der fällbare
Farbstoff 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure.
-
Das
hydratisierbare Material einer Ausführungsform kann ein Induktionsmittel
für ein
Enzym, das den fällbaren
Farbstoff enzymatisch spalten kann, und ein entsprechendes Enzym-Induktionsmittel,
ausgewählt
aus der Gruppe 1-O-Methyl-β-D-glucuronid,
Isopropyl-β-D-thioglucuronsäure, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid,
3-O-Methyl-α-D-glucopyranosid
und 1-O-Methyl-β-D-glucopyranosid, umfassen.
-
Diese
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien,
umfassend die Schritte: Inkontaktbringen einer erste Bakterien umfassenden
Probe mit Bakteriophagen in einer Flüssigkeit unter Bildung einer
flüssigen
Probe; Entfernen der Bakteriophagen, die nicht in Kontakt mit den
ersten Bakterien in der flüssigen
Probe sind; Zugabe der Bakterien aus dem Schritt des Inkontaktbringens
zu einer wasserfesten Oberfläche,
wobei die wasserfeste Oberfläche
mit der flüssigen
Probe einen Gegenfärbungsfarbstoff
und einen fällbaren
Farbstoff umfasst; Bilden eines Bakterienrasens aus zweiten Bakterien,
wobei die Bakteriophagen in dem Bakterium des Bakterienrasens replizieren
können;
und Nachweis einer Vielzahl von Plaques, wobei ein Niederschlag
in den Plaques gebildet wird und der Niederschlag das Produkt einer
enzymatischen Spaltung des fällbaren
Farbstoffs durch ein Enzym aus den Bakterien des Bakterienrasens
ist, und wobei der Nachweis mindestens eines Plaques auf dem Bakterienrasen
auf die Gegenwart des ersten Bakteriums in der Testprobe hinweist.
In einer Ausführungsform dieses
Verfahrens ist das Bakterium des Schritts des Inkontaktbringens
von dem Bakterium des Bakterienrasens verschieden und können die
Bakteriophagen vorzugsweise sowohl in den Bakterien des Schritts des
Inkontaktbringens als auch in den Bakterien des Bakterienrasens
replizieren.
-
In
einer Ausführungsform
dieses Verfahrens umfasst die wasserfeste Oberfläche mit der flüssigen Probe
einen Träger
für Bakterienwachstum.
In einer anderen Ausführungsform
umfasst die flüssige
Probe einen verfestigungsfähigen
Träger
in flüssiger
Form, und in einer weiteren Ausführungsform
umfasst die wasserfeste Oberfläche
einen verfestigungsfähigen Träger in flüssiger Form,
und in einer anderen Ausführungsform
umfasst der Träger
einen hydratisierbaren verfestigenden Träger.
-
In
einem Aspekt dieses Verfahrens ist der Gegenfärbungsfarbstoff Kristallviolett
und in einer anderen ist der fällbare
Farbstoff 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure. In
noch einem anderen Aspekt dieses Verfahrens umfasst der Träger Neutralrot und
schließt
die Oberfläche
mit der flüssigen
Probe vorzugsweise ein Induktionsmittel für das Enzym des Nachweisschritts
ein. In einer Ausführungsform
ist das Induktionsmittel ausgewählt
aus der Gruppe 1-O-Methyl-β-D-glucuronid,
Isopropyl-β-D-thioglucuronsäure, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, 3-O-Methyl-α-D-glucopyranosid und
1-O-Methyl-β-D-glucopyranosid.
-
Vorzugsweise
kann können
die Bakteriophagen in Bakterien replizieren, und ausgewählte Bakterien,
die Wirte für
Bakteriophagen sein können, schließen diejenigen,
ausgewählt
aus der von Gruppe E. coli, Enterobacter, Salmonella, Staphylokokken,
Listeria und Mycobacterium, ein.
-
In
noch einem anderen Aspekt dieser Erfindung betrifft die Erfindung
eine Einwegvorrichtung zum Nachweis von Bakteriophagen, umfassend: mindestens
eine Mulde, umfassend eine wasserfeste Oberfläche und im Wesentlichen senkrechte
Seiten, die eine Mulde bilden, wobei die Seiten einen oberen Teil
und einen Boden aufweisen, wobei die Seiten sich mit mindestens
5 Millimetern Höhe
von der Oberfläche
weg erstrecken; und ein auf der wasserfesten Oberfläche positioniertes
hydratisierbares Material, wobei das Material einen fällbaren
Farbstoff und einen Gegenfärbungsfarbstoff
umfasst, wobei der Gegenfärbungsfarbstoff
das hydratisierbare Material färben
kann, und wobei der fällbare
Farbstoff durch mindestens ein Enzym aus einem Bakterium unter Bildung
eines Niederschlags dort, wo sich die Bakteriophagenplaque befindet,
gespalten werden kann.
-
Die
Vorrichtung umfasst vorzugsweise eine entfernbare Abdeckung, die
im Wesentlichen für
Bakterien undurchlässig
ist, wobei die Abdeckung oben auf den im Wesentlichen senkrechten
Seiten der Mulde aufliegt. In einer Ausführungsform ist die Abdeckung
transparent. Vorzugsweise ist die wasserfeste Oberfläche undurchsichtig,
und in einer Ausführungsform
ist die wasserfeste Oberfläche
weiß.
-
Kurze Beschreibung
der Figuren
-
1 ist
eine Perspektivansicht von oben einer bevorzugten Vorrichtung der
Erfindung.
-
Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mengenbestimmung
von Bakteriophagen und Verfahren und Vorrichtungen zum Unterstützen der Sichtbarmachung
von viralen Plaques zum Erleichtern der Virusmengenbestimmung. In
einem Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Bakteriophagen
auf einem festen oder halbfesten Träger offenbart, der auf einer
Petrischale oder einer Trockenpulverkulturvorrichtung, wie Dünnfilmkulturvorrichtungen,
einschließlich
Vorrichtungen vom „PETRI-FILM"-Typ, gebildet ist.
Die Erfindung lehrt ein Verfahren zum Verbessern der Sichtbarmachung
und deshalbdamit der verbesserten Mengenbestimmung von Bakteriophagenplaques
unter Verwendung einer Kombination von Farbstoffen.
-
Der
Begriff „Bakteriophage" wird hier verwendet,
um ein Virus zu bezeichnen, das Bakterien infizieren und in ihnen
replizieren kann. Der Begriff „Plaque" wird hier verwendet,
um frei gemachte Flächen
oder Flächen
mit einer von Bakteriophagen abgeleiteten Diskontinuität auf einem
Bakterienrasen zu bezeichnen. Der Begriff „Träger" wird hier verwendet, um ein festes
oder halbfestes Medium zu bezeichnen, das Bakterienwachstum in einer
Weise unterstützen
kann, die die Bildung und Sichtbarmachung von viralen Plaques gewährleistet.
-
Ein
Aspekt dieser Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von
Bakteriophagenplaques auf einem Bakterienrasen. Es wurde gefunden,
dass die Kombination aus mindestens einem fällbaren Farbstoff mit mindestens
einem Gegenfärbungsfarbstoff
den Nachweis von Bakteriophagenplaques im Wwesentlichen verbessert.
Mehr als ein fällbarer Farbstoff
und mehr als ein Gegenfärbungsfarbstoff können in
dieser Erfindung verwendet werden.
-
Der
Begriff „Gegenfärbungs"-Farbstoff bedeutet
bezieht sich auf Farbstoffe, die zumindest den Träger, gegebenenfalls
das Bakterium selbst färben können, und
Wachstum des Bakterienrasens und Sichtbarmachung der viralen Plaques
auf dem Bakterienrasen gewährleistet.
Diese Gegenfärbungsfarbstoffe
reagieren nicht mit ihrer Umgebung, das heißt, sie sie sind zum Beispiel
nicht pH-empfindlich. Wie in dieser Erfindung verwendete Gegenfärbungsfarbstoffe
können
können
eine Vielzahl von Farbstoffen einschließen. Beispiele für diese
Farbstoffe schließen
Kristallviolett (C.I. 42555), Rosaanilin (C.I. 42510), Methylgrün (C.I.
42585), Viktoriablau (C.I. 42563), Echtgrün (C.I. 42053), Safranin O
(C.I. 50240), Trypanblau und eine Vielzahl an auf dem Fachgebiet
bekannten Lebensmittelfarbstoffen ein, istsind jedoch nicht darauf
nicht darauf beschränkt. Ein
bevorzugter Farbstoff dieser Erfindung ist Kristallviolett. Andere
geeignete die Merkmale erfüllende Farbstoffe
sind bekannt und in einer Vielzahl von Texten, einschließlich, zum
Beispiel: Kiernan, JA, Histological & Histochemical Methods: Theory & Practice, 1981,
Pergamon Press, New York, detailliert beschrieben.
-
Fällbare Farbstoffe
dieser Erfindung sind vorzugsweise zumindest teilweise in Wasser
löslich und
dienen als Substrat für
ein bakterielles oder virales Enzym zur Herstellung eines gefärbten Niederschlags.
Es gibt eine Anzahl von verschiedenen identifizierten Enzymen, die
die fällbaren
Farbstoffe dieser Erfindung enzymatisch spalten können. Diese Enzyme
schließen
Glycosidasen, Esterasen, Phosphatasen und Sulfatasen ein, sind jedoch
nicht darauf beschränkt.
Geeignete Farbstoffe schließen
diejenigen ein, die durch Bakterienenzyme des Bakterienrasens metabolisiert
werden oder damit auf andere Weise reagieren, und dies unter Bildung
eines gefärbten
Niederschlags tun, der die Sichtbarmachung der Bakteriophagenplaques
verbessert. Diese Farbstoffe sind chromogen, indem sie einen gefärbten Niederschlag
erzeugen. Vorzugsweise ist der gefärbte Niederschlag nicht weiß.
-
Eine
Vielzahl von fällbaren
Farbstoffen, die in die Verfahren und Vorrichtungen dieser Erfindung eingebracht
werden können,
ist bekannt, wobei diese indolylhaltige Farbstoffe, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf, 5-Brom-4-chlorindolylphosphat oder Dinatriumsalze dieser Verbindung,
5-Brom-4-chlorindolylpyranosid
oder Dinatriumsalze dieser Verbindung, einschließlich 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure, 5-Brom-3-chlor-3-indoxyllyl-β-D-galactosid, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D- glucopyranosid, 6-Chlor-3-indolylphosphat, 5-Brom-6-chlor-3-indolylphosphat,
einschließen.
-
Vorzugsweise
ist der gefärbte
Niederschlag blau. Substrate, die einen blau gefärbten Niederschlag bilden,
schließen
5-Brom-4-chlor-3-indoxylxyl-N-acetyl-β-D-galactosaminid, 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-cellobiosid, 5-Brom-4-chlor-3-β-D-fucopyranosid, 5-Chrom-4-chlor-3-indoxyl-α-D-galactopyranosid, 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-galactopyranosid, 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glucopyranosid, 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glucopyranosid, 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glucuronsäure-Cyclohexylammoniumsalz,
5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glucuronsäure-Natriumsalz
und 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-xylopyranosid
ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
-
Die
Farbstoffe können
als Substrate für
bestimmte in verschiedenen Bakterientypen vorliegende Enzyme dienen.
Zum Beispiel schließen
einen blauen Niederschlag erzeugende Farbstoffe, die Substrate für Esterasen
sind, 5-Brom-4-chlor-3-indoxylbutyrat, 5-Brom-4-chlor-3-indoxylcaprylat
und 5-Brom-4-chlor-3-indoxylpalmitat ein, sind jedoch nicht darauf
beschränkt.
Substrate für
Phosphatasen schließen
5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat-Di(2-amino-2-methyl-1,3-propanediol)salz, 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat-Dinatriumsalz, 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat
und -p-Toluidinsalz, 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat
und das Kaliumsalz ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
-
Chromogene
Farbstoffe, die Substrate für Glycosidasen
sind, schließen
3-Indoxyl-β-D-galactopyranosid,
3-Indoxyl-β-D-glucopyranosid,
3-Indoxyl-β-D-glucuronsäure-Cyclohexylammoniumsalz und
3-Indoxyl-β-D-glucuronsäure-Natriumsalz
ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Andere chromogene Substrate
für Phosphatasen
schließen
3-Indoxylphosphat-Di(2-amino-2- methyl-1,3-propandiol)salz
und 3-Indoxylphosphat-Dinatriumsalz,
3-Indoxylphosphat-p-Toluidinsalz ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Substrate
für Sulfatasen
schließen 3-Indoxylsulfat-Kaliumsalz
ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
-
Fällbare Farbstoffe,
die eine Magentafarbe erzeugen, für Glycosidasen, Esterasen,
Phosphatasen und Sulfatasen, schließen 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid, 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-β-galactopyranosid, 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid, 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-β-D-glucopyranosid
und 5-Brom-6-chlor-3-indoxylglucuronsäure-Cyclohexylammoinumsalz
als Substrate für
Glycosidasen; 5-Brom-6-chlor-3-indoxylbutyrat-, 5-Brom-6-chlor-3-indoxylcaprylat
und 5-Brom-6-chlor-3-indoxylpalmitat, die als Substrate für Esterasen
dienen; 5-Brom-6-chlor-3-indoxylphosphat-p-Toluidinsalz
für Phosphatasen
und 5-Brom-6-chlor-3-indoxylsulfat-Kaliumsalz,
die als Substrate für
Sulfatasen dienen, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
-
Fällbare Farbstoffe,
die eine lachsartige Farbe erzeugen, für Glycosidasen, Esterasen und
Phosphatasen schließen
6-Chlor-3-indoxyl-β-galactopyranoside,
6-Chlor-3-indoxyl-β-D-glucopyranoside
und 6-Chlor-3-indoxyl-β-D-glucuronsäure-Cyclohexylammoniumsalz
für Glycosidasen;
6-Chlor-3-indoxylbutyrat, 6-Chlor-3-indoxylcaprylat und 6-Chlor-3-indoxylpalmitat
für Esterasen;
und 6-Chlor-3-indoxylphosphat-p-Toluidinsalz für Phosphatasen ein, sind jedoch
nicht darauf beschränkt.
-
Chromogene
Substrate, die eine Purpurfarbe erzeugen, schließen 5-Iod-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid
ein, und Chromogene Substrate, die eine grüne Farbe erzeugen, schließen N-Methylindoxyl-β-D-galactopyranosid
ein.
-
Andere
fällbare
Farbstoffe schließen
4,6-Dichlor-N- acetylindol-3-ol,
6-Chlorindolyl-β-D-galactosidpentaacetat,
6-Chlorindolyl-β-D-galactosid, 6-Chlorindoxy-1,3-diacetat, 5-Chlor-2-carboxyphenylglycin-Natriumsalz, 4-Chloranthranilsäure, Methyl[6-chlor-N-acetylindol-3-yl-(2,3,4-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranosid)]uronat,
6-Chlorindolyl-β-D-glucopyranosiduronat-Monocyclohexylammoniumsalz,
Chlorindigos, erörtert
von Sadler er al., J Am Chem. Soc. 78:1251–1255, 1956, sowie 4,6-Dichlorindolyl-β-D-glucuronid,
6,7-Dichlorindolyl-β-D-glucuronid,
6,7-Dichlorindolyl-β-D-glucuronid, 4,6,7-Trichlorindolyl-β-D-glucuronid,
4,6-Dichlorindolyl-β-D-galactosid,
6,7-Dichlorindolyl-β-D-galactosid und 4,6,7-Trichlorindolyl-β-D-galactosid
ein. Der Fachmann kann diese und/oder andere fällbare Farbstoffe in Plaquetests
zum Nachweis von Bakteriophagen ohne übermäßige Versuche testen.
-
Diese
Verbindungen und andere fällbare Farbstoffe,
die im Umfang dieser Erfindung erwogen sind, werden unter Bildung
eines unlöslichen
Niederschlags durch bakterielle Enzyme gespalten. Vorzugsweise werden
die fällbaren
Farbstoffe in einer Endkonzentration von etwa 0,01 mg/ml bis etwa
0,5 mg/ml und besonders bevorzugt mit etwa 0,02 mg/ml bis etwa 0,2
mg/ml verwendet. Der Fachmann erkennt, dass optimale Konzentrationsbereiche,
die in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, vom Typ
des verwendeten fällbaren
Farbstoffs abhängen.
Eine zu geringe Farbstoffkonzentration erzeugt einen Niederschlag,
der für
eine Plaquemengenbestimmung nicht sichtbar gemacht werden kann,
und eine zu hohe Farbstoffkonzentration kann für Bakterienwachstum toxisch
sein. Folglich kann der Farbstoffgehalt ohne wesentliches Experimentieren
bestimmt werden.
-
Der
fällbare
Farbstoff und der Gegenfärbungsfarbstoff
liegen im Träger
vor, und diese Kombination verbessert die Sichtbarmachung der Plaques.
Wie in Beispiel 1 gezeigt, könnenwaren,
als ein fällbarer
Farbstoff allein im Träger
vorlag und für den
Bakterienrasen verfügbar
war, Plaques zu sehen, jedoch erzeugte die Kombination aus dem fällbaren
Farbstoff mit dem Gegenfärbungsfarbstoff, verglichen
mit den Standardbakteriophagentests oder Tests unter Einsatz eines
fällbaren
Farbstoffs alleine, Abstreichergebnisseeindrucksvolle Ergebnisse.
Bedeutenderweise kann die verbesserte Sichtbarmachung von Plaques
die Plaquemengenbestimmung verbessern und führt zu einemr besseren Zugang
zuBestimmung der in einer bestimmten Probe vorliegenden Bakteriophagenmenge.
-
Die
Verwendung der Farbstoffkombination dieser Erfindung kann in eine
Vielzahl von plaquebildenden Bakteriophagentests, einschließlich Standard-Petrischalenbakteriophagentests
auf Agarbasis, eingebracht werden. Eine bevorzugte Verwendung der
Farbstoffkombination dieser Erfindung ist die Verwendung dieser
Farbstoffe in Trockenpulver- oder Dünnfilmkultursystemen.
-
Der
Träger
dieser Erfindung bezieht sich auf Agar, Guar, Methylcellulose oder
einen anderen festen oder halbfesten gelartigen Träger, der
die Bildung eines Bakterienrasens und die Sichtbarmachung von Virusplaques
gewährt.
Der Träger
kann durch Hydratisieren eines wasserhydratisierbaren Materials
gebildet werden, das dann gelieren kann, wobei das wasserhydratisierbare
Material auf einer wasserfesten Oberfläche positioniert ist, oder
der Träger
kann als in flüssiger
Form auf eine wasserfeste Oberfläche aufgebrachtes
verfestigungsfähiges
Material zugesetzt werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Träger als
Kombination aus einem auf einem wasserfesten Träger positionierten wasserhydratisierbaren
Material und einem in flüssiger
Form, auf die wasserfeste Oberfläche
aufgebrachten verfestigungsfähigen
Material erhalten werden. Vorzugsweise enthält der Träger nach dem Verfestigen auf
der wasserfesten Oberfläche
den (die) Gegenfärbungsfarbstoff(e),
den (die) fällbaren Farbstoff(e)
und Nährstoffe
und Salze für
die Unterstützung
von Bakterienwachstum.
-
Petrischalenbakteriophagentests
auf Agarbasis sind bekannt. Petrischalen in einer Vielzahl von Größen, einschließlich Kulturschalen
mit mehreren Mulden, sind auf dem Fachgebiet bekannt und von Lieferanten,
wie Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) und Nunc Nalgene (Rochester,
NY) erhältlich.
In diesen Tests erhalten agarhaltige Petrischalen ein Deckagargemisch,
das Deckagar, Bakterien, die die Replikation eines Bakteriophagen
unterstützen
können, und
verschiedene Verdünnungen
einer die Bakteriophagen enthaltenden Testprobe einschließen. Während der
Bakteriophage repliziert, bildet die Bakterienlyse Plaques oder
frei gemachte Bereiche oder Berieche mit reduzierter Undurchsichtigkeit
auf dem zusammenfließenden
Bakterienrasen. Die Verwendung der Farbstoffkombination dieser Erfindung
führt zu
einer verbesserten Sichtbarmachung der Plaques. Die Farbstoffkombination
kann der Bodenagarschicht auf der Petrischale zugesetzt werden,
oder die Farbstoffkombination kann der Deckagarschicht zugesetzt werden
oder eine Kombination davon.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung wird die erfindungsgemäße Farbstoffkombination in
ein für
eine Bakteriophagenmengenbestimmung modifiziertes Trockenpulverkultursystem
eingebracht. Zum Beispiel ist eine bevorzugte Vorrichtung dieser
Erfindung in 1 dargestellt. Ein Körperteil 10 schließt eine
Folie mit einer wasserfesten Oberfläche 12 und ein Trockenpulver 16 ein,
wobei das Trockenpulver 16 daran befestigt ist und zumindest
die Wachstumsregion der oberen Fläche der Oberfläche 12 unter
Verwendung in einer Ausführungsform
eines Klebstoffs 14 oder eines anderen Mittels zum Anhaften
von Pulver 16 auf der Oberfläche 12, bedeckt. Eine
Abdeckung 18 zum Bedecken des Pulvers und der Oberfläche während des
Transports, der Lagerung, der Gelhydratisierung und Verfestigung
und der Bakteriophageninkubation ist ebenso in 1 so
dargestellt, dass sie in einer gelenkartigen Weise entlang einer
Kante von Körperteil 10 angebracht
ist. Die Abdeckung dient vorzugsweise zum Schützen der Kulturen vor Austrocknung
des Trägers
und Kontamination durch andere Bakterien und Schimmelpilze. Wird
keine Abdeckung mit der Vorrichtung geliefert, erkennt der Fachmann,
dass eine Abdeckung über
dem Träger
nützlich
sein kann, um eine Kontamination des Wachstumsträgers während der Inkubation zu verhindern.
-
Die
Oberfläche 12 ist
vorzugsweise ein relativ fester, wasserfester Film, der aus einem
Material wie Polyester, Polypropylen oder Polystyrol hergestellt
ist, das Wasser nicht absorbiert oder sonst negativ durch Wasser
beeinflusst wird. Andere geeignete Oberflächen schließen Papier mit einer Polyethylen- oder einer anderen
wasserfesten Beschichtung ein. Ein Beispiel für eine geeignete mit Polyethylen beschichtete
Papieroberfläche
ist Photodruckpapier „Schoeller
Typ MIL" (Schoeller
Pulaski, New York). Eine bevorzugte Oberfläche schließt „MELINEX"TM (Dupont de
Nemours) ein, und andere bevorzugte Oberflächen dieser Erfindung sind
diejenigen wasserfesten Oberflächen
mit einem weißen
Hintergrund. Polyesterfilme mit einer Dicke von etwa 100 μm bis etwa
180 μm,
Polypropylenfilme mit einer Dicke von etwa 100 μm bis etwa 200 μm und Polystyrolfilme
mit etwa 300 μm
bis etwa 380 μm
erwiesen sich für
die vorliegende Erfindung als funktionsfähig. Ein anderer beispielhafter
Film ist ein transparenter Polyesterfilm, wie „SCOTCHPAR"TM (Minnesota
Mining and Manufacturing, St. Paul, MN).
-
In
einer Ausführungsform
ist die Oberfläche 12 auf
ihrer freigelegten Fläche
mit einer Klebstoffschicht 14 beschichtet, um das Pulver
an seinem Platz zu halten. Klebstoff 14 sollte wasserunlöslich sein
und das Wachstum der Bakterien, die der Vorrichtung zugesetzt werden,
nicht hemmen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Klebstoff 14 ein Haftklebstoff.
Allerdings können
auch wärmeaktivierte
Klebstoffe mit einer niedriger schmelzenden Substanz, die auf einer
höher schmelzenden
Substanz aufgetragen ist, verwendet werden. Wasseraktivierte Klebstoffe
wie Mucilago sind bekannt und können ebenso
in dieser Erfindung verwendet werden.
-
Klebstoff 14 kann
auf die Oberfläche 12 in
einer Dicke von vorzugsweise weniger als der Durchmesser der Teilchen
des pulverförmigen
Geliermittels und/oder der Nährstoffe
aufgetragen werden. Ausreichend Klebstoff wird zugesetzt, um die
Teilchen an der Oberfläche
anzuhaften, jedoch nicht so viel, dass die Teilchen vollständig in
dem Klebstoff eingebettet werden. Eine gleichmäßige Monoschicht aus wasserlöslichem
Pulver 16 wird verwendet, indem sie einen ausreichend großen Oberflächenbereich,
der für die
Hydratisierung freigelegt ist, aufweist. Im Allgemeinen ist eine
Klebstoffschicht im Dickebereich von 0,0002 bis 0,0005 Zoll (0,00051
bis 0,0013 cm) geeignet. wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Pulver" vorzugsweise ein
fein verteiltes teilchenförmiges Material
mit einem mittleren Durchmesser von weniger als etwa 400 Mikrometer.
-
Der
wasserunlösliche
Klebstoff ist vorzugsweise ein Haftklebstoff, der ein Copolymer
aus einem Alkylacrylatmonomer und einem Alkylamidmonomer umfasst.
Vorzugsweise beträgt
das Gewichtsverhältnis
von Alkylacrylatmonomer zu Alkylamidmonomer in diesen Copolymeren
etwa 90:10 bis etwa 99:1, stärker
bevorzugt etwa 95:5 bis etwa 98:2. In einer Ausführungsform ist der bevorzugte
Klebstoff ein Copolymer von Isooctylacrylat/Acrylamid (in einem
Molverhältnis
von 94/6). Andere Haftklebstoffe können verwendet werden und schließen Isooctylacrylat/Acrylsäure (in
einem Molverhältnis
von etwa 95/5 oder etwa 94/6) und Siliconkautschuk ein. Klebstoffe,
die durch Einwirkung von Wasser milchig werden, sind weniger bevorzugt,
wenn sie den Kontrast zwischen dem Bakterienrasen und den Plaques
nicht unterstützen.
-
Ein
Beispiel für
ein Verfahren zur Herstellung der wasserunlöslichen Klebstoffkomponente
dieser Erfindung ist in der US-Patentschrift 5,232,838 an Nelson
et al. offenbart. Im Allgemeinen wird eine wässerige Lösung aus einem nicht-ionischen
Emulgator und Wasser hergestellt. Ein vorher hergestelltes Gemisch
aus den Alkylacrylat- und Alkylamidmoneren in den gewünschten
Gewichtsverhältnissen und
einem nicht-ionischen olefinischen Polymerisationsinitiator wird
dann gemischt und in der wässerigen
Lösung über den
nichtionischen Emulgator dispergiert. Das Mischen wird unter Homogenisierungsbedingungen
für eine
Dauer von etwa 1 Minute durchgeführt,
um eine Öl-in-Wasser-Emulsion
herzustellen. Die erhaltene Öl-in-Wasser-Emulsion
wird auf eine Induktionstemperatur erwärmt und unter Stickstoff bis
zum Stattfinden der Polymerisation, wie durch eine exotherme Reaktion
signalisiert, gerührt. Das
Rühren
wird fortgesetzt, und, falls die erhaltene Zusammensetzung direkt
aufgetragen werden soll, werden jegliche Zusätze wie Nährstoffe und hydrophile selektive
Mittel unter Rühren
zugesetzt. Wasser wird zugesetzt oder entfernt, um eine geeignete
Beschichtungsviskosität
zu erhalten. Typischerweise liegt der Klebstoffteilchendurchmesser
im Bereich von etwa 0,1 μm
bis etwa 0,9 μm
und weist das filtrierte Reaktionsgemisch eine Brookfield-Viskosität von etwa
5 cps bis etwa 15 cps auf. Geeignete Einstellungen auf den pH-Wert
der Klebstoffzusammensetzung werden nach Bedarf durchgeführt, um
zu gewährleisten,
dass die Klebstoffzusammensetzung das Wachstum des Bakterienwirts
nicht hemmt.
-
Klebstoffe
sind nicht erforderlich. Zum Beispiel ist es auch möglich, das
suspendierte Pulver 16 in einer Flüssigkeit zu lösen oder
zu suspendieren, wobei die Flüssigkeit
zum Beschichten der Oberfläche
verwendet und die Beschichtung getrocknet wird, um eine Beschichtung
aus Trockenpulver auf der Oberfläche
bereitzustellen. In diesen Ausführungsformen
kann das Pulver 16 in Form einer Beschichtung oder einer
Beschichtung mit gesonderten Teilchen vorliegen. Das Pulver 16 kann
ein trockenes Geliermittel und/oder Nährstoffe in einer einheitlichen Monoschicht
zur einfachen Hydratisierung umfassen. Der Hauptteil der das Pulver 16 bildenden
Komponenten ist vorzugsweise hydratisierbar, das heißt, die Zugabe
von Wasser zu dem Pulver 16 bildet das Pulver unter Bildung
einer Suspension aus den Komponenten von Pulver 16 neu.
Das Pulver 16 kann auch die Farbstoffkombination dieser
Erfindung einschließen:
einen fällbaren
Farbstoff und einen Gegenfärbungsfarbstoff.
Die Wasserlöslichkeit
des Pulvers 16, das in den Vorrichtungen dieser Erfindung
eingesetzt werden kann, kann zum Beispiel aus dem Einschluss von
Pulvern eines geeigneten Geliermittels resultieren. Geeignete Geliermittel
zum Einschluss in Pulver 16 schließen sowohl neutralenatürliche als
auch synthetische Geliermittel ein, die abhängig von der Temperatur der
flüssigen
Probe, die der Vorrichtung zugesetzt werden soll, in Wasser bei
Raumtemperatur oder bis zu etwa 40°C Lösungen bilden. Geliermittel wie
Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyacrylamid, Locustbohnengummi
und Algin bilden Lösungen
in Wasser bei Raumtemperatur und sind geeignete Geliermittel zum
Bereitstellen von wasserhydratisierbaren Pulvern oder Feststoffen
gemäß dieser
Erfindung. Bevorzugte Geliermittel für Pulver 16 sind Guargummi
und Xanthangummi, diese Geliermittel sind einzeln oder in Kombination
mit anderen Geliermitteln nützlich.
-
Wie
angegeben, kann Pulver 16 nur ein Geliermittel umfassen.
Enthält
die Vorrichtung ein Pulver, das nur ein Geliermittel umfasst, kombiniert
der Endanwender die Wirtsbakterien mit der Bakteriophagen umfassenden
Probe in einem Nährstoffgemisch,
das für
das Wachstum der betreffenden Wirtsbakterien geeignet ist. Wird
ein Nährstoff
mit dem Geliermittel eingebracht, können die getrockneten pulverförmigen Nährstoffe
direkt in das Pulver eingebracht oder in einer schnell verdampfenden
Flüssigkeit
wie Ethanol oder dergleichen suspendiert werden. In anderen Fällen können die
getrockneten pulverförmigen
Nährstoffe
in wässerigen
Lösungen
suspendiert oder gelöst
werden. Ein aliquotes Öl
der Flüssigkeit
wird der oberen Fläche
von Oberfläche 12 zugesetzt,
die vorher mit Klebstoff und Geliermittel beschichtet wurde. Man
lässt die
Flüssigkeit
unter steriler Bedingung abdampfen, wodurch ausreichende Nährstoffe
zusammen mit dem Geliermittel zurückbleiben.
-
Eine
ausreichende Menge an Geliermittel kann in Pulver 16 so
eingeschlossen sein, dass eine vorbestimmte Menge an Wasser oder
einer wässerigen
Probe, im Allgemeinen etwa 3 Milliliter (ml) bis etwa 5 ml, in die
Mulde mit einem Durchmesser von etwa 4 Zentimetern (cm) bis etwa
6 cm platziert, ein Gel mit einer Viskosität bildet, die für die Unterstützung eines
Bakterienrasens, der die Entwicklung von gesonderten mengenbestimmbaren
Plaques gewährt,
geeignet ist. Gele mit einer Viskosität, die für die Unterstützung eines
Bakterienrasens und die Sichtbarmachung von gesonderten viralen
Plaques geeignet sind, gewähren
eine günstige
Handhabung und Stapelung der Vorrichtung nach der Hydratisierung.
-
Pulver 16 kann
auch trockene Wachstumsmedien einschließen, die für das Bakterienwachstum geeignet
sind. Wahlweise könnten
die Medien Inhaltsstoffe einschließen, die das Wachstum eines Typs,
jedoch nicht eines anderen Typs von Bakterien begünstigen.
Medien oder Salze, die das Wachstum eines bestimmten Organismustyps
begünstigen,
sind auf dem Fachgebiet bekannt, und eine Vielzahl dieser Medien
in trockener Form ist zum Beispiel von Difco, Inc. (Detroit, MI),
verfügbar.
Das trockene Medium ist vorzugsweise bei einer Temperatur von weniger
als 42°C
mit Wasser neu bildungsfähig
(d.h. hydratisierbar). Zum Beispiel können Gallsalze zum Unterstützen des
Wachstums von enterischen Bakterien verwendet werden.
-
Ein
bevorzugtes Beschichtungsgemisch für Pulver 16 schließt ein Geliermittel
wie Guargummi oder Xanthangummi, einen oder mehrere Nährstoffe, die
zum Unterstützen
von Bakterienwachstum geeignet sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Hefeextrakt,
Pepton, Zuckerarten, geeignete Salze und dergleichen, sowie eine
Gegenfärbungsfarbstoff, einenn
fällbaren
Farbstoff und wahlweise einenn pH-empfindlichen Farbstoff wie Neutralrot
ein ein. Eine Vielzahl an Nährstoffen,
die zum Unterstützen von
Bakterienwachstum geeignet sind, sind bekannt und diese schließen Bacto-Hefeextrakt,
Bacto-Trypton oder dergleichen ein. Der Fachmann erkennt, dass eine
Vielzahl an anderen Formulierungen verwendet werden könnte,n und
dass diese den Umfang dieser Erfindung nicht schmälern. Ein
beispielhaftes Pulver 16 schließt die in Beispiel 1 bereitgestellte
Pulverzusammensetzung ein.
-
Zum
Bilden eines geklebten Pulvermediums wird eine Schicht aus in kaltem
Wasser löslichem Pulver 16 unter
Verwendung von Klebstoff 14 im Wesentlichen gleichförmig auf
zumindest die Wachstumsregion von Klebstoffschicht 14 gehaftet.
Pulver 16 enthält
die Komponenten des trockenen Mediums. Ist ein Geliermittel in Pulver 16 eingeschlossen, ist
es in einer solchen Menge eingeschlossen, dass eine vorbestimmte
Menge an Wasser oder einer wässerigen
Probe (zum Beispiel mindestens etwa 5 ml, vorzugsweise etwa 5 bis
etwa 10 ml auf der Basis der bevorzugten Ausführungsform, jedoch können größere Volumina
unter Verwendung von größeren Muldengrößen und
Vorrichtungen mit größeren Ausmaßen angepasst
werden), platziert auf dem Medium platziert, ein neu gebildetes
Medium mit einer geeigneten Viskosität zum Unterstützen eines
Rasens aus Bakteriumwachstum und der Entwicklung von gesonderten
viralen Plaques bildet. Medien mit dieser Viskosität gewähren eine
günstige
Handhabung und Stapelung der Vorrichtungen während der Inkubation und stellen
eine ausgeprägte
Plaquebildung im Medium bereit. Die Größe der Pulverteilchen kann
zum Regulieren des Beschichtungsgewichts pro Flächeneinheit verwendet werden.
-
Der
fällbare
Farbstoff und der Gegenfärbungsfarbstoff
können
in Pulver 16 eingeschlossen sein. In einer anderen Ausführungsform
können
der fällbare
Farbstoff und der Gegenfärbungsfarbstoff
zu dem Zeitpunkt zugesetzt werden, bei welchem die Bakteriophagenverdünnung und
die Bakterien der Vorrichtung zugesetzt werden. Wird Vorrichtung 10 nicht
verwendet und ein Standard-Petrischalenbakteriophagentest durchgeführt, können der
fällbare Farbstoff
und der Gegenfärbungsfarbstoff
in den Bodenagar, in den Deckagar oder eine Kombination davon eingeschlossen
sein.
-
Das
Pulver kann auch andere Farbstoffe wie pH-empfindliche Farbstoffe einschließen, wobei
ein pH-Indikator
nützlich
sein oder auf andere Weise die Sichtbarmachung der Plaques verbessern
kann. Das Pulver kann auch Vernetzungsmittel oder andere Reagenzien,
wie Fungizide oder Fungistatika, einschließen. Vernetzungsmittel können zugesetzt
werden, um, falls nötig,
ein festeres Gel zu bilden. Geeignete Vernetzungsmittel beeinflussen
im Wesentlichen das Wachstum der Bakterien und Bakteriophagen nicht. Geeignete
Typen und Mengen von Vernetzungsmitteln werden leicht vom Fachmann
ausgewählt.
Zum Beispiel sind mit Guargummi Vernetzungsmittel wie Kaliumtetraborat,
Aluminiumsalze oder Calciumsalze und zweiwertige Kationen geeignet
und können
in wirksamen Mengen, z.B. weniger als etwa 1,0 Gew.-% von trockenem
Medium zugesetzt werden, sofern die Vernetzungsmittel das Wachstum
des Wirtsbakteriums oder die Absorption des Bakteriophagen auf dem
Wirtsbakterium nicht hemmen.
-
Die
Tests dieser Erfindung können
so aufgebaut sein, dass bestimmte Organismen nachgewiesen werden.
In einer Ausführungsform
der Tests dieses Typs wird eine Verdünnung einer bekannten Bakteriophagenprobe
zu unbekannten Bakterien zugesetzt. Der fällbare Farbstoff wird auf der
Basis seiner Verwendung als Substrat für ein Enzym in einem bestimmten
Bakterientyp ausgewählt.
Fällbare
Farbstoffe, die für
Glycosidasen, Phosphatasen, Esterasen und dergleichen spezifisch
sind, sind bekannt, und Beispiele wurden vorstehend bereitgestellt.
Nicht alle Bakterien weisen Glycosidasen, Phosphatasen und Esterasen
auf, womit die Fähigkeit
eines bestimmten Bakteriophagen, zu infizieren und Plaques zu bilden,
und die Gegenwart eines bestimmten Niederschlags, zum Beispiel eines
bestimmten gefärbten
Niederschlags in der Plaque, zum Bestätigen des Typs der unbekannten
Bakterien verwendet werden kann.
-
In
einer anderen Ausführungsform
dieser Erfindung ist es möglich,
ein Induktionsmittel in Pulver 16, im Agar einer Standardagarschale
oder mit der flüssigen
Probe, die Bakteriophagen und Bakterien umfasst, einzuschließen. Das
Induktionsmittel ist für ein
oder mehrere Proteine, wie ein oder mehrere Enzyme in einem Bakterium
spezifisch und verbessert den Transkriptionsgrad und deshalb die
Menge an Protein (z.B. Enzym) im Bakterium. Eine Vielzahl von Induktionsmitteln
ist auf dem Fachgebiet für
eine Vielzahl von Enzymen bekannt. Beispielhafte Induktionsmittel
schließen
1-O-Methyl-β-D-glucuronid
oder Isopropyl-β-D-thioglucoronsäure für β-Glucuronidase-Enzymaktivität, Isopropyl-β-D-thiogalac topyranosid
für β-Galactosidase-Enzymaktivität, 3-O-Methyl-α-D-glucopyranosid
für α-Glucosidase-Enzymaktivität und 1-O-Methyl-β-D-glucopyranosid
für β-Glucosidase-Enzymaktivität ein, sind
jedoch nicht darauf beschränkt.
-
Die
Vorrichtung dieser Erfindung schließt vorzugsweise eine Abdeckung 18 ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Abdeckung eine wie in 1 veranschaulichte
Deckfolie, die so angepasst ist, dass sie zumindest die Wachstumsregion des
Mediums bedeckt. Die Abdeckung 18 ist vorzugsweise transparent,
um das Zählen
von Bakteriophagenplaques zu erleichtern, und im Wesentlichen für Mikroorganismen
und Wasserdampf undurchlässig.
Im Allgemeinen kann die Abdeckung aus transparenten Materialien,
einschließlich
denjenigen, die zur Herstellung von Oberfläche 12 verwendet werden,
hergestellt werden. Das gegenwärtig
bevorzugte Material für
die Abdeckung ist Polyester, zum Beispiel ein transparentes Polyestermaterial
mit einer Dicke von 4 mil (0,10 mm).
-
Das
Abdeckfolienmaterial kann so auswählt werden, dass die Durchlässigkeit
einer Sauerstoffmenge, die für
den Typ des verwendeten Bakterienwirts nötig ist, bereitgestellt wird.
Zum Beispiel weisen Polyesterfilme eine geringe Sauerstoffdurchlässigkeit
(weniger als 0,78 g/100 cm2/24 Stunden pro 25
Mikrometer (μm)
Dicke) auf und sind für
das Wachstum von anaeroben Bakterien oder aeroben Bakterien geeignet,
wenn sie mit luftdurchlässigen Membranen,
wie diejenigen, beschrieben in der US-Patentschrift Nr. 5,232,838
an Nelson et al., verwendet werden. In anderen Ausführungsform
weisen einige Formen von Polyethylen eine relativ hohe Sauerstoffdurchlässigkeit
(etwa 78 g/100 cm2/24 Stunden pro 25 μm Dicke)
auf und wären
für das
Wachstum von aeroben Organismen mit oder ohne die Verwendung einer
luftdurchlässigen
Membran geeignet.
-
Die
Vorrichtung der Erfindung schließt auch einen Abstandhalter 20 ein,
der zwischen der Oberfläche 12 und
der Abdeckung 18 positioniert ist, um eine Mulde oder eine Öffnung 22 mit
im Wesentlichen senkrechten Seiten zu bilden, die zum Definieren
des Wachstumsbereichs des Mediums dienen und die Testprobe auf denjenigen
Teil der Oberfläche,
der Pulver 16 enthält,
begrenzen. Der Abstandhalter 20 von 1 ist ein
Abstandhalter, der eine kreisförmige Mulde 22 definiert.
Die Wände
der Mulde 22 sind im Wesentlichen senkrecht und stellen
eine Mulde von vorbestimmter Größe und Form
bereit und definieren die Bakterienwachstumsregion der Vorrichtung.
Andere Muldenformen könnten
verwendet werden, und der Fachmann erkennt, dass die Vorrichtung
dieser Erfindung mit anderen Abstandshalteraufbauten konfiguriert
werden könnte,
die den Umfang dieser Erfindung nicht schmälern würden.
-
Der
Abstandhalter 20 sollte eine ausreichende Dicke aufweisen,
um eine Mulde zu bilden, die das gewünschte Testprobenvolumen aufnimmt.
Vorzugsweise weisen die Wände
der Mulde eine Höhe
von mindestens etwa 4 mm und vorzugsweise eine Höhe von etwa 5 mm bis etwa 10
mm auf, wobei der Durchmesser oder die Breite der Mulde vorzugsweise
mindestens etwa 5 cm beträgt.
Der Abstandhalter sollte ausreichend dick sein, um die gesamte Testprobe aufzunehmen,
wenn sie in die Mulde platziert wird. Ferner sollte der Abstandhalter
ausreichend dick sein, damit die Abdeckung 18 nicht mit
dem die Bakterien enthaltenden Träger in Kontakt kommt.
-
Vorzugsweise
wird der Abstandhalter 20 aus Polyethylenschaum mit ggeschlossenenen
Zellen hergestellt, jedoch kann eine Vielzahl von Materialien, die
hydrophob (nicht-benetzend), für
Mikroorganismen inert und vorzugsweise sterilisierbar sind, verwendet
werden. Der Fachmann erkennt, dass die Dicke des Abstandhalters
auch mit der Größe der WandMulde variieren
kann.
-
Zur
Verwendung der Vorrichtung von 1 wird die
Deckfolie 18 durch den Anwender abgezogen und eine vorbestimmte
Menge an flüssiger
Probe, die die Bakteriophagen und einen geeigneten Bakterienwirt
enthält,
werdender Oberfläche 12 in Mulde 22 zugesetzt.
Ein in Pulver 16 vorliegendes Geliermittel wird neu gebildet
oder ein Geliermittel liegt in der flüssigen Probe so vor, dass das
Geliermittel einen festen oder halbfesten Träger bildet, der eine Fläche für Bakterienwachstum
bildet. Schließt Pulver 16 kein
Geliermittel ein, können
die Bakterien und Bakteriophagen einem Geliermittel wie Agar oder
dergleichen und dies der wasserfesten Oberfläche 12 zugesetzt werden.
Wahlweise kann ein Geliermittel in Pulver 16 eingebracht
werden, und ein Geliermittel wie Agar, zum Beispiel eine Deckagarformulierung
(siehe Beispiel 1), kann der Mulde 22 zugesetzt werden.
Wird ein Geliermittel verwendet, lässt man das Geliermittel verfestigen,
und die Vorrichtung wird unter das Wachstum der Bakterien unterstützenden
Bedingungen inkubiert. Die Bakterien und Bakteriophagen umfassende
Probe kann gleichzeitig mit dem Geliermittel oder in Folge nach
der Zugabe des Geliermittels zugesetzt werden. Die Vorrichtung wird
für eine
Dauer von etwa 2 bis 24 Stunden, und vorzugsweise zwischen etwa
2 bis etwa 10 Stunden, zumindest bis sich die Plaques entwickeln, inkubiert.
-
Wird
ein Deckagar verwendet, umfasst ein bevorzugter Deckagar Bacto-Agar-Deckagar
(Becton & Dickinson
Microbiology Systems, Cockeysville, MD), der eine Nährstoffbrühe (Becton & Dickinson Microbiology
Systems) mit einem pH-Wert von etwa 7,2 bis etwa 7,4 enthält. Andere
Agarformulierungen und andere Verfestigungsmittel können ebenso
in dieser Erfindung verwendet werden. Der Deckagar wird, wie in
Beispiel 1 beschrieben, als Flüssigkeit
in Teströhrchen
verteilt.
-
Eine
Bakterienprobe mit einer Bakteriophagen enthaltenden Probe wird
dem Deckagar zugesetzt. Das Gemisch wird sanft gerührt und
die Probe auf Pulver 16 gegossen. Nachdem der Deckagar
das gesamte oder einen Teil von Pulver 16 neu gebildet und
verfestigt hat, wird die Abdeckung auf die Wachstumsfläche gesetzt
und ruht auf Abstandshalter 20. Die Schalen werden für eine Zeitdauer
und bei einer Temperatur, die die Bildung des Bakterienrasens und
die Replikation der Bakteriophagen gewähren, inkubiert. Die Bakteriophagen
enthaltende Probe kann eine Verdünnung,
zum Beispiel in Medien der ursprünglichen
Bakteriophagen enthaltenden Probe sein. Häufig werden 10-fache Reihenverdünnungen hergestellt
und Aliquote von mehreren Verdünnungen
getrennt getestet. Die jeweilige Vorrichtung mit einer Anzahl an
gesonderten Plaques, vorzugsweise größer als 10, wird gezählt und
die Bakteriophagenmenge auf der Basis der Verdünnung der ursprünglichen
Bakteriophagen in der Probe bestimmt. Zum Beispiel werden Plaques
gezählt,
und die Anzahl an Plaques wird für
die Probenverdünnung
korrigiert, um die Anzahl an Plaques zu erzeugen, die in einem vorvorgegebenen
Volumen der unverdünnten
Probe vorliegen würde.
Jedes Plaque stellt einen infektiösen Bakteriophagen in dem ursprünglichen
Inokulum dar; womit die Anzahl an Plaques, die für die Verdünnung korrigiert sind, die
Anzahl an plaquebildenden Einheiten pro Volumen bedeutet.
-
Der
Test kann so modifiziert werden, dass Plaques aus einer Vielzahl
von Bakteriophagen unter Verwendung einer Vielzahl an Wirtsbakterien
identifiziert werden. Zum Beispiel gibt es sechs Hauptfamilien von
Bakteriophagen, einschließlich
Myoviridae (ebene T-Bakteriophagen),
Styloviridae (Lambda-Bakteriophagen-Gruppen), Podoviridae (T-7 und verwandte
Bakteriophagen), Microviridae (X174-Gruppe) Leviviridae (zum Beispiel
Bakteriophage MS2 von E. coli) und Inoviridae sowie Coliphagen im
Allgemeinen, die unter Verwendung der Verfahren dieser Erfindung
nachgewiesen werden können.
Andere Bakteriophagenfamilien schließen Vertreter der Cystoviridae-,
Microviridae- und Siphoviridae-Familien ein. Eine Vielzahl an Bakteriophagen, die
Plaques auf E. coli bilden, ist bekannt. Bakteriophagen, die Plaques
auf Staphylokokken bilden, sind bekannt, und diese sind in J.E.
Blair und R.E.O. Williams, 1961, „Phage typing of Staphylocci" Bull. W.H.O. 24:771-784,
aufgelistet; diejenigen, die Plaques in Salmonella bilden, einschließlich Bakteriophage
SD11 und SD12, sind durch Stubbs, et al., 1994, J. Clin. Microbiol.
2:199 und Gershman M. 1977, J. Clin. Microbiol. 5:302-314 bereitgestellt; Bakteriophagen,
die Plaques auf Listeria bilden, sind bekannt und sind zum Beispiel
von Van der Mee et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:303 bereitgestellt;
und Bakteriophagen, die Plaques in Yersinia bilden, schließen K27
ein und sind von Baker et al. 1982, J. Clin. Microbiol. 15:491-502
bereitgestellt. Bakteriophagen von Pseudomonas schließen ϕ6
(erhältlich
von American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) ein,
Bakteriophagen von Salmonella cholerae schließen P22 (erhältlich von ATCC)
ein, Hilfsbakteriophagen von Enterococcus faecalis schließen VD13
(ebenfalls erhältlich
von ATCC) ein. Zusätzliche
Außerdem
sind auch Bakteriophagen, die in Mycobacterium-Spezies replizieren können, ebenso
bekannt.
-
In
den in Beispiel 1 bereitgestellten Versuchen wurde eine Bakteriophagenprobe
zu E. coli in Deckagar zugesetzt und in die durch Abstandhalter 20 in
Vorrichtung 10 gebildete Mulde gegossen. Violettblau gefärbte Plaques
bildeten sich innerhalb von etwa 2 Stunden mit einer deutlichen
Niederschlagsbildung durchinnerhalb von 5 Stunden.
-
Bedeutenderweise
waren die wie in Beispiel 1 bereitgestellten Plaques, die unter
Verwendung der Kombination von Farbstoffen dieser Erfindung gebildet
wurden, gesonderter deutlicher als die Plaques, die unter Verwendung
von fällbarem
Farbstoff allein gebildet wurden. Schalen, die, wie in Beispiel
1 beschrieben, den fällbaren
Farbstoff ohne Gegenfärbungsfarbstoff
einschlossen, erzeugten klare Plaques im Agar, wobei der Bakterienrasen
einen schwachen Farbton aufwies, der der Farbe des fällbaren
Farbstoffs entsprach. Im Gegensatz dazu waren Plaques, die auf einem
Träger
in Gegenwart einer Kombination von fällbarem Farbstoff und einem
Gegenfärbungsfarbstoff
gebildet wurden, gemäß der Farbe
des Gegenfärbungsfarbstoffs
mit einem schweren Niederschlag gefärbt, der der Farbe des fällbaren
Farbstoffs entsprach. Der Bakterienrasen wies eine sehr schwache
Färbung
des fällbaren Farbstoffs
auf. Die Gegenfarbe, kombiniert mit der Gegenwart eines Niederschlags
in der Plaque, machte die Sichtbarmachung der Plaque viel leichter, als
Standard-Bakteriophagentests oder Bakteriophagentests unter Verwendung
eines fällbaren
Farbstoffs allein.
-
Der
fällbare
Farbstoff und der Gegenfärbungsfarbstoff
dieser Erfindung können
in eine oder mehrere der Agarschichten in einem Standard-Bakteriophagentest
vom Petrischalentyp eingebracht werden, und die Verfahren zum Durchführen von
Petrischalenbakteriophagentests sind auf dem Fachgebiet bekannt.
-
Fällbare Farbstoffe
(chromogene Substrate) wurden zum Identifizieren von Bakterien verwendet. Zum
Beispiel offenbart die US-Patentschrift 5,443,963 an Lund die Verwendung
eines Indolylphosphat enthaltenden Farbstoffs, der in Gegenwart eines
Enzyms von Staphylokokken einen Niederschlag bildet. β-Galactosidase- und β-Glucuronidase-Substrate
wurden zur Identifikation von Coliformen und E. coli offenbart.
Zum Beispiel offenbart die US-Patentschrift Nr. 5,358,854 an Ferguson
die Verwendung von chromogenen Farbstoffen zum Nachweis von Coliformen
und E. coli. Andere Patentschriften, die die Verwendung von chromogenen
Farbstoffen zum Identifizieren von Bakterien offenbaren, schließen die
US-Patentschriften Nr. 5,364,767 an Flowers, 5,210,022 an Roth et
al. und 5,393,662 an Roth et al. ein. Überraschenderweise und im Gegensatz
zu den vorstehend erörterten
Ergebnissen erzeugte ein zusammenfließender Bakterienrasen keine
deutliche Farbe. Nur mit Bakterienlyse oder Bakterienabbau in Gegenwart
von Bakteriophagen lagen ein Niederschlag und eine deutliche Farbe
vor. Dieses Ergebnis ist unerwartet, da man auf der Basis der Patentschriften
an Flowers, Roth et al. und Ferguson eine zusammenfließende Farbe
erwarten würde
und infolgedessen die Verfahren unter Einsatz von fällbarem
Farbstoff und eines Bakterienrasens zur Mengenbestimmung von Bakteriophagen
nicht nützlich sein
würden.
Außerdem
bildete in Bezug auf die Option der Verwendung von Induktionsmitteln
in den Bakteriophagentests zum Stimulieren von der Enzymproduktion
von den Bakterien zur Erhöhung
der Menge an gebildetem Niederschlag die Gegenwart eines Induktionsmittels
in dieser Erfindung zur Bakteriophagenmengenbestimmung keine dunkel
gefärbten
Kolonien, wie es auf der Basis der vorstehend genannten Quelltexte
zu erwarten wäre.
-
Der
Test und die Vorrichtung dieser Erfindung sind zur Bakteriophagenmengenbestimmung
in einer Vielzahl an Testsystemen nützlich. Zusätzlich zu der Verwendung der
Testvorrichtung dieser Erfindung in molekularbiologischen Techniken
und der Verwendung dieser Tests zur Mengenbestimmung von Bakteriophagen
als Markierung für
bakterielle Lebensmittel-, Wasser- oder Milchkontamination kann
die Vorrichtung als Teil eines Testprotokolls zum Bestimmen der
viralen Durchdringungsfähigkeit
einer Vielzahl von Substanzen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf,
medizinische StoffeBekleidung, Latexhandschuhe, Luftsterilisationsfilter,
Membranfilter und dergleichen, verwendet werden. Beispiel 2 beschreibt
detailliert ein Verfahren zum Testen von Virusdurchdringung in Stoffen/Bekleidung
unter Verwendung der Verfahren dieser Erfindung.
-
Der
Test dieser Erfindung kann auch zum Nachweis von Bakterien verwendet
werden. In diesen Tests wird eine Probe, die eine Testprobe umfasst,
die im Verdacht steht, einen bestimmten Bakterientyp zu enthalten,
mit Bakteriophagen in Kontakt gebracht. Nach einer Inkubationsperiode
zum Gewähren
von Adsorption der Bakteriophagen auf den Bakterien werden die Bakteriophagen,
die mit den Bakterien nicht in Kontakt waren oder diese nicht infizierten,
entfernt. Es gibt eine Vielzahl an Verfahren zum Entfernen oder
Abtrennen von freien Bakteriophagen von Bakterien in diesem Stadium.
Ein auf dem Fachgebiet bekanntes Verfahren ist es, die Probe in
ein Zentrifugenrohr einzubringen, um entweder die Bakterien entweder
durch Drehen der Bakterien zum Boden des Rohrs oder durch Abtrennen
der Bakterien auf ein Polstermittel wie Zellulose, oder andere Zuckerlösungen oder
andere auf dem Fachgebiet bekannte Zentrifugendichteabtrennverbindungen
abzutrennen. Rees et al. offenbaren andere Verfahren zum Abtrennen
oder Entfernen von Bakteriophagen von einer Bakterienprobe, einschließlich Zerstören, Neutralisieren
oder Inaktivieren der extrazellulären Bakterien, und diese Verfahren
sind in der US-Patentschrift
Nr. 5,498,525 bereitgestellt. Die Bakterienprobe wird dann vorzugsweise
mit einer Bakterienprobe kombiniert, von welcher es bekannt ist,
dass sie die Replikation der Bakteriophagen unterstützen kann.
Diese Bakterienprobe wird zur Bildung eines Bakterienrasens verwendet.
Plaques, die sich auf dem Bakterienrasen auf einem Träger, der den
(die) fällbaren
Farbstoff e) dieser Erfindung und den (die) Gegenfärbungsfarbstoff(e)
dieser Erfindung enthält
enthalten, bilden, weisen auf die Gegenwart der Test- oder Verdachtsbakterien
in der Testprobe hin.
-
In
einer anderen Ausführungsform
dieser Erfindung ist ein Bausatz zur Diagnose eines bestimmten Bakterientyps
auf der Basis der Gegenwart eines bestimmten Bakteriophagentyps
bereitgestellt, oder ein Bausatz kann zur Mengenbestimmung eines
bestimmten Bakteriophagentyps bereitgestellt werden. Der Bausatz
für zur
bakteriellen Identifizierung schließt vorzugsweise mindestens
eine Kulturmulde, wie die durch diese Erfindung bereitgestellte
Trockenpulverkulturvorrichtung, die erfindungsgemäße Farbstoffkombination,
entweder vorliegend im Pulver der beschichteten Filmkulturvorrichtung
(wie zum Beispiel diejenige, bereitgestellt in 1)
oder als entweder trockenes oder flüssiges Aliquot, die zu der Bakteriophagen
und Bakterien umfassenden flüssigen
Probe kurz vor ihrer Anwendung zuzusetzen ist, Wirtsbakterien, die
das Wachstum der gewünschten Bakteriophagen,
deren Menge zu bestimmen ist, und Kontrollbakteriophagen ein.
-
Bestimmte
Ausführungsformen
dieser Erfindung werden detailliert erörtert, und es wird auf mögliche Variationen
im Umfang dieser Erfindung Bezug genommen. Es gibt eine Vielzahl
an alternativen Techniken und Verfahren, die dem Fachmann verfügbar sind,
welchen man eine erfolgreiche Durchführung der beabsichtigten Erfindung
gewähren
würde, verfügbar sind
und eine ähnlich
erfolgreiche Durchführung
der beabsichtigten Erfindung gewähren
würden.
-
Beispiel 1
-
Bakteriophagenmengenbestimmung
von einer Testprobe
-
Eine
Seite einer Folie „MELINEX"TM-Film (duPont
de Nemours, Bloomington, DE) wurde mit einer Lösung von 3,0 g/l Bacto-Hefeextrakt
(Difco), 7,0 g/l Bacto-Pepton (Difco), 1,5 g/l Bacto-Gallsalz Nr.
3 (Difco), 10,0 g/l Bacto-Lactose, 5,0 g/l NaCl, 0,042 g/l Neutralrot
(Sigma, St. Louis, MO), 0,001 g/l Kristallviolett (Fisher Scientific)
und 0,115 g/l 5-Brom-4-chlor-3- indolyl-β-D-glucuronsäure-Cyclohexylammoniumsalz
(BCIG, Biosynth International, Chicago, Illinois) in doppelt destilliertem
Wasser beschichtet. Vor dem Beschichten wurde der pH-Wert der Lösung auf
etwa 7,0 unter Verwendung von Na2CO3 eingestellt. 10 g/l Guar (Meyhall Chemical AG,
Kreuzlingen, Schweiz) wurden zugesetzt, und die Lösung wurde
auf MELINEXTM aufgetragen und ofengetrocknet,
wodurch eine Beschichtung von etwa 500 mg/24 in2 erhalten
wurde.
-
Ein
Abstandhalter wurde aus einer rechteckigen Folie mit 8 cm × 11 cm
aus Polystyrolschaum einer Dicke von 5 cm Dicke mit einer mittigen
runden Mulde mit einem Durchmesser von etwa 5 cm, die hinein geschnitten
war, hergestellt und durch Handwalzendruck zu einer an eine rechteckigen
Folie des vorstehenden pulverbeschichteten Films befestigt wurde.
-
Eine
obere Abdeckfolie wurde aus einer festen, jedoch flexiblen Folie
aus 4 mil (0,10 mm) dickem, Sol-Gel-behandeltem, transparentem Polyester
(SCOTHPARTM Polyethylenterephthalat-Film,
Nr. FE 40492, 3M St. Paul, MN) in rechteckiger Form (8 cm × 11 cm)
hergestellt. Die Abdeckfolie wurde auf die 8 cm breite Kante des
Schaums der Vorrichtung durch ein doppelt beschichtetes Haftklebeband
auf einem Abschnitt mit 0,7 cm der Decklage befestigt. Bei der Verwendung
wurde die Vorrichtung auf eine ebene Oberfläche platziert und die obere
Abdeckfolie durch Freilegen des Schaumabstandhalters und der Mulde
darin zurückgefaltet.
-
Der
Bodenagar von Standard-Petrischalen wurde aus einer Lösung von
etwa 15,0 g Bacto-Agar (Becton & Dickinson
Microbiology Systems, Cockeysville, MD), etwa 8,0 g Nährstoffbrühe (Becton & Dickinson Microbiology
Systems, Cockeysville, MD) und etwa 5,0 g Kaliumchlorid in 1 Liter
gereinigtemn Wassers hergestellt. Der pH-Wert des Agars wurde unter Verwendung
von 2,5 N Natriumhydroxid auf etwa 7,2 bis etwa 7,4 eingestellt.
Nach Autoklavieren wurde 1 ml einer 1-molaren Lösung von Calciumchlorid zugesetzt.
-
Deckagar
sowohl für
sowohl die beschichteten Filmvorrichtungen als auch die Standard-Petrischalen
wurde unter Verwendung von etwa 7,0 g Bacto-Agar, etwa 8,0 g Nährstoffbrühe und etwa
5,0 Kaliumchlorid in einem Gesamtvolumen von 1 Liter gereinigtemn
Wassers hergestellt. Der pH-Wert des Altars wurde mit 2,5 N NaOH
auf etwa 7,2 bis etwa 7,4 eingestellt. Nach Autoklavieren wurde
1,0 ml einer 1 molaren Lösung
von CaCl2 der Deckagarlösung zugesetzt. Eine Probe
mitvon 2,5 ml des sterilen geschmolzenen Deckagars wurde in sterilen
Polystyrol-Teströhrchen
mit von 16 × 125
mm verteilt und bei etwa 45°C
gehalten. Ein Aliquot (100 μl)
einer Übernachtkultur
von E. coli C (AGTCC # 13706) wurde jedem der Deckagarröhrchen zugesetzt
und im warmen Wasserbad gehalten. Je nach Test wurden etwa 0,1 ml
bis etwa 1,0 ml der Testprobe, enthaltend Verdünnungen von Bakteriophagen,
PhiX174 (positive Kontrolle, ATCC # 13706-B1) oder keine Bakteriophagen
(negative Kontrolle) jedem der E. coli enthaltenden Röhrchen zugesetzt.
Die Inhaltsstoffe der Röhrchen
wurden gut gemischt und in die Mulde der beschichteten filmbeschichteten
Vorrichtung oder auf die Bodenagar enthaltenden Petrischalen gegossen. In
einer Probengarnitur wurde Deckagar, enthaltend 1 mg/ml BCIG, auf
die Petrischalen gegossen, in einer anderen Probengarnitur wurde
Deckagar, enthaltend 1 mg/ml BCIG und 1 mg/ml Kristallviolett, auf
die Petrischalen gegossen. Man ließ den Deckagar verfestigen
und er wurde bei 37°C
für eine
Dauer von bis zu 24 Stunden inkubiert und mit intervallmäßig über diese
Zeitdauer überprüft.
-
Nach
zwei Stunden waren Plaques als kleine blaue winzige Punkte auf den
den aufgetragenen Film enthaltenden Vorrichtungen sichtbar. Winzige Plaques waren
auch auf den Petrischalen sichtbar, jedoch wurde kein Niederschlag
beobachtet. Nach drei Stunden lagen kleine violettblau gepunktete Plaques
auf dem aufgetragenen Film vor, während die Plaques in den Standard-Petrischalen
mit einem Hintergrund mit blauem Farbton klar waren. Im Gegensatz
zu den den fällbaren
Farbstoff alleine enthaltenden Standard-Petrischalen enthielten
die mit Trockenpulver beschichteten Filmvorrichtungen, umfassend
sowohl den Gegenfärbungsfarbstoff
als auch den fällbaren
Farbstoff, deutliche Plaques innerhalb von 3 Stunden. Man ließ die Plaques über eine
Dauer von 24 Stunden wachsen; jedoch war die Anzahl an Plaques nach
6 Stunden gleich der Anzahl an Plaques, die nach 24 Stunde gezählt wurde.
Die Plaques in den BCIG-enthaltenden
Petrischalen blieben klar, jedoch bildeten die Agarschalen mit dem fällbaren
Farbstoff in Kombination mit dem Gegenfärbungsfarbstoff ausgeprägtere Plaques.
Die Plaques in den Petrischalen mit der Farbstoffkombination dieser
Erfindung wiesen eine deutlich gefärbte Kante auf. Waren zwei
oder mehrere Plaques in enger Nachbarschaft zu einander, wiesen
die die Farbstoffkombination dieser Erfindung enthaltenden Petrischalen
deutliche Kanten auf, die eine leichtere Mengenbestimmung gewährten. Die
pulverförmig
beschichteten Filmvorrichtungen mit der Farbstoffkombination dieser
Erfindung waren deutlich leichter mengenmäßig zu bestimmen als die Schalen,
die den fällbaren
Farbstoff alleine enthielten. Bakteriophagenberechnungen variierten
je nach Test und Bakteriophagenkonzentration in der ursprünglichen zu
testenden Probe. Für
Testoptimierungsstudien wurden Schalen gezählt, die 30–50 Plaques pro Schale unter
Verwendung einer Petrischale mit 10 × 100 mm enthielten, und diese
Anzahl an Plaques wurde allgemein unter Verwendung von 0,1 ml einer 10–6-Verdünnung einer
Standard-Bakteriophagentestsuspension, enthaltend mindestens etwa
1 × 108 Plaque-bildende Einheiten/ml, erhalten.
Der Fachmann erkennt, dass unbekannte Testproben eine unbekannte
Bakteriophagenkonzentration enthalten, und dass deshalb vorzugsweise
eine Vielzahl an Verdünnungen
der unbekannten Testprobe getestet wird.
-
Beispiel 2
-
Verfahren zum Nachweis
von Virusdurchdringung durch ein Material
-
Bakteriophage
Phi-X 174 hat annähernd
die Größe des Hepatitis-C-Virus
und ist ein akzeptiertes Surrogat für das Hepatitis-B-Virus und
das Human-Immunodeficiency-Virus
(HIV) auf dem Fachgebiet (siehe zum Beispiel „Emergency Standard Test Method
for Resistance of Protective Clothing Materials to Penetration by
Blood-Borne Pathogens
using Viral Penetration as a Test System", Bezeichnung ES 22–92, American Society for Testing
and Materials, Philadelphia, PA 19103, SS. 1–7).
-
Schutzbekleidungsmaterial
wird mit einer Suspension der Bakteriophagen Phi-X174 (American Type
Culture Collection, Rockville, MD) in Kontakt gebracht, wobei die
Kleidung durch Zugabe von 0,01 Vol.-% oberflächenaktives Mittel des Typs
Tween 80TM für eine Dauer von 5 min ohne
angewandten Druck, 1 min bei 13,8 kPa (2,0 psig) und 54 weitere Minuten
ohne angewandten Druck oder bis zum sichtbaren Nachweis einer flüssigen Penetration
auf eine Oberflächenspannung
von 40 dyn/cm eingestellt wurde. Die Sichtseite des Testmaterials
wird mit Nährstoffbrühe gespült. Dieses
Testfluid wird mit Deckagar, enthaltend E. coli, wie im Test dieser
Erfindung verwendet, gemischt. Das Gemisch wird in eine Mulde, enthaltend
mindestens einen fällbaren
Farbstoff und mindestens einen Gegenfärbungsfarbstoff gemäß dieser
Erfindung, gegossen. Die Menge der lebensfähigen Viren, die im Testfluid
vorliegen, wird in Form von Plaques unter Verwendung der Vorrichtung
dieser Erfindung bestimmt. Die Plaques werden gezählt, um
die Anzahl an Virusteilchen zu bestimmen, die das Testmaterial durchdringen. Ähnliche Tests
können
unter Verwendung von Latexhandschuhmaterial, Luftfiltern, Membranfiltern
und dergleichen durchgeführt
werden. Diese Tests zeigen, dass der Bakteriophagentest und die
Vorrichtung dieser Erfindung zum Nachweis oder zum Testen der Wahrscheinlichkeit
von viraler Durchdringung für eine
Vielzahl von Säugerviren
nützlich
ist sind.
-
Es
ist dem Fachmann klar, dass während
die Erfindung vorstehend in Verbindung mit bestimmten Ausführungsformen
und Beispielen beschrieben wurde, die Erfindung nicht unbedingt
darauf beschränkt ist,
und dass zahlreiche andere Ausführungsformen, Beispiele,
Verwendungen, Modifikationen und Abweichungen von den Ausführungsformen,
Beispielen und Verwendungen ohne Verlassen des erfinderischen Rahmen
dieser Anmeldung durchgeführt
werden können.